View
45
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
PCR A TIEMPO REAL
Mara Maiques R4-Bioqumica Clnica 25-Abril-07
VEAMOSHerramientas para detectar mutaciones Molculas fluorescentes y tecnologa FRET PCR a tiempo real: equipos y mtodos de deteccin Interpretacin de resultados Utilidades de PCR a tiempo real Ventajas y aplicaciones Conclusiones
en RGre SYB
SecuenciacinHib rida ci n
SONDAS ESPECFICAS
COMPONENTES DE LA REACCIN
SONDAS SYBRGreen ESPECFICAS
FLUORESCENCIA
*FLUORESCENCIAEEstado de Mxima Excitacin Estados IntermediosCALOR
Estado Fundamental
Tiempo
E = h/
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)FRET es un proceso por el cual un fluorforo (DONADOR) en estado excitado, transfiere su energa a una molcula prxima (ACEPTOR)
E1= h/1
E3= h/3 E1 > E2 > E3 1 < 2 < 3 E2= h/2
FRET se produce slo si las dos molculas (DONADOR Y ACEPTOR) estn suficientemente juntas, disminuyendo su eficacia al aumentar la distancia entre ellas
MTODOS DETECCIN: sybr-greenSYBR Green I
ELONGACIN Unin inespecfica al DNAds Requiere empleo curvas de melting Emite seal intensa que aumenta proporcionalmente al producto acumulado
ANLISIS DE RESULTADOS
Umbral de deteccin
Ct: primer ciclo de la PCR en el que se detecta producto amplificado Ct es inversamente proporcional a la cantidad de DNA o RNA de partida
en RGre SYB
SecuenciacinHib rida ci n
SONDAS ESPECFICAS
COMPONENTES DE LA REACCIN
Sondas especficas
MTODOS DETECCIN: sondas FRETFluorescein LC Red
ANNEALING Hibridacin de sondas especficas, marcadas con 2 fluorocromos (donador y aceptor) Su aproximacin disminuye la fluorescencia emitida x el donador (FRET)
MTODOS DETECCIN:
sondas de hidrlisis (TAQMAN)
Sondas especficas con un fluorocromo en cada extremo (Reporter y Quencher) Apantallamiento cuando la sonda est intacta
ELONGACIN
INSTRUMENTACIN
ANLISIS DE RESULTADOS
Umbral de deteccin
Ct: primer ciclo de la PCR en el que se detecta producto amplificado Ct es inversamente proporcional a la cantidad de DNA o RNA de partida
en RGre SYB
SecuenciacinHib rida ci n
SONDAS ESPECFICAS
DISCRIMINACIN ALLICA
Alelo normal o wild-type
Alelo mutante
DISCRIMINACIN ALLICA
WILD-TYPE HETEROCIGOTO
HOMOCIGOTO
UTILIDADES DE LA PCRtrDeteccin de mutaciones, discriminacin allica Cuantificacin - absoluta (patrn de diluciones estndar) - relativa (respecto a un control) Caracterizacin de productos de PCR
UTILIDADES DE LA PCRtrDeteccin de mutaciones, discriminacin allica CuantificacinGENES DE REFERENCIA
- absoluta (patrn de diluciones estndar) - relativa (respecto a un control) Caracterizacin de productos de PCR
UTILIDADES DE LA PCRtrGene -actin -actin GAPDH 5.8S,18S, 28S RNA 2-microglobulin G6PDH PBGD aldolase HPRT U3, U8, ... ornithin decarboxylase ... Genomic structure / pseudogenes multigene family; > 20 genes; 1 active locus 20 pseudogenes multigene family; pseudogenes multigene family; 10-30 genes; > 200 in mouse mostly pseudogenes pseudogenes no pseudogenes no pseudogenes Regulation e.g. : hormones of tyroid gland : stomach tumor : lung, pancreatic, colon cancer : insulin, EGF
Deteccin de mutaciones, discriminacin allica no pseudogenes SHpseudogenes pseudogenes Pseudogenes
O
SE U
EE K
NG PI
: Non-Hodgkin lymhoma abnormal expression in tumors : kidney, stomach tumor : hormones, oxidant stress, growth factors
G
NE E
: tumors
Cuantificacin absoluta
UTILIDADES DE LA PCRtrDeteccin de mutaciones, discriminacin allica Cuantificacin - absoluta (patrn de diluciones estndar) - relativa (respecto a un control) Caracterizacin de productos de PCR
Cuantificacin relativaGe n Re fe re ncia 8 6 4 2 0 0 10 20 30 Log ng RNA y = -1,0365x + 28,82 R = 0,99362
Gen Diana8 6 4 2 0 0 Log ng RNA 20 40 y = -0,7147x + 27,213 2 R = 0,9852
MUESTRAS Cerebro
C t
Ct GD 28.36
Ct GR 15.22
ng GD 0.84
ng GR 589
GD/GR 1.43* 10-3
C t
Ratio 1
Msculo Hgado Rin
32.33 20.71 24.58
15.74 15.12 15.15
0.13 33.11 5.13
302 661 646
4.17*10-4 5.01*10-2 7.94 * 10-3
0.29 35.08 5.56
UTILIDADES DE LA PCRtrDeteccin de mutaciones, discriminacin allica Cuantificacin - absoluta (patrn de diluciones estndar) - relativa (respecto a un control) Caracterizacin de productos de PCR
Caracterizacin de productos de PCRCada producto de PCR se caracteriza por su Tm (T a la que el 50% del DNA est en forma de cadena sencilla) Diferentes DNA tienen distintas Tm y productos no especficos Amplificacin como dmeros DNA-primers tambin. Deteccin con SYBRGREENLa Tm vara con:
GCLa Tm depende de:
41 C 10 C
GC 10,000 pb
50 pb
Identificacin del producto sales, MgCl , Sybr-green Concentracin de 2 Grado de homologa entre la sonda y el DNA
VENTAJAS DE LA PCRrtAmplificacin especfica Automatizacin y disminucin del tiempo de anlisis Reaccin monitorizada a tiempo real No procesamiento post-PCR: no contaminacin Ciclos de amplificacin rpidos (
Recommended