NOMBRE DEL PROYECTO Determinación de parámetros

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NOMBRE DEL PROYECTO

Determinación de parámetros hematológicos, inmunológicos y mecanismos involucrados en las respuestas del hospedero

a infecciones prevalentes y co-infecciones

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Introducción• En la línea de investigación del proyecto FIE “Respuesta del huésped”

las prioridades abordadas fueron:- La determinación de los parámetros fisiológicos de las tres especies

de salmónidos, en agua dulce y mar, a fin de fortalecer el diagnósticoclínico de enfermedades endémicas y emergentes, con especialreferencia a SRS y BKD

- Aportar al conocimiento de los mecanismos implicados en larespuesta inmune de los salmones a las enfermedades SRS y BKD

- Iniciar el estudio de las infecciones múltiples o co-infecciones eidentificar las respuestas del hospedero a PRV-IPN, PRV-SRS y otrosagentes.

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ObjetivosI. General

• Determinación de parámetros hematológicos, inmunológicos y mecanismos involucrados en las respuestas del hospedero a infecciones prevalentes y co-infecciones

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ObjetivosII. EspecíficosA. Líneas base respecto de variables fisiológicas de salmónidos de

cultivo:1. Determinar valores de referencia de hematología, bioquímica sanguínea,

endocrinología y gasometría sanguínea en smolt, post-smolt y reproductores de las tres especies salmonídeas cultivadas en Chile

2. Determinar cambios en la hematología y bioquímica sanguínea de las tres especies en estadios de desarrollo en agua dulce y mar enfrentados a P. salmonis y R. salmoninarum

3. Confección de Manual de Patología Clínica de Peces Salmónidos

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ObjetivosII. EspecíficosB. Dinámica de la respuesta inmune:4. Establecer parámetros de la respuesta inmune en salmón del Atlántico y salmón coho desafiado con P. salmonis y R. salmoninarum5. Caracterizar factores inmunológicos asociados a la sobrevivencia a la infección con P. salmonis y R. salmoninarum en salmón del Atlántico6. Caracterizar la respuesta inmunológica de S. salar y O. mykiss asociada a la infestación de Caligus sp.

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Objetivos

II. Específicos

C. Mecanismos de Co - infección7. Identificación de las respuestas del hospedero a múltiples patógenos:Determinación de co-infección en salmón del Atlántico de PRV-SRS, PRV- IPN y otros agentes

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Resultados

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• OBJETIVO-ACTIVIDAD 1: Determinación de Intervalos deReferencia (IRs) para parámetros hematológicos,bioquímica sanguínea, endocrinología y gasometríasanguínea en pre-smolt, smolt, adultos y reproductoresde las tres especies salmonídeas cultivadas en Chile.

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Objetivo específico 1: resultados

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Tabla 1. Número de individuos muestreados a la fecha para cada especie y etapa de desarrollo.

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IRs gasometría sanguínea

Pre smolt-smolt

Post smolt ReproductorPre smolt-

smoltPost smolt-

AdultoReproductor Smolt Post smolt Reproductor

pH 7,03 - 7,45 7,21 - 7,54 7,13 - 7,46 7,02 - 7,56 7,24 - 7,64 7,28 - 7,54 7,17 - 7,47

pCO2 mmHg 14,0 - 24,8 12,0 - 29,8 11,6 - 29,5 11,7 - 20,6 11,2 - 21,9 7,8 - 17,1 16,0 - 25,8

HCO-3 mmol/L 4,9 - 14,2 8,4 - 21,4 8,7 - 14,4 6,7 - 10,5 8,3 - 13,6 5,3 - 9,8 12,6 - 16,7

TCO2 mmol/L 5,3 - 14,9 9,1 - 23,2 9,5 - 15,1 7,9 - 11,6 8,8 - 14,3 5,6 - 10,3 14,0 - 18,3

Beb mmol/L 24,3 - 9,7 18,8 - 6,5 20,4 - 9,8 26 - 15,6 18,4 - 9,4 21,8 - 14,5 11,6 - 18,8

BEecf mmol/L 26,2 - 10,3 20,4 - 6,5 20,3 - 10,2 28,2 - 17,0 18,3 - 8,4 21,0 - 13,8 12,1 - 19,1

Parámetro UnidadTrucha arcoíris Salmón del Atlántico Salmón Coho

Tabla 2. Intervalos de referencia de gases sanguíneos para las tres especies salmónidas.

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IRs endocrinología

Pre smolt-smolt

Post smolt-Adulto

ReproductorPre smolt-

smoltPost smolt-

AdultoReproductor

Pre smolt-smolt

Post smolt-Adulto

Reproductor

Cortisol ng/mL 8,1 - 98,2 7,0 - 116,6 8,4 - 411,4 2,2 - 102,4 0,4 - 212,6 9,2 - 241,5 37,9 - 162,3 0,8 - 232,6 18,0 -379,7

TSH µLU/L <0,4 * * * <0,02 <0,1 <0,2 < 0,1 *

T3 nmol/L 0,7 - 28,5 * 1,8 - 47.8 11,5 - 22,2 24,2 -62,2 3,3 - 88,8 3,7 - 17,3 1,9 - 22,0 4,9 - 76,5

T4 tota l nmol/L 5,2 - 11,2 * 5,8 - 72,5 7,0 - 85,4 5,1 -24,5 3,6 - 38,7 * - *

Testosterona ng/mL 0,01 - 0,3 * 0,04 - 8,4 * * * <2,0 <1,8 *

Progesterona a ng/mL - - 0,04 - 0,4 - - <0,3 - - 0,1 - 1,8

Estradiol ng/mL <0,13 * 0,1 - 118 * * 0,03 - 1,3 * * 0,1 - 24,5

Prolactina b µLU/L * - * * - <4,9 <12,8 - *

ACTH µLU/L <7,8 * * * * <2,7 <3,5 * 119,7 - 165,8 l d l h d

Parámetro UnidadTrucha Arcoíris Salmón del Atlántico Salmón Coho

Tabla 3. Intervalos de referencia de parámetros hormonales para las tres especies salmónidas.

TSH: Hormona tiroestimulante; T3: triyodotironina; T4: tiroxina total; ACTH: hormona adrenocorticotrópica; *: Resultados bajo el límite de detección de la técnica en equipo Cobas®e411.

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IRs hematologíaTabla 4. Intervalos de referencia de parámetros hematológicos

para las tres especies salmónidas.

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IRs bioquímica sanguínea

Objetivo específico 3: resultados

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Objetivo específico 3: resultados

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• CAP I Generalidades Patología Clínica

– Herramienta apoyo diagnóstico, se realizan pruebas de laboratorio en la sangre

– Evaluar condición fisiológica, pronóstico, monitoreo, diagnóstico en una población de peces

Punciónvena caudal

• CAP II Obtención Muestra de Sangre

Objetivo específico 3: resultados

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• CAP III Técnicas Hematológicas– Hemograma

• Eritrocitos• Leucocitos • Trombocitos

K

L

O

Eritrocitos

LinfocitoHeterofilo

Trombocito

Monocito

Objetivo específico 3: resultados

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• CAP IV Interpretación de Resultados Hematológicos– Respuestas asociadas a:

• Eritrocitos• Leucocitos• Trombocitos

Presencia de trauma, parásitos, deficiencia de vitamina K y

septicemia, P. salmonis, ISAV, deficiencia vitaminas, intoxicación

amoníaco:ANEMIA

Objetivo específico 3: resultados

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• CAP V Técnicas en Bioquímica Clínica– Medición de:

• Actividad de enzimas en la sangre• Concentración de substratos en la sangre

Técnica de Espectrofotometría

Objetivo específico 3: resultados

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• CAP VI Interpretación de Resultados Bioquímicos – Permiten:

• Evaluación electrolítica• Evaluación del epitelio branquial• Evaluación del hígado y muscular Lesión de tejido branquial:

Desequilibrios electrolíticos y aumentos en las concentraciones de amoníaco y

urea en la sangre

Objetivo específico 3: resultados

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• CAP VII Técnicas en Gasometría Sanguínea– Medición de:

• Gases en la sangre CO2, O2, HCO3, pH

Equipo de gasometría

Sangre arterial y venosa

Objetivo específico 3: resultados

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• CAP VIII Interpretación Resultados de Gasometría Sanguínea– Detectan disturbios ácido-básicos en la sangre:

• Acidosis y alcalosis respiratoria• Acidosis y alcalosis metabólica

El estrés, lesiones branquiales, alta densidad:

Desequilibrios ácido-básicos en la sangre

Objetivo específico 3: resultados

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• CAP IX y X Determinación e Interpretación de Resultados de Hormonas– Técnicas de Medición de hormonas (técnicas inmunoquímicas o inmunoensayos– Sirven para evaluar:

• Osmorregulación• Respuesta al estrés• Maduración y Reproducción

Captura, alta densidad, manipulación, ejercicio intenso,

incorporación de tóxicos, cambios en la salinidad, pH, temperatura: Estrés con aumento de cortisol y

ACTH

Objetivo específico 3: resultados

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• CAP XI Intervalos de Referencia – Hematología y bioquímica clínica, gasometría sanguínea y hormonas en smolt,

post-smolt y reproductores de las tres especies de salmónidos cultivadas en Chile

OBJETIVO-ACTIVIDAD 4A: Parámetros de respuesta inmune ensalmón del Atlántico desafiado con los aislados LF-89 y EM-90de P. salmonis mediante RT-qPCR.

OBJETIVO-ACTIVIDAD 4B: Perfil transcriptómico de la respuestainmune en salmón del Atlántico desafiados mediantecohabitación con P. salmonis mediante RNA-Seq.

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Objetivo específico 4A: resultados

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Desafío por cohabitación con P. salmonis

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Objetivo específico 4A: resultados

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Resumen esquemático de resultados

Macrophage

IL-12IL-15IL-18

IFN-𝛄𝛄

T-betEomes

Macrophage activationInflammation

Killing of infected cells

Cell-mediatedimmunity

TNFα, IL-1β, IL-8

P. salmonis activa respuesta inmune innata e induce respuesta inflamatoria, pero comprometiendo respuesta inmune adaptativa

Objetivo específico 4B: resultados

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Muestreo día 5 p.i. Troyanos y día 35 p.i. cohabitantes

Día 5

Día 5

Día 5

Día 5

Día 35

Día 35

Día 35

Día 35

Objetivo específico 4B: resultados

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Número de genes diferencialmente expresados en diferentes grupos (p>.05)

Objetivo específico 4B: resultados

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Número de genes diferencialmente expresados en diferentes grupos (p>.05)

1. Reconocimiento de antígenos/patógenos2. Mediadores pro-inflamatorios3. Respuesta estrés oxidativo4. Inmunidad adaptativa5. Citoesqueleto, interacción celular y transducción señal6. Lisosomas, fagosomas, endosomas, autofagia7. Progresión ciclo celular, proliferación celular y apoptosis

Categorías

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Innate responseIFN-y, TNFa, IL1, IL8

CXCL7, CXCL9, CXCL10, CXCL12

Reconocimiento de antígenos/patógenos mediante TLR5 y DC-SIGN

Mediadores pro-inflamatorios mediante activación de NF-kB

1 2

Reducida eficiencia de Inmunidad adaptativa

3

CD37CD276

CD22Ms4a8Sppl2aCadenas

livianas IgIgM

Humoral Celular

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Reorganización del citoesqueleto estado GTPasa inactivo y endocitosis mediada por clatrina

4

Lisosomas, fagosomas, endosomas, autofagia reducción de tráfico de vesículas y endosomas, reducción eficiencia proteolítica de catepsinas, escape de vía vacuolas-endosomas.

5

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Promoción del ciclo celular, proliferación celular e inhibición de apoptosis6

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Objetivo-Actividad 5B. Informe que contenga el/los perfiles de respuesta inmune y de estrés a nivel transcriptómico en peces desafiados con Renibacterium salmoninarum

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1. Los perfiles de respuesta a estrés anivel de la transcripción serelaciona a un perfil transcripcionalasociado a una respuestainmunosupresiva. En este sentido,la expresión de NFκB se vedisminuida en el inicio de lainfección y el aumento de laexpresión de IκBα durante todo elperiodo de infección se asocia auna situación anti-inflamatoria.

Objetivo específico 5: resultados

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1. El análisis del perfil de expresión deinmunoglobulinas IgT e IgM, sugiere quela respuesta inmune adquirida humoralcontra R. salmoninarum estaríadisminuida durante la infecciónbacteriana.

2. Se observan aumentos del mRNA de IL-12, IL-1β y TNFα (10 dpi). Esta respuestase ve disminuida hasta valores basales alos 20 y 28 dpi.

Objetivo específico 5: resultados

OBJETIVO-ACTIVIDAD 6A: Efecto de la infestaciónpor Caligus rogercresseyi sobre los niveles deexpresión transcripcional de marcadores derespuesta inmune en salmón del Atlántico (Salmosalar) y trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) encondiciones experimentales.

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Figura. Efecto de la infestación por C. rogercresseyi sobre los niveles de expresiónde RNAm de IL-1β (A), TNF-α (B), IL-10 (C), IL-12 (D) e IL-6 (E) en músculo/piel desalmón del Atlántico y trucha arcoíris. c/c, salmónidos infestados con Caligus; s/c,sin infestación. p < 0,001 (***); p < 0,05 (*).

− Se observa una fuerte respuesta inmunológica a nivel de piel/músculo en

peces infestados con Caligus asociada a la expresión de estas 5 citoquinas

analizadas.

− Para todas las citoquinas analizadas, los aumentos de expresión son

similares y significativas tanto para salmón del Atlántico y trucha a nivel de

piel/músculo, a excepción de TNF-α y IL-6, que presentaron mayores

niveles de expresión en salmón del Atlántico y trucha, respectivamente.

− Los tejidos analizados corresponden a tejido sano, por tanto, se estima

que estos niveles de expresión reflejan una respuesta más bien sistémica

que local.

• OBJETIVO-ACTIVIDAD 6A. Informe que contenga al menos,el/los perfiles de respuesta inmune a nivel transcriptómicoque abarca la inmunidad innata y adquirida, asociados a lasobrevivencia de S. salar a la infección con P. salmonis.

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Objetivo específico 6A: resultados

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1. El perfil obtenido corresponde alos peces sobrevivientes a infecciónexp. con P. salmonis. Se relaciona aun perfil transcripcional asociado auna respuesta a estrés, lo cual se vereflejado en el aumento del mRNAde GR1 y la disminución del mRNAde GR2.

2. Si bien la respuesta inflamatoriamediada por NFκB está presente,ésta estaría modulada por elaumento de la expresión de IκBα

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1. El análisis del perfil de expresión deinmunoglobulinas IgT e IgM, sugiere que larespuesta inmune adquirida humoral contra P.salmonis, estaría asociada principalmente a laexpresión de IgT en riñón anterior de S. salar.

2. A nivel de citoquinas proinflamatorias, seobserva la disminución del transcrito de IL-12.En el caso de IL-1β, IL-8, TNFα y CD8, susrespectivos mRNAs experimentan un aumentode la expresión, sugiriendo a estas citoquinascomo relevantes para la sobrevida de los pecesinfectados con la bacteria.

Objetivo específico 6A: resultados

OBJETIVO-ACTIVIDAD 6.B. Informe que contenga al menos,el/los perfiles de respuesta inmune a nivel transcriptómico queabarca la inmunidad innata y adquirida, asociados a lasobrevivencia de S. salar a la infección con R. salmoninarum.

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t0 GR1 GR2 NFκΒ IκΒα IgM IgT IL-1β IL-12 TNFα IL-100.00.51.01.52.0

2468

10

50100150200250

**

*

*****

****

**

Genes

Vece

s de

cam

bio

1. De acuerdo a los resultados, los pecessobrevivientes a la infección con R.salmoninarum mostraron una condicióninmune con una fuerte señal anti-inflamatoria,asociado a una alta expresión de IκBα

2. En el caso de IgM e IgT, no existen cambiossignificativos de la expresión de estos mRNAs,lo cual sería una característica importante aconsiderar, para determinar los niveles séricosde estas inmunoglobulinas.

3. Finalmente, peces sobrevivientes mantendríanmecanismos involucradas en la eliminación ycontrol de la proliferación de patógenosintracelulares.

• OBJETIVO-ACTIVIDAD 7. Informe que contenga al menos, el/losperfiles de respuesta inmune a nivel transcriptómico que abarcatanto la inmunidad innata, adquirida y estrés, asociados a la co-infección de S. salar con PRV-ASCV (Piscine OrthoReovirus -Atlantic Salmon Calicivirus), PRV-IPNV (Virus de la NecrosisPancreática Infecciosa) y PRV-Psalmonis.

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Objetivo específico 7: resultados

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1. De acuerdo a los resultados obtenidos,no se distingue un perfil de expresióndiferencial clásico de los genes GR1, GR2,NFκB, IκBα, asociado a una respuesta aestrés, en los especímenes analizados eneste estudio.

2. Asimismo, se puede concluir que lasinfecciones virales y co-infeccionespresentan un aumento de la expresión deIgM, y que el caso de IgT, su expresiónestaría ligada a la presencia de P.salmonis en la co-infección con PRV.

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1. De igual forma, existe una inducciónsignificativa de los marcadores celulares deinmunidad CD8 en peces co-infectados conPRV-ASCV y PRV-Psalmonis, lo cual estaríarelacionado con la modulación de linfocitos TCD8+, asociados a actividad citotóxica contrapatógenos intracelulares.

2. A su vez, en el grupo de peces co-infectados,la inducción de IFN-II sugiere su relación con laactividad citotóxica de células NK y células TCD8+, lo cual está asociado con la eliminaciónde patógenos intracelulares de peces.

Conclusiones- Los parámetros hematológicos HCT, RGB, RGR y RPL podrían ser indicadores

tempranos de la infección por P. salmonis en salmón del Atlántico.

- Los parámetros validados previamente durante la infección con P. salmonis en condiciones controladas (PTO, ALB, ALT, AST, CRE), fueron confirmados con el estudio de campo y podrían ser complementados con LIP, TRG y ALP.

- P. salmonis fue detectada en branquias de ambos grupos de peces cohabitantes a los 21 dpi, confirmando a las branquias como principal vía de ingreso.

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Conclusiones- La patogénesis de peces infectados con PS-LF-89 y PS-EM-90 fue diferente. Los peces

infectados con PS-EM-90 mostraron mortalidad acumulada más alta y menor tiempo a la muerte que los peces PS-LF-89.

- Las lesiones tisulares tempranas determinaron la alteración de la funcionalidad renal (CRE, PTO, ALB) y hepática (ALT, AST, PTO, ALB).

- P. salmonis fue detectada en branquias de ambos grupos de peces cohabitantes a los 21 dpi, confirmando a las branquias como principal vía de ingreso.

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Conclusiones- A nivel transcriptómico, P. salmonis manipula la cinética de la producción de

citoquinas, el cual constituiría un mecanismo de virulencia para promover su replicación intracelular.

- La estrategia involucraría la inducción de la respuesta inmune innata, pero la inhibición de la respuesta adaptativa (humoral y mediada por células)

- La respuesta fue significativamente más exacerbada en peces infectados con PS-EM-90, probablemente asociada con mayor patogenicidad.

- La respuesta inflamatoria exacerbada incrementaría la susceptibilidad de los peces, determinando altas cargas bacterianas, severas lesiones patológicas y baja tasa de sobrevivencia.

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Conclusiones- No se distingue un perfil de expresión diferencial clásico de los genes GR1, GR2,

NFκB, IκBα, asociado a una respuesta a estrés en co-infecciones.

- Las infecciones virales y co-infecciones presentan un aumento de la expresión deIgM, y que el caso de IgT, su expresión estaría ligada a la presencia de P. salmonisen la co-infección con PRV.

- Existe una inducción significativa de los marcadores celulares de inmunidad CD8 enpeces co-infectados con PRV-ASCV y PRV-Psalmonis, lo cual estaría relacionado conla modulación de linfocitos T CD8+, asociados a actividad citotóxica contrapatógenos intracelulares.

- La inducción de IFN-II sugiere su relación con la actividad citotóxica de células NK ycélulas T CD8+, lo cual está asociado con la eliminación de patógenos intracelularesde peces. 55

Integración de los resultados

Independiente del aislado, P. salmonis implementa unaestrategia de evasión del sistema inmune adaptativo delos peces, mantiene la viabilidad de las células delhospedero para incrementar su replicación intracelular ypersistencia en el sitio de infección, facilitando laprogresión crónica de la infección…

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Alcances/Impacto/Proyecciones de los resultados

• Respuestas del hospedador, línea base: necesario profundizar en resultados relevantes

• Aplicaciones a la evaluación de biológicos, dietas, genética…. y estrategias de prevención y control.

• Desafío por cohabitación R. salmoninarum

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Equipo del proyecto• Dr. Ricardo Enriquez• Dr. Alex Romero• Dra. Ananda Müller• Dr. Pedro Bittencourt• Dra. Isabel Aguirre• MV Vania Quinteros• TM Mónica Monrás• Bioq Augusto Vargas• Sr. Esteban Henriquez

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• Dr. Marco Rozas• Dra. Andrea Peña• Dr. (c) Ricardo Ildefonso• MV MSc Romina Walker• MV Arturo Riquelme• Biol Mar Carolina Senn• Tec Alim Darling Coñuecar• TecVet Lucerina Maldonado• TecAcuic Soraya Barrientos

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Agradecimientos:

¡GRACIAS!

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