View
10
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
1
ÖGBT 2011 13.10.11
Stand der Nicht-invasiven Pränataldiagnostik
(NIPD-RhD) von Rhesus-D und anderen
Blutzellalloantigenen
1. Jahrestagung der ÖGBT13.10.2011
Tobias J. LeglerAbteilung Transfusionsmedizin, Universitätsmedizin Göttingen
Zertifiziert nach DIN ISO 9001:2000
ÖGBT 2011 13.10.11
NIPDNIPD RhDRhD in Europa (in Europa (alloimmunisiertealloimmunisierte))
2
ÖGBT 2011 13.10.11
NIPDNIPD RhDRhD in Europa (Rhin Europa (Rh--Prophylaxe)Prophylaxe)
ÖGBT 2011 13.10.11
SchwartzSchwartz + Legler = 60 min+ Legler = 60 min
Schwartz Wien 55 minLegler Göttingen 5 min==
Schwartz Wien 1 secLegler Welt 60 min==
3
ÖGBT 2011 13.10.11
ThemenThemen
• Präanalytik
• Cff Nukleinsäureextraktion
• Amplifikation/Detektion
ÖGBT 2011 13.10.11
Zeitpunkt der BlutentnahmeZeitpunkt der BlutentnahmeAkolekarAkolekar et al. Fetalet al. Fetal DiagnDiagn TherTher 2011;29:3012011;29:301--306306
• 591 RhD negative Frauen 11.-14. SSW (Median 12,4)
• Automatische Nukleinsäureextraktion (BioRobot MDx, Qiagen)
• Real-time PCR 3x RHD exon 5 und 7, CCR5 als genomische Kontrolle
•502 Ergebnisse („conclusive“)
•332 D-positive Ergebnisse, 170 D-negative Ergebnisse (davon 6 falsch negativ,Sensitivität 98,2%)
•84 (14,3%) kein Ergebnis („inconclusive“)
Deutlicher Unterschied in der Sensitivität dieser Methodezwischen 12. SSW (98,2%) und 26. SSW (99,8%)
4
ÖGBT 2011 13.10.11
TransportbedingungenTransportbedingungenMMüüllerller SP et al. TransfusionSP et al. Transfusion 2008;48:22922008;48:2292--301301
• 1,022 RHD-negative Schwangere, 6. – 32. SSW (median 25)Transportzeit 0-8 Tage
• QIAamp DSP Virus Kit (Qiagen, Hilden, Germany)„Säulenmethode“ (Legler et al. Prenat Diagn 2007; 27: 824-839)
• Chemagic Magnetic Separation Module 1 (Chemagen, Baesweiler, Germany)„Magnetspitzenmethode“
• Real-time PCR 2x RHD exon 5 und 7, CCR5 als genomische Kontrolle
• Diskrepanzen wurden mittels Wangeabstrich beim Neugeborenen abgeklärt
ÖGBT 2011 13.10.11
073n falsch positiv
31†2*†n falsch negativ
99.7%99.2%99.5%Genauigkeit(n = 1,022)
> 99.7%98.1%99.2%Spezifität(n = 360)
99.5%99.8%99.7%Sensitivität(n = 662)
SerologieMagnetspitzen(automatisiert)
Säulenmethode(manuell)
TransportbedingungenTransportbedingungen
*22. SSW, fetale DNA Konzentration unterdurchschnittlich, Magnetspitzenmethode†25. SSW, Transportzeit 6 Tage bei Raumtemperatur
5
ÖGBT 2011 13.10.11
Transportbedingungen (Transportbedingungen (cffcff DNA)DNA)MMüüller SP et al.ller SP et al. PrenatPrenat DiagnDiagn, im Druck, im Druck
Median 25%-75% Non-Outlier Range Outliers Extremes
0 1 2 3 4 5 6 7 8
30
35
40
45
50
Transportzeit (Tage)
Anstieg der Ct-Werte ab Tag 6(p=0,023)
RHD
Exo
n7
real
tim
e PC
R (
ct)
ÖGBT 2011 13.10.11
TransportbedingungenTransportbedingungen ((GesamtGesamt DNA)DNA)MMüüller SP et al.ller SP et al. PrenatPrenat DiagnDiagn, im Druck, im Druck
6
ÖGBT 2011 13.10.11
MonovettentypMonovettentypFernando MR et al.Fernando MR et al. PrenatPrenat DiagnDiagn 2010;30:4182010;30:418--424424
Cell-Free DNA BCTFa. Streck, La Vista, USA
ÖGBT 2011 13.10.11
MIDIMB
CSTMINI
MINIMINI
MINIMINI
MINIMINI
HPDSP
Mea
npg
/ml
4000
3000
2000
1000
0
Pool
1
2
3
cffcff DNA Extraktion (manuell)DNA Extraktion (manuell)Legler TJ et al.Legler TJ et al. PrenatPrenat DiagnDiagn 2007;27:8242007;27:824--99
DSP: QIAamp DSP Virus Kit, HP: High Pure PCR Template Preparation Kit, MINI:QIAamp DNA Blood Mini Kit, CST: CST genomic DNA purification Kit, MB: in-housemagnetic bead separation method, MIDI: QIAamp DNA Blood Midi Kit
7
ÖGBT 2011 13.10.11
DNADNA AusbeuteAusbeute:: RHDRHD ExonExon 7 PCR7 PCR
Säulenmethode: Median, 99 pg/ml mütterliches Plasma (6-6.973 pg/ml)Magnetspitzen: Median, 692 pg/ml mütterliches Plasma (35-34.418 pg/ml)
n = 660 Proben, die richtig RHD+ mit beiden Extraktionsverfahren bestimmt wurden
ÖGBT 2011 13.10.11
NukleinsNukleinsääureextraktionureextraktionQIAampQIAamp CirculatingCirculating NucleicNucleic AcidAcid KitKit, QIAGEN, Hilden, Deutschland, QIAGEN, Hilden, Deutschland
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
RH
D E
xon
7 cf
f DN
A p
g/m
l
Magnetspitzen Säulenmethode
8
ÖGBT 2011 13.10.11
Automatisierte DNAAutomatisierte DNA--ExtraktionsverfahrenExtraktionsverfahrenLegler TJ et al.Legler TJ et al. TransfusTransfus MedMed HemotherHemother 2009;36:1892009;36:189––198198
ChemagenSeparation Module 1
QIAGENBiorobot MDx
bioMérieuxNucli-Sens easyMAG
RocheAmpliprep
RocheMagna Pure
QIAGENQIAsymphony
ÖGBT 2011 13.10.11
DiagnostischeDiagnostische LeistungsfLeistungsfäähigkeithigkeit
99.5>99.7Ampliprep (Minon 2008)
98.999.5MagnaPure(van der Schoot 2006)
94.099.7MDx (Finning 2008)
98.199.8Chemagen (Müller 2008)
>99.799.5Serologie (Müller 2008)
Spezifität [%]Sensitivität [%]
9
ÖGBT 2011 13.10.11
Kontrollen bei der Analyse fetaler MarkerKontrollen bei der Analyse fetaler Marker
• Y-Chromosom: nur 50% werden erfasst
• Ins/Del Polymorphismen: ca. 300 $ / Test
• Plazentare m-RNA: Bisher keine Studiendaten
• Methylierungsspezifische PCR/RFLP
• Plasmid-DNA als Sensitivitätsmarker: CE-Markierung
ÖGBT 2011 13.10.11
Free DNA FetalFree DNA Fetal KitKit®® RhDRhDInstitut deInstitut de BiotechnologiesBiotechnologies, Jacques Boy, Reims, France, Jacques Boy, Reims, France
http://www.biotechjboy.com/http://www.biotechjboy.com/ Vertrieb: BioVertrieb: Bio--RadRad LaboratoriesLaboratories
DNA Extraktion• QIAamp® MinElute® Virus Vacuum Kit (QIAGEN)• QIAamp DSP Virus Kit (IVD CE) (QIAGEN)RHD Exons• RHD Exons 5, 7 und 10Kontrollen• Positives Kontrollplasma• Negatives Kontrollplasma• Extraktions-/Amplifikationskontrolle DNA (Mais)
10
ÖGBT 2011 13.10.11
Free DNA FetalFree DNA Fetal KitKit®® RhDRhDC.C. RouillacRouillac--LeLe Sciellour et al.Sciellour et al. TransfusTransfus ClinClin BiolBiol 2007;14:5722007;14:572--577577
• 300 D-negative Frauen (CTS 2009/108/EC: 3000)
• 10. – 34. SSW
• 229 richtig positiv (Ct 35-40, Sensitivität 100%)
• 79 richtig negativ (Spezifität >99%)
• 2 falsch positiv (Ct>39 Exon 7 und 10)
• Bestätigung durch 2. Blutprobe bei RHD-negativem
Ergebnis
310
Spezifität 97.5%
ÖGBT 2011 13.10.11
Matrix Assisted LaserMatrix Assisted Laser DesorptionDesorptionIonizationIonization -- Time Of Flight MassTime Of Flight Mass
(MALDI(MALDI--TOF)TOF)
SequenomCMM (Center for Molecular Medicine)http://www.scmmlab.com/
SensiGene™ Fetal RhD Genotyping (launched Feb 04, 2010)
SEQureDx™ technology
11
ÖGBT 2011 13.10.11
SensiGeneSensiGene FetalFetal RHDRHD GenotypingGenotypinghttp://www.scmmlab.com/
95% Konfidenz Intervall
89.5% - 99.2%96.9%Spezifität
92.9% - 98.9%97.2%Sensitivität
ÖGBT 2011 13.10.11
RASSF1A-GenHyland CA et al.Hyland CA et al. Med JMed J AustAust.. 2009;191:212009;191:21--55
• 139 D-negative Schwangere• 94 richtig D-positv• 2 Exon 4/5 neg. Exon 10 pos.
– 1x paternales Pseudogen– 1x paternale RHD Variante
• 3 „inconclusive“ (4 Replikate, 3 Exons)• 40 richtig D-negativ
– 24 männlich– 16 SRY negativ (11.5 % D-neg. weibliche Feten)
• 16 hypermethyliertes RASSF1A nachgewiesen
12
ÖGBT 2011 13.10.11
WHO Reference Reagent RHD/SRY Plasma DNA
sensitivity standard NIBSC code: 07/222
1414131111 178 15 17
13 7 9 1912 7 8 18
16 12 4 6 1816 9 2 6 1510 4 1 3 5
10 3 1 2 5 19
No +ve neat 1 in 2 1 in 4 1 in 8 1in 16 1in 32
Anforderung: 1:2
ÖGBT 2011 13.10.11
44thth ISBT WorkshopISBT WorkshopDaniels G et al.Daniels G et al. VoxVox Sang 2011 (Sang 2011 (EpubEpub aheadahead ofof printprint))
• 24 von 25 Laboratorien richtig D-positiv• 20 von 21 Laboratorien richtig D-negativ• Kontrollen
– 18 von 24 Y-Chromosom– 5 RASSF1A– 3 Ins/Del Polymorphismen– 2 Multiples SNPs– 19 von 24 Referenz DNA
13
ÖGBT 2011 13.10.11
44thth ISBT WorkshopISBT WorkshopDaniels G et al.Daniels G et al. VoxVox Sang 2011 (Sang 2011 (EpubEpub aheadahead ofof printprint))
ÖGBT 2011 13.10.11
153
147
n
100%
100%
Genauigkeit
RhE
RhCc
NIPDNIPD ffüürr fetalesfetales RhCRhC,, RhcRhc, und, und RhERhE(Geifman(Geifman--Holtzman O, et al. BJOG 2009;116:144Holtzman O, et al. BJOG 2009;116:144--151)151)
Metaanalyse: Legler 2002, Hromadnikova 2005, Finning 2007
14
ÖGBT 2011 13.10.11
100
87
46
n
>99%
>99%
>98%
Genauigkeit
>99%>95%RhE
>97%>98%Rhc
>97%>93%RhC
SpezifitätSensitivität
NIPDNIPD ffüürr fetalesfetales RhCRhC,, RhcRhc, und, und RhERhEGutensohn K et al. BJOG. 2010 117:722Gutensohn K et al. BJOG. 2010 117:722--99
• Chemagic MSM1• Primer/Sonde nach Finning et al. Transfusion 2007; 47:2126-2133• 12.-28.Schwangerschaftswoche, Median 16. SSW
ÖGBT 2011 13.10.11
>97%>93%>94%30Scheffer et. al 2011real-time PCR PNA
32
70
n
94%
98%
Genauigkeit
>95%85%Li et al. 2008MALDI-TOF
>98%96%Finning et. al. 2007real-time PCR, LNA
SpezifitätSensitivität
NIPDNIPD ffüürr KellKell
15
ÖGBT 2011 13.10.11
HPAHPA--11Scheffer et al. BJOG 2011;118:1392Scheffer et al. BJOG 2011;118:1392--55
12.-39. SSW (Median 32), n=34, Msp1-Verdau
ÖGBT 2011 13.10.11
ZusammenfassungZusammenfassung• Vorläufig ab 9. SSW, endgültig ab 12. SSW
• NIPD Monovetten
• NIPD Extraktionsverfahren
• NIPD Amplifikation/Detektion
• NIPD fetale Kontrollen
• Kein NIPD CE-IVD Verfahren
16
ÖGBT 2011 13.10.11
DanksagungenDanksagungen
Sina MüllerSibylle DammeBritta SeverittMichael Köhler†Kirsten ThomannIris BartelsWolfgang EngelGünther EmonsWerner Stein
Kai Gutensohn
SAFE Partner: Ellen van der Schoot, SinuheHahn, Kirsten Finning, Geoff Daniels, NeilAvent ....
Susan Gammon, Dirk van den Boom: Sequenom
Abteilung Transfusionsmedizin
Institut für Humangenetik
Abteilung für Gynäkologie und Geburtshilfe
Endokrinologikum Hamburg
Europäische Kommission SAFE-NoE (LSHB-CT-2004 503243)für die finanzielle Unterstützung
ÖGBT 2011 13.10.11Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!
Recommended