PCR

PCRReaccion en cadena de la

polimerasa

Integrantes: Bárbara Avello

Paulina Campos

Profesor Guía: Isabel Castro

Universidad de ChileFacultad de MedicinaEscuela de Tecnología MédicaBioquímica II

Un poco de historia…

Técnica desarrollada en 1985 por el Bioquímico Estadounidense Kary B. Mullis quien recibió el premio Nobel de Química de 1993.

Esta tecnica resultó ser una revolución en la investigación biológica y médica.

Definición de PCR

Reacción en Cadena de la Polimerasa

Técnica de Biología Molecular que tiene por objetivo la amplificación directa de un gen (o fragmento de DNA) o indirecta de un RNA, presente en mezclas de muy diversas fuentes.

* No es necesaria una purificación previa de la muestra íntegra original.

Tiene la capacidad de amplificar millones de veces fragmentos pequeños de DNA de hasta 10 Kb (10.000 pares de bases), en un período de tiempo relativamente corto.

Es un método muy adecuado para preparar ácidos nucleicos en una cantidad muy superior a la de la muestra original.

Objetivo básico de la PCR

AMPLIFICAR DNA

AMPLIFICACION Para disponer de

cantidad suficiente como para utilizarlo con

fines diversos.

DETECCIONPara poderlo detectar

en muestras con pequeñas cantidades

del DNA diana.

Fundamentos

Mimetiza el proceso de replicación

Complementariedad BN

Capacidad del DNA para desnaturalizarse/ renaturalizarse

Requerimientos1.- Muestra (templado o molde: DNA o cDNA)

2.- Primers

3.- DNA polimerasa resistente a alta temperatura

4.- Mg++

5.- Desoxinucleótidos trifosfatos – dNTPs (dATP, dGTP,dCTP, dTTP)

6.- Buffer, KCl

1.- Templado o Molde Molécula que contiene la región de DNA que se

quiere amplificar.

Puede ser DNA o cDNA.

Se requiere poca cantidad.

No debe ser necesariamente puro.

Tiene que ser libre de altas concentraciones de EDTA o cationes que pueden actuar como quelantes.

2.-Primers (iniciadores, partidores o cebadores)

2 oligonucleótidos sintéticos que flanquean a la región blanco, uniéndose por complementariedad de bases a cada uno de los extremos del fragmento de DNA que se quiere amplificar.

Primer sentido Primer antisentido

Deben ser específicos para la secuencia a amplificar.

Deben tener idealmente un alto % de C+G, entre un 40-60%.

Deben evitar ser complementarios entre si, especialmente en el extremo 3´.

Deben evitar formar estructuras secundarias.

Generalmente su longitud debe variar entre 18 y 30 pb.

La concentracion debe ser adecuada para favorecer la hibridacion entre el molde y el primer.

Ambos primers deben tener una Tm (temperatura de melting) similar,con una diferencia de no mas de 5ºC.

Tm = [2 x (A + T) + 4 x (G + C)] – 5

La temperatura de annealing o de hibridacion (Ta) debe ser aprox. 5ºC menos que los valores de Tm obtenidos.

3.- DNA polimerasa

Características que debe tener la enzima:

PROCESIVIDAD

FIDELIDAD

TERMOESTABLE

Taq DNA polimerasa Termoestable: -Aislada de Thermus aquaticus (vive en aguas termales).-Comete un error cada 10.000 nucleótidos.-Su temperatura optima de actuación es a 72ºC.-Su concentracion varia entre 1 a 2 unidades de enzima por cada 100µL de reaccion.-No posee la actividad editora o correctora (3` exonucleasa).

Otras DNA polimerasas termoestables, obtenidas de bacterias termófilas:Pwo Pyrococcus woeseiPfu Pyrococcus furiosusTli Thermococcus littoralis

4.- Mg++ (MgCl2, MgSO4)

Mg++ es un cofactor de DNA polimerasas.

Determinar la [Mg++] óptima es uno de los pasos más importantes en la puesta a punto de una PCR.

[Mg++] muy bajas : la polimerasa no funciona correctamente, afectando el rendimiento de la reacción.

[Mg++] muy altas :favorece amplificaciones inespecificas, afectando la especificidad reacción.

5.- Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs)Provee de nucleotidos (base+ azucar +

fosfato) a la reaccion para la sintesis de DNA.

Deben estar presentes en cantidad suficiente para que se logre la extensión a lo largo de todos los ciclos (~200 µM cada dNTP).

No deben estar en exceso para que los iones Mg++ no estén formando complejos con los dNTPs.

6.- Buffer y salesBuffer Mantiene el pH optimo para que la enzima actúe.

El buffer es en general Tris base ajustado a un pH específico con HCl.

pH óptimo para Taq: 8.3

Sales KCl: contribuye al plegamiento correcto de la enzima.

Aditivos adyuvantes

Existen una serie de reactivos que pueden contribuir a la reacción de amplificación.

Formamida y el dimetil-sulfóxido (DMSO)

Glicerol

Equipos: Termociclador Instrumento programado para cambiar

la temperatura de las muestras rápidamente desde una temperatura a otra.

PCR convencional en el laboratorio1.Creación del Primer

2.Extracción de DNA (o RNA)

3. PCR

4. Detección de resultados

1. Creación del primer

Los primer o cebadores (compuestos por oligonucleótidos

específicos) son sintetizados químicamente.

*Para realizar esta labor se utilizan bases de dato universales y programas

computacionales que establecen la secuencia primer para un gen determinado.

2. Extracción de DNA

Se extrae el DNA genómico desde la muestra a analizar

*Para esto existen Kits comerciales que aseguran: Alto rendimiento. Alta pureza. Gran cantidad de DNA

La correcta extracción de DNA o RNA se comprueba mediante la determinación de:

Integridad y concentración aproximada de DNA o RNA (electroforesis en gel de agarosa 1%)

Relación Ác. Nucleicos/Proteínas (ABS a 260/280 con espectrofotometro)

3. PCR y sus etapas

3.1 Desnat

ura-lización

del DNA

3.2 Unión del

iniciador a la

secuencia

complementa-ria

3.3 Elongación de

la cadena

3.1 Desnaturalización del DNA

El DNA molde de doble hebra es desnaturalizado por calor a un t° por encima de su punto de fusión

T° inicial del PCR: 95°C por 5 minT° inicial de cada ciclo: 95°C por 30 seg.

3.2 Alineamiento/unión del iniciador a la secuencia complementaria

Se desciende la t° lo suficiente para que ocurra la hibridación entre los cebadores y el DNA molde.

T° ideal: 65°C por 45 seg.

3.3 Extensión/elongación de las cadenas

La t° es nuevamente aumentada para favorecer la actividad catalítica de la polimerasa la cual se ha unido al extremo del duplex molde-cebador.

T° ideal en cada ciclo: 72°C por 45 seg.T° Final: 72°C por 10 min.

*Amplificación exponencial

4. Detección de resultados

La detección del producto del PCR se realiza normalmente mediante

una electroforesis.

*Electroforesis en gel de agarosa, revelado con rayos UV gracias a la utilización de bromuro de etidio (colorante)

Precauciones

Contaminación con DNA

ControlesControl sin molde.

Control positivo.

Control de primers.

Ventajas

Velocidad

Facilidad

Sensibilidad

Muestras

Aplicaciones PCR

Huella digital genética.Test de paternidad.Detección de enfermedades

hereditarias.Comparación de la expresión génica.Clonamiento de genes.Mutagénesis.Análisis de DNA antiguo.Genotipificacion de polimorfismos

BibliografíaTexto Ilustrado de Biología

Molecular e Ingeniería Genética (Conceptos, Técnicas y Aplicaciones en Ciencias de la Salud), José Luque y Ángel Herráez.

Biología molecular y Biotecnología (2da edición), J.M. Walker y E. B. Gingold. 1997