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PRESENCIA DE ALCALOIDES EN DENDROBATES TRUNCATUS (AMPHIBIA:
DENDROBATIDAE) CRIADAS EN CAUTIVERIO Y ALIMENTADAS
CON HORMIGAS Y MOSCA DE LA FRUTA
Jorge Eduardo Gualdrón Duarte
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar título de
Biólogo
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGIA
Bogotá, D. C.
Noviembre 23 de 2005
2
NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por los alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
4
PRESENCIA DE ALCALOIDES EN DENDROBATES TRUNCATUS (AMPHIBIA:
DENDROBATIDAE) CRIADAS EN CAUTIVERIO Y ALIMENTADAS
CON HORMIGAS Y MOSCA DE LA FRUTA
Jorge Eduardo Gualdrón Duarte
APROBADO
_________________________
Inge Armbrecht, Bióloga Ph.D.
Director
_________________________ _________________________
James Montoya, Biólogo Ph.D. Andrés Acosta, Biólogo B.Sc.
Codirector Codirector
_____________________________ ____________________________
Julio Mario Hoyos, Biólogo Ph. D. Julio Pedrozo, Químico
Jurado Jurado
5
PRESENCIA DE ALCALOIDES EN DENDROBATES TRUNCATUS (AMPHIBIA:
DENDROBATIDAE) CRIADAS EN CAUTIVERIO Y ALIMENTADAS
CON HORMIGAS Y MOSCA DE LA FRUTA
JORGE EDUARDO GUALDRÓN DUARTE
APROBADO
__________________________ ________________________
Ángela Umaña, M.Phil Biología Cecilia Espíndola, M.Sc
Decana Académica Directora de Carrera
8
A mis padres.
9
AGRADECIMIENTOS
Deseo agradecer a todas las personas que de alguna u otra manera me colaboraron
durante todo el proceso del desarrollo de este trabajo, especialmente a los profesores
Inge Armbrecht, James Montoya y Andrés Acosta por su apoyo y guía en la
elaboración de este trabajo.
También un especial agradecimiento a Vladimir Corredor por ser el gestor de realizar
este trabajo y por compartir sus conocimientos y consejos.
A Germán Corredor y la Fundación Zoológica de Cali quienes hicieron posible
realizar los experimentos, a los estudiantes del Laboratorio de Entomología de la
Universidad del Valle por ayudarme en la colecta y la cría en cautiverio de las
hormigas, y a Angela Minas por haberme suministrado las cepas de Drosophila
melanogaster.
A Santiago Castaño y Helberg Asencio del Laboratorio de Biofísica de la
Universidad del Valle por su ayuda en la extracción de los alcaloides y valiosos
comentarios del manuscrito, al Departamento de Química de la Universidad Javeriana
en especial al profesor Jorge Robles por su ayuda en las pruebas químicas para la
detección de alcaloides e interpretación de los resultados.
A Julia Calderón y Luis Ospina por haberme acogido en su casa y brindado una
buena compañía durante mi estancia en Cali.
A mis amigos del Laboratorio de Herpetología de la Universidad Javeriana y otros
laboratorios de la misma universidad por su compañía y colaboración durante todo el
transcurso de la carrera.
10
A mis padres y hermanos por que siempre apoyarme y brindarme ese apoyo
incondicional en todo momento.
Noviembre 23 de 2005
11
RESUMEN
“Presencia de alcaloides en Dendrobates truncatus (Amphibia: Dendrobatidae)
criadas en cautiverio y alimentadas con hormigas y mosca de la fruta”.
En un gran número de ranas neotropicales de la familia Dendrobatidae una amplia
variedad de alcaloides con únicas propiedades fisicoquimicas ha sido encontrada en
sus pieles. Se ha sugerido que el recurso de estos alcaloides viene del medio de la
rana, específicamente de su dieta. El propósito de este trabajo fue establecer la
relación entre el tipo de alimento y la presencia de alcaloides en la piel de
Dendrobates truncatus, manteniendo grupos en cautiverio por ocho semanas
alimentados con Paratrechina steinheili, Wasmannia auropunctata (Formicidae) o
Drosophila melanogaster (Drosophilidae). D. truncatus mostró una selección positiva
para D. melanogaster y W.auropunctata, mientras que mostró una selección negativa
para P. steinheili. El reactivo de Mayer y la Cromatografía de Capa Delgada
indicaron que no se encontraron alcaloides en las pieles de D. truncatus mantenidas
en cautiverio, sin embargo se encontraron alcaloides en los extractos de los
artrópodos aunque estos no fueron tomados por las ranas. Los resultados sugieren,
que en cautiverio, hay una relación entre la dieta y la presencia de alcaloides en D.
truncatus, ya que si la función metabólica para la presencia de alcaloides fuera
determinada solo por la constitución genética de la especie, entonces la rana,
independientemente de la dieta produciría alcaloides.
12
ABSTRACT
“Alkaloids presence in frogs Dendrobates truncatus (Amphibia: Dendrobatidae)
raised in captivity and fed with ants and fruit flies.”
A wide number of alkaloids with unique physicochemical proprieties have been
found in the skins of netropical frogs from the Dendrobatidae family. It has been
suggested that the source of these alkaloids comes from the frog’s environment,
specifically from their diet. The purpose of this work was to establish a relation
between the type of food and the presence of alkaloids in the skin of Dendrobates
truncatus by keeping three groups of frogs in captivity for eight weeks. The frogs
were fed with Paratrechina steinheili, Wasmannia auropunctata (Formicidae) or
Drosophila melanogaster (Drosophilidae). It was found that D. truncatus has a
positive selection for D. melanogaster and Wasmannia auropunctata and a negative
selection for P. steinheili. The Mayer Reagent and the Thin Layer Chromatography
indicated that no alkaloids were found in the skin of D. truncatus while raised in
captivity, although alkaloids were found on the arthropods extracts however these can
not take for the frogs. These results suggest, that in captivity, there is a relation
between the diet and the presence of alkaloids in D. truncates, if the metabolic
function for the presence of the alkaloids was determined only by the genetic
constitution of the species, then the frog, independently of the diet, would produce
alkaloids.
13
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
1. Introducción……………………………………………………………. 16
2. Marco Teórico…………………………………………………………. 18
2.1. Alcaloides Mayores…………………………………………………… 19
2.1.1. Batracotoxinas……………………………………………………… 19
2.1.2. Pumiliotoxinas……………………………………………………… 20
2.1.3. Histrionicotoxinas………………………………………………….. 21
2.1.4. Indolizidinas……………………………………………………….. 22
2.1.5. Decahidroquinolinas………………………………………………. 22
2.1.6. Epibatidina……………………………………………………….... 22
2.2. Alcaloides Menores…………………………………………………… 23
2.2.1. Gephyrotoxinas……………………………………………………… 23
2.2.2. 2,6 disustituido piperidinas…………………………………………. 23
2.2.3. Pirrolidinas………………………………………………………….. 23
2.2.4. Piridil-piperidinas…………………………………………………... 23
2.2.5. Indol alcaloides……………………………………………………... 23
2.2.6. Azatricyclododecenas………………………………………………. 24
2.2.7. Alcaloides de amidina………………………………………………. 24
2.3. Presencia de alcaloides y variabilidad en sus perfiles………………… 24
2.4. Fuentes de origen……………………………………………………… 25
2.5. Capacidad de acumulación de alcaloides……………………………... 27
3. Antecedentes específicos………………………………………………... 29
3.1. Dendrobates truncatus (Cope 1861)………………………………….. 29
3.1.1. Alcaloides encontrados en Dendrobates truncatus…………………. 31
3.2. Especies de Hormigas…………………………………………………. 32
3.2.1. Paratrechina steinheili (Forel 1893)………………………………... 32
3.2.2. Wasmannia auropunctata (Roger 1863)……………………………. 33
3.3.3. Drosophila melanogaster Meigel, 1830……………………………. 34
4. Justificación……………………………………………………………... 35
14
Pág.
5. Hipótesis……………………………………………………………….... 35
6. Objetivos………………………………………………………………… 36
6.1. General………………………………………………………………… 36
6.2. Específicos…………………………………………………………….. 36
7. Metodología……………………………………………………………... 36
7.1. Cría y mantenimiento en cautiverio de ranas………………………….. 37
7.2. Colecta, establecimiento y mantenimiento de colonias de hormigas….. 37
7.3. Bioensayos……………………………………………………………... 38
7.4. Extracción y análisis de las muestras…………………………………... 40
7.4.1. Insectos………………………………………………………………. 40
7.4.2. Anfibios……………………………………………………………… 41
8. Métodos analíticos………………………………………………………. 42
8.1. Reactivo de Mayer…………………………………………………….. 42
8.2. Cromatografía de Capa Delgada (CCD)………………………………. 42
9. Resultados……………………………………………………………….. 43
9.1. Consumo de las dietas…………………………………………………. 43
9.2. Detección de alcaloides………………………………………………... 44
9.2.1. Reactivo de Mayer…………………………………………………... 44
9.2.2. Cromatografía de Capa Delgada…………………………………….. 46
10. Discusión……………………………………………………………….. 46
10.1. Consumo de las dietas………………………………………………... 46
10.2. Relación de la dieta con la producción de toxinas…………………… 47
11. Consideraciones finales y conclusiones………………………………… 51
12. Recomendaciones………………………………………………………. 53
13. Bibliografía……………………………………………………………... 54
15
LISTA DE TABLAS Pág.
Tabla 1. Presencia de alcaloides lipofílicos en anfibios……………………. 17
Tabla 2. Detección de alcaloides. Resultado de las muestras con el reactivo de
Mayer……………………………………………………………………….. 44
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Color en vivo de Dendrobates truncatus. A) vista lateral. B) vista
ventral……………………………………………………………………….. 29
Figura 2. Mapa de distribución de la especie Dendrobates truncatus…….... 30
Figura 3. Paratrechina steinheili, vista lateral…………………………….... 32
Figura 4. Wasmannia auropunctata…………………………………………. 33
Figura 5. Drosophila melanogaster, vista lateral…………………………….. 34
Figura 6. A) cajas colonias de hormigas. B) vista interna de la caja………... 38
Figura 7. Caja para los grupos de D. truncatus alimentadas con hormigas. A)
vista lateral. B) vista interna………………………………………………….. 39
Figura 8. Caja para los grupos de D. truncatus alimentadas con moscas de la
fruta. A) vista lateral. B) vista interna…………………………………………39
Figura 9. Revelado de la cromatografía de capa delgada con reactivo de sulfato
de cerio…………………………………………………………………........... 45
16
1. INTRODUCCION
En las últimas décadas los anfibios, en especial los anuros, han despertado el interés
de la comunidad científica, ya que en las pieles de algunas especies se han encontrado
una gran variedad de compuestos biológicos activos (más de 500 alcaloides) los
cuales son usados por estos individuos como defensa química contra depredadores
y/o microorganismos (Cevikbas 1978, Daly et al. 2003). Por sus características
químicas y actividades fisiológicas que presentan, éstos alcaloides han venido siendo
parte importante de numerosos estudios e investigaciones tanto en el área de la
biología como en el de la medicina (Albuquerque et al. 1971, Daly et al. 1987, Daly
2003, Badio et al. 1994).
El grupo de anfibios que posee la mayor variedad de alcaloides con actividades
tóxicas más potentes es el de las ranas neotropicales de la familia Dendrobatidae; los
alcaloides que han sido aislados de las pieles de los individuos de esta familia
conforman cuatro grandes grupos: Las Batracotoxinas (BTXs), presentes sólo en el
género Phyllobates; las Pumiliotoxinas (PTXs), presentes en Phyllobates,
Dendrobates y Epipedobates; las Histrionocotoxinas (HTXs) presentes en todos los
géneros anteriores, y la Epibatidina, que ha sido hallada únicamente en Epipedobates
(Mensah-Dwumah & Daly 1978, Myers & Daly 1976, Daly et al. 1987, Daly 2003)
(Tabla 1).
Aunque el descubrimiento de diferentes tipos de alcaloides ha aumentado en los
últimos treinta años, todavía no se tiene claro de dónde provienen estos compuestos
orgánicos. En un principio se pensó que las ranas sintetizaban los alcaloides de novo,
pero se encontró que individuos mantenidos en cautiverio disminuyen
considerablemente la concentración de los alcaloides y en algunos casos los llegan a
perder (Daly et al. 1980, Daly et al. 1992, Daly et al. 1997a). Sin embargo, aunque
se disminuye los niveles de concentración de los alcaloides estos pueden permanecer
17
Tabla No. 1. Presencia de alcaloides lipofílicos en anfibios. SAM, samandarinas; BTX, batracotoxinas; HTX, histrionicotoxinas; PTX, pumiliotoxinas; aPTX, alopumiliotoxinas; hPTX, homopumiliotoxinas; DHQ, 2,5-disustituido decahidroquinolas; 3,5-P, 3,5-disustituido pirrolizidinas; 3,5-I y 5,8-I, disustituido indolizidinas; 1,4-Q, 1,4- disustituido quinolizidinas; Epi, epibatidina; Pseudophrynaminas (Daly 1995).
Presencia de alcaloides lipofílicos en anfibios Clases PTX-A Alcaloides de Izidina Familia y
Género SAM BTX HTXPTX aPTX hPTX
DHQ 3,5-P 3,5-I 5,8-I 1,4-Q
Epi Pseudophry
Salamandridae Salamandra + - - - - - - - - - - - - Dendrobatidae Phyllobates - + + + - - + - + - - - - Dendrobates - - + + + + + + + + + - - Epipedobates - - + + + - + - - + + + - Myniobates - - - + + - + - - + + - - Mantellidae Mantella - - - + + + + + + + + - - Myobatrachidae Pseudophryne - - - + + - - - - - - - + Bufonidae Melanophryniscus - - - + + + + + + + + - -
18
durante varios años en ranas mantenidas en cautiverio (e.g. Phyllobates). Lo anterior
apunta a que probablemente la fuente de estos alcaloides proviene del medio donde
viven las ranas y que son obtenidos a partir de la alimentación, en este caso el
consumo de pequeños artrópodos estaría sirviendo como fuente de alcaloides
maduros o de precursores que son almacenados en sus pieles.
Siguiendo esta idea, se han realizado trabajos (Jones et al. 1999, Spande et al. 1999,
Saporito et al. 2004) con el fin de hallar los posibles organismos que proporcionan
los alcaloides maduros o sus precursores. Aunque se han encontrado en artrópodos
(principalmente hormigas, escarabajos y milpiés) algunos alcaloides también
presentes en dendrobátidos, la gran mayoría de estos alcaloides sólo han sido
encontrados en los extractos de pieles de ranas (Daly et al. 2003, Saporito et al.
2004).
Zambrano (2000) realizó un estudio sobre la dieta de poblaciones de Dendrobates.
truncatus y su relación con los niveles de toxicidad, en el que muestra que el
componente principal de la dieta de esta especie esta constituido por hormigas de la
familia Myrmicinae, y que los efectos tóxicos de la rana se mantenían aún después de
mantener los individuos en cautiverio durante cuatro meses, bajo una dieta artificial
con Drosophila melanogaster.
El propósito de este trabajo fue examinar si existe una relación directa entre el
consumo de alimento y la presencia de alcaloides en la especie de rana Dendrobates
truncatus criadas en cautiverio.
2. MARCO TEORICO
Los alcaloides presentes en ranas de la familia Dendrobatidae son alcaloides
lipofílicos que poseen un anillo de piperidina, a excepción del alcaloide batracotoxina
19
que es un alcaloide esteroidal y alcaloides con grupos indol, alcaloides constituidos
por pirrolidinas y los alcaloides constituidos por amidinas.
Por la gran cantidad y variedad de alcaloides encontrados en los extractos de los
dendrobátidos se ha desarrollado un código nomenclatural, el cual emplea el peso
molecular del alcaloide seguido con una letra (en negrilla) para distinguir alcaloides
con el mismo peso molecular (e.g. 223A y 223B). Sin embargo, algunos se pueden
presentar como simples compuestos o en mezclas difícilmente separables (e.g.
239CD). En el caso de la caracterización de los isómeros (e.g. cis, trans, epi, iso) se
ha implementado el uso de primas (A´, A´´), por ejemplo, los diastómeros 307A´ y
307A´´ fueron aislados del alcaloide 307A (Daly et al.1993).
Los alcaloides lipofílicos de la familia Dendrobatidae los podemos clasificar en dos
grandes grupos, así:
2.1. Alcaloides mayores
Agrupan una gran variedad y número de alcaloides. Algunos miembros ocurren en
varias especies de anfibios.
2.1.1. Batracotoxinas (BTXs): Son alcaloides complejos, estos difieren de los otros
alcaloides por la estructura esteroidal del anillo la cual es idéntica en todas las
batracotoxinas, y se catalogan entre los venenos más tóxicos no protéicos. Dentro de
este grupo se encuentran los siguientes compuestos: Las batracotoxinas (BTX),
homobatracotoxinas (hBTX), Batracotoxina A (BTX A), y un cuarto compuesto, la
Pseudobatracotoxina, la cual se ha observado que durante su aislamiento se convierte
en BTX A (Myers & Daly 1976, Daly et al. 1987).
Actividad tóxica: La actividad tóxica de las BTXs genera una despolarización del
nervio y el músculo por su capacidad de incrementar la permeabilidad de los iones
sodio sobre la mebrana excitable. Las batracotoxinas actúan directamente sobre los
20
canales de sodio modificando la selectividad iónica y la sensibilidad al voltaje. La
toxicidad se debe al bloqueo de la transmisión nerviosa hacia el músculo (Daly 1995,
1998).
Presencia: Las BTXs solo se han encontrado en cinco especies de Phyllobates, lo cual
hace pensar que la capacidad de almacenamiento de este tipo de alcaloides en ranas
sea una característica monofilética (Myers & Daly 1976, Daly 1995). Este tipo de
alcaloides también se ha encontrado en otros grupos de vertebrados no anfibios, aves
passeriformes del género Pitohui (Dumbacher et al. 1992) e Ifrita (Dumbacher et al.
2000).
Origen: La fuente de batracotoxina en aves de Nueva Guinea se encontró en especies
de escarabajos del género Choresine (familia Melyridae) (Dumbacher et al. 2005).
2.1.2. Pumiliotoxinas: Se conocen más de cien tipos de toxinas conocidas como
pumiliotoxinas y que se agrupan en Pumiliotoxinas A, B, and C. (PTX A, B, C).
Entre sus estructuras hay piperidinas 2,6-disustituidas, indolizidines 3,5-disustituidas,
derivados de la perhidroquinolina etc. Las PTX A y B son alcaloides complejos que
poseen un sistema de anillos bicíclicos esteroidales que contienen nitrógeno
difiriendo solo en una porción terminal de un lado de la cadena (Myers & Daly
1976). La Pumiliotoxina C (PMT-C), es una simple cis-decahydroquinolina. Este tipo
de componentes se presentan en varias especies de géneros de anfibios que poseen
alcaloides lipofílicos con la excepción del género Salamandra que sólo posee
samandarinas (SAM) (Schöpf 1961).
Actividad tóxica: Miembros de la PTX-A poseen actividad tóxica con efectos sobre
los canales de sodio y posiblemente sobre los canales calcio. La PTX-B tiene efectos
cardiotóxicos y miotóxicos mediados por la interacción con el canal de sodio así
como por sus efectos antagonísticos con el receptor nicotínico de acetilcolina (Daly
1995).
21
Origen: Se encontró que las hormigas Brachymyrmex longirostris, B. cf. depilis y
Paratrechina steinheili eran la fuente para las PTXs de la especie Dendrobates
pumilio (Saporito et al. 2004). También se ha encontrado PTX 251D en la especie
de ácaro Scheloribates azumaensis (Takada et al. 2005)
2.1.3. Histrionicotoxinas (HTX): Son una clase de alcaloides caracterizados por
tener una estructura con un anillo de espiropiperidina (las sustituciones alélicas y
acetilénicas de algunas histrionicotoxinas también se han encontrado en las
pumiliotoxinas-C y gefirotoxina) e incluye los alcaloides C19 y los homólogos de
menor peso 235A y 259 (Daly et al. 1978). Existe más de una docena de alcaloides
clasificados como histrionicotoxinas que no han sido detectadas en cantidades
suficientes para determinar sin ambigüedades su estructura. (Lapa et al. 1975, Daly
et al. 1987).
Actividad tóxica: son relativamente poco tóxicas (menos que las PTX-A) y causan
dificultades motoras y postración después de administración subcutánea (Daly et al.
1971). Las histrionicotoxinas han sido muy útiles como reactivos farmacológicos por
su capacidad para antagonizar los cambios de conductancia que normalmente ocurren
después de la activación de los receptores nicotínicos por la acetilcolina en el
músculo. Adicionalmente las histrionicotoxinas antagonizan los cambios de
conductancia de potasio asociados con los potenciales de acción en el nervio y el
músculo (Daly, 1978).
Presencia: Detectados en varias especies y poblaciones de Dendrobates,
Epipedobates, Phyllobates y también en la rana de Madagascar, Mantella
madagascarensis. Estas no se presentan en todas las especies de estos géneros, o en
todas las poblaciones de ranas donde se ha encontrado (Daly et al. 1984; Daly et al.
1987, Daly 1995).
Origen: Hasta el momento no se conoce ningún precursor o fuente de este alcaloide.
22
2.1.4. Indolizidinas (I): Indolizidinas bicíclicas que incluyen las gefirotoxinas (Daly
et al. 1978). Son series simples de alcaloides bicíclicos, estos incluyen 3,5
disustituida pirrolizidinas (3,5-P), 3,5 Y 5,8 disustituida indolizidinas (3,5-I y 5,8-I),
y el 1,4 disustituida quinolizidinas (1,4-Q). Alcaloides como los 223A, B; 239A, B,
C, D han aparecido como trazas en algunos extractos de pieles de dendrobátidos
(Daly 1995).
2.1.5. Decahidroquinolinas (DHQ): Son aminas secundarias bicíclicas. Cerca de
treinta alcaloides extraídos de ranas han sido asignados a esta clase (Spande et al.
1999). Las PTX-C fue el primer miembro aislado de esta clase, estos tienen
respectivamente un hidrógeno, un etil o un propil sustituido en lugar del grupo 5-
metil de la PTX-C. La antigua terminología “PTX-C” no ha sido muy utilizada por la
probabilidad de confusión con la estructura disimilar de la PTX-A por consiguiente
“DHQ” es usado para describir a PTX-C y los alcaloides relacionados
estructuralmente (Daly et al. 1987).
2.1.6. Epibatidina (E): Hasta el momento es el más relevante descubrimiento clínico
de todos los alcaloides encontrados en la pieles de los anfibios, ya que es un potente
analgésico doscientas veces más potente que la morfina (Daly et al. 2000a). La
epibatidina provee una actividad agonística selectiva hacia receptores neuronales y
ganglionares. Esta actividad puede ser la base de la potente actividad analgésica y
representa un instrumento importante para el estudio de los receptores nicotínicos y
su función (Badio et al.1994, Daly et al. 1997b).
Presencia: La epibatidina ha sido detectada sólo en ranas del género Epipedobates. En
diferentes poblaciones de E. tricolor la epibatidina se presenta en cantidades
variables. Esta también se ha encontrado en una población de E. anthony, pero no en
todas las poblaciones de esta rana, y en bajas concentraciones en algunas poblaciones
de E. epinosai y E. pictus (Daly et al. 1993). Hasta el momento, no se conoce la
fuente primaria de la epibatidina, esta se considera semejante a la nicotina, y sería
23
lógico pensar que la epibatidina de la rana podría derivar de una planta común vía
artrópodo en la cadena alimenticia (Daly et al. 1997b).
2.2. Alcaloides menores
Son considerados menores al contenerlos pocas especies y también porque se
presentan principalmente como alcaloides en minoría o como trazas.
2.2.1. Gephyrotoxinas (GTX): Son alcaloides tricíclitos conocidos sólo para las
poblaciones de Dendrobates histrionicus; son los siguientes: 287C, 289B, 239AB,
239CD (Daly 1978, Daly et al. 1987).
2.2.2. 2,6 disustituido piperidinas: Parece ser el precursor de las HTX, GTX, DQH
e I, estas piperidinas han sido encontradas solo en algunas poblaciones de D.
histrionicus y D. trivittatus.
2.2.3. Pirrolidinas: Encontrado en las poblaciones de D. histrionicus y D. pumilio.
La determinación estructural del 197B es idéntica a un alcaloide previamente
identificado en hormigas africanas Solenopsis punctaticeps y la Monomorium
pharaonis (Jones et al. 1982).
2.2.4. Piridil-piperidinas: Este es un alcaloide menor de piperidina
(noranabasamina), de un constituyente menor de Phyllobates terribilis y en trazas
menores en P. aurotaenia y P. bicolor (Daly et al. 1987).
2.2.5. Indol alcaloides: Dos isómeros alcaloides calycanthina y chimonanthina
fueron extraídos de P. terribilis y P. bicolor. Aunque como enantiómeros fueron
previamente conocidos en una planta del género Calycanthus (Calycantheaceae)
(Daly et al. 1987).
24
2.2.6. Azatricyclododecenas: Es un alcaloide triciclito. El 205B, aislado de D.
pumilio, también se encuentra presente en escarabajos (conocidos como
“mariquitas”) de la familia Coccinelidae (Daly et al. 1987).
2.2.7. Alcaloides de amidina: tres alcaloides (222, 236 y 252) con amidina fueron
detectados en extractos de pieles de D. pumilio, pero también se han encontrado en D.
tricolor, y posiblemente se presentan en D. espinosai y D. pictus. Estas trazas de
alcaloides presentan una actividad analgésica según algunas pruebas de laboratorio
(Daly et al. 1987).
2.3. Presencia de alcaloides y variabilidad en sus perfiles:
Se ha visto que los perfiles de los alcaloides pueden variar entre individuos de una
misma población, pero esta variación es poca comparada con la observada entre
poblaciones de una misma especie. Por ejemplo, las poblaciones de Dendrobates
leucomelas de dos localidades diferentes en Venezuela poseen como alcaloides
principales PTX 251D y aPTX 267A. La aPTX 267A se presentó como alcaloide
mayor en una población y como menor en la otra población (Daly et al. 1987). De
igual forma Daly et al. (1992) detectaron que la presencia de alcaloides varia en tres
poblaciones de D. auratus dependiendo de su ubicación geográfica. La primera
población en la Isla Taboga (Panamá) presento HTX, PTX-A y DQH, la segunda de
las montañas centrales de Panamá contenía principalmente HTX, PTX-A y una I; y
la tercera, de la Costa Caribe de Costa Rica, presentó HTX, hPTX, un DHQ, una
variedad de I, quinolizidinas y pirrolizidinas. También, en el mismo trabajo se
observó que los descendientes de una población de D. auratus de Panamá que fue
introducida en la isla de Manoa (Hawaii) no presentaron HTX, pero si se encontró un
nuevo alcaloide triciclito (193), el cual no fue detectado en los parentales de Panamá,
demostrando con esto que debe existir un control genético de las vías biosintéticas
sumado a una interacción con factores ambientales, en este caso la dieta, que juegan
un papel importante en la producción de alcaloides (Daly et al.1992).
25
Otros individuos de D. auratus, de la población de Manoa, tomados de vida silvestre
y mantenidas en laboratorio con grillos y moscas de la fruta, presentaron niveles de
aPTX semejantes a las ranas silvestres, mientras que los niveles de PTX 251D fue
reducido al 50%, y los de 195A (DQH) y 195B (I) se redujeron cerca del 80% (Daly
et al. 1992), lo cual estaría mostrando una dependencia de recursos alimenticios
específicos para la formación de alcaloides.
2.4. Fuentes y origen
En la mayoría de los casos, los alcaloides detectados en los extractos de las pieles de
las ranas no se han encontrado en otro tipo de organismo. No obstante, se ha
comprobado que las hormigas, cucarrones y ciempiés son fuente de DHQ, algunas
Indolizidinas, coccinelinas, pirrolizidinas, PTXs y aPTX. En algunos casos estos
alcaloides se han encontrado en especies de artrópodos específicos, o en varias
mezclas de estos (Daly et al.1994a, Daly et al. 2002) sin establecer cuáles especies
en concreto son la fuente de origen de los alcaloides. También se ha planteado la idea
que microorganismos simbióticos o artrópodos microscópicos que produzcan los
alcaloides puedan estar usando más de un taxón como hospedero (Daly et al. 2002).
Un ejemplo de esto lo muestran las hormigas del género Tetraponera que poseen un
alcaloide llamado tetraponerina sintetizado por una bacteria fijadora de nitrógeno
ubicada en el tracto digestivo de la hormiga (Smith & Jones 2004).
Por lo anterior se han desarrollado experimentos en laboratorio para comprobar la
relación que tiene el recurso alimenticio en estado silvestre versus la toxicidad.
Individuos de la especie de rana D. auratus mantenidos en terrarios y alimentados
con termitas (Kalotermes sp. y Neoternes connexis) y Drosophila sp., presentaron en
sus pieles PTX 251D, aPTX 267A y DHQ 195A, los mismos que presentan sus
parentales silvestres, pero en menores cantidades (Daly et al. 1992). Otro trabajo
realizado con la misma especie en Panamá mostró que artrópodos silvestres dados de
26
comer a estas ranas en cautiverio, generaban perfiles de alcaloides muy parecidos a
los que presenta esta especie en la naturaleza, además, se encontraron alcaloides
como la precoccinelina (193C), un alcaloide encontrado previamente en escarabajos y
la nitropolizonamina, encontrado en los ciempiés (Daly et al.1994a).
Del grupo de los artrópodos las hormigas son consideradas como la principal fuente
de alcaloides para las especies de Dendrobatidae. La mayoría de los siguientes
alcaloides se ha encontrado en hormigas de los géneros Solenopsis, Monomorium y
Megalomyrmex: pirrolidinas 197B, 225C, 225H, 3-5 disustituida; piperidinas 223K,
225I, 253J; pirrolizidinas 223 (dos isómeros); I 167E, 195B, 223AB, 223R;
quinolizidinas 195C; DHQ cis-195A, cis-195J, cis-275B y cis-275B (Jones et al.
1980, 1982, 1984,1999, Spande et al. 1999). Estos mismos alcaloides también se han
encontrado en especies de ranas neotropicales pertenecientes a los géneros
Dendrobates y Phyllobates.
Por ello se han realizado hallazgos y trabajos tanto en campo como en laboratorio que
podrían explicar la relación entre la dieta y la presencia de alcaloides. En cautiverio y
durante siete semanas, Daly et al. (1994b) ofrecieron como alimento a ranas D.
auratus, hormigas de la especie Monomorium pharaonis, estas hormigas contienen
tres tipos de alcaloides indolizidinas (3,5 I y la monomorina-I) y pirrolidinas (trans-
2-heptil-5-(5-hexenil)-pirrolidina). Después del tiempo de alimentación detectaron en
la piel de las ranas una acumulación significativa de indolzidinas (sobretodo la
monomorina-I) aunque las pirrolidinas no fueron detectadas en los extractos de piel.
Por otro lado, y en medio silvestre, Saporito et al. (2004) detectaron PTX A 307A y
323A en hormigas formicinas de los géneros Brachymyrmex (B. longirostris y B. cf.
depilis) y Paratrechina (P. steinheili). Estos corresponden a los mismos alcaloides
detectados en extractos de piel de Dendrobates pumilio provenientes de los lugares
donde se colectaron las hormigas. Además, estas hormigas también se encontraron en
los contenidos estomacales de estas ranas, obteniendo con esto, una fuerte evidencia
27
de que las hormigas, como recurso alimenticio, son la fuente de las PTXs para esas
poblaciones de D. pumilio.
Recientemente, Dumbacher et al. (2004) descubrieron la presencia de BTXs en
extractos de los escarabajos Melyridae Choresine pulcra, C. rugiceps y C.
semiopaca, siendo esta última la especie que presentó una mayor concentración del
alcaloide. Los autores sugieren que estas especies son la posible fuente potencial de
BTXs también presentes en especies de aves passeriformes de los géneros Pitohui e
Ifrita.
2.5. Capacidad de acumulación de alcaloides
Se ha observado que la función ecológica de los de alcaloides en la piel de las ranas
es principalmente defensiva contra depredadores, al secretarlos la rana a la superficie
de la piel gracias a sistemas glandulares que estas poseen cuando se ven en
situaciones de peligro o estrés (Myers & Daly 1983, Daly et al. 1997b).
En un principio se planteó que estos alcaloides descubiertos en los extractos de las
pieles de las especies de dendrobátidos eran sintetizados por las propias ranas. Sin
embargo, estudios de laboratorio revelaron que en dendrobátidos mantenidos en
cautiverio los alcaloides bajaban sus niveles de toxicidad o se perdían totalmente
(Daly et al. 1997b). Ejemplo de ello se vio en un juvenil de Phyllobates bicolor
mantenido en un terrario cuando no presentó BTX, DHQ ni HTX, alcaloides
principales que posee la especie en vida silvestre (Daly et al. 1992). En otro caso
similar se observó en individuos de P. terribilis una disminución de sus niveles de
BTX-hBTX de 1140 µg/rana a 250 µg/rana luego de seis años de cautiverio, además
las BTXs ni ningún otro tipo de alcaloide se detectaron en los extractos de las pieles
de su F1. Esta disminución y/o pérdida de alcaloides fue igualmente observada en
especies de distintos géneros mantenidas en cautiverio: por ejemplo, los individuos de
28
Mantella viridis (Mantellidae), o ranas de Madagascar, no conservan PTX-A, que es
un alcaloide presente en individuos silvestres (Daly et al. 1997a).
Lo anterior puede sugerir que las ranas que poseen alcaloides no los sintetizan ellas
mismas – de novo- sino que han desarrollado un sistema de almacenamiento de estos
alcaloides a partir de la dieta (Daly et al. 1994b). Daly et al. (1994b) observaron que
este sistema de acumulación de alcaloides está ausente en géneros que no los
presentan, como por ejemplo especies de Colostethus (Dendrobatidae). Esto se
demostró cuando individuos de Colostethus talamancae y C. inguinalis que fueron
alimentados con una mezcla de alcaloides durante cinco semanas, no mostraron la
acumulación de estos en la piel, evento que sí ocurrió en especies de Dendrobates y
Phyllobates alimentadas con el mismo tipo de dieta (Daly et al. 1994b). Igualmente
la capacidad de retención de distintos alcaloides (HTX, DHQ, PTX, 3,5-P, 3,5 y 5,8 I,
1,4-Q) ha sido demostrada en experimentos con D. auratus, D. galactonotus, D.
castaneoticus, Epipedobates tricolor, P. bicolor (Daly et al. 1994b, Daly et al. 2003)
al alimentarlas con Drosophila previamente espolvoreadas con alcaloides extraídos
de otras ranas. Además, Daly et al (2003) observon en laboratorio, que algunas
especies del género Dendrobates (D. auratus, D. galactonatus y D. castaneoticus)
presentan una enzima, la 7-hidroxilasa, la cual permite transformar un alcaloide en
otro más tóxico haciendo la conversión de una PTX a aPTX. Lo anterior podría estar
explicando, de cierta forma, porque algunos alcaloides no han sido hallados en forma
madura en una fuente alimenticia, ya que se estarían formando a partir de un
precursor a través de una vía metabólica.
Sin embargo, llama la atención que en el caso del género Pseudophryne
(Myobatrachidae), las ranas exhiben un aumento del alcaloide pseudophyramina en
cautiverio, independientemente del tipo de alimentación, aunque las PTXs, también
presentes en estas ranas en vida silvestre, se perdieron durante el cautiverio (Smith et
al. 2002).
29
3. ANTECEDENTES ESPECÍFICOS
3.1. Dendrobates truncatus (Cope, 1861)
Dendrobates truncatus es una especie endémica de Colombia; se distribuye desde los
10 hasta los 1100 m (Silverstone 1975, Páez et al. 2002). Habita en el Río
Magdalena desde el municipio de Neiva (Huila) hasta la costa Caribe (Acosta com.
pers); en las tierras bajas alrededor de los extremos de las cordilleras Central y
Occidental y al occidente del Golfo de Urabá (Figura 2).
Esta especie, miembro del grupo tinctorius, presenta en estado adulto una longitud
rostro-cloaca de 23.5-31 mm; se caracteriza por tener dorsalmente la piel ligeramente
granular excepto en la parte posterior del vientre y en la superficie ventral del muslo y
por el tubérculo tarsiano ausente o ligeramente desarrollado (Silverstone 1975).
En vivo el color del dorso es negro con líneas amarillas completas dorsolateralmente
e incompletas lateralmente; el vientre y los flancos son negros, con retículo grueso
azul pálido. El tímpano es redondo y con diámetro igual a un medio del diámetro del
ojo. El segundo, tercero y cuarto discos de los dedos manuales son más anchos en las
hembras que en machos (Silverstone 1975) (Figura 1).
A B
Figura 1.Color en vivo de Dendrobates truncatus, A) vista lateral. B) vista ventral.
30
Al igual que en las demás Dendrobates, las hormigas representan una alta proporción
de su dieta (Toft 1981; 1995; Donelly 1991, Daly 1998, Saporito et al. 2004).
Zambrano (2000) encontró en contenidos estomacales de D. truncatus, que las
hormigas constituyen la principal fuente alimenticia (94.6%), seguido de otro tipo de
artrópodos como avispas, ácaros, colémbolos y cucarrones. En el caso de las
hormigas se encontraron en total nueve géneros: las Myrmicinae Wasmannia,
Solenopsis, Strumigenys, Mycocepurus, Pheidole, Crematogaster, Cyphomyrmex,
Hylomyrma y la Ponerinae Gnamptogenys. Silverstone (1975) encontró en el
contenido estomacal de un solo individuo de D. truncatus una especie de la familia
Staphylinidae (Coleoptera), una especie de la familia Entomobryidae (Colembola), y
www.globalamphibian.org
Figura 2. Mapa de distribución de la especie Dendrobates truncatus.
31
siete especies de la familia Formicidae: Dorymyrmex cf. biconis, Mycocepurus
smithi, Wasmannia auropunctata, Zacryptocerus maculatus, Pheidole sp.,
Aphaenogaster sp., y una especie de Myrmicinae.
3.1.1. Alcaloides encontrados en Dendrobates truncatus
Se han identificado alcaloides tóxicos pertenecientes a las clases histrionicotoxinas,
decahidroquinolinas, indolizidinas y trazas de otros alcaloides en extractos de piel de
D. truncatus (Daly et al. 1987, Spande et al. 1999), estos son:
• Alcaloides mayores:
Histrionicotoxina 259
Histrionicotoxina 283A
Alodihistrionicotoxina 285C
Decahidroquinolinas 219A
• Alcaloides menores:
Histrionicotoxina 235A
Neodihistrionicotoxina 285B
Octahidrohistrionicotoxina 291A
Decahidroquinola 243A
• Alcaloides en trazas:
Indolizidina 223D
Decahidroquinola 223 (A, B, C)
Decahidroquinola 269AB
32
3.2. Especies de hormigas
3.2.1. Paratrechina steinheili (Forel 1893)
La especie P. steinheili es una hormiga pequeña que pertenece a la subfamilia
Formicinae, tribu Lasinni (Fernández 2003a). Su rango de distribución cubre el
neotrópico, desde el sur de Méjico hasta el sur de Brasil y varias islas del Caribe
(Longino 2004).
Las especies de este género se encuentran asociadas al suelo en lugares naturales y
áreas ecológicamente alteradas. Se diferencian de las demás formicinas por los pelos
gruesos y erectos de la cabeza y promesonoto, así como la típica dentición
(Fernández 2003a). P. steinheili se caracteriza por tener escapo con macrochaetae
conspicua, alargada, fuertemente diferenciada; de color generalmente café, con
trocánteres contrastantemente claros que se diferencia de las coxas medias y
posteriores, con pubescencia presente sobre el mesosoma y variablemente presente en
el primer tergito gastral (Longino 2004) (Figura 3).
Recientemente Saporito et al. (2004) detectaron los alcaloides PTX 307A y 323A en
extractos de poblaciones de P. steinheili en la Isla Bastimentos (Panamá).
Figura 3. Paratrechina steinheili, vista latera
33
3.3.2. Wasmannia auropunctata (Roger 1863)
Es una hormiga de la subfamilia Myrmicinae, tribu Blepharidattini (Fernández
2003b), nativa del Neotrópico, con una amplia distribución que va desde Florida
(EEUU) hasta Argentina y en varias islas del Caribe, siendo considerada como plaga
en tres diferentes aspectos: invasión de cultivos (cacao, café, cítricos y ornamentales),
infestación de viviendas humanas y competencia interespecífica con fauna local
(Ulloa-Chachón & Cherix 1990, Longino 2003). Esta especie de hormiga habita en
la hojarasca, cortezas de árboles y debajo de piedras (Ulloa-Chacón & Cherix 1990,
Fernández 2003b). Es abundante en bosques primarios y secundarios, húmedos o
secos, sin embargo también se puede encontrar en áreas perturbadas (Longino 2003).
W. auropunctata es de color café-dorado a café, alcanza a medir entre 1.2-1.5 mm.,
su mandíbula está bien desarrollada (Ulloa-Chacón & Cherix 1990).
Morfológicamente posee un prominente cuadrado lateral de perfil en el nodo peciolar
el cual es característico de la especie (Longino 2003), su cabeza es larga y más
amplia que el tórax, los pelos del cuerpo son largos, erguidos y dispersos (Figura 4).
Su picadura es dolorosa y sus mandíbulas secretan alkilpirazinas (alcaloide
lipofílico), compuestos utilizados como señal de alarma y en funciones defensivas
(Howard et al. 1982).
Figura 4. Wasmannia auropunctata, vista lateral.
34
3.3.3 Drosophila melanogaster Meigen, 1830
Es una especie de la familia Drosophillidae originaria de Africa Central pero ahora se
considera cosmopolita al presentarse en varios países de clima templado. La especie
se caracteriza por tener ojos rojos, una coloración del cuerpo amarillo-café, con
anillos transversales negros en su abdomen (Figura 5). Exhiben un dimorfismo
sexual: las hembras son más grandes que los machos, además estos últimos presentan
coloración negra al final del abdomen (Roberts & Standen 1998).
Se ha comprobado que esta especie dada a consumir a ranas Dendrobatibatidae en
cautiverio no es fuente ni precursor para la obtención de los alcaloides tóxicos (Daly
et al. 1992)
Figura 5. Drosophila melanogaster, vista lateral.
35
4. JUSTIFICACION
En varias especies de ranas neotropicales de la familia Dendrobatidae se ha
encontrado una gran variedad de alcaloides los cuales además de poseer
características químicas únicas, presentan acciones fisiológicas que han despertado
gran interés farmacológico. El hecho de que ranas mantenidas en cautiverio hayan
disminuido la concentración de estos alcaloides y en algunos casos se haya visto la
pérdida total de estos, hace pensar que la fuente de estos alcaloides se encuentra en el
medio en que viven y más específicamente en su dieta. Aunque se ha descubierto en
varios grupos de artrópodos alcaloides que también se presentan en las ranas, la
mayoría de estos solo se han hallado en dendrobatidos lo cual hace pensar que
aparentemente estas toxinas son exclusivos de estas ranas.
En el presente trabajo se buscó establecer si existe una relación entre el tipo de
alimento y la presencia de alcaloides en la especie de rana Dendrobates truncatus,
manteniendo grupos de ranas en cautiverio con diferentes tipos de dieta.
5. HIPOTESIS
Si existe una relación entre el consumo de alimento y la presencia de alcaloides en
ranas del género Dendrobates (Dendrobatidae), debe ser posible observar diferencias
en la presencia de alcaloides en grupos de D. truncatus sometidos a diferentes tipos
de alimentación.
36
6. OBJETIVOS
6.1. General
Examinar si la especie Dendrobates truncatus genera su toxicidad a partir de un
insecto no Formicidae o si por el contrario, una dieta a base de hormigas genera su
toxicidad.
6.2. Específicos
Observar la presencia de alcaloides en ranas criadas en cautiverio y alimentadas con
Drosophila melanogaster.
Observar la presencia de alcaloides en ranas criadas en cautiverio y alimentadas con
hormigas: Paratrechina steinheili y Wasmannia auropunctata
7. METODOLOGIA
La fase experimental de la presente investigación se desarrolló en colaboración con el
Zoológico de Cali y el Departamento de Biología de la Universidad del Valle. Para el
desarrollo de los ensayos se establecieron y mantuvieron colonias de individuos
juveniles de D. truncatus (Zoológico) y de las hormigas de P. steinheili y W.
auropunctata (Univalle). La temperatura promedio mínima fue de 20 °C y la máxima
de 30 °C, con un fotoperiodo normal de 12h luz día.
37
7.1. Cría y mantenimiento en cautiverio de ranas
Adultos, machos y hembras, de D. truncatus mantenidos en cautiverio donados por
Piscilago Zoo fueron transferidos al Zoológico de Cali en enero y julio de 2004. Las
ranas fueron mantenidas en terrarios con bromelias y sustrato de musgos, piedras y
cortezas de árbol. La alimentación estaba constituida por pequeños artrópodos,
colectados por jameo en el zoológico. En diciembre de 2004 se colectaron posturas en
los terrarios y en cajas de petri fueron incubadas en oscuridad a 19 C° dentro de una
cubierta plástica. Con la última eclosión, a los 30 días, los renacuajos fueron
colocados en cajas plásticas circulares transparentes de 7 x 4cm. con agua, y
alimentados con comida para peces (Tetramin, Compañía Tetra) hasta completar la
metamorfosis de los individuos (en promedio 49 días). Lo anterior se realizó
siguiendo los parámetros que maneja la Fundación Zoológico de Cali para el
mantenimiento en cautiverio de esta especie.
7.2. Colecta, establecimiento y mantenimiento de las colonias de hormigas
Las colonias de P. steinheili fueron colectadas el 21 de enero de 2005 en el
Departamento de Risaralda, Municipio de Apia, Vereda Valladolid, Finca La Playita.
1440m. mientras que las de W. auropunctata se colectaron el 2 de febrero de 2005 en
el Departamento del Cauca, Municipio de Santander de Quilichao, Hacienda San
Julián, 980m.
Cada una de ocho colonias de hormigas, cuatro de P. steinheili y cinco de W.
auropunctata, se colocó en una caja plástica de 24 x 24 x 10cm., con dos o tres
ranuras de 3 x 3cm. selladas con anjeo metálico (Figura 6). Cada caja era recubierta
internamente con teflón para facilitar la manipulación de las hormigas. Dentro de las
cajas se colocó un recipiente plástico redondo (nido) que tenía en la parte superior
yeso y en su parte central un algodón que se sumergía en agua en la parte inferior del
envase, manteniendo húmedo el yeso. Este envase era cubierto por un recipiente
38
negro con agujeros para la entrada de las hormigas. En el caso de W. auropunctata, se
introducían los pedazos de tronco donde se encontraban las colonias, ya que se ha
visto que de esta forma tienen una mayor adaptación en cautiverio.
A B
Figura 6. A) cajas de colonias de hormigas. B) vista interna de la caja.
Una vez por semana, las hormigas eran alimentadas con dieta artificial, propuesta por
Keller et al. (1989), suplementadas con agua y miel todos los días. Las colonias
permanecieron por una semana en el insectario de la Universidad del Valle antes de
ser llevadas a las instalaciones del Zoológico de Cali.
7.3 Bioensayos
Se realizaron ensayos para establecer las condiciones adecuadas para el buen
mantenimiento de las ranas en cautiverio y el desarrollo de los bioensayos. Para los
grupos alimentados con hormigas se emplearon cajas plásticas de 18 x 18 x 6cm., con
una ranura de 3 x 3cm. en la parte superior de la tapa, sellada con organza (Figura 7).
Para el grupo alimentado con mosca de la fruta (D. melanogaster) se utilizó una caja
plástica de 16 x 23 x 9cm., con una ranura de 10.5 x 19cm. en la parte superior de la
tapa, sellada con anjeo y organiza (Figura 8). A cada caja se le colocaron piedras,
cortezas de árbol, un envase plástico pequeño de 2 x 2 x 2cm con agua; y una caja de
petri de 7 x 1cm con agua para la caja de D. melanogaster. Como sustrato se utilizó
39
papel absorbente blanco humedecido, el cual era cambiado dos veces por semana.
Este tipo de sustrato fue considerado el más apropiado, ya que era más fácil detectar
si las ranas estaban consumiendo la dieta, además, de que conservaba la humedad del
ambiente dentro de las cajas.
A B
Figura 7. Cajas para los grupos de D. truncatus alimentados con hormigas. A)
vista lateral. B) vista interna.
A B
Figura 8. Cajas para los grupos de D. truncatus alimentados con moscas de la fruta.
A) vista lateral. B) vista interna.
40
Se establecieron tres grupos de D. truncatus, cada uno conformado por tres
individuos. El primer grupo (control) se alimentó con D. melanogaster cepa
silvestre, criadas en medio de banano con suplemento vitamínico (Minaviar,
Compañía Chalver-veterinaria). Este tipo de alimentación aparentemente no aporta a
la dieta ningún precursor de los alcaloides tóxicos (Daly et al. 1992). Las moscas
eran espolvoreadas con vitaminas antes de proporcionárselas a las ranas. El segundo
grupo de ranas se alimentó con P. steinheili y el tercero con W. auropunctata.
Estas dos especies de hormigas se escogieron porque se han encontrado en el hábitat
de la rana pero específicamente, y más específicamente para el caso de
W. auropunctata ya que se encontró en contenidos estomacales de D. truncatus
(Silverstone 1975). D. melanogaster, al no ser fuente ni precursor de alcaloides para
los dendrobátidos, este tipo de alimentación se tomo para el grupo control.
El tiempo de alimentación para todos los grupos se realizó hasta que todos los
individuos de D. truncatus completaran, como mínimo, un total de ocho semanas de
haber comenzado la dieta.
7.4. Extracción y análisis de las muestras
7.4.1. Insectos
Para los extractos de los artrópodos se utilizó la metodología de Dumbacher et al.
(2004): individuos de cada grupo de insectos fueron macerados en 1 ml. de etanol al
90% y seguido de un proceso de sonicación (Sonicador Cole-Parmer 8892) por 30
minutos a temperatura ambiente, tomando de cada muestra el sobrenadante sin
ningún residuo sólido.
41
7.4.2. Anfibios
En el caso de los individuos de D. truncatus se obtuvieron muestras de exudaciones y
de piel, en cada caso fueron manipuladas de la siguiente forma:
Para los exudados se utilizó la metodología implementada por Grant & Land (2002)
y Osorio (2003) llamada TAS (Transcutaneous Amphibian Stimulator) por sus
siglas en inglés, mediante el cual las ranas son estimuladas utilizando un dispositivo
de emisión de voltaje (protocolo desarrollado en el Laboratorio de Biofísica de la
Universidad del Valle, Santiago Castaño com. pers. abril 2005). Las ranas son
excitadas con microchoques eléctricos de 6 voltios, 1Hz de frecuencia y una duración
de pulso de 6,5 milisegundos, el cual induce por estrés a la exudación de las toxinas
que son colectadas con pequeños trozos de papel filtro (Whatman) los cuales se
colocaban en recipientes de polipropileno con 1 ml de etanol, para después ser
sonicadas (igual que la muestra anterior).
En la separación de alcaloides de las pieles se utilizó la metodología establecida por
Daly et al. (1987), con una variante en el método, ya que se utilizó etanol en lugar de
metanol para el macerado de las pieles (Daly com. pers.). Las muestras entre 50-
500mg fueron maceradas dos veces, en un volumen de etanol entre 5-10 ml., el
extracto fue diluido en igual volumen de agua y a esta mezcla acuosa se le agregó dos
veces el volumen de cloroformo, se agitó tomando la fase orgánica. A la muestra
resultante se le adicionó la mitad en volumen de HCl 0.1 N y se agitó, tomando
después el HCL se ajustó su pH a 9 con NH4OH 1 N. A esta solución se agregó la
mitad en volumen de cloroformo, se agitó y nuevamente se tomó la fase orgánica, la
cual fue secada. El residuo fue reconstituido en 1 ml de etanol.
42
8. Métodos analíticos
Para el análisis de la presencia-ausencia de alcaloides en las muestras se realizaron
dos pruebas analíticas:
8.1. Reactivo de Mayer:
Este es un reactivo que produce precipitados cuando hay presencia de alcaloides. El
color del precipitado que se forma al agregar este reactivo a una solución que tenga
alcaloides, es de color blanco. De acuerdo con la abundancia de los precipitados
formados, se tabulan los resultados con (+++), (++), (+) o (-), teniendo en cuenta que
cualquier turbidez que se aprecie claramente es considerad positiva. La muestra tiene
que estar acidificada para un mejor desarrollo de la prueba (Sanabria 1983).
Para este trabajo se extrajo de cada muestra una alícuota de 0.3 ml y se agregaron dos
gotas del reactivo de Mayer; las muestras se acidificaron previamente con HCL (0.5
N) para el manejo de la prueba. Como control se utilizó una muestra con alcaloide ya
conocido (voacangina).
8.2. Cromatografía de capa delgada (CCD):
“Es un método rápido y simple para la detección y aislamiento de alcaloides. Los
extractos de D. pumilio y D.histrionicus han servido como referencia estándar en los
análisis cromatográficos de los extractos de otras especies y poblaciones del género
Dendrobates.
La cantidad de un alcaloide en la placa cromatográfica es aproximadamente
proporcional al diámetro de la mancha y el ancho relativo de este, al paso de la
extensión relativa de la migración del alcaloide en el solvente. Cada mancha posee
una relación de flujo (Rf) la cual constituye una característica física constante para
cada compuesto (Daly et al. 1987)”.
43
El valor del Rf va entre 0 y 1, y se calcula así:
Rf Distancia desde el origen hasta el centro de la mancha
Distancia del solvente que ha recorrido desde el origen
En este trabajo se realizó una CCD, empleando como fase móvil metanol cloroformo
(grado cromatográfico) en relación 1:1 y como fase estacionaria silicagel (f254
Merck). Para esta cromatografía se utilizaron extractos de los individuos de D.
truncatus de cada grupo mantenido en cautiverio. Como controles se utilizaron
extractos de pieles de D. truncatus silvestres (control positivo) y Colostethus sp.
(control negativo), ya que las especies de este último género no posee alcaloides
lipofílicos. Esta prueba también se realizó para las muestras de insectos con el
objetivo de comprobar la presencia o no de alcaloides en estos.
Se tomaron alícuotas de las muestras con tubos capilares y se sirvió sobre la capa
cromatográfica a 0.5 cm del extremo inferior. Se dejaron secar las muestras y la placa
se introdujo en una cámara de vidrio previamente equilibrada con la mezcla de
solventes. La migración se dejó transcurrir hasta que los solventes llegaran hasta la
parte superior de la placa. Después de retirada la placa se dejó secar al medio
ambiente. A continuación, la placa fue revelada en presencia de calor (50 ºC) con
sulfato de cerio, reactivo específico para alcaloides (Merck 1980).
9. RESULTADOS
9.1. Consumo de las dietas
Durante el tiempo de experimentación se observó que la hormiga P. steinheili no fue
consumida por D. truncatus. En algunos casos individuos de esta especie de hormiga
era encontrados muertos en los terrarios presentando un estado de haber sido expelido
por la rana. Caso contrario se observó con la otra especie de hormiga W.
44
auropunctata y la mosca de la fruta D. melanogaster, las cuales sí fueron consumidas
por la rana. Lo anterior se demostró ya que se conocía el número de hormigas que se
colocaban en los terrarios todos los días.
9.2. Detección de alcaloides
9.2.1. Reactivo de Mayer:
Salvo para el control positivo, la cual poseía alcaloides ya establecidos, y de D.
truncatus silvestre, todas las demás muestras mostraron ser negativas para el Mayer,
cabe anotar que las únicas muestras a las cuales no se les realizó esta técnica fueron a
las de insectos, ya que durante el proceso de acidificación estas se alteraban. Los
resultados se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2. Detección de alcaloides. Resultado de las muestras con el reactivo de
Mayer. C= control, muestra con alcaloides ya conocida; COL= Colostethus sp.;
DTS= D. truncatus silvestre; WRP= piel D. truncactus alimentada con W.
auropunctata; DRP= piel D. truncactus alimentada con D. melanogaster; WR=
extracto de D. truncatus alimentadas con W. auropunctata y DR= Extracto de D.
truncatus alimentadas con D. melanogaster. (+)=presencia de alcaloides, (-)=
ausencia de alcaloides.
MUESTRA CANTIDAD (ml) REACTIVO DE MAYER
C 0,3 (+++)
COL 0,3 (-)
DTS 0,3 (++)
WRP 0,3 (-)
DRP 0,3 (-)
WR 0,3 (-)
DR 0,3 (-)
45
Figura 9. Revelado de la cromatografía en capa delgada con reactivo de sulfato de
cerio. Las bandas oscuras muestran la presencia de alcaloides en las muestras con sus
Rf. COL= Colostethus sp. , DTS= D. truncatus silvestre, WRP= piel D. truncactus
alimentada con W. auropunctata, DRP= piel D. truncactus alimentada con D.
melanogaster, W= W. auropunctata, D= D. melanogaster, WR= Extracto de D.
truncatus alimentadas con W. auropunctata y DR= Extracto de D. truncatus
alimentadas con D. melanogaster.
COL DTS WRP DRP W D WR DR
Rf= 0.85
Rf= 0.17Rf= 0.07
Rf= 0.051
Rf= 0.20
Rf= 0.12Rf= 0.15
Rf= 0.74 Rf= 0.71
COL DTS WRP DRP W D WR DR
Rf= 0.85
Rf= 0.17Rf= 0.07
Rf= 0.051
Rf= 0.20
Rf= 0.12Rf= 0.15
Rf= 0.74 Rf= 0.71
46
9.2.2. Cromatografía en capa delgada
El revelado de la cromatografía en capa delgada con el reactivo para alcaloides,
sulfato de cerio, sólo mostró bandas de color café para D. truncatus silvestre, y las
dos muestras de insectos, W. auropunctata y D. melanogaster, mientras que las
demás muestras no presentaron banda alguna, indicando la ausencia de alcaloides
(Figura 9). La muestra de D. truncatus silvestre mostró tres bandas las cuales tenían
un Rf de 0,07, 0,17 y 0,85. En la de W. auropunctata se observaron cuatro bandas con
un Rf de 0,051, 0,12, 0,20 y 0,74 respectivamente, y en D. melanogaster se
observaron dos bandas con un Rf de 0,15 y 0,71.
10. DISCUSIÓN
Las ranas de la familia Dendrobatidae pertenecientes al género Dendrobates tienen la
capacidad de secretar alcaloides tóxicos gracias a glándulas granulares que poseen en
la piel (Daly 1998). Sin embargo, aunque estas ranas pueden retener estos alcaloides
en cautiverio por varios años, se ha visto que estas no los producen y todo apunta a
que las ranas secuestran y acumulan tales toxinas de una dieta de pequeños
artrópodos usando un sistema (fisiológico) de captura que todavía no se ha podido
identificar (Clark et al. 2005).
El presente trabajo pretendió examinar si existe una relación entre el consumo en
cautiverio de dos diferentes especies de hormigas y la presencia de alcaloides en la
rana D. truncatus, pero no se encontró evidencia de dicha relación, como se discute a
continuación.
10.1. Consumo de las dietas
Durante el experimento se observó el no consumo de P. steinheili al contrario del
consumo de D. melanogaster y W. auropunctata en cautiverio. Este comportamiento
en cautiverio puede estar mostrando que en la rana D. truncatus presenta una
selectividad en el consumo del recurso alimenticio, así sea el único recurso-presa que
47
se le presente a la rana en cautiverio. Aunque en varios trabajos se ha descubierto que
en la mayoría de los miembros de la familia Dendrobatidae -en especial los géneros
Dendrobates, Phyllobates y Epipedobates- su principal fuente de alimento los
constituyen altas proporciones de hormigas (Toft 1981, 1995, Donnelly 1991,
Caldwell 1995, Zambrano 2000, Osorio 2003), Toft (1995) menciona que las ranas
presentan características tanto morfológicas como fisiológicas que pueden estar
relacionadas con el tipo de alimentación que estas consumen. Una de las
características que menciona es la fisiología digestiva de la rana la cual puede
determinar el consumo o no de presas con alto contenido de quitina o que en algunos
casos esta pueda tener algún grado de toxicidad, dificultando así el consumo de la
presa. Esto puede estar explicando por qué P. steinheili no fue consumida por D.
truncatus debido a que esta no fue palatable para la rana y por lo tanto rechazada por
la rana, caso que también expone Zambrano (2000) sugiriendo que existe una
incapacidad diferente al tamaño para el consumo de presas por parte de D. truncatus,
como es la presencia de pelos largos y gruesos en especies de hormigas del género
Paratrechina y hormigas del género Atta y Acromyrmex. Demostrando con esto, que
aunque se sugiera que el género Dendrobates es un grupo hormiga-especialista (Toft
1981) hay una selección de presa dentro de esta especialización de recurso
alimenticio.
10.2. Relación de la dieta con la producción de toxinas
En D. truncatus, se ha demostrado la presencia de dos tipos de alcaloides mayores en
su piel, las histrionicotoxinas y pumiliotoxinas (Daly et al. 1987). El método de
cromatografía en capa delgada, el cual ha sido ampliamente utilizado para mirar la
presencia de alcaloides en la piel de los anfibios, confirmó efectivamente la presencia
de estos alcaloides en los individuos silvestres de D. truncatus, ya que en la muestra
se presentó una mancha con un Rf=0,85, coeficiente de relación de flujo designado
para la HTX 283A, alcaloide reportado para esta especie en estado silvestre, las otras
manchas en esta muestra mostraron unos Rf que pueden ser para los alcaloides que no
se conocen en la bibliografía sobre esta especie de rana. A diferencia del resultado
48
con las ranas silvestres, las muestras de los individuos de D. truncatus que fueron
criados y mantenidos en cautiverio con las dietas específicas no se observaron
manchas en la placa cromatográfica, demostrando la no presencia de alcaloides en sus
pieles (Figura 9). Cabe anotar que el resultado de las muestras de Colostethus sp. fue
lo que se esperaba al no presentar alcaloides, y de igual forma se observó la ausencia
del sistema de captura de alcaloides señalado por Daly et al. (1994b) ya que esta
especie fue colectada en el mismo lugar donde se colectaron los individuos silvestres
de D. truncatus la cual si presentó alcaloides. De igual forma, aunque de forma
colorimétrica, la prueba de Mayer también arrojó los mismos resultados para las
muestras de las ranas (Tabla 2).
Los datos datos que indican la ausencia de alcaloides, en el caso de las ranas
alimentadas con moscas de la fruta (D. melanogaster) estaría demostrando la
dependencia alimenticia por una alimentación específica que le suministraría los
alcaloides presentes en la especie D. truncatus en vida silvestre. Evidencia de esto
también se ha visto en varios dendrobátidos (Dendrobates, Epipedobates y
Phyllobates) y mantelidos (Mantella) mantenidos con un tipo de alimentación
diferente al silvestre han perdido su toxicidad (Daly et al. 2000b). D. auratus
mantenidos en cautiverio y alimentados con Drosophila sp. no presentaron alcaloides
en sus pieles (Daly et al. 1992, Daly et al. 1994a). De la misma manera no se les
detectó alcaloides a ranas M. aurantiaca (Mantellidae) después de haber sido
sometidas a una alimentación con D. melanogaster y grillos (Daly et al. 1997a).
Ya para el caso de los individuos que alimentados con W. auropunctata tampoco
presentaron alcaloides, aunque las muestras de hormigas al igual que la de las moscas
presentaron alcaloides (Figura 9). Se ha visto que no siempre todos los alcaloides que
presentan los individuos-presa son tomados por las ranas, ejemplo de ello lo
observaron Daly et al. (1994b) en el cual individuos de D. auratus solo capturaron el
alcaloide monomorina-I de una dieta en cautiverio con hormigas Monomorium
pharaonis, mientras otros dos alcaloides, de las clase de las indolizidinas y las
49
pirrolizidinas, que también se presentan en esta especie de hormiga no fueron
retenidos por la rana. Sin embargo, se ha podido comprobar que en algunas
poblaciones de especies de hormigas que poseen alcaloides lipofílicos no siempre
estos se presentan, así estas se encuentren dentro de localidades geográficas cercanas.
Saporito et al. (2004) demostraron en la isla Bastimentos (Panamá) que no todas
las poblaciones de la hormiga Brachymyrmex longicornis presentaban
pumiliotoxinas, sugiriendo que tanto una variación espacial y temporal estaría
afectando la presencia o no de los alcaloides. De la misma manera Daly et al. (2000b)
plantean que los artrópodos silvestres que se presentan en la estación seca (en el
Panamá-Pacífico) aparentemente le podrían estar suministrando algunos de los
muchos alcaloides a la rana D. auratus según algunos experimento de esta especie
tanto en campo como de laboratorio. Además las diferencias en cuanto a los niveles y
rangos de alcaloides encontrados en las pieles de varios dendrobátidos
presumiblemente reflejan muchos factores, tales como la disponibilidad y
adaptabilidad de alcaloides que puedan contener las presas item, selección de presa
por las especies de rana, y la selectividad y grado de expresión del sistema de captura
de alcaloides en cada especie de rana (Daly et al. 2000b).
En la naturaleza la búsqueda de los recursos alimenticios de los diversos alcaloides
lipofílicos detectados en los extractos de las pieles de las dendrobátidos, continúa
siendo uno de los mayores retos para los químicos-ecologistas (Daly 1998), y aunque
cada vez es más clara la evidencia de que el consumo de hormigas por estas ranas es
la principal fuente para la mayoría de estos alcaloides, la interacción de los
mecanismos genéticos y medioambientales (dieta) todavía no se comprende. Hasta el
momento se conoce que ocho de las más de 20 clases estructurales de alcaloides
lipofílicos encontrados en la piel de las ranas se presentan también en varias especies
de hormigas de los géneros Monomorium, Megalomyrmex, Solenopsis
(Diplorhoptrum), Tetramorium, Brachymyrmex (Myrmicinae); Anochetus
(Ponerinae); Paratrechina y Camponotus (Formicinae) (Jones et al. 1999, Daly et
al. 2000b, Saporito et al. 2004, Clark et al. 2005), sin embargo, la mayoría de las
50
especies de estos géneros son el recurso para alcaloides lipofílicos menores, y sólo
hasta el momento se han reportado dos especies de hormigas para alcaloides mayores
de la familia de las HTX (Saporito et al. 2004) las cuales son el recurso-fuente de
alcaloide para una especie de dendrobátido (D. auratus), mientras que la fuente de los
demás alcaloides mayores aun continua siendo un misterio.
Sin excluir el importante rol que pueda tener la interacción con organismos
simbióticos, dieta y factores ambientales que juegan un papel importante en la
producción de alcaloides (Daly et al. 1992), la presencia de tales alcaloides solo en
Amphibia, y que algunos de estos compuestos sólo sean específicos para unos
géneros, argumenta la idea de un control genético sobre las vías de biosíntesis de
alcaloides para explicar por qué diferentes especies de dendrobátidos que coexisten
en simpatría en las selvas tropicales posean diferentes clases y perfiles de alcaloides
(Daly et al. 1987), aun compartiendo ofertas de alimento similares en términos de
artrópodos..
Este trabajo realiza por primera vez un estudio ex situ con unas de las posibles fuentes
alimenticias que podría explicar la relación que puede existir en la dieta y la presencia
de alcaloides en la rana Dendrobates truncatus. Además de estas dos especies con
que se trabajó faltan por evaluar muchas de las especies de hormigas consideradas
como posibles precursores para la producción de alcaloides en esta rana, como
Solenopsis y Pheidole que son megadiversos. Sin embargo, los resultados del
presente estudio constituyen un paso muy importante para la comprensión del
fenómeno de producción de alcaloides, dado que, al no encontrarse producción de
alcaloides en ranas alimentadas con dieta monoespecífica, podrían plantearse
hipótesis alternas como la combinación de varias especies de hormigas en la dieta
(polifagia). El origen de la toxicidad en estas ranas también podría deberse a la
interacción de factores ambientales y genéticos. Por lo tanto, hacia el futuro se
plantea prioritario continuar con la cría artificial de la rana para realizar modelos
51
experimentales más complejos, por ejemplo de tipo factorial, que permitan dilucidar
la influencia o no de la dieta en la producción de alcaloides en D. truncatus.
11. CONSIDERACIONES FINALES Y CONCLUSIONES
Se estandarizaron las condiciones para el mantenimiento en cautiverio de la especie
de rana D. truncatus. Las condiciones ambientales en los terrarios temperatura
promedio mínima fue de 20 °C y la máxima de 30 °C, con un fotoperiodo normal de
12h luz día. Además se observó que la utilización de papel blanco absorbente como
sustrato de los terrarios puede ayudar a evaluar más fácilmente el consumo de
alimento por parte de la rana cuando las presas que se le ofrecen a estas son muy
pequeñas y difíciles de manipular.
De igual forma, también se estandarizaron el mantenimiento en cautiverio para las
especies de hormigas P. steinheili y W. auropunctata, las cuales se mantuvieron a la
misma temperatura y con el mismo fotoperiodo que las ranas. La dieta artificial
suministrada, la miel y el agua, fue bien recibida por parte de las dos especies.
Se observó que en condiciones de cautiverio D. truncatus presentó escogencia en el
tipo de alimentación, al presentar una selección positiva por la mosca de la fruta D.
melanogaster y la hormiga W. auropunctata, mientras que la selección fue negativa
para la otra especie de hormiga P. steinheili.
Los individuos en cautiverio de D. truncatus que fueron alimentados con D.
melanogaster y W. auropunctata no presentaron alcaloides en las muestras de piel ni
en las exudaciones. Este resultado sugiere la relación que existe entre la alimentación
y los alcaloides presentes en estas ranas ya que si esta función metabólica fuera
determinada únicamente por la constitución genética de la especie, entonces todas las
ranas, independientemente de la dieta, hubieran presentado alcaloides en sus pieles,
caso que no sucedió.
52
D. melanogaster y W. auropunctata presentaron alcaloides en sus extractos, los
cuales no se hallaron en las ranas alimentadas con estas dos especies, lo que sugiere
que debe existir un control genético del metabolismo para la toma de alcaloides
específico para cada especie de rana.
Ya que se observó que las ranas de Dendrobates truncatus nacidas y mantenidas en
cautiverio no generaron ningún alcaloide, sumándose que se tiene un protocolo
establecido de cría en cautiverio, y además, que no es una especie que se encuentra
en peligro de extinción, se presenta a D. truncatus como un buen modelo biológico
para desarrollar investigaciones en laboratorio encaminadas a conocer cual(es)
podrían ser las fuente(s) y la forma de captura de las histrionicotoxinas, las cual a hoy
en día no se conoce.
53
12. RECOMENDACIONES
1. Montar experimentos en cautiverio de alimentación con otro tipo de especies de
hormigas que han sido encontradas en los contenidos estomacales de D. truncatus,
para analizar como podrían estar afectando la toxicidad de la rana.
2. Tomar muestras de artrópodos en las zonas de hábitat de la rana y hacer estudios
por cromatografías de gases y espectrometría de masas, con el fin de identificar
alcaloides que puedan estar compartiendo con las ranas.
3. Ya que se ha documentado que las plantas poseen alcaloides, establecer en un
estudio de campo si existe una cadena biológica planta-artrópodo-vertebrado en la
captura de los alcaloides presentes en las ranas.
4. Implementar este tipo de estudios en cautiverio para evaluar la toxicidad y su
relación con la alimentación con otras especies de ranas venenosas de la familia
Dendrobatidae.
54
13. BIBLIOGRAFIA
1. Albuquerque, E., J. Daly & B. Witkop. 1971. Batrachotoxin: Chemistry and
Pharmacology. Science 172: 995-1002.
2. Badio, B., H. Garraffo., T. Spande & J. Daly. 1994. Epibatidine: Discovery
and definition as a potent analgesic and nicotinic agonist. Medical Chemistry
Research 4:440-448.
3. Caldwell, J. 1995. The evolution of myrmecophagy and its correlates in
poison frogs (Family Dendrobatidae). Journal Zoological London 240: 75-
101.
4. Cevikbas, A. 1978. Antibacterial activity in the skin secretion of the frog
Rana ridibunda. Toxicon 16:195-197.
5. Clark,V., C. Raxworthy., V. Rakotamalala., P. Sierwaid & B. Fisher.
2005. Convergent evolution of chemical defense in poison frogs and
arthropod prey between Madagascar and the neotropics. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America 102
(33):11617-11622.
6. Daly, J. 1995. The chemistry of poison in amphibian skin. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America 92:9-13.
7. Daly, J. 1998. Thirty years of discovering arthropod alkaloids in amphibian
skin. Journal of Naturals Products 61 (1):162-172.
55
8. Daly, J.W. 2003. Ernest Guenther Award in Chemestry of Natural Products.
Amphibian Skin: A remarkable source of biologically active arthropod
alkaloids. Journal of Medical Chemistry 46 (4):445-452.
9. Daly, J., G. Brown., M. Mensah-Dwumah & C. Myers. 1978. Classification
of skin alkaloids from neotropical poison-dart frogs (Dendrobatidae). Toxicon
16: 163-188.
10. Daly, J., C. Myers., J. Warnick & E. Albuquerque. 1980. Levels of
batrachotoxin and lack of sensitivity to its action in poisson dart frogs
(Phyllobates). Science 208: 1383-1385.
11. Daly, J., R. Highet & C. Myers. 1984. Occurrence of skin alkaloids in non-
dendrobatid frogs from Brazil (Bufonidae), Australia (Myobatrachidae) and
Madagascar (Mantellidae). Toxicon 22 (6): 905-919.
12. Daly, J., C. Myers & N. Whittaker. 1987. Further classification of skin
alkaloids from neotropical poison frogs (Dendrobatidae), with a general
survey of toxin/noxious substances in the amphibia. Toxicon 25 (10):1023-
1095.
13. Daly, J., S. Secunda., H. Garraffo., T. Spande., A. Wisnieski & J. Cover
Jr. 1992. Variability alkaloid profiles in neotropical poison frogs
(Dendrobatidae): genetics versus environmental determinants. Toxicon 30
(8):887-898.
14. Daly, J., H. Garraffo & T. Spande. 1993. Amphibian alkaloids. Vol. 43.
Cap. 3. págs. 185-288 en: G. A. Cordell (ed.) The Alkaloids. Academia Press.
San Diego.
56
15. Daly, J., H. Garraffo., T. Spande., C. Jaramillo & A. Stanley. 1994a.
Dietary source for skin alkaloids of poison frogs (Dendrobatidae)? Journal of
Chemical Ecology 20:943-955.
16. Daly, J., S. Secunda., H. Garraffo., T. Spande., A. Wisnieski & J. Cover
Jr. 1994b. An uptake system for dietary alkaloids in poison frogs
(Dendrobatidae). Toxicon 32: 657-663.
17. Daly, J., H. Garraffo., G. Hall & J. Cover Jr. 1997a. Absence of skin
alkaloids in captive-raised Madagascan mantelline frogs (Mantella) and
sequestration of dietary alkaloids. Toxicon 35 (7):1131-1135.
18. Daly, J., H. Garraffo & C. Myers. 1997b. The origin of frog skin alkaloids:
an enigma. Pharmaceutical News 4 (4):9-14.
19. Daly, J., H. Garraffo, T. Spande, M. Decker., J. Sullivan & M. Williams.
2000a. Alkaloids from frog skin: the discovery of epibatidine and the potential
for developing novel non-opioid analgesics. Natural Products Reports 17:131-
135.
20. Daly, J., H. Garraffo, P. Jain., T. Spande., R. Snelling., C. Jaramillo & S.
Rand. 2000b. Arthropod-frog connection: decahydroquinoline and
pyrrolizidine alkaloids common to microsympatric myrmicine ants and
dendrobatid frogs. Journal of Chemical Ecology. 26(1):73-85.
21. Daly, J., T. Kaneko., J. Wilham., H. Garraffo., T. Spande., A. Espinosa &
M. Donnelly. 2002. Bioactive alkaloids of frog skin: Combinatorial
bioprospecting reveals that pumiliotoxins have an arthropod source.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 99 (22):13996-14001.
57
22. Daly, J.W., H. Garraffo., T. Spande., V. Clark., J. Ma., H. Ziffer & J.
Cover Jr. 2003. Evidence for an enantioselective pumiliotoxin 7-hydroxylase
in dendrobatid poison frogs of the genus Dendrobates. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America 100
(19):11092-11097.
23. Donnelly, M. 1991. Feeding patterns of the strawberry poison frog,
Dendrobates pumilio (Anura: Dendrobatidae). Copeia (3):723-730.
24. Dumbacher, J., B. Beehler., T. Spande., M. Garraffo & J. Daly. 1992.
Homobatrachotoxin in the genus Pitohui: chemical defense in birds?. Science
258: 799-801.
25. Dumbacher, J., T. Spande & J. Daly. 2000. Batrachotoxin alkaloids from
passerine birds: a second toxic bird genus (Ifrita kowaldi) from New Guinea.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 97(24):12970-12975.
26. Dumbacher, J., A. Wako., S. Derrickson., A. Samuelson., T. Spande &. J.
Daly. 2004. Melyrid beetles (Choserine): a putative source for the
batrachotoxin alkaloids found in poison-dart frogs and toxic passerine birds.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 101(45):15857-15860.
27. Fernández, F. 2003a. Subfamilia Formicinae. Cap. 21. págs. 299-306 en: F.
Fernández (ed.) Introducción a las hormigas de la región neotropical. Instituto
de Investigación de Recurso Biológicos Alexander von Humboldt, Bogotá,
Colombia.
58
28. Fernández, F. 2003b. Subfamilia Myrmicinae. Cap. 22. págs. 307-330 en: F.
Fernández (ed.) Introducción a las hormigas de la región neotropical. Instituto
de Investigación de Recurso Biológicos Alexander von Humboldt, Bogotá,
Colombia.
29. Grant, J. & B. Land. 2002. Transcutaneous amphibian stimulator (TAS): a
device for the collection of amphibian skin secretions. Herpetological Review
33(1):38-41.
30. Howard, D. F., M. S. Blum, T. H. Jones & M. D. Tomalski. 1982.
Behavioral responses to an alkylpyrazine from the mandibular gland of the ant
Wasmannia auropunctata. Insectes Sociaux 29:369-374.
31. Jones, T., M. Blum., H. Fales & C. Thompson. 1980. (5Z, 8E)-3-Heptil-5-
methylpyrrolizidine from a thief ant. Journal of Organic Chemestry 45: 4778-
4780.
32. Jones, T., M. Blum & H. Fales. 1982. Ant venom alkaloids from Solenopsis
and Monomorium species: recent developments. Tetrahedron 38: 1949.
33. Jones, T., R. Higher., M. Blum & H. Fales. 1984. (5Z, 9Z)-3-Alkyl-5
methylindolizidine from Solenopsis (Diplorhoptrum) species. Journal of
Chemical Ecology 10: 1233.
34. Jones, T. H., J. Gorman., R. Snelling., J. Delabie., M. Blum., H.
Garraffo., P. Jain., J. Daly & T. Spande. 1999. Further alkaloids common
to ants and frogs: decahydroquinolines and a quinolizidine. Journal of
Chemical Ecology 25(5):1179-1193.
59
35. Keller, L., D. Cherix & P. Ulloa-Chacon. 1989. Decription of a new
artificial diet for rearing ant colonies as Iridomyrmex humilis, Monomorium
pharaonis and Wasmannia auropunctata (Hymenoptera; Formicidae). Insecte
Sociaux 36(4):348-352.
36. Lapa, A. J., E. X. Albuquerque, J. M. Sarvey, J. Daly & B. Witkop. 1975.
Effects of the histrionicotoxin on the chemosensitive and electrical propierties
of skeletal muscle. Experimental Neurology 47:558.
37. Longino, J. T. 2003. Wasmannia auropunctata (Roger 1863) [en línea]:
<http://www.evergreen.edu/ants/genera/paratrechina/species/auropunctata/aur
opunctata.html [Consulta 12 feb. 2005].
38. Longino, J. T. 2004. Paratrechina steinheili (Forel 1893) [en línea]:
<http://www.evergreen.edu/ants/genera/paratrechina/species/steinheili/steinhe
ili.html [Consulta 12 feb. 2005].
39. Mensah-Dwumah, M. & J. Daly. 1978. Pharmacological activity of
alkaloids from poison-dart frogs (Dendrobatidae). Toxicon 16:189-194.
40. Merck, E. 1980. Dyeing reagents for thin layer and paper chromatography.
Federal Republic of Germany. 114p.
41. Myers, C. & J. Daly. 1976. Preliminary evaluation of skin toxins and
vocalizations in taxonomic and evolutionary studies of poison-dart frogs
(Dendrobatidae). Bulletin of the Museum of the Natural History 157(3):177-
259.
42. Myers, C. & J. Daly. 1983. Dart-poison frogs. Scientific American
248(2):120-133.
60
43. Osorio, D. 2003. Caracterización de la dieta de Dendrobates histrionicus
(Anura: Dendrobatidae) y su relación con la producción de toxinas. Trabajo
de grado presentado como requisito para optar el título de Biólogo con
mención en Zoología. Facultad de Ciencias, Universidad del Valle. 43 p.
44. Páez, V. P., B. C. Bock., J. J. Estrada., A. M. Ortega., J. M. Daza & P. D.
Gutiérrez-C. 2002. Guía de Campo de Algunas Especies de Anfibios y
Reptiles de Antioquia. Conciencias, Universidad de Antioquia y Universidad
Nacional de Colombia (sede Medellín). Medellín. 136 p.
45. Roberts, D. & Standen, G. 1998. Drosophila: a practical approach. Second
edition. IRL Press at Oxford University.
46. Sanabria, A. 1983. Análisis fitoquímico preliminar: metodología y su
aplicación en la evaluación de 40 plantas de la familia Compositae. Facultad
de Ciencias, departamento de Farmacia, Universidad Nacional de Colombia
113 p.
47. Saporito, R., H. Garraffo., M. Donnelly., A. Edwards., J. Longino & J.
Daly. 2004. Formicine ants: an arthropod source for the pumiliotoxin
alkaloids of dendrobatid poison frogs. Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America 101 (21):8045-8050.
48. Schöpf, C. 1961. Structure of salamander alkaloids. Experientia 17:285-295.
49. Silverstone, P. 1975. A revision of the poison-arrow frogs of the genus
Dendrobates Wangler. Natural History Museum of Los Angeles County
Science Bulletin 21: 49-55.
61
50. Smith, S. & T. Jones. 2004. Tracking the cryptic pumiliotoxins. Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of America 101
(21):7841-7842
51. Smith, B., M. Tyler., T. Kaneko., H. Garraffo., T. Spande & J. Daly.
2002. Evidence for biosynthesis of pseudophrynamine alkaloids by an
Australian myobatrachid frog (Pseudophryne) and for sequestration of dietary
pumiliotoxins. Journal of Natural Products 65 (4):439-447
52. Spande, T., P. Jain., H. Garraffo., L. Pannell., H. Yeh, J. Daly., S.
Fukumoto., K. Imamua., T. Tokuyama., J. Torres., R. Snelling & T.
Jones. 1999. Occurrence and significance of decahydroquinolines from
dendrobatid poison frogs and myrmicine ant: use of 1H and 13C NMR in their
conformational analysis. Journal of Natural Products 62:5-21.
53. Takada, W., T. Sakata., S. Shimano., Y. Enami., N. Mori., R. Nishida &
Y. Kuwahara. 2005. Scheloribatid mites as the source of pumiliotoxins in
dendrobatid frogs. Journal of Chemical Ecology 31 (10):2403-2415.
54. Toft, C. 1981. Feeding ecology of Panamanian litter anurans: patterns in diet
and foraging mode. Journal of Herpetology 15(2):139-144.
55. Toft, C. 1995. Evolution of diet specialization in poison-dart frogs
(Dendrobatidae). Herpetologica 51 (2):202-216.
56. Ulloa-Chacón, P. & D. Cherix. 1990. The little fire ant Wasmannia
auropunctata (R.) (Hymenoptera: Formicidae). págs. 281-289 en: R. K.
Vander Meer, K. Jaffe & A. Cedeno (eds). Applied myrmecology: a world
perspective. Westview Press, Boulder, CO. 741 p.
62
57. Zambrano, G. 2000. Determinación de la dieta en dos poblaciones de
Dendrobates truncatus (Anura: Dendrobatidae) y su relación con los niveles
de toxicidad. Trabajo de grado presentado como requisito para optar el título
de Biólogo. Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia 99 p.
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