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Propagación in vitro de la cactácea Echinocactus platyacanthus
Resumen Echinocactus platyacanthus es una cactácea mexicana que se distribuye únicamente en los
estados de Chihuahua, Coahuila, Hidalgo, Guanajuato, Nuevo León, San Luis Potosí,
Tamaulipas y Zacatecas. Esta especie es de crecimiento lento y cuenta con pocos individuos
jóvenes en la población natural; su uso no permitido en dulces tradicionales y forraje de
ganado hacen de ella una especie vulnerable por tanto está enlistada en la NOM-059-
SEMARNAT-2010 como "sujeta a protección especial", en la Lista Roja de la IUCN y
apéndice II de CITES.
Su importancia biológica, ecológica y económica hacen que la urgencia de conservarla sea
propagada por cualquier método, sin embargo las formas tradicionales de propagación ya no
son efectivas para abastecer la demanda del mercado comercial. Debido a su lenta
reproducción, al saqueo ilegal de sus poblaciones y a la poca tolerancia a cambios abruptos
en su hábitat, es necesario implementar nuevas tecnologías que permitan disminuir las
presiones que existen en las poblaciones naturales. Se propone el Cultivo de Tejidos
Vegetales como una opción viable para su conservación ya que permite propagar numerosas
especies a gran escala (Mammillaria, Turbinicarpus, Pelecyphora, Strombocactus entre
otros), a partir de estructuras somáticas a mediano plazo.
Este trabajo se centra en la propagación in vitro de E. platyacanthus a partir de 25 semillas
que se germinaron en medio Murashige & Skoog (MS) 50/100 y 100% (al 50% de sus
componentes inorgánicos y 100% de orgánicos; al 100% de todos sus componentes), y 25
semillas en condiciones de invernadero, de las cuales, germinaron 14 al cabo de 22 días, y
11 en 4 semanas respectivamente. Posteriormente se seleccionaron cuatro plántulas
germinadas in vitro y se les hizo un corte transversal para sembrarlas en medio MS (50/100 y
100%) suplementado con ANA/BAP (0/0; 0/1; 1/0 y 1/1 mg/L). La respuesta de los explantes
en dichos medios adicionados con hormonas se evaluó semanalmente. Se observó
desarrollo de callo de tipo friable y en algunos casos continuó el desarrollo de raíces y
espinas del explante original. Debido a un estrés lumínico, los ejemplares sufrieron una
severa oxidación que no permitió continuar con el proyecto por la falta de material vegetal.
3 Introducción
La Biotecnología es la ciencia que se refiere a toda aplicación tecnológica que utiliza
sistemas biológicos y organismos vivos para la creación o modificación de productos o
procesos para usos específicos (Convenio sobre la Diversidad Biológica, Naciones Unidas,
1999). Esta ofrece herramientas para un desarrollo sostenible de la agricultura y contribuye a
satisfacer las necesidades de una población en crecimiento. Uno de los procedimientos más
importantes en la Biotecnología es el Cultivo de Tejidos Vegetales (CTV) que se refiere al
conjunto de metodologías usadas para obtener plantas completas a partir de pequeñas
fracciones de tejido (explantes) en medios nutritivos bajo situaciones controladas de luz,
temperatura, pH y humedad. Se utiliza para obtener copias idénticas de plantas en poco
tiempo (Olivera, 2013).
Existen tres vías de multiplicación in vitro:
1. Organogénesis: formación de órganos adventicios, como tallos, hojas y raíces. Puede
tener una fase intermedia de desarrollo de callo.
2. Embriogénesis somática: formación de embriones que no provienen de la fusión de
gametos masculino y femenino, sino que se desarrollan de una célula de cualquier
parte de la planta. Puede tener una fase intermedia de desarrollo de callo.
3. Multiplicación a partir de yemas preformadas: éstas se pueden encontrar en la base
de las hojas. Las yemas se desarrollarán en tallo luego de ser puestas en contacto
con los medios de cultivo (González et al., 2012)
Los reguladores de crecimiento vegetal (RCV), también llamadas hormonas vegetales, son
sustancias producidas por células en sitios estratégicos de la planta y que actúan sobre otras
células como mensajeros químicos. Son capaces de regular de manera predominante los
fenómenos fisiológicos de la planta. Son un factor interno que incide en el desarrollo de una
planta, dentro de los procesos que regulan, se encuentran los de correlación, es decir, que
recibido el estímulo en un órgano, lo amplifica, traduce y genera una respuesta en otra parte
de la planta. Los más utilizados en el CTV son las auxinas y citocininas (Ácido α-
naftalenacético (ANA) y 6-N-Bencilaminopurina (BAP)). Se puede señalar que una mayor
concentración exógena de citocinina que de auxina favorecerá el desarrollo de hojas y tallos;
un balance a favor de las auxinas promoverá el desarrollo de raíces y callo. Concentraciones
4 relativamente altas de auxinas en presencia o no de citocininas promoverían el desarrollo de
embriones somáticos (González et al., 2012)
Es importante mencionar que el CTV ha resultado exitoso en varios miembros de la familia
Cactaceae (Mammillaria, Turbinicarpus, Pelecyphora, Strombocactus entre otros), en donde
los brotes en la propagación in vitro crecen más rápido y en mayor cantidad en comparación
con el cultivo tradicional (Machado y Prioli, 1996).
El estudio de las cactáceas actualmente ha cobrado un enorme interés, hecho que se
sustenta en los diversos valores de uso que se les adjudica: ornamental, medicinal y
alimentario principalmente (Díaz et al., 2008).
Una cactácea mexicana que merece especial atención es Echinocactus platyacanthus;
endémica de México que se distribuye en la mitad sur del desierto de Chihuahua, en
Coahuila, Guanajuato, Hidalgo, Nuevo León, Querétaro, San Luis Potosí, Tamaulipas,
Zacatecas, Puebla y Oaxaca. Junto con Ferocactus histrix, es el cactus barril más abundante
y extendido en México.
Marco teórico
Los cactos (o cactus) son nativos de América –con excepción de la Rhipsalis baccifera, que
se extiende a lo largo de África tropical- y se distribuyen desde el sur de Canadá hasta
Argentina, siendo México el país que posee la mayor diversidad de especies dentro de este
grupo, además de un alto índice (78%) de endemismo (Hernández y Godínez, 1994). A su
vez, la familia Cactaceae se divide en cuatro subfamilias: Pereskioideae, Opuntioideae,
Maihuenioideae y Cactoideae (Anderson, 2001).
Existen alrededor de 1400 especies, de las cuales 669 son mexicanas y 518 de ellas son
endémicas (Guzmán et al, 2003.)
Morfología
La estructura distintiva en la familia de las cactáceas es la aréola, que está especializada en
producir espinas, vástagos, y en ocasiones flores. La aréola se encuentra sobre podarios y
costillas, generalmente mantienen dos zonas de crecimiento: en la parte superior, se hallan
los meristemos floríferos, y en la inferior, los que producen las espinas. En algunas
ocasiones, las aréolas desarrollan tricomas (pelos) que se asemejan a las fibras del algodón.
5 El tallo conforma casi en su totalidad el cuerpo de la planta, está engrosado por el desarrollo
del parénquima, generalmente es de color verde. El tallo puede adquirir tres formas distintas:
cladodio (tallo aplanado en forma de raqueta), tallo columnar (forma cilíndrica con o sin
ramificaciones) y tallo globoso (casi esférico, con forma de barril). El tallo es una estructura
hinchada y carnosa, adaptada para la acumulación de agua, está diseñado de tal forma que
conduce el agua directamente a las raíces. Las flores de los cactus comúnmente tienden a
ser grandes, vistosas, además de presentarse aisladas.
➢ Echinocactus platyacanthus
E. platyacanthus es una cactácea toneliforme, verde amarillenta y
muy maciza. Los ejemplares adultos miden aproximadamente de
0.5 a 2 m de altura y de 0.4 a 0.8 m de ancho. Esta especie
requiere ser conservada, ya que se reproduce lentamente y no
tolera la alteración de su hábitat, sin una mayor protección podría
verse amenazada. Parte de su distribución se encuentra dentro del
Área Natural Protegida del Real de Guadalcázar y la Reserva de la
Biosfera Tehuacán-Cuicatlán (Jiménez, 2012). Es afectada
severamente debido a la destrucción de su hábitat natural por el cambio de uso de suelo
(agricultura y ganadería), asentamientos humanos, y por la extracción ilegal para su
comercialización (Álvarez, 1997; Huerta y Escobar 1998; Casas et al. 1999). Precisamente
por esto se encuentra sujeta a protección especial en la NOM-059-SEMARNAT-2010
(SEMARNAT, 2010), en la lista roja de la IUCN y en el apéndice II de CITES. La regulación
de su uso en dulces y forrajes es necesaria para proteger a ésta especie de una baja más
rápida. Estudios sobre la demografía de esta especie sugieren que su conservación sólo
puede lograrse si se interrumpe la remoción y destrucción de individuos adultos, dado que su
valor se aproxima apenas a uno (Jiménez, 2012).
➢ Mammillaria schiedeana
Es una especie endémica de México, particularmente de los estados de Guanajuato, Hidalgo,
Querétaro, San Luis Potosí y Tamaulipas. Crece en elevaciones de 1.300 a 1.600 m sobre el
nivel del mar, en piedra caliza y laderas rocosas. Hasta ahora se conocen otras dos
subespecies, Mammillaria schiedeana subs. dumetorum y Mammillaria schiedeana subs. giselae. También conocida como Biznaga de Metztitlán. Es una planta pequeña, con tallos
cespitosos de 2.5 a 10 cm de alto y 2 a 4 cm de diámetro. Por su forma y su color dorado en
6 las espinas es una planta muy apreciada por los coleccionistas. Es recolectada ilegalmente
para después ser vendida como ornamento. Está catalogada como amenazada de extinción
en la NOM-059-SEMARNAT-2010, vulnerable en la lista de la IUCN y CITES (apéndice II),
debido a su restringido rango de distribución, escasa
producción de semillas y baja tasa de germinación.
La pérdida de estas especies tendrían
consecuencias negativas a nivel ecológico, económico y
cultural, por ende es urgente contar con un sistema
eficiente en aras de su propagación como el Cultivo de
Tejidos Vegetales, que permite multiplicar cantidades
masivas de plantas en poco tiempo y a gran escala a partir de tejidos somáticos (Morgan,
2008).
El presente trabajo describe la propagación in vitro de Echinocactus platyacanthus y
Mammillaria schiedeana, con el propósito de generar un protocolo que permita obtener plantas completas, como una alternativa para evitar su extinción.
Objetivo general
● Desarrollar un protocolo que permita la propagación in vitro de Echinocactus
platyacanthus. Objetivos particulares
● Lograr el establecimiento aséptico de la especie E. platyacanthus.
● Evaluar la germinación de E. platyacanthus, en medios de cultivo MS al 100 % y
50/100 .
● Conocer las respuestas de los tejidos al estímulo de los reguladores del crecimiento
vegetal ANA y BAP en diferentes concentraciones en plántulas germinadas in vitro de
E. platyacanthus.
Problema La especie E. platyacanthus es muy común, pero es de crecimiento lento lo que la hace
vulnerable a su eliminación. El tiempo de generación puede ser de 100 años o más; su
7 crecimiento en el campo es tan lento que las plántulas de dos años llegan a tener sólo 2.5 cm
de altura. Tiene una densidad promedio estimada de 15 individuos/hectárea (Hernández et
al., 2013)
Se encuentra en riesgo por factores que inciden negativamente en su supervivencia como el
uso de sus frutos en dulces tradicionales (acitrón). También se utiliza como forraje vivo para
cabras y burros que se alimentan de las estructuras reproductivas (flores y frutas) así como
también de los tallos sin espinas (Jiménez, 2012). Debido a su lento crecimiento, baja tasa
de germinación y la amenaza bajo la que se encuentra es un candidato potencial para ser propagado por Cultivo de Tejidos Vegetales.
Hipótesis
La propagación de la especie Echinocactus platyacanthus mediante el Cultivo de Tejidos
Vegetales y Reguladores de Crecimiento Vegetal será más rápida que por propagación en
condiciones naturales . Metodología
El proceso se llevó a cabo en Laboratorio LACE de Biología y el Invernadero del plantel.
Material biológico:
Se empleó un lote de 50 semillas de Echinocactus platyacanthus y 50 de Mammillaria
schiedeana donadas por el Jardín Botánico de la UNAM.
Material para medio de cultivo:
● Agua destilada
● Vaso de precipitados de 1L
● Probeta de 100 ml y 1L
● Stocks de macro y micronutrientes, sacarosa y agar
● Parrilla de agitación
● Tiras de pH, hidróxido de sodio 1M y ácido clorhídrico 1M
● 30 frascos de vidrio con tapa de capacidad de 115 ml con
tapa
Material para desinfección:
● Agua destilada
● 4 vasos de precipitados de 500 ml
● Solución jabonosa (detergente líquido)
8
● Alcohol al 70%
● Solución de hipoclorito de sodio al 30% v/v
Material para siembra:
● 4 Pinzas
● 4 Bisturíes
● 8 Cajas petri
● Campana de flujo laminar
● Frasco con alcohol 96% para instrumental
● Rollo plástico de Egapack
Prueba de viabilidad
● 1gr de cloruro de Tetrazolio en
● Agua destilada
Procedimiento: Elaboración de medio de cultivo: En una parrilla de agitación
se preparó medio de cultivo MS agregando los stocks (Tabla
1) al agua destilada en una concentración 50/100 (al 50% de
sus componentes inorgánicos y 100% de orgánicos) y 100%
(al 100% de todos sus componentes) para la germinación de
las semillas y medio MS 50/100 suplementado con ANA/BAP
(0/0; 0/1; 1/0 y 1/1 mg/L) para las plántulas regeneradas in
vitro. Se agregó la sacarosa, se ajustó el pH a 5.7 con ayuda
de hidróxido de sodio 1M o ácido clorhídrico 1M y finalmente
se agregó el agar. Posteriormente se vació 25 ml en cada
frasco y se esterilizó en autoclave junto con pinzas de
disección, bisturíes y cajas petri. Estos se mantuvieron
cerrados hasta la siembra.
Desinfección de semillas.
Las semillas se lavaron con agua destilada y detergente líquido en agitación constante en
una parrilla de agitación magnética durante 15 minutos. Después se sumergieron en alcohol
etílico al 70%, durante 1 minuto en agitación constante; enseguida se sumergieron en una
solución al 30% v/v de hipoclorito de sodio. Bajo condiciones asépticas, en una campana de
9 flujo laminar, para eliminar los restos de hipoclorito de sodio se enjuagaron tres veces con
agua destilada estéril. Las semillas se colocaron en una caja Petri y con la ayuda de pinzas
de disección se sembraron 12 semillas de E. platyacanthus en medio de cultivo MS 50/100 y
13 semillas en MS 100% (Figura 1). Se realizó lo mismo con las semillas de Mammillaria
schiedeana.
Siembra in vitro y en invernadero
Dentro de la campana de flujo laminar, previamente desinfectada con alcohol al 96° se
destapó cada frasco y se colocó la tapa hacia arriba cerca del mechero. Con ayuda de pinzas
de disección, se colocaron entre cinco y cuatro semillas por frasco. Se tomó la tapa y se pasó
rápidamente por la flama y se tapó el frasco con las semillas. Los bordes de la tapa se
sellaron usando un rollo de plástico (Egapack). Los frascos se mantuvieron en un sitio donde
recibieron luz suficiente de dieciséis horas y ocho horas de oscuridad; y una temperatura
aproximada de 25°C.
Para ambas especies se realizó un grupo control in vitro y en sustrato. En las instalaciones
del invernadero se sembraron 25 semillas en una charola de germinación con sustrato
(esterilizado) para cactáceas (Tepojal, composta y tierra negra (3:1:1)). Se regaron una vez
por semana y se monitorearon hasta su germinación.
Prueba de viabilidad
Se disolvió 1gr de cloruro de Tetrazolio en 100ml de agua destilada, se rompió la testa para
exponer al embrión a la solución y se humedecieron con Tetrazolio en una caja petri, ésta se
mantiene 24 horas en la oscuridad para evitar que la luz interfiera con las reacciones de
oxidación del embrión. Pasado este tiempo se observó en cada parte seccionada de la
semilla su coloración.
Multiplicación de brotes
Después de 60 días a partir de la germinación de E. platyacanthus, de la concentración
50/100 se eligieron cuatro plántulas de 5mm o más de altura que habían desarrollado raíz.
Se les realizó un corte transversal, obteniendo ocho explantes y se sembraron dos en cada
frasco, teniendo los siguientes tratamientos para activar las aréolas:
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● Tratamiento 1: MS 50/100 adicionado con hormona BAP (1 mg/ L).
● Tratamiento 2: MS 50 /100 adicionado con hormona ANA (1 mg/L) y BAP (1 mg/ L).
● Tratamiento 3: MS 50/100 adicionado con hormona ANA (1mg/L) ● Tratamiento 4: MS 50/100 (testigo).
*En el caso de contaminación por hongos y/o bacterias se realizó un cambio de medio de
cultivo en un nuevo frasco con las mismas concentraciones de RCV, realizando una
desinfección previa.
Resultados y Análisis
➢ Germinación y prueba de viabilidad de Mammillaria schiedeana
Después de que algunos medios de cultivo MS 50/100 y 100% presentaran contaminación
por bacterias y de no observar germinación durante 5 semanas, se llevó a cabo una prueba
de viabilidad de semillas con Tetrazolio (una semilla es viable cuando su embrión está vivo),
mediante esta técnica se comprobó si las semillas estaban vivas o muertas. Se usan como
indicador de viabilidad las sales de Tetrazolio, estas sales son incoloras pero cuando se
reducen adquieren un color rojo intenso. Si la semilla es viable su embrión se teñirá de rojo
con la solución de Tetrazolio; por el contrario, si la semilla no es viable, es decir, está muerta:
su embrión no se colorará de rojo. El resultado se expresa en porcentaje de semillas viables
del lote, en este caso el porcentaje de viabilidad de Mammillaria schiedeana fue 28%, es
decir, no viables (Imagen 1 y 2).
Imagen 1 y 2. Semillas de Mammillaria schiedeana en microscopio Zeiss en aumentos A-.8 y
B-3.2 después de realizar la prueba con Tetrazolio.
➢ Germinación de Echinocactus platyacanthus
A B
11 Se decidió trabajar con Echinocactus
platyacanthus, debido a la disposición
de semillas y a su categoría de riesgo.
Las semillas de E. platyacanthus se
sembraron en los medios de cultivo
MS 50/100 y 100% y en tierra (testigo)
el día 24 de Octubre del año 2016. En
el medio de cultivo MS 50/100, el 38%
de las semillas germinaron mientras
que en el medio de cultivo MS 100 sólo el 36% de las semillas lo hicieron (Gráfica 1), por lo
que funcionó mejor el medio de cultivo MS 50/100 (Imagen 3).En total germinaron 11
semillas del grupo control en tierra en cuatro semanas, sin embargo sufrieron constante
contaminación, por lo que a pesar de ser desinfectadas no sobrevivieron.Los explantes del
tratamiento 2 (Figura 5-B) fueron los que mayor crecimiento tuvieron, en estos se obtuvo
notablemente la presencia de callo
friable, desarrollo de raíces del
explante original y un crecimiento
acelerado en comparación a los
tratamientos 3 y 1 (Figura 5-C y
A), en los cuales el crecimiento se
vio lento y la aparición de callo no
fue abundante. El callo friable
tiene la característica de que las células tienen el espacio necesario para dividirse, a
diferencia de un callo compacto las células están demasiado cerca, evitando una división
celular adecuada. Sin embargo, en el tratamiento 4 (Figura 5-D), se observaron mejores
resultados que en el tratamiento 3 y 1. Se cree que este resultado sucedió a la concentración
endógena de hormonas en el explante, probablemente una alta concentración de ANA y BAP
que por separado como en los tratamientos 3 y 1. En condiciones in vitro explantes de E.
platyacanthus crecieron en 7 semanas bajo los tratamientos con ANA (1 mg/L) y BAP (1
mg/L), y en 4 semanas más alcanzaron una talla aproximada de 5 mm aproximadamente.
En contraste en su ambiente natural, le toma 1 año en crecer 1 cm.
12
Se observaron resultados favorables cuando las hormonas se encuentran en combinación
(tratamiento 2) o cuando no se aplican (Tratamiento 4), debido a que los efectos de las
hormonas endógenas que posee la planta naturalmente se vieron potenciados por estos
tratamientos (Tabla 2).
Debido a un estrés lumínico, consecuencia de no tener las instalaciones adecuadas de una
cámara de incubación donde la luz y temperatura son controladas, los explantes en los
diferentes tratamientos con RCV sufrieron una oxidación severa que mató al tejido (Figura 6),
lo que eliminó la posibilidad de continuar registrando resultados del material vegetal en esta
investigación. Sin embargo, los resultados obtenidos con los tratamientos 2 y 4, indican que
el CTV es viable para la propagación de la especie Echinocactus platyacanthus, además de
otras cactáceas y suculentas.
A
B A
Imagen 3. Germinación de E. platyacanthus en A-MS 50/100 y B-100%. Se observa rompimiento de testa y desarrollo de raíz.
Figura 5. Tratamientos A-1; explante sin desarrollo aparente de callo, B-2; desarrollo de callo friable, espinas y
raíz, C-3; explante sin desarrollo aparente de callo y D-4; desarrollo de callo y espinas.
B C D
13
Figura 6. Explantes oxidados por estrés lumínico.
Conclusión El cultivo de plantas in vitro es una estrategia de conservación de
especies con problemas poblacionales, como un lento desarrollo y la
escasez de ejemplares jóvenes que permite propagar a la especie
multiplicándola rápidamente. Los resultados obtenidos en la presente
investigación, sugieren que propagar Echinocactus platyacanthus
mediante Cultivo de Tejidos y aplicando reguladores de crecimiento
vegetal(hormonas) pues utilizar este método en lugar de propagación
tradicional ofrece un mejor control sobre la contaminación, un factor
que perjudica la germinación; más un crecimiento mucho más rápido de la planta (5 mm en
cuatro semanas) en comparación con el crecimiento en condiciones de campo (1 cm por
año).
Estas plántulas obtenidas a corto plazo posteriormente pueden ser utilizadas en programas
de inserción.
Dichos programas pueden emplearse, incidiendo benéficamente en la conservación de la
especie de una manera más rápida y eficaz.
De haber podido continuar con la investigación, las plántulas hubieran sido trasplantadas al
invernadero del plantel.
Se recomienda ampliamente continuar con este estudio ya que en esta investigación se
sentaron las bases para protocolos de especies de la misma familia de Echinocactus
platyacanthus.
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