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PROTOCOLO PARA LA OBTENCIÓN DE ENZIMA INVERTASA A PARTIR DE HONGOS
FILAMENTOSOS Y LEVADURAS.
PROTOCOL FOR THE OBTAINING OF ENZYME INVERTASA FROM FILAMENTOSUS
FUNGI AND YEASTS.
Autores: De Ávila-Luna, María. R1, González-Alcalá, Yulieth. A2 Director: Echeverri,
Gustavo. Co-director: Orozco-Ugarriza, Mauricio.
Artículo de revisión desarrollado en el marco del diplomado de investigación en salud X
cohorte para optar por el título de bacteriología.
RESUMEN
Objetivo: analizar las diferentes técnicas de obtención de la enzima invertasa a partir de
levaduras y hongos filamentosos, para proponer un protocolo que cumpla con los parámetros
necesarios para su consecución. Metodología: se realizó una búsqueda bibliográfica a partir
de los artículos de investigación publicados en los últimos 10 años en bases de datos como
Scielo, Science Direct, Springer y Google Académico. Resultados: se obtuvo un total de 185
artículos, se seleccionaron aquellos que fueran estudios experimentales, estudios que
comprendieran de los años 2009 al 2019, que trataran de la obtención de la enzima invertasa
a partir de levaduras y hongos filamentosos, dando un total de 10 artículos encontrados que
cumplen los criterios de selección para el desarrollo de la temática. Conclusión: esta revisión,
permitió conocer diferentes técnicas implementadas para la obtención de la enzima invertasa
a partir de hongos filamentosos y levaduras, estos microrganismos al estar tan distribuidos en
el medio ambiente son de fácil acceso y puede ayudar disminuir los costos de elaboración.
Esta revisión además permitió elaborar una guía de pasos modificables (protocolo) por el
investigador, debido a que es difícil establecer un protocolo homogéneo por la existencia de
gran variedad de métodos y lugares de aislamiento, cantidad del inóculo, cultivos de
1 Universidad de San Buenaventura seccional-Cartagena, facultad de ciencias de la salud, Bacteriología, grupo de investigación GIMA, Correo: marii-de-avila03@hotmail.com 2 Universidad de San Buenaventura seccional-Cartagena, facultad de ciencias de la salud, Bacteriología, grupo de investigación GIMA, Correo: yuligonzalezalcala@hotmail.com
2
fermentación y técnica de extracción. En cuanto a la determinación de la actividad enzimática
por el contrario es muy similar en la mayoría de los artículos, lo que significa que es confiable
y contribuye a dar confiabilidad al proceso.
PALABRAS CLAVES: enzima, invertasa, obtención, biotecnología, levaduras, hongos
filamentosos, β- fructofuranosidasa, azúcar invertido. (DECS – CAB)
ABSTRACT
Objective: To analyze the different techniques to obtain the invertase enzyme from yeasts and
filamentous fungi, to propose a protocol that complies with the parameters necessary for its
achievement. Methodology: A bibliographic search was carried out based on the research
articles published in the last 10 years in databases such as Scielo, Science Direct, Springer
and Google Academico. Results: a total of 185 articles were obtained, those were selected
that were carried out experimental studies, studies that included the years 2009 to 2019, that
would be the obtaining of the inverted enzyme from the yeasts and filamentous fungi, giving a
total of 10 Articles found that meet the selection criteria for the development of the subject.
Conclusion: this review, which will be published in the implementation techniques for obtaining
the enzyme invertase from filamentous fungi and yeasts, these microorganisms are distributed
in the environment, are easily accessible and can help reduce the costs of the elaboration. This
is a guide of modifiable steps (protocol) by the researcher, because it is difficult to establish a
homogeneous protocol for the great variety of methods and places of isolation, the amount of
the inoculum, the fermentation cultures and the extraction technique. Regarding the
determination of enzymatic activity on the contrary it is very similar to most articles, which
means that it is reliable and give a confidence in the process.
KEYWORDS: enzyme, invertase, obtaining, biotechnology, yeast, β-fructofuranosidase, invert
sugar, filamentous fungi. (DECS – CAB)
3
INTRODUCCIÓN
La biotecnología ha tenido gran auge en los últimos años en distintos aspectos, no solo en lo
tecnológico y económico sino también en la industria de los alimentos, específicamente en el
área de producción de endulzantes (jarabes concentrados de fructosa o glucosa). al momento
de la fabricación de bebidas y alimentos es muy habitual utilizar agentes endulzantes como la
sacarosa, la glucosa y la fructosa (1).
Existen procesos que facilitan la obtención de estos jarabes concentrados ampliamente
utilizados en la industria alimentaria y farmacéutica debido a su alta funcionalidad y
propiedades deseables (2), uno de estos procesos es a utilizando la enzimas como la invertasa
o β-fructofuranosidasa (EC 3.2.1.26), también conocida como sacarasa, encargada de
catalizar la hidrolisis de la sacarosa específicamente los terminales no reductores β-
fructofuranosílicos de los fructofuranósidos, rompiendo el enlace β-fructofuranosil, es decir,
actúa sobre el extremo fructosa de la molécula de sacarosa (3).
Como resultado de la reacción, se obtiene una mezcla de glucosa más fructosa, generando lo
que se llama azúcar invertido, comúnmente usado en la industria alimenticia por su alto poder
edulcorante (4). Por otra parte, además de tener una alta capacidad hidrolítica en medios con
altas concentraciones de sacarosa puede intervenir en la síntesis de fructooligosacáridos
(FOS) (5), estos por su bajo poder calórico son benéficos para el ser humano, ayudando a
prevenir enfermedades cardiacas, cáncer de colon, diabetes, entre otras(6).
La invertasa se caracteriza por tener una masa molecular en el rango de 47–430 kDa, valor de
Km de 0.063 a 470 mM, Kcat de 5.68 a 7.4 × 106 s-1 y vida media de 2.42–78.8 min a (65°C)
funciona óptimamente entre temperaturas de 30-75°C y pH de 2.9–6.2. (7), además puede ser
obtenida partir de animales vertebrados e invertebrados, vegetales, frutas, plantas
especialmente la caña de azúcar (Saccharum spp.) (8, 9).
Por otro lado, estudios realizados revelan que se puede hallar en bacterias, algas verdes y
hongos. Demostrando que Aspegillus niger, Candida utilis, Penicilium sp., Torulaspora
delbrueckii y cerevisiae son los mayores productores de invertasa y en menor proporción
Aspergillus sp., Aspergillus clavatus, Candida versatili, Pichia guilliermondii, Aureobasidium
pullulans, Pichia Pastoris (10), siendo Saccharomyces cerevisiae una de las levaduras más
4
utilizada industrialmente por su alta capacidad de fermentación de sacarosa (11), y asimismo
se considera como una cepa hiper-productora de invertasa donde se han identificado 2 tipos
de invertasa: (una forma glicosilada encontrada en el espacio extracelular y una forma no
glicosilada ubicada en el espacio intracelular), siendo la forma glicosilada las más
predominante (12).
En la actualidad, en la industria alimentaria se utilizan distintos tipos de compuestos químicos
y biológicos que ayudan a disminuir o mantener el tiempo y los costos de producción y la
inocuidad del producto. Es por esta razón que se utilizan enzimas como la invertasa, ya que
son proteínas caracterizadas por su especificidad que actúan como catalizadores de las
reacciones químicas, de síntesis y degradación de compuestos para realizar estos procesos
(13).
En Colombia, este tipo de enzimas poco se fabrican, quizás por falta de motivación, inversión
e infraestructura. Por esta razón el desarrollo de esta importante área en dicho país se
encuentra limitada, conllevando a la importación lo que beneficia a países industrializados
(Japón, Estados Unidos, Canadá y México). Pero aun así existen diferentes grupos de
investigación dedicados al estudio de la aplicabilidad de microorganismos y sus enzimas. Entre
ellos el grupo de biotecnología ambiental e industrial de la universidad Javeriana, el grupo
BIOALLI de la Universidad de Antioquia, etc. Sin embargo, el valor tan importante que tienen
sus trabajos para la biotecnología aun esta por ser explorado (14, 15).
Por lo tanto, es importante analizar las diferentes investigaciones que se han realizado al
respecto para estudiar los protocolos o técnicas de obtención de la enzima, con el fin de
mostrar aquellas técnicas de fácil implementación a partir de hongos filamentosos y levaduras.
Esta revisión se basó en la búsqueda de estudios que tuvieran como objetivo la obtención de
la enzima invertasa a partir de levaduras y hongos filamentosos utilizando diferentes técnicas
o protocolos, que permitieran establecer una guía de pasos modificables por el investigador
según sus necesidades, usando estos microorganismos, por ser considerados los mayores
productores de la enzima (16, 17).
Según lo anteriormente planteado surgió la necesidad de realizar una revisión bibliográfica con
el fin de observar nuevas técnicas de producción y obtención de la enzima invertasa,
5
promoviendo el desarrollo biotecnológico, microbiológico e industrial de un producto de menor
costo a escala de laboratorio. Debido a que para la producción industrial de azúcar invertido
se están implementando técnicas basadas en la aplicación de altas temperaturas lo que
produce un gasto energético y a su vez un mal uso de los combustibles fósiles, es importante
implementar técnicas que disminuyan el impacto ambiental que generan este tipo de prácticas.
Por lo tanto, el objetivo de esta revisión es “analizar las diferentes técnicas de obtención
de la enzima invertasa a partir de levaduras y hongos filamentosos, para proponer un
protocolo que cumpla con los parámetros necesarios para su consecución”.
6
METODOLOGÍA
Estrategia de búsqueda bibliográfica
Para la búsqueda de artículos relacionados con el tema de interés “PROTOCOLO PARA LA
OBTENCIÓN DE ENZIMA INVERTASA A PARTIR DE HONGOS FILAMENTOSOS Y
LEVADURAS” Se usaron las bases de datos Google Académico, Springer, Scielo y
ScienceDirect, utilizando las palabras clave enzyme, invertase, obtaining, biotechnology,
yeast, β-fructofuranosidase, invert sugar, filamentous fungi disponibles en DeCS y CAB.
La búsqueda en Google Académico se realizó con la combinación de los siguientes
descriptores y operadores booleanos:
Search (((“Yeast and invertase”) OR (“Invertase extraction ”) OR (“Extraction or yeast”) OR (“β-
fructofuranosidasa”) OR (“β-fructofuranosidasa and yeast”) OR (“biotechnology invertase”) OR
(“Invertase”) OR (“β-fructofuranosidasa extraction”) OR (“Biotecnology yeast or invertase”) OR
(“Biotecnology and extraction”) OR (“filamentous fungi and invertase”) OR (“filamentous fungi
and extraction”) OR (“filamentous fungi and β-fructofuranosidasa”) OR (“filamentous fungi and
Obtaining and extraction ) OR (“Yeast biotecnology”) OR (“Obtaining and extraction or yeast”))))
AND (((“Obtaining and extraction or invertase”) OR (“Obtaining and extraction or β-
fructofuranosidasa”) OR (“Obtaining invertase”) OR (“Obtaining yeast”) OR (“Obtaining β-
fructofuranosidasa”) OR (“ Obtaining and extraction, enzyme”) OR (“Enzyme invertase”) OR
(“β-fructofuranosidasa enzyme”) OR (“Enzyme biotecnology”) OR (“Enzyme biotecnology
extractions”) OR (“Enzyme invertase extractions”) OR (“NOT invertase producing bacteria”) OR
(“NOT invertase producing plants ”) OR (“NOT invertase producing fruits”) OR (“NOT invertase
chemically produced”)))
La búsqueda en las bases de datos Springer, Scielo y Science Direct se realizó con las
palabras clave tomadas deL DeSH y CABI <<Invertase>>, << levadura and invertase >>,
<<NOT bacterias >>, << invertase obtaining >>, <<β-fructofuranosidasa >>, y combinándolas
con los operadores booleanos <<AND>> <<OR>> <<NOT>>.
7
Como criterios de búsqueda avanzada y filtro de selección se restringió la búsqueda a
investigaciones publicadas en los últimos 10 años (2009-2019); la búsqueda bibliográfica se
realizó en un periodo de tiempo que comprende del 2 al 20 de marzo de 2019.
Como criterio de selección de artículos se definió:
Criterios de inclusión: estudios experimentales, ensayos de laboratorio, estudios que
incluyan levaduras y hongos filamentosos, estudios realizados en un periodo de 2009-
2019.
8
RESULTADOS
Los criterios de búsqueda en las bases de datos Scielo, Science Direct, Springer, Google
Académico se desarrollaron mediante una búsqueda avanzada con las palabras clave y las
combinaciones de operadores booleanos descritos anteriormente en la metodología. Los
artículos pasaron por diferentes filtros como periodos de año entre 2009-2019, se tuvo en
cuenta que fueran estudios experimentales, que trataran de la obtención de la enzima invertasa
a partir de levaduras y hongos filamentosos, dando un total de 10 artículos encontrados que
cumplen los criterios de selección para el desarrollo de la temática.
La distribución de artículos según las bases de datos usadas fue el siguiente:
Gráfico 1. Resultado de la búsqueda de artículos
9
De acuerdo a los criterios previamente señalados, se seleccionaron finalmente 10 artículos.
En la tabla 1 se puede observar la distribución de los artículos según su descriptor y base de
datos utilizada, para los análisis posteriores los 10 artículos seleccionados fueron ordenados
según el título, año, revista, autores, precisiones metodológicas y resultados de cada uno de
ellos para facilitar el análisis comparativo, los artículos utilizados se basaron en la relación con
el objeto de estudio, donde se describen los métodos utilizados para la extracción y obtención
de invertasa y los materiales y equipos utilizados en las técnicas, y se excluyeron aquellos que
incluían otros microorganismos o fuentes de obtención diferentes a hongos y levaduras.
Tabla 1. Artículos analizados en el estudio.
Estudio
(Autor, Año,
Revista [Ref.])
Tipo de estudio
Metodología
Microorganismo
Resultados
Ferreira MV, Rossler AF, Toralles RP, Ruiz WA, Rombaldi CV, 2018
Scielo.
Experimental
Elección y descripción del Microorganismo y el cultivo utilizado.
Determinación azúcares reductores.
Actividad de la invertasa
Efecto de la concentración de bicarbonato de sodio y velocidad de agitación en la extracción de la invertasa.
Purificación del extracto bruto por precipitación
Saccharomyces cerevisiae.
El NaHCO3 es un agente de autolisis efectivo y su utilización es una buena alternativa en la extracción de invertasa, principalmente si es combinado con la velocidad adecuada de agitación en el shaker y liofilización de la levadura.
Rubio C, Latina C, Navarro A, 2014.
Google Academico
Experimental
Aislamiento directo.
Identificación.
Producción de invertasa.
Preparación del extracto enzimático.
Actividad invertásica.
Actividad transferasa.
Aspergillus niger IB56
Según los microorganismos aislados del jarabe de fructosa obtuvieron una cepa que fue identificada como Aspergillus niger IB56, capaz de producir invertasa a las 48 h de incubación, que posee alta actividad transfructosilante (5,6 U/ml). Se determinó que la máxima producción de
10
Influencia de factores físicos y químicos sobre la producción de FOS.
Cromatografía de alta presión (HPLC).
Reproducibilidad de los resultados.
FOS fue 105 g/l, respecto a la concentración de sacarosa inicial (300 g/l), en las siguientes condiciones de ensayo: pH, 5,0; Temperatura 20 ºC y en un tiempo de reacción de 60 min.
Alekseeva OV, Sabirzyanova TA, Selyah IO, 2014.
Springer.
Experimental
Cepas de microorganismos y condiciones de cultivo.
Preparación de pared celular de la levadura C. utilis y tratamiento de la pared celular con tripsina.
Aislamiento de proteínas, unido no covalentemente a polisacáridos, de la pared celular.
Electroforesis
Preparación de invertasa homogénea a partir de la pared celular de C. utilis y su secuenciación parcial.
Determinación de la actividad de la invertasa.
Microscopía electrónica de células de levadura.
Candida utilis
En este estudio, encontraron solo el alto peso molecular de la invertasa glicosilada, y el bajo peso molecular de la no glicosilada (62 kDa) en la pared celular bajo las condiciones experimentales podría ser explicado por dos razones: ya sea la tripsina dividida en proteína, o esta forma no fue retenida en la pared celular en el curso de exportación al medio de cultivo.
Shankar T, Thangamathi P, Rama R, Sivakumar T, 2013.
Google académico.
Experimental
Efecto del pH, temperatura, tiempo, fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno orgánico, fuentes de nitrógeno inorgánico, de las diferentes concentraciones del nivel de inóculo, niveles de sacarosa, iones
Saccharomyces cerevisiae
La producción de invertasa y las interacciones de sustrato de sacarosa de cepa de levadura en la palma de vino fue evidente a través de este estudio. Este estudio nos da una pista, de la riqueza microbiana de la invertasa producida por levadura y que puede ser
11
metálicos, surfactantes, buffers, aminoácidos, de los residuos agrícolas en la producción de invertasa.
Medios de Producción invertasa en estado sólido fermentación (SSF).
Medios de producción invertasa sumergidos fermentación (SmF)
aprovechada para procesos biotecnológicos.
Ghasemi Y,
Mohkam M,
Ghasemian Abdollah,
Rasoul-Amini S, 2014.
Springer.
Experimental
Aislamiento y cribado de microorganismos.
Identificación de microorganismos.
Preparación de medios de cultivos.
Técnica de fermentación.
Ensayo de actividad de invertasa.
Procedimiento de optimización.
Identificación de componentes y nutrientes importantes.
Optimización de componentes cribados.
Pichia sp.
Las condiciones para la producción de invertasa por Pichia sp. revelaron un incremento en la producción de invertasa de nuevas levaduras aisladas.
La estrategia utilizada aquí demuestra la ventaja en comparación con los métodos tradicionales y permite después de 2 diseños experimentales y 27 experimentos optimizados establecer que la mejor condición de fermentación fue: 40 g / l de sacarosa, 5 g / l de extracto de levadura, 4 g / l de peptona, que dio lugar a una actividad enzimática de 38,71 U / ml.
Aslam A, Haq I, Sikander A, 2013.
Google académico
Experimental
Elección del microorganismo.
Resistencia a la 2-desoxi-D-glucosa.
Preparación de inóculo.
Producción de invertasa en fermentador agitado.
Aislamiento de invertasa extracelular.
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae fue seleccionado porque contenían ambos tipos de invertasas. Fue previamente mutagenizado químicamente por metilsulfonato de etilo (EMS). para la producción de invertasa
12
Aislamiento de invertasa intracelular.
Purificación de invertasa.
Precipitación con sulfato de amonio.
Cromatografía de intercambio anicónico.
Filtración en gel.
Diálisis.
Electroforesis.
Marcador proteico.
Contenido de carbohidratos.
Caracterización de invertasas purificadas.
extracelular como principal enzima secretora. Como resultado se obtuvo que, la purificación de la invertasa extracelular con recuperación de 38% se logró. El peso molecular (110 kD) de invertasa glicosilada que tiene 48% de contenido de carbohidratos e intracelular no glicosilada (55 kD).
Lazar Z, Rossignol T, Verbeke J, Crutz-Le Coq A, Nicaud J, Robak M, 2013.
Springer.
Experimental
Construcción de plásmidos.
Cepas Y. lipolytica utilizadas en este estudio.
Condiciones de los medios y la cultura.
Crecimiento en placas de microtitulación.
Estudio de biorreactor.
Métodos analíticos
Determinación de biomasa e invertasa intracelular.
Extracción medición de azúcares y ácidos.
Actividad de invertasa
Yarrowia lipolytica
El nuevo cassette de expresión invertasa desarrollado en esta investigación, permite una fuerte secreción de invertasa en el medio y en consecuencia, una rápida escisión de sacarosa en glucosa y fructosa independiente de cualquier condición de inducción y posteriormente no está sujeto a inhibición por el medio.
Abre el camino para una utilización racional de Y. lipolytica en fermentación industrial.
Paiva A, Teixeira M, Terenzi H, João J, Souza L, 2009.
Scielo.
Experimental
Microorganismo y condición de cultivo.
Influencia de varios compuestos sobre las invertasas.
Producción en SbmF y SSF.
Influencia del salvado de trigo humedecido con diferentes soluciones.
Extracción de enzimas extracelulares e intracelulares.
Ensayo enzimático
Cuantificación de proteínas
Análisis estadístico
Aspergillus caespitosus
Se obtuvieron altos niveles de invertasas cuando A. caespitosus se cultivó en SbmF (medio Khanna) y SSF utilizando residuos agroindustriales como fuente de carbono, Sin embargo, la producción de invertasa extracelular en SSF fue de 2.73 veces superior en comparación con el SbmF, con salvado de trigo.
13
Veana F, Martínez-Hernández J.L, Aguilar C.N., Rodríguez-Herrera R, Michelena G, 2011.
Scielo.
Experimental
Microorganismo y condiciones de propagación.
Preparación de subproductos.
Fermentación en estado sólido
Caracterización enzimática del extracto.
análisis estadístico.
Aspergillus niger GH1
Los resultados obtenidos en este estudio son consistentes con Informes anteriores, el hecho de que la actividad invertasa producida bajo SmF es inferior a la producida en SSF, se obtuvo invertasa usando A. niger Aa20 en SSF. Otros autores emplearon sacarosa (25 g / L) y diferentes concentraciones de glucosa. La actividad máxima de 212 U / L se obtuvo en glucosa 100 g / L. y en medio solo con el inductor, se detectaron 140 U / L. En términos de productividad, en el presente estudio se aumentó 30 veces la productividad que otros autores que utilizan diferentes cepas A. niger
De Souza A, Esteves P, De Castro B, Archette C, Nascif É, Ribeiro F, Stringhetaa P, Mota A, 2019.
Science direct
Experimental
Reactor de ultrasonido
Caracterización de la enzima: determinación de la actividad invertasa, pH óptimo y temperatura.
Efecto de la ecografía sobre la reacción enzimática.
Determinación de los parámetros cinéticos de la invertasa.
Parámetros del modelo de Michaelis-Menten
Efecto del ultrasonido sobre el sustrato.
Efecto de la ecografía sobre la actividad de la invertasa.
Diseño experimental, regresiones
Sacharomyces cerevisiae
Este trabajo fue el primero en evaluar el efecto del ultrasonido en la reacción de invertasa, así como un pre-tratamiento en el sustrato y enzima. Por lo tanto, según los autores de puede afirmar que los efectos positivos del ultrasonido están relacionados con la turbulencia y la transferencia de masa durante la reacción. El ultrasonido potencia la hidrólisis enzimática de la sacarosa. lo que demuestra que este proceso mejora la hidrólisis enzimática de la invertasa, resultado que puede ser interesante a nivel industrial.
14
Figura 1. Flujograma para obtención de la enzima invertasa según la evidencia
experimental publicada.
Un protocolo de obtención permite ajustar, ordenar, estandarizar y tener un control exhaustivo
de los procesos que se quieran llevar a cabo. En la figura 1 se observa los pasos
fundamentales para realizar una obtención enzimática.
CARACTERIZACION ENZIMATICA
OBTENCION DE EXTRACTO CRUDO
APLICAR TECNICAS DE EXTRACCIÓN (AGITACIÓN, FERMENTACION EN ESTADO SOLIDO O LIQUIDO, ETC.)
INÓCULACION EN EL MEDIO DE FERMENTACIÓN
CONTEO DE CÉLULAS PARA EL INÓCULO
IDENTIFICACION DEL MICROORGANISMO
CULTIVO DEL MICROORGANISMO EN MEDIO APROPIADO PARA SU CRECIMIENTO
AISLAMIENTO DEL MICROORGANISMO
matemáticas y análisis estadístico.
15
Aislamiento
Los hongos filamentosos y levaduras son los que según la revisión de artículos tienen la mayor
capacidad de producir invertasa en presencia de sacarosa, estos pueden ser aislados en
ambientes con altas concentraciones de azúcar, suelo fértil, plantas, frutas, etc. Para su
correcto aislamiento es necesario utilizar medios que favorezcan el crecimiento de estos, como
son los medios de cultivo selectivos o enriquecidos para recuperar los microorganismos en
gran porcentaje, por otro lado, es importante qué los materiales estén previamente
esterilizados para evitar contaminación(18). Otra fuente para conseguir estos microorganismos
es por medio de la compra o donación de cepas ATCC y por exposición de los hongos
filamentosos y levaduras a compuestos químicos (17).
Cultivo
Existen distintos tipos de medios de cultivos que cumples con las condiciones necesarias para
el crecimiento de estos, entre los medios de cultivo más utilizados se encuentran:
Medio MY40 (Osmophilic Agar): es un medio de cultivo utilizado para la búsqueda de
microorganismos osmofilicos, es decir, microorganismo con capacidad de desarrollarse
en medios con alta presión osmótica (altas concentraciones de azucares), (10).
Placa de Agar de Dextrosa de Papa (PDA): Es un medio de cultivo altamente nutritivo,
favorece el crecimiento de hongos y levaduras, permite la esporulación y la producción
de Algunos puede ser suplementado con antibióticos o ácidos para inhibir el crecimiento
bacteriano (12), (19).
Medio YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose Agar): Es un medio de cultivo que
contiene extracto de levadura al 1%, glucosa al 0,8% y bactopéptona al 2%, los
hidrolizados del extracto permiten un crecimiento más rápido, de modo que durante el
crecimiento exponencial o fase logarítmica, las células se dividen cada 90 minutos (20).
Medio YNB (YEAST NITROGEN BASE): Este medio contiene las vitaminas esenciales
y sales inorgánicas necesarias para cultivar levadura, excepto aminoácidos y nitrógeno,
utiliza como fuente de carbono los carbohidratos (glucosa o sacarosa) (21).
Agar Extracto de Malta: Es particularmente adecuado para levaduras y hongos ya que
contienen una alta concentración de maltosa y otros sacáridos como fuentes de energía,
16
este tipo de medio es ideal para recuperar al 100% los conidios si se desea realizar
suspensión conidial para el inoculo (22)
Medio Czapek Dox (CD): es benéfico para el cultivo de hongos saprófitos, bacterias
del suelo y otros microorganismos a partir de diversos materiales (23).
Según la necesidad del investigador, decidirá qué cantidad de inoculo y que medio utilizará o
por el contrario suplementará los antes mencionados con otras fuentes de carbono como
trehalosa, maltosa, galactosa, manosa, fructosa, etc. Otras fuentes de nitrógeno como extracto
de levadura, glicina, peptona, gelatina, urea y caseína, diferentes concentraciones de inóculo,
como 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3 y 3.5% para establecer su capacidad para estimular la producción
de invertasa en el medio de fermentación (24).
Identificación
Para la correcta identificación de hongos y levaduras, basada en la literatura es posible aplicar
distintas estrategias de identificación una de estas es el sistema API 20C AUX, con un 95% de
exactitud y perfil numérico 2040032 (25), La identificación para hongos filamentosos se debe
realizar en base a características macromorfológicas, micromorfológicas, fisiológicas y tipos
de reproducción (10), el análisis de la secuencia del gen que evaluará las caracterizaciones
morfológicas, fisiológicas y bioquímicas del aislado productor de invertasa (26); para la
identificación de Cándida, utilizar CANDIFAST test kit (20).
Inóculo
Para determinar la cantidad de inoculo que se desea utilizar es necesario tener en cuenta el
tipo de técnica a aplicar, para hacerlo se puede realizar un conteo de células en cámara de
Neubauer (27, 28), mediante suspensión conidial de esporas, para levaduras puede usarse la
técnica espectrofotométrica a 600 nm para leer turbidez y poder estandarizar dicho inóculo
(24), por otro lado, se pueden evaluar diferentes concentraciones del nivel del inóculo según
la cantidad de invertasa que se desee obtener (29).
Obtención de invertasa
Según la literatura se puede obtener la enzima invertasa utilizando diferentes métodos como,
cultivo en batch (12), mediante precipitación con sulfato de amonio (17), biorreactores (30),
17
fermentación sumergida o de estado sólido (31), usando bicarbonato de sodio como método
de extracción (32), manejando biocatalizadores solubles e inmovilizados , extracción acuosa
de dos fases (33), etc.
Cuando se trabaja con microorganismos liofilizados se deberá suspender 1 g de preparado
liofilizado de levadura u hongo en 200 ml de tampón de extracción (tampón acetato 0,1 M, pH
5,0, en NaCl 0,5 M), es necesario agitar la mezcla durante 15 min mediante sonicación de la
suspensión u homogeneización de la misma, centrifugar y tomar el sobrenadante como
extracto enzimático. El extracto enzimático, cuando no se esté utilizando, se guardará en frío
en frascos estériles (34).
Es importante mantener en agitación constante para estimular la hidrolisis de la sacarosa por
parte de los hongos según la técnica a aplicar y tener en cuenta el tipo de sustrato a utilizar
(34), la temperatura y el pH 2.9 a 6.2 (35), el periodo de incubación puede variar de 24, 48 a
72 horas y se deben realizar los ensayos y pruebas por triplicado para reducir el margen de
error (36, 37).
Medios de fermentación para la obtención de invertasa
Cultivo en batch: es un sistema cerrado de fermentación discontinua, a este proceso
se le añade al inicio un inóculo proveniente de un medio de cultivo donde creció el
microorganismo previamente (agar PDA), el medio de cultivo puede contener glucosa,
(NH4)2SO4, KH2PO4 MgSO4.7H2O, FeSO4 y peptona, luego se debe poner en
agitación a 150 rpm a 30°C durante 24 horas. A lo largo de todo el proceso de
fermentación se debe añadir oxígeno en forma de aire, un agente antiespumante y
controlar el pH (12).
Medio Czapek Dox: Es un medio que favorece el crecimiento de hongos y bacterias de
suelo no fastidiosas. Para trabajar con este medio es necesario preparar el inóculo en
una solución fisiológica del microorganismo aislado, tomando aproximadamente 104
conidios/ml o 104 células/ml, luego tomar el inoculo y añadirlo en medio de Czapek Dox,
18
constituido por NaNO3, K2HPO4, MgSO4 7H20, KCL y sacarosa, a pH 4.5, a una
temperatura de 30°C y en agitación de 250 rpm durante 48 horas (10).
Fermentación de Estado Sólido (SSF): favorece el crecimiento de microorganismos
sobre medios húmedos en ausencia de agua libre, en el cual se adiciona el inóculo y un
sustrato al medio de producción, el medio de producción contiene sacarosa, extracto de
levadura, cloruro de amonio, cloruro de calcio, polietilenglicol, metionina, tampón citrato
a pH 6 e incubar durante 48 horas. Al finalizar agregar agua destilada al sustrato
fermentado y poner en agitación durante 1 hora. Luego centrifugar a 10.000 rpm durante
5 minutos (24, 38).
Fermentación Sumergida (SmF): este tipo de fermentación se realiza en Erlenmeyer
que contienen el inóculo, sustrato y medio de producción que está constituido por
sacarosa, extracto de levadura, cloruro de amonio, cloruro de calcio, polietilenglicol,
metionina, tampón de citrato a pH-6 e incubar durante 48 horas(24).
Luego del proceso de fermentación se procede a extraer la fracción de enzima de
interés, que puede ser extracelular o intracelular:
1. Invertasa extracelular: para la obtención de este tipo de invertasa es necesario
tomar el sobrenadante del cultivo, separando las células por medio de
centrifugación, luego se lleva a precipitación con sulfato de amonios y el
precipitado proteico resultante, se purifica a través de cromatografía de
intercambio iónico (17, 39).
2. Invertasa intracelular: tomar las células producto de aislamiento, lavar una vez
con tampón de acetato o en su defecto lavar dos veces con agua destilada, filtrar
utilizando una membrana de poros y dejar secar (17, 21).
19
Preparación del extracto enzimático
Al tener lista el tipo de invertasa de interés (extracelular o intracelular), las levaduras se
deberán separar por centrifugación a 4500 rpm y los hongos filamentosos se deben separar
por filtración. El extracto crudo producto de la centrifugación y filtración se conservará a 4°C
para posteriormente determinar la actividad enzimática (10).
Caracterización enzimática
Se debe realizar a través del método de cuantificación de azucares reductores (DNS). Esta
técnica es aplicable a todos los procedimientos de sistemas de cultivos de medios líquidos y
sólidos cuya molécula de sustrato sean azucares reductores como glucosa, xilosa, entre otros.
La coloración final desarrollada es estable durante 4 horas, sensible y adaptable durante la
manipulación de un gran número de muestras a la vez (40).
Para medir la actividad de la enzima agregar 0.2 ml del extracto enzimático a 0,8 ml de solución
de sacarosa, luego colocar en ebullición durante 5min. Posteriormente agregar 1ml de reactivo
3,5-dinitrisalicilico para detener la reacción y poner en ebullición durante 5 minutos. Después
enfriar en agua helada y leer absorbancia a 540nm utilizando un espectrofotómetro. Todas las
determinaciones analíticas se deben realizar por triplicado y los resultados producto de la
actividad deben calcularse por medio de una curva de calibración de glucosa estándar (9, 41).
El método DNS es el más acorde y con mejores resultados para la cuantificación de azucares
reductores. Por lo que ha tenido diversos ajustes para ser utilizado en distintas materias primas
debido a su alta sensibilidad (42, 43).
20
DISCUSIÓN
Teniendo en cuenta la metodología planteada por los artículos seleccionados para la
elaboración del protocolo de obtención de enzima invertasa, se evidenció que es posible
establecer un protocolo de fácil consecución, económico y que puede ser modificable según
las necesidades del autor, por lo tanto, es de gran importancia continuar con este tipo de
investigaciones para seguir realizando aportes que beneficien a la industria enzimática
colombiana e impulse a aumentar la producción de esta.
Según investigaciones realizadas por Ferreira MV, et al (2018), permiten afirmar que es
posible obtener enzima invertasa utilizando compuestos económicos y de fácil acceso como lo
es el bicarbonato de sodio (NaHCO3), junto con una adecuada velocidad de agitación en
presencia del microorganismo (hongo o levadura) permite obtener invertasa en forma libre.
Cabe resaltar que durante la aplicación de esta técnica en la investigación se utilizaron medios
de cultivos como él PDA y reactivo DNS, que según la evidencia científica son los más
adecuados para este tipo de indagaciones. por otro lado, Según resultados de la investigación
de Lazar Z, et al (2013), permite afirmar que el método de elección para realizar una correcta
medición de azucares reductores y de actividad de la invertasa es el método DNS por lo que
se decidió incluir en el protocolo descrito en esta investigación ya que aportan excelentes
resultados durante su ejecución (12, 44).
Datos revelados por Rubio C, et al (2014), muestran que un microorganismo como Aspergillus
niger es capaz de producir invertasa a las 48 horas incubación, pero esto es relativo ya que
dependerá de la velocidad de reacción, de las condiciones y los requerimientos dados para
que el microorganismo actúe, la temperatura y el pH, juegan un papel muy importante durante
la obtención de la invertasa por lo que deben ser controlados (10, 35).
Alekseeva OV, et al (2014), demostraron en su investigación que la forma glicosilada de
invertasa exportada al medio de cultivo, se retiene en la pared celular, mientras que la otra,
la forma no glicosilada, no se detectó en la pared celular, siendo un hallazgo muy relevante
ya abre paso a otro tipo de investigaciones que según posteriores investigaciones y
basándose en la literatura la forma glicosilada es la más predominante en investigaciones de
uso de la invertasa (20, 39)
21
Shankar T, et al (2013), mediante un estudio experimental describen el efecto de diferentes
condiciones, soluciones y compuestos frente a la producción de invertasa lo que hace un gran
aporte al uso de la invertasa porque le ofrece múltiples alternativas al investigador para
establecer un protocolo que logra evidenciar el comportamiento de invertasa al reaccionar
frente a pH, temperatura, tiempo, fuentes de carbono, sacarosa , aminoácidos, residuos
orgánicos entre otros compuestos que permiten que el investigador utilice diferentes métodos
para mejorar la producción de invertasa (24).
Los investigadores Ghasemi Y, et al (2014), utilizaron en su investigación un microorganismo
poco usado para la producción de invertasa Pichia sp, Obteniendo buenos resultados al
trabajar con este tipo de ya que es su mayoría se trabaja con la levadura Saccharomyces, lo
que indica que tanto las levaduras como los hongos filamentosos en su mayoría son excelentes
productores de enzima invertasa lo que ofrece al investigador distintas estrategias para la
producción de invertasa (26).
Para un mejor resultado Aslam A, et al (2013), utilizaron sulfato de amonio para realizar la
precipitación en el extracto crudo y así tomar el sobrenadante, lo que parece un método poco
convencional, pero con el que al igual que con otros métodos, se logra obtener excelentes
resultados, aunque en este estudio se utilizó cromatografía de intercambio iónico y filtración
en gel, es más aconsejable solo utilizar el método de precipitación de la técnica utilizada en
esta investigación ya que la cromatografía y la filtración en gel pueden resultar costosos y lo
que se buscan son alternativas económicas para la extracción de la enzima (17).
El aporte realizado por Paiva A, et al (2009), es de gran importancia porque muestra al lector
como mediante residuos agroindustriales como única fuente de carbono en microbiología de
alimentos se pueden obtener grandes beneficios como lo es la producción de enzima invertasa
fermentación sumergida o en estado sólido lo que ofrece diferentes alternativas como fuente
de carbono para obtenerla (29), Veana F, et al (2011), durante su investigación también
utilizaron residuos agroindustriales, en este caso utilizaron melaza y bagazo de caña de azúcar
junto a Aspergillus niger para la producción de invertasa obtenida mediante hidrólisis ácida la
cual favoreció la disponibilidad de azúcares fermentables. Además, se utilizó una baja
concentración de sustrato, lo que puede redujo los costos de producción, por lo tanto, este tipo
22
de estudios representan un método alternativo para la producción de invertasa utilizando
hongos xerófilos aislado de sustratos de bajo costo (melaza y bagazo de caña de azúcar) (28).
De Souza A, et al (2019), aplicaron una estrategia muy diferente a todas las demás planteadas
en la investigaciones citadas anteriormente ya que midieron el efecto del ultrasonido o
ecografía sobre la reacción enzimática para la producción de invertasa, determinando que el
ultrasonido aplica como una alternativa para acelerar la inversión de sacarosa por la invertasa,
Por lo tanto, la tecnología de ultrasonido surge como una alternativa interesante para mejorar
el rendimiento de la invertasa, acelerando la reacción enzimática.
Es de gran importancia tener en cuenta cada una de las apreciaciones dadas en el protocolo
para una correcta obtención de la enzima, todo puede estar sujeto a cambio según las
necesidades del investigador.
23
CONCLUSIONES
Al realizar la revisión de artículos se logró llegar a las siguientes conclusiones:
La búsqueda bibliográfica permitió conocer diferentes técnicas implementadas para la
obtención de la enzima invertasa a partir de hongos filamentosos y levaduras. además
que al estar estos microrganismos tan distribuidos en el medio ambiente son de fácil
acceso, lo que facilita el proceso y puede ayudar disminuir los costos de obtención.
Para la realización del aislamiento, cultivo e identificación es necesario tener en cuenta
el tipo de hongo o levadura para establecer la técnica que requiere utilizar, en el
protocolo no se encuentran establecidas las mediciones necesarias para la producción
de la enzima ya que esto dependerá de la cantidad que el investigador decida obtener,
por otro lado, la técnica de identificación varía según el tipo de microorganismo escogido
para producir la enzima.
Teniendo en cuenta la literatura consultada existen diferentes técnicas para establecer
la cantidad de inóculo para la obtención de la enzima, tomando en cuenta 3 tipos de
técnicas diferentes para su preparación, puesto que se observó que se obtenían
excelentes resultados durante la aplicación de estas.
Es de resaltar que invertasa extracelular resulta fácil de obtener y se produce en mayor
cantidad lo que la convierte en una gran elección para la producción de la enzima.
En cuanto a la medición de azucares reductores y la actividad enzimática se logró inferir
que el método DNS es el indicado para la realización de estas pruebas según los diez
artículos utilizados para la construcción del protocolo, seis afirman que el método DNS
arroja mejores resultados y genera mayor confiabilidad.
Por último, es difícil unificar toda la información encontrada para establecer un protocolo
homogéneo, ya que hay mucha variedad en cuanto a métodos y lugares de aislamiento,
cantidad del inóculo, cultivos de fermentación y técnica de extracción, lo que permite al
investigador modificarlo a sus necesidades.
24
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