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cionald
eBiobancos
Gua de protocolos utilizados para la
obtencin de cidos nuclicos en biobancos
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Este documento ha sido elaborado con la participacin de las siguientes personas e
instituciones:
Coordinador:
Alberto Orfao de Matos -Banco Nacional de ADN
Adjunto coordinador:
Rosa Pinto LabajoBanco Nacional de ADN
Colaboraciones:
Juan Pascual Snchez.-Hospital Marqus de Valdecilla
Eugeni AragallFundacin Instituto de Investigacin Germans Tras i Pujol
Edurne Pedrosa Berrio -Fundacin Instituto de Investigacin Germans Tras i Pujol
Anta Solloso BanobreComplejo Hospitalario de la Corua
Manuel Posada de la PazInstituto de Enfermedades Raras-ISCiii
Elisabet Ars CriachFundacin Puigvert
Irene Vietez GonzlezComplejo Hospitalario Universitario de Vigo
b d l d bl
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OBJETO
El objetivo de esta gua de trabajo consiste en la elaboracin de un documento donde se
recogen diferentes protocolos de trabajo (PNTs) utilizados en varios biobancos integrados en
la Red Nacional del ISCIII para la obtencin de cidos nucleicos a partir de diferentes tipos de
muestra.
Los protocolos han sido clasificados segn su principio de actuacin y en cada uno de ellos
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1. INTRODUCCIN
El procedimiento general de extraccin de cidos nucleicos consiste en tres etapas
consecutivas: disgregacin de las clulas o tejidos (lisis celular), inactivacin de las nucleasas
intracelulares y en separacin de los cidos nucleicos de los dems componentes celulares.
La lisis celular depende en gran medida del tipo de muestra que se va a procesar.
Mientras que en muestras como sangre, clulas, ciertos tipos de tejidos o saliva puede
alcanzarse una eficiente lisis celular en tiempos relativamente cortos, en otros tipos de
muestras como tejidos incluidos en parafina la lisis celular requiere un tratamiento previo
mucho ms laborioso.
1.1.Lisis celular.
Durante la lisis celular se procede a la destruccin de las estructuras formadas por lpidos
y protenas permitiendo la liberacin de los cidos nucleicos del ncleo celular. La lisis se
lleva a cabo mediante una solucin salina que suele contener detergentes que desnaturalizanlas protenas y/o proteasas. Una vez separados los cidos nucleicos de las protenas y lpidos
se lleva a cabo su purificacin.
1.2.Purificacin de cidos nucleicos.
Los mtodos de purificacin presentan una gran variabilidad y estn desarrollados en
funcin de las propiedades fsico-qumicas de las molculas de ADN y ARN. Algunos de estos
f
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1.2.4. Separacin magntica:
En este mtodo las muestras lisadas se mezclan con esferas magnticas con capacidad de
unirse a los cidos nucleicos. Tras una serie de lavados para conseguir la mxima purificacin
del material gentico las esferas son retiradas de la solucin mediante un separador
magntico.
Referencias:-Nucleic Acid Isolation and Purification Manual. www.roche-applied-science.com.
-DNA Isolation Methods. World of Forensic Science, 2006. Gale Cengage.
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2.- PROTOCOLOS DE EXTRACCIN DE ADN GENMICO.
La elaboracin de esta gua de trabajo se ha realizado teniendo en cuenta la informacin
aportada por varios de los biobancos integrados en la Red Nacional del ISCIII referente a los
protocolos utilizados para la extraccin de ADN genmico.
Estos protocolos se han clasificado en funcin de su principio de actuacin para la
obtencin de muestra. Se ha desarrollado para cada mtodo un protocolo general que
refleja las lneas de procesamiento comunes en todos los protocolos utilizados en los
biobancos con esteprincipio de actuacin. Teniendo en cuenta que los protocolos utilizados
en los biobancos pueden presentar particularidades se recomienda seguir las
especificaciones propias de cada protocolo. Para cada uno de los mtodos se describe el
alcanceas como el rendimientoy calidad de las muestras de ADN obtenidas.
El alcance definido en cada mtodo seala para qu tipo de muestras se utiliza este
protocolo en los biobancos que han participado en la elaboracin de esta gua
El rendimiento indica el valor obtenido aportado por los datos experimentales de losdiferentes biobancos que los utilizan.
La calidad de las muestras obtenidas est determinada por la pureza, integridad yfuncionalidad de las mismas.
Pureza:
L d l t t l i d l l d i b b i d l
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degradada presentar una estela o smeara lo largo del gel que ser ms pronunciada
cuanto mayor sea la degradacin de la muestra.
Funcionalidad:El hecho de que una enzima de tipo ADN polimerasa pueda actuar sobre una muestra
de ADN como molde de la reaccin de PCR es indicativo de que la pureza de la muestra es
ptima. Adems, dependiendo del tamao del fragmento amplificado se puede evaluar el
grado de integridad de la muestra.
Al final del documento se incluyen como anexos dos tablas en las que se refleja el
rendimiento y la calidad de las muestras obtenidas con cada uno de los protocolos utilizados
en los distintos centros que han participado en la elaboracin de esta gua.
Tabla 1. Se muestran los datos del rendimiento obtenido con cada protocolo para
d ti d t
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2.1- MTODO DE PRECIPITACIN POR SALES.
2.1.1. PRINCIPIO.
En primer lugar se procede a una lisis celular con un detergente aninico que solubiliza los
componentes celulares e inhibe la accin de las nucleasas intracelulares. A continuacin se
desnaturalizan y se eliminan las protenas por precipitacin salina. El ADN en solucin se
precipita con isopropanol y se lava con etanol para finalmente ser resuspendido en un
tampn estabilizante para ADN.
2.1.2. ALCANCE.
Este mtodo se utiliza para la obtencin de ADN de los siguientes tipos de muestra:
Sangre perifrica:volmenes de entre 3 ml hasta 20 ml (las cantidades de reactivos de estemtodos son escalables en funcin del volumen de muestra).
Clulas mononucleares de sangre perifrica (CMSPs):las preparaciones de CMSPs pueden
tener un volumen variable de entre 0,1-2 ml de medio y pueden ser procesados entre 1 y 3x10
7clulas.
Clulas:el nmero de clulas que puede ser procesado depende del tipo celular y del modode obtencin de las clulas (p.ej: cultivos celulares, clulas purificadas por citometra de flujo,
). En cualquier caso, puede procesarse un amplio rango de clulas, desde 1 x106hasta 50
x106, siempre y cuando se escalen proporcionalmente las cantidades de soluciones de
reactivos.
li d 2 l d li l d 2 l d t O
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Paso 3. Se aade una solucin salina que permite la precipitacin de las protenascitoplasmticas y nucleares de la muestra. Se procede a una agitacin vigorosa de
la muestra (con vrtex) durante 20-30 segundos. A continuacin, se lleva a cabouna centrifugacin a la velocidad y tiempo necesarios para asegurar la
precipitacin total de las protenas. Las protenas precipitadas se observarn en el
fondo del tubo como un botn de color marrn. El sobrenadante debe observarse
sin turbidez o presencia de partculas o trazas de color marrn; si no fuese as,
debe procederse a una incubacin de la muestra durante 5 minutos en hielo
repitiendo de nuevo la centrifugacin.
Paso 4.El sobrenadante que contiene el ADN en solucin se transfiere a un nuevo tubocon isopropanol. La muestra se mezcla con el isopropanol invirtiendo el tubo
suavemente aproximadamente 50 veces. En este paso se puede observar la
aparicin de la hebra de ADN. No obstante, la observacin de esta hebra va a
depender de la cantidad de muestra de ADN procesada.
Paso 5.Se procede a la centrifugacin de la muestra para precipitar el ADN en el fondodel tubo. El ADN se observar como un precipitado de color blanquecino.
Paso 6.Con mucho cuidado, se elimina el sobrenadante por decantacin y el tubo con elprecipitado de ADN se coloca invertido sobre una hoja limpia de papel absorbentepara eliminar al mximo el remanente de isopropanol.
Paso 7.Se aade Etanol al 70%, se tapa el tubo y se invierte con suavidad varias vecespara lavar el precipitado de ADN.
Paso. 8. La muestra se centrifuga y el etanol se elimina por decantacin o extraccinmediante punta de pipeta (con mucho cuidado puesto que el ADN puede
d d l f d d l t b ) D b d l i it d d
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Para ello se aaden tres volmenes de una solucin de lisis de glbulos rojos al volumen
inicial de sangre total a lisar. La muestra se mezcla por inversin y se deja actuar durante 5
minutos invirtiendo el tubo con suavidad varias veces durante la incubacin. Si la muestra seha lisado completamente se observar un cambio de color hacia una tonalidad bastante ms
oscura. Posteriormente se procede a una centrifugacin para precipitar los leucocitos de la
muestra que quedan pegados en el fondo del tubo mientras que el sobrenadante que
contiene los glbulos rojos lisados se elimina por decantacin. Es conveniente dejar un
pequeo volumen de lquido residual de 200-400 l para resuspender los leucocitos
mediante un vigoroso vrtex de aproximadamente 20 segundos. A continuacin, se procede
a la lisis celular de los leucocitos correspondiente al paso 1del protocolo general descrito
anteriormente.Esta lisis adicional de eritrocitos tambin puede realizarse sobre muestras de clulas
mononucleares de sangre perifrica (CMSPs) si se observa presencia de glbulos rojos en la
muestra.
Muestras de saliva: previamente al procesamiento de las muestras de saliva recogidas enun recipiente con preservante Oragene se recomienda una incubacin de la muestra a 50C
durante 1-2 horas con objeto de optimizar el rendimiento final de ADN obtenido. Este tiempo
de incubacin puede incrementarse si se considera necesario para aumentar el rendimientofinal de muestra.
Muestras de tejido: las muestras de tejido deben ser homogeneizadas para que las clulasqueden ms expuestas a la accin de los reactivos. Existe una gran variedad de mtodos de
disrupcin de tejido desde sonicacin, hasta trituradores mecnicos, utilizacin de mortero,
adicin de esferas de vidrio y fuerte agitacin entre otros mtodos. En algunos protocolos de
extraccin de ADN la solucin de lisis celular se aade una vez homogeneizada la muestra,
mientras que en otros la homogeneizacin de la muestra se lleva a cabo en la propia solucin
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-RealPure SSSkit. Durviz s.l.u (Valencia, Espaa). www. durviz.com.
-DNA Isolation Kit for Mammalian Blood.Roche. (Basel, Switzerland). www.roche.com.
-Tissue DNA Extraction kit-AGF. AutoGen. (Massachussetts, USA). www. autogen.com.
-Oragene DNA Saliva Extraction-AGF. AutoGen. (Massachussetts, USA). www.autogen.com.
2.1.6. RENDIMIENTO.
El rendimiento esperado para cada uno de los protocolos anteriores es el siguiente:-Miller et al., (1988): el rendimiento esperado es de aproximadamente 25 g ADN/ ml de
sangre total.
-Gentra Puregene Handbook: el rendimiento obtenido en muestras de sangre total oscilaentre 25-50 g ADN/ ml de sangre, establecindose el rendimiento medio en torno a 35 g
ADN/ ml de sangre.
En muestras de saliva el rendimiento medio se sita alrededor de 55 g ADN /ml de saliva
siempre y cuando se haya recogido la cantidad de saliva adecuada (2ml) en el contenedorcorrespondiente.
En muestras de clulas el rendimiento es de entre 5 y 7 g ADN/ 106clulas, aunque este
valor puede resultar muy variable dependiendo del tipo celular.
-Qiagen Genomic DNA Handbook: el rendimiento obtenido est en el rango de 25-35 gADN/ ml de sangre.
-Flexigene DNA Handbook:el rendimiento medio obtenido es de aproximadamente 37 g
ADN/ l t 13 ADN/ 106
l l t d l l l
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saliva se ha observado una relacin inferior a 1.5 en algunos casos, sin que se vea afectada la
integridad o funcionalidad de la muestra.
Integridad:
Las muestras de ADN obtenidas con este protocolo se pueden considerar muestras de una
integridad muy alta puesto que habitualmente se observan como una nica banda definida
en gel de agarosa. Como excepciones hay que sealar: 1)muestras de saliva, puesto que enalgunos casos puede observarse un leve smear a lo largo de la carrera junto con la
presencia de una banda ntegra mayoritaria en la parte superior del gel, y 2)muestras deADN procedentes de tejidos fijados y parafinados en las que se observa un pronunciado
smeara lo largo del gel de agarosa.
Funcionalidad:
En la mayor parte de los protocolos utilizados las muestras permiten la amplificacin de un
fragmento de ADN de gran tamao (> 17 kb). En las muestras de ADN obtenidas con el
mtodo descrito por Miller et al., (1988)se ha comprobado la amplificacin de fragmentosde 8,4 kb que permiten una buena secuenciacin del ADN. La funcionalidad de las muestras
de ADN obtenidas con el protocolo Tissue DNA Extraction kit-AGF se ha comprobadomediante la amplificacin de fragmentos de 795 pb, 453 pb y 227 pb tanto en tejido fresco
congelado como en tejido fijado y parafinado.
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2.2.- MTODO DE EXTRACCIN DE ADN CON SOLVENTES ORGNICOS.
2.2.1. PRINCIPIO.
Este protocolo permite la purificacin de ADN mediante la adicin de fenol y cloroformo lo
que da lugar a la aparicin de 2 fases: una fase acuosa superior que contiene los cidos
nucleicos y una fase orgnica que contiene las protenas disueltas en el fenol y los lpidos
disueltos en el cloroformo. Para la purificacin de ADN el fenol debe tener un pH7-8.
Posteriormente se precipita el ADN de la fase acuosa con isopropanol o etanol absoluto y se
lava con etanol al 70% para eliminar sales y pequeas molculas orgnicas que podran an
estar presentes en la muestra. Por ltimo el ADN se resuspende en un tampn apropiado.
2.2.2. ALCANCE.
Este mtodo puede ser utilizado para la obtencin de ADN de diferentes tipos de muestra
como sangre perifrica, clulas o tejidos. En los biobancos integrados en la Red Nacional del
ISCIII este mtodo se aplica para la obtencin de ADN a partir de sangre y tejido fresco
congelado.
2.2.3. PROTOCOLO GENERAL.
Paso 1. Se procede al lisado celular de la muestra. La lisis se lleva a cabo en funcin del tipode muestra que se va a procesar pero es necesario que antes de la adicin del fenol
la lisis sea completa y el lisado resultante sea homogneo.
S d l d f l l l d li d l l i
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Paso 9.El precipitado se lava con 500 l de etanol al 70%. La muestra se centrifuga a 12,000g durante 10-15 min. Opcionalmente se puede realizar un segundo lavado con
etanol para maximizar la purificacin de la muestra.
Paso 10.Se elimina el etanol y se deja secar el precipitado de ADN. Finalmente el ADN esresuspendido en un volumen adecuado de tampn TE o agua destilada.
Nota: solucin CIA: mezcla de cloroformo y alcohol isoamlico en una proporcin 24:1
tampn TE :Tris HCl 10 mM, pH 8.0, EDTA 1 mM
2.2.4. ESPECIFICACIONES PARA DIFERENTES TIPOS DE MUESTRA.(Ver epgrafe con el mismo ttulo en el apartado 2.1.4. descrito en la pginas 7 y 8 de esta
gua).
2.2.5. PROTOCOLO DE SOLVENTES ORGNICOS QUE SE HA UTILIZADO EN EL DESARROLLODE ESTA GUA.
Sambrook, Fritsch, Maniatis (1989).Molecular Cloning: A Laboratory Manual2nd Edition. Vol.3,pages E3-E4. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
2.2.6. RENDIMIENTO.
El rendimiento obtenido con este protocolo en muestras de sangre total se sita en torno a
30-70 g ADN/ ml de sangre. En tejidos el rendimiento resulta mucho ms variable
dependiendo del tipo de tejido y de la cantidad de muestra de partida. No obstante, la
i l i i b di i l d ADN l
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2.3- MTODO DE ADSORCIN EN COLUMNAS DE SLICE.
2.3.1. PRINCIPIO.
El principio de extraccin de este tipo de mtodo se basa en la capacidad de adsorcin de
los cidos nucleicos en una columna de slice ante la presencia de altas concentraciones de
sales caotrpicas. Los contaminantes de la muestra son eliminados con posteriores lavados
de la columna y finalmente el ADN es eludo con H20 o un tampn de resuspensin de baja
fuerza inica a pH neutro o ligeramente alcalino.
2.3.2. ALCANCE.
Cuando se utiliza una columna para la purificacin de cidos nucleicos es importante no
saturar la capacidad de la columna de unir cidos nucleicos debido a un exceso de muestra.
De hecho, el rendimiento y la calidad del ADN (o ARN) obtenido con este mtodo depende en
gran medida de la cantidad y calidad de la muestra de partida.
Este mtodo puede ser utilizado para la obtencin de ADN de los siguientes tipos demuestra:
Sangre perifrica: existen kits con columnas de slice con diferentes capacidades deretencin de tal manera que se pueden procesar volmenes que oscilan entren 0,02 ml y 10
ml de sangre.
Clulas mononucleares de sangre perifrica (CMSPs):las preparaciones de CMSPs puedentener un volumen variable puesto que se pueden procesar desde 5x 10
6 leucocitos hasta
id d d 1 108 l i i d l ki l id d d
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muestra donde la presencia de ARN puede ser alta se recomienda aadir RNAsa
siguiendo las indicaciones del kit que vaya a ser utilizado.
Paso 3. Se aade a la muestra una solucin de unin de cidos nucleicos a la columna.Puede ser una solucin provista por el kit o etanol absoluto. La mezcla se aplica a la
columna de slice que se encuentra adaptada a un tubo vaco y mediante
centrifugacin el ADN queda retenido en la columna mientras que las protenas y
otros contaminantes de la muestra son arrastrados con la solucin de lisado al
tubo.
Paso 4.Sobre la columna, que se ha transferido a un nuevo tubo, se aade una solucin de
lavado para eliminar el resto de contaminantes de la muestra que son arrastradosen esta solucin por centrifugacin. Este paso suele repetirse dos veces para
asegurar una buena pureza de la muestra.
Paso 5.Se transfiere la columna a un nuevo tubo y se lleva a cabo una nueva centrifugacina la mxima velocidad posible (durante 1-2 minutos) para asegurar una eliminacin
completa de los restos de la solucin de lavado de la columna previamente a la
elucin del ADN.
Paso 6.La columna se transfiere a un nuevo tubo con tapa y se lleva a cabo la separacindel ADN de la columna de slice aadiendo H20 o un tampn de baja fuerza inica.
El tampn de resuspensin debe aplicarse en el centro de la columna y con un
volumen suficiente para asegurar que se reparte uniformemente por toda la
superficie de slice. Se aconseja un tiempo de incubacin de la columna con el
tampn de resuspensin de 4-5 minutos para aumentar el rendimiento de ADN. Por
ltimo, se realiza una centrifugacin que permite la coleccin del ADN en solucin
en el tubo y se desecha la columna.
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-QiAampDNA Mini and Blood Mini Handbook for DNA purification from whole blood,plasma, serum, buffy coat, lymphocytes, dried blood spots, body fluids, cultured cells.
swabs, tissue. Qiagen. (Hilden, Germany). www. qiagen.com.
-QIAamp DNA FFPE Tissue Handbook for purification of genomic DNA from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Qiagen. (Hilden, Germany). www. qiagen.com.
2.3.6. RENDIMIENTO.
El rendimiento esperado para cada uno de los protocolos utilizados es el siguiente:
-Manual PerfectPureTM DNA Blood Kit: el rendimiento obtenido oscila entreaproximadamente 25-40 g ADN/ ml sangre.
-Genomic DNA from Blood: con este protocolo se alcanza un rendimiento medio de
aproximadamente 30 g ADN/ ml de sangre.
-QIAampDNA Mini and Blood Mini Handbook: para muestras de sangre este mtodopermite obtener un rendimiento de 25-35 g ADN/ ml de sangre.
Para muestras de saliva extradas con preservante Oragene se obtiene un rendimiento de15-25 g ADN/ ml de saliva. Para muestras de saliva obtenidas por torunda se obtienen
alrededor de 15-25 g ADN/ torunda.
En muestras de clulas se han obtenido valores en torno 1,5-5 g ADN/ 106 clulas; la
extraccin de ADN a partir de clulas fijadas en solucin de Carnoy (etanol absoluto,
cloroformo, cido actico glacial en proporcin 6:3:1) ha permitido obtener cantidades de 1-
4 g ADN/ 106clulas.
Para muestras de tejido el rendimiento esperado es de en torno a 0,2-1,2 g ADN/ mg de
jid l d d h d l i id d d l d jid
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de tejidos FFPE se observa un smearpronunciado a lo largo del gel de agarosa reflejando
una mayor degradacin del ADN.
Funcionalidad:las muestras que presentan una banda definida en la parte superior del gelde agarosa son capaces de amplificar por una reaccin de PCR un fragmento > 17.5 kb. En
muestras de ADN de saliva o de clulas fijadas en medio de Carnoy no siempre se logra
amplificar fragmentos >17.5 kb. No obstante, en la mayora de los casos se logra amplificar
fragmentos de ADN de aproximadamente 5- 7 kb. No se ha comprobado mediante PCR la
funcionalidad de muestras de tejido fresco congelado, aunque dado que tanto la integridad
como la pureza obtenidas con este tipo de muestras son altas, probablemente se logren
amplificar por PCR fragmentos de ADN de gran tamao. Las muestras procedentes de tejidosFFPE suelen amplificar fragmentos de aproximadamente 300 pb y se ha comprobado que son
funcionales en una reaccin de qPCR que amplifica fragmentos de 100-150 pb.
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2.4- MTODO DE PURIFICACIN POR UNIN A MICROESFERAS MAGNTICAS.
2.4.1. PRINCIPIO.
Este mtodo utiliza esferas magnticas cuya superficie est recubierta con polmeros
naturales o sintticos que presentan una alta afinidad por los cidos nucleicos. Las esferas
magnticas se aaden al lisado de la muestra lo que permite su unin a las molculas de
ADN. Cuando se sita un imn en la pared del tubo, ste permite el agrupamiento en dicha
pared de las esferas con el ADN unido, mientras que los contaminantes de la muestra en
solucin son eliminados por pipeteo o decantacin. Despus de varios ciclos de resuspensiny lavado en los que las esferas quedan retenidas por el imn, el ADN es eludo en un tampn
adecuado.
2.4.2. ALCANCE.
Este mtodo se utiliza para la obtencin de ADN de los siguientes tipos de muestra:
Sangre perifrica:pueden procesarse volmenes de entre 5 y 10 ml de sangre perifrica.Clulas mononucleares de sangre perifrica (CMSPs):las preparaciones de CMSPs pueden
tener un volumen variable de entre 0,1-2 ml de medio.
Cultivos celulares: pueden procesarse hasta 1.2 x107clulas.
Lquido amnitico: pueden procesarse volmenes de entre 1-3 ml.
Saliva: pueden procesarse 2 ml de saliva mezclados con 2 ml de preservante Oragene.
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Paso 6. Se realizan dos nuevos lavados siguiendo el mismo procedimiento descrito en elpaso 5. Al eliminar el tampn de lavado en el ltimo paso no se retira el tubo del
separador magntico de modo que las esferas quedan agrupadas en la parte deltubo en contacto con el separador.
Paso 7.Se aade una nueva solucin de lavado sobre las esferas magnticas agrupadas y serealiza una incubacin durante 1 minuto. Tiempos ms prolongados de incubacin
o la dispersin de las bolas magnticas durante la misma pueden dar lugar a un
rendimiento ms bajo reflejado en la obtencin de una menor cantidad de ADN.
Paso 8. Se elimina la solucin de lavado y se aade el volumen adecuado de tampn de
resuspensin (tambin puede utilizarse tampn TE a pH 8.0 o H20 a pH 8.0). Seretira el separador para mezclar bien las esferas con el tampn de resuspensin de
ADN. La solucin se incuba durante 10 minutos con agitacin a temperatura
ambiente para eluir el ADN de las esferas. Esta incubacin puede realizarse a 55C
para optimizar la elucin del ADN.
Paso 9.Se aplica el separador magntico al tubo durante aproximadamente 3 minutos paraseparar las esferas magnticas de la suspensin de ADN. La solucin de ADN se
pasa a un tubo limpio con cuidado de no arrastrar las esferas magnticas. Si an se
observarse presencia de esferas magnticas en las solucin de ADN se repite de
nuevo este ltimo paso.
2.4.4. ESPECIFICACIONES PARA DIFERENTES TIPOS DE MUESTRA.
(Ver epgrafe con el mismo ttulo en el apartado 2.1.4. descrito en la pgina 7 y 8 de estagua).
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En muestras de lquido amnitico se alcanza un rendimiento en torno a 0,5-3 g ADN/ ml
de muestra.
Para tejidos frescos se ha observado un rendimiento de alrededor a 2-6 g ADN/ mg detejido. El resultado puede variar en funcin de la naturaleza del tejido que se procese.
2.4.7. CALIDAD DE LAS MUESTRAS.
Pureza: si se detecta la presencia de esferas magnticas en la muestra las relaciones deabsorbancia pueden resultar afectadas por lo que se recomienda aplicar de nuevo el
separador magntico a la solucin de ADN durante unos 3 minutos para eliminar las esferas
que pudiesen quedar en de la muestra de ADN.
En general con este mtodo las relaciones de absorbancia A260/280 presentan valores
entre >1.7 y 2.1. Mientras que en la mayora de los casos la relacin A260/230 es >1.5.
Integridad: tras la migracin del ADN mediante electroforesis se observa una bandadefinida en la parte superior del gel de agarosa indicativa de una integridad ptima del ADN
Funcionalidad: la mayora de las muestras obtenidas con este mtodo permiten la
amplificacin de fragmentos de ADN de elevado tamao molecular (>17.5 kb) mediantereaccin de PCR.
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Tablas RENDIMIENTO obtenido:
1A. Se muestran los datos del rendimiento obtenido para cada tipo de muestra con los mtodos de extraccin de ADN basados en precipitacinpor sales y extraccin con solventes orgnicos.
MTODOS DE EXTRACCIN DE ADN GENMICO
PRECIPITACIN CON SALESSOLVENTESORGNICOS
Miller et al.(1988)Gentra
Puregene
Quiagen Genomic
DNAFlexigene DNA RealPure SSS
DNA Isolation Kit for
Mammalian Blood
Tissue DNA Extraction
kit-AGF
Oragene DNA Saliva
Extraction-AGFFenol/ Cloroformo
T
IPODEMUESTRA
sangre perifrica 25 g ADN /ml
de sangre 35 g ADN /ml
de sangre25-35 g ADN/ ml
de sangre. 37 g ADN/ ml
sangre 35 g ADN /ml de
sangre2-5 g ADN/106
clulas30-70 g ADN/ ml de
sangre
CMSPs 13 g ADN/106
clulas
clulas5-7 g ADN/106
clulas
mdula sea2-5 g ADN/106
clulas
clulas fijadas enCarnoy
saliva 55 g ADN /ml
de saliva 140 g ADN/ ml de
saliva.
tejido frescocongelado
3,5 g ADN/ mg
tejidomuy variable
tejidos FFPE 30 g ADN/3 corte
de 8 m
lquido amniotico
cogulo
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1B. Se muestran los datos del rendimiento obtenido para cada tipo de muestra con los mtodos de extraccin de ADN basados en adsorcin encolumnas de slice y unin a esferas magnticas.
37 g ADN/ mg
25-35 g ADN/ 10 g
8-16 g ADN/ 10
6
clulas
25 g ADN/ ml de
sangre
0,5-3 g ADN/ ml de
muestra
2-6 g ADN/ mg de
tejido
MTODOS DE EXTRACCIN DE ADN GENMICO
20 g /200 l
25-33 g ADN/ ml de
sangre
25 g ADN/ ml de saliva
30 g ADN/ ml de sangre25-35 g ADN/ ml de
sangre
15-25 g ADN/ ml o
torunda
1,5-5 g ADN/ 106clulas
1-4 g ADN/ 106clulas
0,2-1,2 g ADN/ mg de
tejido
25-40 g ADN/ ml sangre
mdula sea
Buffy Coat Kit
special
Genomic DNA Isolation
from Saliva
Chemagic Amniotic
Fluid Kit special
Chemagic DNA
Cell Kit special
UNIN A ESFERAS MAGNTICAS
QIAamp DNA FFPE
Tissue
ADSORCIN EN COLUMNAS DE SLICE
TIPODEMUESTRA
Chemagic DNA
Blood Kit
Chemagic DNA
Tissue Kit
Manual PerfectPureTM
DNA Blood Kit
Genomic DNA from
Blood
QiAampDNA Mini
and Blood Mini
lquido amniotico
cogulo
sangre perifrica
CMSPs
clulas
saliva
tejido fresco
congelado
tejidos FFPE
clulas fijadas en
Carnoy
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Tablas CALIDAD observada en las muestras:
2A.Se muestran los datos de la calidad observada en cada tipo de muestra con los mtodos de extraccin de ADN basados en precipitacin porsales y extraccin con solventes orgnicos.
MTODOS DE EXTRACCIN DE ADN GENMICO
PRECIPITACIN CON SALES SOLVENTES ORGNICOS
Miller etal.(1988) Gentra Puregene Quiagen Genomic DNA Flexigene DNA RealPure SSSDNAIsolationKitfor
MammalianBloodTissue DNA Extractionkit-AGF
Oragene DNASaliva
Extraction-AGFFenol/ Cloroformo
TIPODEMUESTRA
sangreperifrica
P:A260/280: 1.8-2P: 260/280: >1.7-2.1;A260/230:
>1.5P: 260/280: >1.7-2.1;A260/230:>1.5 P: 260/280: >1.8;A260/230:> 2
P: 260/280: >1.7-2.1;A260/230:
>1.5P: A260/280: >1.8;A260/230:> P: A260/280 > 1.7; A260/230< 1.5
I: banda definida parte superiorgel
I: banda definida parte superiorgel
I: banda definida parte superiorgel I: banda definida parte superiorgelI: banda definida parte superiorgel
I: banda definida parte superiorgel
I: banda definida parte superiorgel
F: PCRamplificacin > 8,4kb,secuenciacin alta calidad
F: PCRamplificacin>17kb F: PCRamplificacin>17kb F: PCRamplificacin>17kb F: PCR amplificacin>17kbF: PCRamplificacin>17kb enla mayoramuestras . Siempre amplificacin de 7 kb
CMSPs
P: 260/280: >1.8;A260/230:>1.9
I: banda definida parte superiorgel
clulas
P: 260/280: >1.7-2.1;A260/230:
>1.5
I: banda definida parte superior
gelF: PCRamplificacin>17kb
mdula sea
P: 260/280: >1.8;A260/230:>1
I: banda definida parte superior
gel
PCR: amplificacin>17 kb
clulas fijadas en Carnoy
saliva
P: 260/280: >1.7-2.1;A260/230:
1.7;A260/230:
>1.4
I: banda definida conleve smear
F: PCRamplificacin>17kb enla
mayora mues tras . Siempre
amplificacinde 7kb
tejidofrescocongelado
P: 260/280: >1.9;A260/230:>1.8
P:260/280:>1.7;A260/230:< 1.5
I: banda definida parte superior
gelI: banda definida parte superiorgel
PCR: amplificacinbandas :795,
453y 227pb
F: PCRamplificacin>17kb enla mayora
muestras . Siempre amplificacin de 7 kb
tejidos FFPE
P: 260/280: >1.9;A260/230:> 2
I: smearpronunciado
F: PCRamplificacin bandas:
795, 453y 227pb
lquidoamniotico
cogulo
P:pureza
I:integridadF:funcionalidad
7/23/2019 Protocolos Extraccin ADN
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2B. Se muestran los datos de la calidad observada en cada tipo de muestra con los mtodos de extraccin de ADN basados en adsorcin en columnas deslice y unin a esferas magnticas.
MTODOS DE EXTRACCIN DE ADN GENMICO
ADSORCIN EN COLUMNAS DE SLICE UNIN A ESFERAS MAGNTICAS
Manual PerfectPureTM DNABloodKit Genomic DNAfromBlood
QiAampDNAM ini andBloodMini QIAampDNAFFPE Tissue
Chemagic DNABloodKit Chemagic DNATissueKit Chemagic DNABuffy CoatKitspecial
Genomic DNA IsolationfromSaliva Chemagic Amniotic FluidKits pecial
Chemagic DNACell Kitspecial
TIPODEMUESTRA
sangreperifrica
P: A60/280:>1.9;A260/230:>2.1 P: A26 0/280: >1.7;A260/230:1-1.5 P: A26 0/280: >1.7; A260/230: >1.5 P: A26 0/280: >1.7-2,1; A260/230:>1 .5
I: bandadefinida parte superiorgel I: bandadefinida partesuperiorgel I: bandadefinidapartesuperiorgel
F: PCR amplificacin>17kb F: PCR amplificacin>17kb F: PCR ampl i f icacin>17kb
CMSPsP: A260/280: >1.7-2.1; A260/230:>1 .5
I: bandadefinidapartesuperiorgel
F: PCR amplificacin>17kb
clulasP: A26 0/280: >1.7 A260/230:> 1 P: A26 0/280: >1.7-2,1; A260/230:>1 .5
I: bandadefinida partesuperiorgel I: bandadefinida parte superiorgel
F: PCR amplificacin>17kb F: PCR ampl i f icacin>17kb
mdula sea
clulas fijadasenCarnoy
P: A2 60/280: >1.65; A260/230:> 1
I: banda enpartesuperiorgel consmear
F: PCR amplificacin>7 kb
salivaP: A26 0/280: > 1,7-2;A260/230:>1 P: A26 0/280: >1.7-2.1; A260/230:>1 .5
I: bandadefinidaconlevesmear I: bandadefinida partesuperiorgel
F: PCR amplificacin>7 kb F: PCR amplificacin>17kb
tejidofrescocongelado
P: A26 0/280: >1,7-2 P: A26 0/280: >1.7-2,1; A260/230:>1 .5
I: bandadefinida partesuperiorgel I: bandadefinida partesuperiorgel
F: PCR amplificacin>17kb
tejidos FFPE
P: 260 /280 : >1.7-2;A260/230: >2
I: smearpronunciado
F: PCR amplificacin300pb;qPCR:amplificacin 100-150pb
lquidoamniotico
P: A26 0/280: >1.7-2,1; A260/230:>1 .5
I: bandadefinidapartesuperiorgel
F: PCR amplificacin>17kb
coguloP: A26 0/280: >1,7;A260/230:>1.5
P:pureza
I:integridadF:funcionalidad
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