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ENZIMAS DE RESTRICCION / MAPAS DE RESTRICCION VECTORES DE CLONACION - TIPOS GENOTECAS - TIPOS CLONACION IDENTIF. DE SECUENCIAS CLONADAS METODOS PARA EL ANALISIS DE SECUENCIAS:

SOUTHERN/ NORTHEN/WESTERN PCR SECUENCIACION

BIBLIOGRAFIAGriffiths et al. (2000)

Klug y Cummings (1999)Tamarin (1999)

Strachan et al. (1996)Kaplan et al. (1993)

wwwhttp://www.cbs.dtu.dk/dave/roanoke/genetics.html

* Nucleasa sintetizada por las bacterias como un mecanismo de defensa natural

* Nucleasa capaz de reconocer y cortar una secuencia específica de nucleótidos en una doble cadena* Longitud de la secuencia reconocida de 4 a 8 bp* Reconocen secuencias palindrómicas

Primera enzima descubierta fue a partir de Haemophilus influenzae

EXTREMOS COEXIVOS

EXTREMOS ROMOS

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. MAPA DE RESTRICCION CONOCIDOUn único pto. De corte

. MARCADORES SELECTIVOSResistencia antibióticosCambios de color

. REPLICACION AUTONOMA

. RECUPERACION SENCILLA

. TIPOS:Plásmidos, fagos, cósmidos, YACs, BACs, etc.

Factor F de Bacterias: plásmido con replicación

autónoma, que transfiere información genética durante la conjugación bacteriana

PolilinkerResistencia antibióticos

1º Inserción del fragmento de DNA a clonar en un Vector de clonación:

MOLECULA DE DNA RECOMBINANTE

2º Introducción mol. DNA recombinante en hospedador (bacterias)

3º Vectores se multiplican de forma autónoma

4º Bacteria se divide 5º Un gran nº de copias dará lugar

a un clon, con muchas copias del fragmento

. Clonación de todas las secuencias del genoma . Presente al menos una copia de cada gen. Nº de clones depende: - tamaño inserto

- tamaño genoma. Tipos : genómicas, cromosómicas, cDNAln ( 1-p) N : nº de clones N = -------- P : Prob de recuperar

ln ( 1-f) f: fracción genoma en el clon

ln ( 1-p) N : nº de clones N = -------- P : Prob de recuperar

ln ( 1-f) f: fracción genoma en el clon

Genoma humano: 3,0 x 106 KbP : 99%f : Inserto 17 Kb - 1,7 x 104 /3 x 109

N : 8.1 x 105 fagos

Genoma humano: 3,0 x 106 KbP : 99%f : Inserto 5 Kb N : varios millones

plásmidosGenoma humano: 3,0 x 106 KbP : 99%f : Inserto 50 Kb N : 400.000 cósmidos

1º PASO

2º PASO

3º PASO

4º PASO

SOUTHERN BLOTTING

5º PASO

1º PASO: DESNATURALIZACION

2º PASO: ANILLAMIENTO DE PRIMERS

3º PASO: ELONGACION

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METODO DE SANGER

1º Paso: Desnaturalización2º Paso: Adición de :

dNTPsDNApolimerasacebador

3ºPaso: adición de ddNTPs