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Procedimientos invasivos para el diagn óstico de las anomalías
cromos ómicas fetales
Antoni Borrell
Hospital Clínic de Barcelona
Perspectivas de futuro del diagnóstico prenatal de las
anomalías cromosómicas fetales
Procedimientos invasivos para el diagn óstico de las anomalías
cromos ómicas fetales:
PASADO
Tasa procedimientos invasivos(REDCBarcelona 1992-2009)
16
2119 19
2527 28
3034 34
31 31
41
33 33
2826
22
56
69
64
57
63
58
70
65
70
60 59 58
71
57
51 52 53
38
8
1310 9
1618
1618
2123
1921
26
20 2016
12 12
0
10
20
30
40
50
60
70
80
92 93 94 95 96 97 98 99 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
totalEdat 35+Edat<35
Cribra do secuencialcon interpretación independente
• ~ 8% edad materna avanzada• ~ 5% TN aumentada• ~10% screening bioquímico positivo• ~ 6% angustia• ~ 1% marcadores ecografía 20 semanas
• 30% procedimientos invasivos• 85% detección T21
Evolución AC y BC HCB
10
104
188264
316
409
501441 442 430
369 344312 318
359400
509
418491
426388 381372
411 385
1981 86
154
383
542
837 814
9581033
965921
720
815736 724
657620
531 530 560621
731661
606528
483 492 488
267
154
0
200
400
600
800
1000
80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 0 2 4 6 8 10.
Procedimientos invasivos para el diagn óstico de las anomalías
cromos ómicas fetales:
PRESENTE
Amniocentesis
Obtención de líquido amniótico por punción transabdominal
Biopsia Corial
Obtención de vellosidades coriales por vía transcervical/transabdominal
Indicaciones
Indicación AC BC
Alto riesgo aneuploidia
- edad materna avanzada
- cribado bioquímico 2o trimestre
- cribado combinado 1r trimestre
- anomalía parental
- anomalía previa
- anomalía fetal 2t 1t
Estudios moleculares/bioquímicos
Infección fetal/amniótica
Edad gestacional
AC
< 14 s. nunca14 s. excepcionalmente15 s. si membranas coaptadas
≥ 16 s. idonea
BC
< 10 s. nunca10-14 s. TC≥ 11 s. TA
Riesgo elevado RPM y malposiciónextremidades
Nicolaides. Lancet, 1994
Asociado a defectos de reducción de extremidades e hipoplasia oromandibular
Dolk. Lancet, 1992
• Grupo y RhD
• Serologías víricas– VIH– VHB– VHC si factores de riesgo
Preprocedimiento
Evaluar riesgo-beneficioVIH: CV, HAART
VHB: HBeAg,DNA
VHC: DNA
AC mejor BC?
Lopez & Coll, Fetal Diagn Ther 2010
Técnica procedimiento : AC
– Técnica ambulatoria
– Control ecográfico:• previo a punción
• punción ecoguiada• aspiración ecoguiadaRomero et al. Obstet Gynecol 1995
– Aguja 22-20G
- Punción transplacentaria• si es el acceso más fàcil al pool de LA
VentajasAmnio -Vacutainer
• Aspiración más sencilla– no se necesita un segundo operador o
dejar la sonda ecográfica– colocación de vacutainers por auxiliar
• Menor manipulación• Mejor transporte
Borrell et al.,Prenat Diagn 2008
Técnica procedimiento BC
• Procedimiento ambulatorio
• Control ecográfico continuo
• TC– Pinza– Cánula
• TA− aguja 18-20 G− doble aguja− cánula 18G +pinza
Dolor-Anestesia subcutánea AC:
no diferencias RCOG 2010
-AC en zona más baja, más dolor
-Scores de dolor Csaba,0641 BC-TA35 AC26 BC-TC
-BC: TA más dolorosa en obesas
TC más dolorosa en nulíparasWax,09
• Gammaglobulina anti-D si RhD negativo
• VHB: IG específica (600UI) en:- HBeAg o DNA positivo- AC transplacentaria o en tercer trimestre
• Reposo 24 h.
• Dolor abdominal: AC, BC-TA
• Sangrado vaginal: BC-TC
• Riesgo de amniorrexis
• Riesgo de pérdida fetal
Postprocedimiento
AC: riesgo de pérdida fetal
Estudio Randomizado Tabor,1986
en 4606 mujeres bajo riesgo: 1% exceso (1.7% vs 0.7%)
Cochrane Review Alfirevic & Mujezinovik, 2003
5 estudios con grupo control: 0,6% exceso de pérdida
Centros con experiencia
0,13% exceso de pérdida (CI 0,07-0,20).Odibo,2007
Amniocentesis de tercer trimestretercer trimestretercer trimestretercer trimestre (Hodor, 2007’
no aumenta riesgo de RPM, DPPNI, exitus fetal, cesarea urgente
BC: Riesgo de perdida fetal
No estudios randomizados: BC vs Control
MetaanálisisAlfirevic, 2007
Cohorte Danesa: > 60000 gestantes. AC 1.4% - BC-1.9% (Tabor,2009)
Grupo control: No exceso riesgo BC. No diferencias TC vs TA (Odibo, 2008)
Randomización (US) TC (2.5%) vs. TA (2.3%) (Jackson, 1992)
AC BC
antes 14 d.
0.6 0.7
total 1.9 2.0
Pèrdida < 24 s. (Caughey,06’
AC•Comparación ginecológo-perinatólogo (Blessed,01)
0.3% vs 0.03% en 30 dias post-AC
• Comparación con la experiencia anual (Stone,04)
0.3% vs 0.03% en 30 dias post-AC segun </> 50 AC anuales
Pérdida fetal: Experiencia operador
BC40% más de riesgo de perdida fetal (OR 1,4)
según <1000 />1500 proc ( periodo de estudio 11 años)(Tabor, 2009)
Pérdida fetal Estudio randomizado HCB
• 301 BC vs. 335 AC
• Pérdida fetal espontanea hasta 1 s. post-parto :– BC 2.3% (7/301)– AC 2.4% (8/335)– by intention to treat: 2.3% vs. 2.3%– by actual treatment: 2.3% vs. 2.4%
• Pérdida fetal 2 s. post-procedimiento:– BC 1.7% (5/301)– AC 0.9% (3/335)
Borrell, 1999
RIESGO AMNIOCENTESIS: ¿0.06%?
1% vs. 0.94% hasta 24 s.
RIESGO ABORTO:
- edad materna- peso- etnicidad- pérdidas previas- diabetes mellitus- inducción ovulación- PAPP-A bajo- DV reverso- TN aumentada
No resultado en AC y BC
• RIESGO DE NO OBTENER MUESTRA (< 1%)• AC: 2 punciones blancas• BC-TC: Estenosis cervical • BC-TA: No acceso al corion
• RIESGO DE NO OBTENER UN CARIOTIPO (<1%)• AC: 0.5% fallo cultivo• BC directo: no hay cultivo
Fiabilidad de AC y BC
• FALSOS POSITIVOSAC: Pseudo/mosaicos (0.9%)BC: Resultado no conclusivo: mosaico/ anomalíaconfinada placenta (2%)
• FALSOS NEGATIVOSAC: Contaminación materna (<1%)BC directo: 0.4% pero 9/10 anomalías ecográficas
(van denBerg,06)BC directo+cultivo 0.08%
¿QF-PCR en todas las amnios ?
No es necesario, sólo sirve per avanzar el resultado
¿QF-PCR substituyendo el cariotipo ?
Quizas sí, en casos de edad materna avanzada y screening de 2 trimestre
En gemelos : ¿AC o BC?
• RIESGO DE CONFUSION DE MUESTRAS EN DC DA- AC: NO (no fluoresceina)- BC: 1% en 2 placentas adyacentes
• RIESGO DE PERDIDA FETAL
- AC: 2%2%2%2% Yukobowich,01 en 476 gemelares- BC: 1%
• PRECOCIDAD RESULTADO riesgo interrupción selectiva 1 gemelo DC:
• 5% < 16 s.• 10% 16-20 s.• 15% > 20 s.
¿Una o dos entradas ?
• DICORIALES: SI
• MONOCORIALES DIAMNIOTICOS: NO, a no ser que exista una anomalíadiscordante
• MONOCORIALES MONOAMNIOTICOS NO es posible
Conclusiones1) La edad materna no debería considerarse indicación de
procedimiento invasivo2) Los estudios genéticos y cromosómicos precisan de la
extracción de material fetal mediante un procedimiento invasivo
3) Los procedimientos invasivos comportan un cierto riesgo de pérdida fetal Indicación clara
4) La AC se realiza a partir de la semana 15, idealmente en la semana 16
5) La BC es una técnica que se realiza precozmente Ventajas
6) En manos expertas, la biopsia corial y la amniocentesis tienen similar tasa de complicaciones.
7) Un programa de cribado precoz debe disponer de un método diagnóstico precoz
Procedimientos invasivos para el diagn óstico de las anomalías
cromos ómicas fetales:
FUTURO
Dos escenarios de futuro
1. Abandono: Diagnóstico prenatal no invasivo
2. Universalización: Estudio genómico masivo
Cell-free fetal DNA (cffDNA) en circulación materna
• Descubrimiento del DNA fetal libre (cffDNA) abrió nuevas perspectivas
• 1947: hallazgo DNA extracelular
• 1977: aumento DNA libre en pacientes cancer
• 1997: secuencias del cromosoma Y en sangrede gestantes portadoras de fetos masculinos(Lo,97)
Caracteristícas cffDNA/RNA
• Cuantificación cffDNA en plasma:– 3% en segundo trimestre– 6% en tercer trimestre– 10% estimaciones más recientes en T21
• Persistencia cffDNA: eliminación en 2h post-parto en 7/8 gestants y en todas en 2 d. (Lo,99). Vida media 16 min.
• Presencia RNA específico de la placenta (ZFY) en plasma materno (Poo,00).
Diagnóstico Prenatal no invasivo
Al haber mucho más DNA librematerno que fetal, sólo es factible identificar las secuencias de origen paterno ausentes en la madre:
1) determinación sexo: cromosoma Y
2) RhD en gestantes RhD negativas3) mutaciones paternas
DPNI aneuploidías
1) Selección ácidos nucleicosespecíficos fetales:
- mRNA: “RNA-SNP allelic ratio”- DNA metilado: “epigenetic allelic ratio”
2) Dosificación cromosómica relativa- Massively Parallel Sequencing (MPS)
RNA Allelic Ratio
• Localización selectiva ácidos nucleicosfetales:– DNA: gen maspin (c18) imprintado en madre
y no metilado en placenta– RNA: transcrits PLAC4 (c21): cffRNA de un
gen que sólo se expresa en la placenta
• Dosificación cromosómica– “Allelic ratio”: analisis de unos locus
heterozigotos de SNPs (diferencia únicooligonucleotido entre genomas paterno y materno) localizados en el gen estudiado.
Normal
Fetus(heterozygote)
Down
syndrome
Fetus(heterozygote)
1. Transcribed SNP
locus on 21st
chromosome
2. RNA expressed
in placenta
3. Circulating
placental RNA in
maternal plasma
transcription release into circulation
G
A
A
G
G
4. Measure
G/A ratio
1:1
2:1
Testing strategy for Down syndromeheterozygous on one SNP (Lo YMD et al., 2007)
Normal
Fetus(heterozygote)
Down
syndrome
Fetus(heterozygote)
1. Transcribed SNP
locus on 21st
chromosome
2. RNA expressed
in placenta
3. Circulating
placental RNA in
maternal plasma
transcription release into circulation
G
A
A
G
4. Measure
G/A ratio
1:1
1:2
Testing strategy for Down syndromeheterozygous on one SNP – 1:2 (Lo YMD et al., 2007)
A
Normal
Fetus(homozygous)
Down
syndrome
Fetus(homozygous)
1. Transcribed SNP
locus on 21st
chromosome
2. RNA expressed
in placenta
3. Circulating
placental RNA in
maternal plasma
transcription release into circulation
A
A
4. Measure
G/A ratio
?
?
Testing strategy for Down syndromehomozygous on one SNP (Lo YMD et al., 2007)
A
A
A
The RNA Study(RNA-based Non-invasive testing for Aneuploidy)
Jacob A. Canick & Glenn E. Palomaki
Co- Principal InvestigatorsWomen & Infants Hospital
Alpert Medical School of Brown University
An independent observational study funded by Sequenom, Inc.
BROWNBROWNBROWNBROWNWomen & InfantsWomen & InfantsWomen & InfantsWomen & Infants
V4.1
• Regiones diferentementemetiladas (DMR) en el cromosoma 21
• Enriquecimiento de regioneshipermetiladas (DMR) del cromosoma 21 fetal
• Analisis discriminante muestra8 DMR útiles
The Concept
Relative amount of chromosome 21Normal Mother Normal Fetus
18 copies + 2 copies20 copies
18 copies + 3 copies21 copies
Relative amount of chromosome 21Normal Mother Down syndrome
Fetus
Need to distinguish 21 copies from 20 copies, a 5% difference.(assumes 10% of ccfDNA is fetal)
But fetal and maternal DNA are not distinguishable in MPS
Relative amount of chromosome 21
18 copies + 2 copies20 copies
18 copies + 3 copies21 copies
Relative amount of chromosome 21
Need to distinguish 21 copies from 20 copies, a 5% difference.(assumes 10% of ccfDNA is fetal)
Schematic illustration of the procedural framework for using massively parallel genomic sequencing for the nonin vasive
prenatal detection of fetal chromosomal aneuploidy.
Chiu R W K et al. PNAS 2008;105:20458
Schematic illustration (cont)
Chiu R W K et al. PNAS 2008;105:20458
%chr21 = 1 / 51 = 2%
Chiu R W K et al. PNAS 2008;105:20458
Schematic illustration (cont)
`
2.012.001.982.022.031.99------2.01 (sd=0.02)
2.11(2.11 – 2.01)
Z = ---------------- = 5.0 0.02
Percent unique reads and corresponding z-score for chromosome 21, on 28 maternal plasma samples
Chiu R W K et al. PNAS 2008;105:20458
% of all unique reads
Z-score
Black genomic representationBlue normal male
Orange normal femaleGreen T21 maleRed T21 female
Normal range
• ¿Cuando estará a punto?
• ¿Screening o diagnóstico?
• ¿Sólo para T21?
Consideraciones finales DPNI
Alteraciones DNA
• A. genómica: anomalía cromosómicanumérica
Alteraciones DNA
• A. genómica: anomalía cromosómicanumérica
• A. cromosómica: anomalía cromosómicaestructural
Síndromes microdelecionals
Alteraciones DNA
• A. genómica: anomalía cromosómicanumérica
• A. cromosómica: anomalía cromosómicaestructural
• A. génica: cambio de un par de bases
Resolución técnicas de citogenética
CGH-array10Kb-1Mb
CITOGENETICA CONVENCIONAL
~10 Mb
CITOGENETICAMOLECULAR
FISH~130 Kb
(sonda-específica)
3.000 Mb
CGH-array
CGH-array
CGH-array
CGH-array
CGH-array
¿Procedimentos invasivos?
1) ABANDONO: El DPNI de la trisomia 21 fetal está en fase de estudio y sufuturo inmediato dependerá en gran medida de los resultados de los proyectos en marcha basados en MPS.
2) UNIVERSALIZACIÓN: es una posibilidad futura, cuando un estudio exhaustivo de anomalías genéticasno comporte ni tantas dudas en suinterpretación (CNV), ni unos costos tan altos.
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