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Máster Interuniversitario en Zootecnia y Gestión Sostenible:
ganadería ecológica e integrada.
Instituto de Estudios de Postgrado
Universidad de Córdoba
J. De la Fuente INIA – Reproducción Animal y
Conservación Recursos Zoogenéticos
jfuente@inia.es
REPRODUCCIÓN ASISTIDA EN EL VACUNO DE LECHE FIV
Córdoba, Marzo 2012
Impacto de las Tecnologías de
Reproducción Asistida
Mejora Reproductiva Bovina
I.A.
FIV
Clonación
Transgénesis
MOET
Sexaje OPU
1
2
3
4 5
6
7
PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO (FIV):
ÍNDICE
1.- INTRODUCCIÓN
3.- VALORACIÓN DE OVOCITOS
4.- VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA FIV
2.- ASPIRACIÓN DE OVOCITOS :
- OVARIOS DE MATADERO
- DE ANIMALES VIVOS:
* PUNCIÓN LAPAROSCÓPICA
* PUNCIÓN ECOGRÁFICA
• >200.000 ovocitos al nacer
• 1 ovulación por ciclo - 17 ciclos/año
• Media por vaca < 3 crías
• Descendencia limitada:
– Duración de la gestación
– 1-2 ovocitos ovulados
Cómo MEJORAMOS esto ?
FISIOLOGÍA REPRODUCTIVA DE LA HEMBRA BOVINA
Fecundación in vitro
Cultivo In vitro In vivo
Aspiración Ovarios
Maduración Ovocitos
Transferencia
Capacitación Espermas
Fertilización
Embriones
ASPIRACIÓN DE OVOCITOS
1.- OVARIOS DEL MATADERO: En caso de accidente No repetible Aplicación en investigación
2.- ANIMALES VIVOS
2.1.- PUNCIÓN LAPAROSCÓPICA: Requiere cirugía Repetibilidad limitada (bienestar animal y adhesiones
2.2.- PUNCIÓN ECOGRÁFICA: Repetible y poco invasivo Fácil para vacas gestantes y con problemas Posible en terneras
1.- OVARIOS DE MATADERO:
Aspiración de ovocitos
Búsqueda de ovocitos
2.1.- PUNCIÓN LAPAROSCÓPICA:
Anestesia quirúrgica Puertos
Suturas
2.1.- PUNCIÓN LAPAROSCÓPICA:
Ovario SOV
Aspiración
Punción
Producción de embriones in vitro, aspiración laparoscópica en prepúberes
Edad,
meses
Folículos
puncionados
Ovocitos
recuperados
Embriones
desarrollados
6
50
32 (64%)
3 (10%)
7
43
14 (33%)
2 (14%)
8
19
5 (26%)
3 (60%)
9
18
9 (50%)
4 (44%)
2.2.- PUNCIÓN ECOGRÁFICA: Aplicaciones
Vacas cíclicas: semen caro
problema: oviductos bloqueados
quistes ováricos
fallo en la SOV
fallo en la fecundación
post parto: durante el anoestro
gestantes: durante el primer trimestre
Novillas impúberes: desde el primer mes
– Aspiración ultrasonográfica:
– Aguja de 14g.
– 20-22 ml/min de presión de aspiración.
– Medio: PBS + BSA, surfactante.
Aspiración en animales prepúberes
– Tratamiento de superovulación:
• 750 a 1.000 ui de eCG.
• Neutra eCG + GnRH.
• A intervalos de 2 a 4 semanas.
– Intervalo de SOV a la obtención de 48 a 72h.
Punción en hembras prepúberes:
Modificación de la sonda para terneras
A) Rotación axial B) Plano vertical C) Craneal-caudal D) Plano horizontal
Direcciones y planos
Terneras de 6 meses
Imagen ultrasonográfica: ovario estimulado
Punción en hembras prepúberes:
Folículo aspiración transvaginal hembras prepúberes
Aguja de aspiración
Tamaño de los folículos
Punción en hembras prepúberes:
1. Aspiración folicular
4. Recuperación de ovocitos
2. Sedimentación
3. Búsqueda
Metodología de FIV:
OBTENCION DE OVOCITOS:
Primera visión
Denudados Poco CODs
SELECCION DE OVOCITOS:
NO
¿ ?
SI
Expandido
SELECCION DE OVOCITOS:
Vacuolizados
Picnóticos
Placa de
maduración
Grado 1 y 2
Grado 3 y 4
Maduración in vitro
1er corpúsculo polar
MIV durante 24 h
39o C, 5% CO2
Fecundación (FIV)
• Descongelar el semen.
• Capacitación - heparina.
• Selección espermática:
– Swim-up.
– Gradiente de densidad de Percoll.
• 0,5-1 X 106 spz/mL.
• Co-cultivo durante 24 h en 5% CO2 en aire.
Separación espermática con Swim-up
0.25 mL semen + 1 mL medio
DESCONGELACIÓN SPZ
Separación espermática con Percoll
Antes de centrifugar Después de centrifugar
Zigoto
FIV durante 24h
39o C, 5% CO2
Diferencias entre toros al fecundar in vitro e in vivo (7 réplicas por semental, P<0.001)
Toro
Ovocitos
Cultivo
% División
% Desarrollo
TNR (IAs)
A
1.212
73 a
21 a
78% (5.300)
B
1.207
64 b
14 b
73% (1.500)
C
684
56 b
12 b
-
D
615
44 c
5 c
-
Diferencias entre eyaculados de un mismo semental (17 réplicas, P<0.01)
Ovocitos cultivados
(%) División
(%) Eclosión
Eyaculado 1
2.817
70
19
Eyaculado 2
2.604
72
11*
Estabilidad de la cromatina (EC, explica el 36%).
Porcentaje de spz normales determinados por eosina/nigrosina (%ENOR, explica el 25%).
Porcentaje de embriones divididos (%D, explica el 16,8%)
Porcentaje de ovocitos penetrados in vitro (%P, explica el 3,6%).
Ecuación de Predicción de la Tasa de No Retorno (PTNR)
PTNR= 173,11 – 0,02 (EC) + 1,38 (%ENOR) + 0,95 (%D) + 0,39 (%P)
R2 = 0,82
La ecuación para predecir la fertilidad de los toros incluyó cuatro parámetros que explican el 82% de la variación en la fertilidad de los toros estudiados.
Día 2 Día 3 Día 4 Día 5
Día 6 Día 7 Día 8 - 9
Desarrollo de embriones cultivados in vitro
Cultivo in vitro de embriones a los 7-8 días
Pocillo completo
Blastocistos sin ZP, elongados
Blastocistos expandidos
Congelación y vitrificación de embriones producidos in vitro
10% ETG
10´
10% Gly 10% Gly
20% ETG
25% Gly
25% ETG
5´ 5´ 30´´
Viabilidad (%)
Eclosión (%)
Congelación
77/150 (51)
46/150 (31)
Vitrificación
82/147 (56)
52/147 (35)
Viabilidad post descongelación de embriones PIV vitrificados
Viabilidad
Eclosión
1 paso
55% (33/60)
35% (21/60)
2 pasos
56% (38/68)
41% (28/68)
3 pasos(4ºC)
72% (47/65)*
63% (41/65)*
0.5 M S 10 min 35ºC
Comparación entre ambos tipos de producción de embriones bovinos
In vivo
In vitro
Embriones/vaca/año +21 +80
Partos de embriones frescos 60 % 45 %
Partos de emb. congelados 50 % 20 %
Defectos congénitos 1 % 4 %
Distocias 6 % 11 %
Peso al nacimiento
>10 %
FECUNDACIÓN IN VITRO
• VENTAJAS
• Disminución del estrés de manejo.
• Sin interacción sobre la ovulación.
• Utiliza varios sementales sobre una misma vaca.
• Evita la transmisión de enfermedades.
• Realización durante largos períodos fisiológicos.
• Propicio para la investigación.
• Insustituible en la Conservación de Recursos Genéticos.
• INCONVENIENTES
• Bajos resultados en la congelación.
• Equipo y formación muy elevada.
• Síndrome del Ternero Gigante.
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