Nuevas perspectivas en el diagnostico de Clostridium...

Nuevas perspectivas en el diagnóstico de

Clostridium difficile

Evelyn Rodríguez Cavallini

Pruebas diagnósticas

Detectan productos

de C. difficile

•GDH (glutamatodeshidrogenasa)

•Toxinas A y/o B

Métodos de cultivo

• para detección de CD y confirmar cultivo toxigénico

Detección de genes o deleciones

• RNA 16 S, genes de toxinas, genes GDH, tpi, tcdC

Detección Prueba utilizada

Toxinas Cultivo celular

Inmunoensayo

PCR

C. difficile Cultivo

PCR

Variantes de

C.difficile

PCR: deleción en tcdC

y toxina binaria

Tipificación

Inmunoensayos o inmunocromatografías

Los que detectan toxinas A y B: muy baja sensibilidad (desde 50% a 85%)

Si se incluye GDH: hasta 83-90% de sensibilidad

Estrategia!!!! Evaluar costos

GDH a las muestras sospechosas

Toxinas A y B solo a las muestras positivas por GDH.

RIDA®QUICK Clostridium difficile Toxin A/B

Es una inmunocromatografía

Emplea anticuerpos contra toxinas A y B marcados con biotina y oro

Si hay reacción AgAc hay migración del complejo y unión con estreptavidina

Si no hay reacción AgAc los Ac marcados con oro impiden la migración

Técnicas moleculares

Altamente específicas y sensibles

Caras, equipo especial

Detectan el gen y no las toxinas

Algunos detectan deleciones en tcdC

Agunos detectan genes de resistencia a quinolonas

Requieren de entrenamiento de variable complejidad

PCR tradicional, CR.

Extracción de ADN

Verificación de ARNr16S

Detección de genes tpi, tcdA,

tcdB, tcdC y ctdB

Multiplex 1: tcdA, tcdB y ctdB

Multiplex 2: tpi, tcdC

RIDA®GENE CD Toxin A/B PCR tiempo real

•Solo detecta genes para toxina A y B

Utiliza fluorocromos

Requiere equipo de PCR RT

•Diferentes ciclos según el equipo

No incluye los reactivos de extracción de ADN

•Señalan marcas específicas

Requiere equipo revelador

Additional equipment and materials required

DNA-Extraction kit for stool samples or DNA-Extraction system

for stool samples

Real-time PCR Instrument:

QIAGEN: Rotor-Gene Q

RIDA®GENE Color Compensation II

Real-time PCR consumables (plates, tubes, foil)

Centrifuge with a rotor for the reaction vials

-Vortexer

-Pipettes (0.5 – 20 µl, 20 – 200 µl, 100 – 1000 µl)

-Filter tips

-Powder-free disposal gloves

Caro,limitado

Gene-Xpert, de Cepheid, PCR tiempo real

Gene-Xpert-C.difficile

PCR- Tiempo Real

deteta C. difficile y C. difficile NAP1/027

• toxB, deleción, tox binaria

Resultados en una hora

De uso en dos hospitales

nacionales en Costa Rica

Caro, $90 por cartucho + equipo

Solo para grandes volúmenes de

muestras

Buena correlación con los pulsotipos, hasta el momento

Although Xpert can provide rapid laboratory diagnosis of C. difficile and

presumptive 027/NAP1/BI identification in stool within 45 min it is

suggested that positive results be confirmed by formal typing of

cultures. A North American study recently reported five stool samples in

which 027/NAP1/BI was identified by Xpert but not confirmed by two or

more typing methods (PCR ribotyping, pulsed-field gel electrophoresis

[PFGE], and/or restriction endonuclease analysis [REA])

Genotype C.diff. (PCR isotérmico)

para C. difficile

tpi

para toxigenicidad de la muestra o del

aislamiento

tcdA

tcdB

Para NAP1/027

cdtA/cdtB de tox binaria

tres tipos de deleción en tcdC

mutación en gyrA

Procedimiento

Extracción de ADN

Amplificación multiplex con

primers marcados con biotina

Hibridación reversa en

membranas recubiertas con

sondas específicas

complementarias a los ADN

amplificados

No incluye reactivos de extracción, ni taq polimerasa.

No requiere equipo de PCR.

De díficil interpretación!!!!

Muy caro. No hay estudios evaluativos

AmpliVue (Quidel molecular)

• Amplificación isotérmica llamada amplificación dependiente de helicasa (HDA)

Detección de C. difficile directamente

en la muestra

• Por tratamiento térmico Tampón de lisis para

muestras

•Región conservada de las toxinas

• Sondas marcadas con biotina

Tubo de reacción con primers específcos y

HDA

•Detecta el híbrido sonda-amplicón por conjugación con estreptavidina para la visualización

Cartucho para detección rápida.

C. diff. toxig C. diff. no toxig No interpretable

La línea C es un

control de

amplificación

$780, en CR Fácil

Excelente especificidad y

sensibilidad

Importa menos el almacenamiento de la muestra porque no detecta las toxinas

Solo reconce C difficile toxigénico

¿Es imprescindible usar técnicas moleculares?

103 hospitales en España-

2011

95% utiliza EIA

10% EIA y cultivo

16% cultivo celular

Solo 2% PCR

Recomendación

Combinar varios métodos de detección

•GDH

• Toxinas

•Genes

Cultivo

•para estudios epidemiológicos

•De sensibilidad a los antibióticos