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SEGUIMIENTO DEL PROCESO DE HUMIFICACIÓN EN COMPOST
INOCULADO
SANDRA PATRICIA KALIL PERDOMO
PROYECTO DE GRADO Presentado como requisito parcial
para optar al título de
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Bogotá D.C
Febrero 12 de 2007
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
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NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona
alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
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SEGUIMIENTO DEL PROCESO DE HUMIFICACIÓN EN COMPOST
INOCULADO
SANDRA PATRICIA KALIL PERDOMO
APROBADO
_________________________ _________________________ Jaime Augusto Casas Mateus M.Ed Maria Mercedes Martínez Salgado M.Sc Departamento de Química Departamento de Microbiología Director Codirectora
_________________________ ________________________ Aura Marina Pedroza M.Sc Gerardo Moreno M.Sc Departamento de Microbiología Departamento de Microbiología Jurado Jurado
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
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SEGUIMIENTO DEL PROCESO DE HUMIFICACIÓN EN COMPOST
INOCULADO
SANDRA PATRICIA KALIL PERDOMO
APROBADO
__________________________ ____________________________ Ángela Umaña Muñoz M.Phill Luís David Gómez Méndez M.Sc Decana Académica Director de Carrera
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
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DEDICATORIADEDICATORIADEDICATORIADEDICATORIA
José y AidéJosé y AidéJosé y AidéJosé y Aidé
…en realidad las palabras …en realidad las palabras …en realidad las palabras …en realidad las palabras no son suficientes para expresar mis mno son suficientes para expresar mis mno son suficientes para expresar mis mno son suficientes para expresar mis máááás sins sins sins sinceros ceros ceros ceros agradecimientos a mis papáagradecimientos a mis papáagradecimientos a mis papáagradecimientos a mis papás, todo lo que soy es gracias a elloss, todo lo que soy es gracias a elloss, todo lo que soy es gracias a elloss, todo lo que soy es gracias a ellos
Brian SuárezBrian SuárezBrian SuárezBrian Suárez
sencillamente, creyósencillamente, creyósencillamente, creyósencillamente, creyó en mi…. en mi…. en mi…. en mi….
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
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AGRADECIMIENTOS
A Bioagrícola del Llano, empresa de aseo de Villavicencio que fue la entidad
encargada de financiar este proyecto.
A Jaime Casas, director de este proyecto, por su valiosa colaboración, apoyo y
conocimientos aportados.
A María Mercedes Martínez, codirectora de este proyecto, por su constante apoyo,
interés y paciencia.
A la Pontificia Universidad Javeriana por apoyar para el buen desempeño y desarrollo
de este proyecto.
A Viviana Gutiérrez por su constante apoyo moral, ayuda en la elaboración de este
proyecto, compañía y amistad.
Febrero 12 de 2007
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
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TABLA DE CONTENIDO
Número Título Página Lista de figuras 9 Lista de tablas 10 Lista de anexos 11 Resumen 12
1 Introducción 14 2 Marco teórico y revisión de literatura 16
2.1 Materia orgánica en el suelo 16 2.2 Compostaje 18
2.2.1 Factores que influyen en el proceso 19 2.2.2 Humificación de la materia orgánica 20 2.2.3 Poblaciones desarrolladas durante el compostaje 21 2.2.4 Enzimas microbianas 23
2.2.4.1 Proteasas 23 2.2.4.2 Celulasas 25
2.3 Métodos de determinación y seguimiento de humificación en suelos
27
2.3.1 Determinación de materia orgánica total en el suelo 29 3. Objetivos 31
3.1 Objetivo general 31 3.2 Objetivos específicos 31 4. Materiales y métodos 32
4.1 Recolección de muestras 32 4.1.1 Zona de muestreo 32 4.1.2 Toma de muestras de compost 32
4.1.2.1 Análisis fisicoquímicos de la muestra 33 4.1.3 Toma de muestras de suelo 34
4.1.3.1 Análisis fisicoquímicos de la muestra 35 4.2 Ensayos invitro 35
4.2.1 Preparación de las muestras 35 4.2.2 Determinación de humedad de los tratamientos 36 4.2.3 Determinación de pH en la mezcla compost:suelo 36
4.3 Determinación de materia orgánica en el suelo 36
4.3.1 Oxidación de materia orgánica total en el suelo por vía húmeda
36
4.4 Evaluación de la actividad enzimática cuantitativa 38 4.4.1 Extracción de proteasas 38
4.4.1.1 Ensayo de la actividad proteolítica 38
4.4.1.2 Curva patrón para la técnica del ácido tricloroacético (TCA)
39
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
8
4.4.2 Extracción de celulasas 39 4.4.2.1 Ensayo de actividad celulolítica 39
4.4.2.2 Curva patrón ara la técnica del ácido 3,5 dinitrosalisílico (DNS)
40
4.5 Análisis estadístico 41 5 Resultados y discusión 42
5.1 Recolección de muestras 42 5.1.1 Toma de muestras 42
5.2 Procesamiento de muestras 44 5.2.1 Determinación de características fisicoquímicas 44
5.2.1.1 Determinación de pH 46 5.2.1.2 Determinación de carbono orgánico oxidable 51
5.2.2 Cuantificación de la actividad proteolítica 53 5.2.3 Cuantificación de la actividad celulolítica 58
6 Conclusiones 69 7 Perspectivas 70 8 Referencias 71 Anexos 80
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LISTA DE FIGURAS
Número de figura
Título Página
1 Ciclo de la materia orgánica 16
2 Crecimiento de hongos como indicadores de finalización de fase termofílica
20
3 Cambios relativos observados en poblaciones microbianas, características durante el compostaje
22
4 Mecanismos de acción de las proteasas 24 5 Estructura química de la celulosa 25 6 Disposición de pilas de compost 33 7 Cultivo de Stevia rebaudiana Bertoni 34
8 Valores de pH de cada unos de los 11 tratamientos durante el primer muestreo
47
9 Seguimiento de los valores de pH durante los 90 días del proceso de humificación
49
10 Determinación de materia orgánica durante los 90 días del proceso
52
11 Coeficiente de variación Vs. Tiempo 52 12 Curva de calibración de tirosina 53 13 Actividad proteolítica del primer muestreo (tiempo cero) 55 14 Actividad proteolítica del segundo muestreo (30 días) 56
15 Seguimiento de la actividad proteolítica durante los 90 días del proceso
57
16 Curva de calibración de glucosa 59 17 Valores obtenidos por la técnica de DNS y Somogyi Nelson 60 18 Valores obtenidos por la técnica de DNS y Somogyi Nelson 61
19 Actividad celulolítica obtenida de cada uno de los 11 tratamientos del primer muestreo
62
20 Actividad celulolítica obtenida de cada uno de los 11 tratamientos del segundo muestreo (30 días)
64
21 Actividad celulolítica obtenida de cada uno de los 11 tratamientos del tercer muestreo (60 días)
65
22 Actividad celulolítica obtenida de cada uno de los 11 tratamientos del segundo muestreo (90 días)
66
23 Seguimiento de la actividad celulolítica durante los 90 días del proceso
67
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LISTA DE TABLAS
Número de tabla
Título Página
1 Factores que influyen en el proceso y su influencia en el proceso de compostaje
19
2 Características generales de las celulasas 26
3 Determinación de la actividad celulolítica cuantitativa por el método de DNS
40
4 Composición fisicoquímica del compost estable en base húmeda
43
5 Composición fisicoquímica del suelo 45
6 Medias de los valores de pH de cada uno de los 11 tratamientos del primer muestreo
48
7 Medias de pH de las 11 réplicas de cada tratamiento por tiempo de muestreo durante los 90 días de seguimiento.
48
8 ANOVA. Seguimiento del pH durante todos los 90 de proceso 50
9 Medias de los valores de UP/min/g de cada uno de los 11 tratamientos del primer muestreo.
54
10 Medias de los valores de UP/min/g de cada uno de los 11 tratamientos del segundo muestreo (30 días).
55
11 Medias de la actividad proteolítica de las 11 réplicas de cada tratamiento por tiempo de muestreo durante los 90 días de seguimiento.
56
12 ANOVA. Seguimiento de la actividad proteolítica durante todos los 90 de proceso
58
13 Comparación de 2 métodos de extracción y cuantificación de azucares reductores
60
14 Medias de la actividad celulolítica de las 11 réplicas de cada tratamiento del tiempo cero
63
15 Medias de la actividad celulolítica de las 11 réplicas de cada tratamiento del segundo muestreo (30 días)
63
16 Medias de la actividad celulolítica de las 11 réplicas de cada tratamiento del tercer muestreo (60 días)
64
17 Medias de la actividad celulolítica de las 11 réplicas de cada tratamiento del cuarto muestreo (90 días)
65
18 Medias de la actividad celulolítica de las 11 réplicas de cada tratamiento por tiempo de muestreo durante los 90 días de seguimiento.
66
19 ANOVA. Seguimiento de la actividad celulolítica durante todos los 90 de proceso
67
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LISTA DE ANEXOS
Número de anexo
Título Página
1 Sal ferrosa (Mohr) 80 2 Preparación de buffer fosfato 0,1M 81
3 Preparación de la solución de caseína hidrolizada Preparación del ácido tricloroacético (TCA) al 15% m/v
82
4 Preparación de la solución stock de tirosina 100 µmol/mL 83
5 Promedio de absorbancias para la determinación de la curva patrón de tirosina
84
6 Preparación de carboximetilcelulosa al 1,0% m/v en buffer fosfato 0,1M
85
7 Preparación de la solución stock de glucosa 2 g/L Preparación de la solución stock de glucosa (0,5 – 2 g/L)
86
8 Preparación del reactivo de DNS 87
9 Medias y desviación estándar de los valores de pH obtenidos de cada uno de los 11 tratamientos del primer muestreo
89
10 Promedio de absorbancias a 540 nm para la determinación de azucares reductores por el método de DNS
90
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RESUMEN
La degradación de residuos orgánicos es una herramienta fundamental para disminuir
el impacto ambiental que estos tienen sobre el planeta, es por esto que se utiliza el
proceso de compostaje para este fin, además de obtener un producto con interés
agroindustrial.
En esta investigación se llevó a cabo el monitoreo de la actividad enzimática
proteolítica y celulolítica cuantitativamente, en respuesta a diferentes cantidades de
compost:suelo en el transcurso de 90 días y relacionado con la materia orgánica, esto
con el fin de realizar el seguimiento como medida indirecta del proceso de
humificación. Los tratamientos se realizaron con diferentes relaciones de
compost:suelo medido en gramos, obtenidos de la siguiente manera: T1 100:0; T2
90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5 60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10
10:90; T11 0:100 y montados a partir de muestras obtenidas de pilas de compostaje
con la fracción orgánica de los residuos sólidos de la ciudad de Villavicencio (Meta)
y suelo proveniente de un cultivo de Stevia rebaudiana Bertoni ubicado en Puerto
López – Meta. En buffer fosfato 0,1M fueron suspendidos 5 g de muestra de cada uno
de los 11 tratamientos centrifugados a 16 000 g por 30 minutos y el sobrenadante
producido, fue resuspendido en acetona a -15°C centrifugado de nuevo por el mismo
tiempo. A los sobrenadantes obtenidos se les determinó y cuantificó las actividades
proteolítica y celulolíticas utilizando la técnica del ácido tricloroacético (TCA) y la
técnica del ácido 3,5 dinitrosalisílico (DNS), respectivamente. Además se relacionó
con estas actividades el porcentaje de materia orgánica medido por el método de
Walkley y Black y usando herramientas estadísticas como ANOVA para determinar
diferencia de medias entre diferentes tiempos de muestreo. Los resultados mostraron
gran actividad celulolítica durante los 90 días, sin embargo, en los primeros 60 días
fue mas notable la actividad que tiene este complejo enzimático frente a este tipo de
sustrato, de la misma manera sucedió con la actividad proteolítica ya que se mantuvo
constante durante todo el proceso presentando una actividad enzimática bastante alta
a los 30 días, relacionando estas dos actividades con el comportamiento del pH y de
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13
la materia orgánica, presentando así una disminución esperada mediante la oxidación
con dicromato de potasio.
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1. INTRODUCCIÓN
El término de materia orgánica en suelos (MOS), se refiere al conjunto de substancias
orgánicas que contienen carbón. Química y físicamente, consiste en una mezcla de
residuos de plantas y animales en varios estados de descomposición, substancias
sintetizadas microbiológica y/o químicamente, de productos desmenuzados, de
cuerpos vivos y muertos de microorganismos y pequeños animales que permanecen
descompuestos. Sin embargo se emplea como fertilizante, ya que es una práctica que
se ha constatado beneficiosa desde los inicios de la agricultura. Ya en el año 900
A.C., Homero cita en la Odisea que el padre de Ulises añadía estiércol a sus viñas y
Jenofonte, en el año 400 A.C., mencionaba el uso de abonos verdes y estercolados.
La humificación es el paso final en la degradación de la materia orgánica, la cual es
básicamente el clivaje de moléculas de gran peso molecular en complejos coloides
amorfos que contienen grupos fenólicos.
En relación a esto, científicos como Pasteur, revelaron que la formación del humus
representa un ciclo biológico que se debe a la actividad de diferentes micro y
macroorganismos, y con ayuda de otros investigadores como Schloesing, Kostichev,
Wollny, Deherain, entre otros, concluyeron que parámetros como la temperatura,
humedad, aireación, etc., influyen sustancialmente en la producción de estos
compuestos, en especial cuando se reconoce que la evolución de la materia orgánica
está estrechamente ligada a la estructura y conformación del suelo y su degradación
genera beneficios como el incremento de la fertilidad física, química y biológica del
suelo, además de intervenir en la capacidad de intercambio catiónico y en la retención
de productos xenobióticos y plaguicidas.
Sin embargo, organismos y microorganismos presentes en el suelo son los
responsables de esta actividad, ya que descomponen esta materia orgánica con la
ayuda de factores ambientales, para producir sustancias húmicas donde se incluyen
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15
los ácidos húmicos, ácidos fúlvicos y huminas residuales que son moléculas que se
diferencian por su composición molecular y .la solubilidad a diferente pH. Estas
sustancias aportan las propiedades ideales a los suelos y se consideran fertilizantes
por excelencia, puesto que son agentes quelantes que ayudan a atrapar los cationes y
hacerlos disponibles para la raíz de las plantas, este importante papel lo desarrollan
los grupos carboxilos e hidroxilos fenólicos de los que están formados los ácidos
húmicos y fúlvicos respectivamente. Por otro lado, aumenta la permeabilidad celular
y el proceso respiratorio y de esta manera, se induce la proliferación de la raíz.
El presente trabajo tiene como finalidad realizar un seguimiento del proceso de
humificación de compost aplicado en suelo agrícola, bajo condiciones de laboratorio,
evaluar el método para la determinación de materia orgánica por vía húmeda y hacer
el seguimiento de la evaluación de la actividad enzimática (proteolítica y celulolítica)
en compost inoculado como medidas indirectas del proceso de humificación de este
tipo de materia orgánica, ya que presenta diversas moléculas como proteínas y
azucares, entre otros, que permiten verificar el proceso desarrollado en esta matriz.
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16
2. MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN DE LITERATURA
2.1 Materia orgánica en el suelo
La materia orgánica desempeña un papel fundamental en la estructura del suelo, ya
que proporciona una función insustituible en el mantenimiento de las propiedades
físicas, químicas y biológicas del mismo. La fuente original de materia orgánica en
los suelos de cultivo proviene de la incorporación de restos vegetales y animales en
diferentes estados de descomposición, así como de la biomasa microbiana. Estos
restos tan dispares se suelen denominar materia orgánica fresca y, bajo la acción de
factores edáficos, climáticos y biológicos se encuentran sometidos a un constante
proceso de transformación. Hay que destacar pues, la naturaleza dinámica de la
materia orgánica del suelo, ya que no es un componente fijo y homogéneo, sino que
va transformándose y evolucionando sin cesar (Figura 1) (Ribó, 2004).
Figura 1. Ciclo de la materia orgánica. Transformación de la materia orgánica fresca y sus diferentes
productos finales (Ribó, 2004).
MINERALIZACIÓN SECUNDARIA
celulosa hemicelulosa
taninos
lignina taninos
COMPUESTOS SIMPLES
precursores fenólicos
azúcares aminoácidos
COMPUESTOS MINERALES
BIOMASA MICROBIANA
COMPUESTOS HÚMICOS
núcleo polimerizado
compuestos aromáticos
HUMIFICACIÓN
AF
AH
oxidación +
polimerización
Polimerización +
condensación con compuestos nitrogenados
suministro cadenas alifáticas
DESCOMPOSICIÓN
MINERALIZACIÓN PRIMARIA
MATERIA ORGÁNICA FRESCA
Soporte energético
para microorganismos
compuestos alifáticos
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17
Es por esto, que esta materia orgánica constituye no solo la fuente de energía y
nutrientes para los microorganismos del suelo, sino que también es la fuente de
materia para la humificación posterior o sea, el humus duradero, el cual es difícil
descomponer (Mayea et al., 1982).
La descomposición de la materia orgánica es el resultado de varios procesos que
actúan simultáneamente, como la mineralización y la humificación microbiana de la
lignina, celulosa y otros componentes y el lavado hacia horizontes mas profundos del
suelo, de componentes solubles, cuyo C y N son progresivamente mineralizados e
inmovilizados (Coûteaux et al., 1995). Autores como Heal et al. (1997) mencionan
que se puede distinguir tres fracciones principales con respecto a la composición
química y a la calidad de la materia orgánica: una de fácil descomposición, soluble,
que se pierde rápidamente; otra insoluble, pero fácilmente degradable, que se
compone principalmente de celulosa y hemicelulosa y una tercera que persiste
durante más tiempo y que está compuesta principalmente por ceras, lípidos, ligninas y
carbohidratos lignificados
Esta descomposición de la materia orgánica tiene lugar gracias a poblaciones de
microorganismos. Inicialmente, las moléculas de bajo peso molecular son
descompuestas principalmente por levaduras saprófitas que son los colonizadores
primarios, los colonizadores secundarios utilizan materiales más complejos como los
polisacáridos y por último, los colonizadores terciarios metabolizan los polímeros
más complejos como la lignina. Su tasa dependerá en la eficiencia de las bacterias y
en la capacidad del suelo para proporcionar donantes de electrones. Los
microorganismos necesitan desarrollarse en un medio húmedo por lo tanto, la
humificación y la mineralización tendrán lugar esencialmente en presencia de agua.
Si el suelo se halla muy seco, los procesos se detienen hasta que vuelva a hidratarse,
por lo que los ciclos de humectación y desecación del suelo influyen sobre la
evolución de la materia orgánica sobre el mismo (Rueda et al., 2001).
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
18
Otros factores indispensables, son las variables climáticas que condicionan las
características que rodea la materia orgánica como la temperatura, el pH, el oxígeno,
humedad y que afectan a la comunidad que lleva a cabo la degradación de la materia
orgánica, formada por microorganismos del suelo que la degradan enzimáticamente y
por la micro, meso y macrofauna edáfica, que contribuye a estas oxidaciones (Oliver
et al., 2002).
Tanto en las reacciones abióticas como en las relacionadas con la actividad
microbiana aumentan su tasa con la temperatura. A temperaturas muy bajas se
detienen los procesos de humificación y mineralización, creciendo a medida que
suben las temperaturas (Ruiz et al., 1997); ayudando además factores como el pH, ya
que debe ser ligeramente ácido o neutro para aumentar la degradación (Rueda et al.,
2001).
Las anteriores características son primordiales a la hora de determinar la calidad de
un suelo, sin embargo autores como Karlen et al. (1997), definen la calidad del suelo
como “la capacidad de un suelo específico, dentro de los límites de un ecosistema
natural o controlado, para mantener la productividad animal y a nivel de plantas,
sosteniendo o aumentando la calidad del aire y del agua y así mismo, mejorando la
salud humana y su entorno”.
2.2 Compostaje
El compostaje es un proceso en el que intervienen microorganismos aerobios y en el
cual se descompone la materia orgánica, este conjunto de materiales hace que se
mantenga el calor internamente y además, de la generación de energía propia
producto del metabolismo de los microorganismos, esta producción de calor hace que
se aumente la temperatura. Este proceso, es totalmente aerobio (Palmisano y Barlaz,
1996).
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
19
2.2.1 Factores que influyen en el proceso
Un sistema de compostaje ideal y con características únicas se ve determinado por
factores diversos como temperatura, aireación y relación C/N, como se describe en la
Tabla 1.
Cuando los materiales tienen alto contenido de carbono, se requiere adicionar
nitrógeno para reducir la relación C/N a un rango óptimo. Cegarra en 1994 manifiesta
que los microorganismos, generalmente utilizan 30 partes de carbono por una de
nitrógeno; valores bajos originan pérdidas de nitrógeno en forma de amoniaco,
especialmente con valores altos de pH y temperatura. Si la relación C/N es mayor de
35, la duración del proceso puede prolongarse.
Tabla 1. Factores que influyen en el proceso y su influencia en el proceso de compostaje.
Factor Influencia
Temperatura
- Temperatura mesofílica I: Mayor tasa de crecimiento en el inicio del proceso. - Temperatura termofílica: Produce muerte de microorganismos mesófilos por temperaturas superiores a 45°C. Se presenta una máxima sanitización como también, tasa de degradación en el proceso (Palmisano y Barlaz, 1996; Bertoldi et al., 1996). - Temperatura mesofílica II: La población de actinomicetos y hongos aumenta y las moléculas complejas son degradadas por enzimas extracelulares por descenso de temperatura inferior a 35°C (Figura 2) (Palmisano y Barlaz, 1996). Se presenta una máxima diversidad microbial, para que se obtenga un producto con condiciones estables (Bertoldi et al., 1996).
Aireación
- La temperatura normal en esta etapa es de 50ºC, sin la sobrevivencia de ningún tipo de hongo ni de actinomiceto (Palmisano y Barlaz, 1996). - Control de la temperatura del proceso. - Suministro de oxígeno (Henao, 1996).
Relación C/N
- El carbono es una fuente de energía y constituye alrededor del 50% del contenido celular microbiano. - El nitrógeno es un componente crucial de proteínas, además de ser esencial para brindar un buen crecimiento y desarrollo de los microorganismos. - Cuando hay muy poco nitrógeno, la población microbiana no crece y la rata de transformación es muy lenta. - Cuando hay mucho nitrógeno prolifera el crecimiento de la microbiota y se acelera la rata de descomposición, lo cual puede crear problemas de olor y alta demanda de oxígeno lo que conlleva a producir condiciones anaeróbicas en la pila. - El exceso de nitrógeno genera amonio en forma de gas, lo que ocasiona los malos olores (Mayea et al., 1982). - Cegarra (1994) manifiesta que los microorganismos, generalmente utilizan 30 partes de carbono por una de nitrógeno; valores bajos originan pérdidas de nitrógeno en forma de amoniaco, especialmente con valores altos de pH y temperatura. - Si el índice C/N es mayor de 35, la duración del proceso puede prolongarse. - Finalmente, como el carbono se convierte en anhídrido carbónico esta relación decrece durante el proceso, la cual debe alcanzar un valor alrededor de 10/1, al concluir el proceso (Ballesteros, 2001).
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
20
Se requiere conocer los valores de la relación C/N en los diferentes materiales a
compostar con el ánimo de iniciar el llenado de la pila con una mezcla adecuada el
valor que se recomienda es 30/1. Como el carbono se convierte en anhídrido
carbónico esta relación decrece durante el proceso, la cual debe alcanzar un valor
alrededor de 10/1, al concluir el proceso (Ballesteros, 2001).
Figura 2. Crecimiento de hongos como indicadores de finalización de la fase termofílica
Fuente: Autor 2006
2.2.2 Humificación de la materia orgánica
La humificación es el paso final en la degradación de la materia orgánica, la cual es
básicamente el clivaje de moléculas de gran peso molecular en complejos coloides
amorfos que contienes grupos fenólicos. La mayoría de los procesos de humificación
es debido a los microorganismos del suelo, sin embargo es acentuado por actividades
de invertebrados como los nemátodos y artrópodos. (Magdoff y Weil, 2004).
Según Mayea et al, 1982, el humus es una mezcla de compuestos complejos y no un
material único, estos compuestos son materiales resistentes, algo modificados a partir
del tejido originario, o compuestos sintetizados de tejido microbiano con restos de
organismos muertos. Actualmente se acepta la definición: “El humus es un complejo,
o mejor, una mezcla de sustancias oscuras o negruzcas, amorfas y coloidales que se
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
21
han modificado a partir de los tejidos originarios o han sido sintetizadas por los varios
organismos del suelo” (Mayea et al., 1982).
Sin embargo, el término humus es muchas veces sinónimo de materia orgánica del
suelo, aunque otros autores distinguen entre materia orgánica total en el suelo y el
humus. El humus es uno de los elementos que conforman el compost maduro, este
humus es la materia que queda de la descomposición de los restos vegetales como
hojas o flores, es la parte orgánica reestructurada, que además posee características
importantes en cuanto al mejoramiento de cultivos como son la elongación foliar,
aumento del tamaño radicular, mayor permeabilidad celular y por consiguiente,
mejora en la calidad del suelo.
2.2.3 Poblaciones desarrolladas durante el compostaje
El dominio Bacteria, es el grupo más importante de microorganismos durante el
primer paso del compostaje y la parte mas activa, tienden a dominar el proceso
gracias a su tiempo de duplicación tan corto, utilizando sustratos simples y
disponibles y muchas pueden vivir en altas temperaturas y bajas tensiones de oxígeno
(Palmisano y Barlaz, 1996).
Otros microorganismos presentes en este ciclo son los Actinomycetes termofílicos,
pueden tolerar una temperatura de 50ºC, además son aeróbicos y viven en un pH
neutro o ligeramente alcalino. Los actinomicetos representan un indicador de
madurez del compostaje (Palmisano y Barlaz, 1996).
Además de poseer poblaciones bacterianas, se encuentran diferentes géneros de
hongos, ya que tienen la capacidad de degradar muchos polímeros, incluyendo la
lignina, celulosa, hemicelulosa y diversas moléculas orgánicas (Palmisano y Barlaz,
1996) (Figura 3).
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
22
Figura 3. Cambios relativos observados en poblaciones microbianas características durante el
compostaje (Palmisano y Barlaz, 1996)
Autores como Galindo et al., (2005) realizaron un aislamiento de bacterias termófilas
y hongos mesófilos a partir de la fracción orgánica de residuos sólidos urbanos de la
ciudad de Villavicencio-Colombia, con el fin de evaluar la actividad proteolítica y de
producir un inoculante acelerante del proceso de degradación de materia orgánica en
compostaje, el inoculante producido consta de 14 cepas termofílicas, 3 Actinomycetes
y 11 bacterias, demostrando actividad enzimática de 140,18 Unidades Proteolíticas
(UP). Concluyeron que la actividad enzimática de proteasas depende del crecimiento
microbiano, siendo consideradas como metabolitos primarios. Estudios similares
realizados por Granados et al., (2003), obtuvieron actividades proteolíticas mayores,
del orden de 3200,92 UP/min/L de sustrato proveniente de residuos de la actividad
floricultora de especies de Pompon y Gypsophyla
Por otro lado, Cortés en 2005, estudió la degradación de residuos de caña de azúcar
por medio de microorganismos celulolíticos para así determinar su actividad
celulolítica mediante carboximetilcelulosa (CMC) al 1% m/v, efectuando
fermentaciones consecutivas de los microorganismos aislados de los residuos de caña,
que fueron Trichoderma con 95 Unidades Celulolíticas (UC)/min/L, Aspergillus 83
UC/min/L y Penicillium 100 UC/min/L.
ACTINOS TERMOFÍLICOS HONGOS MESOFÍLICOS ACTINOS MESOFÍLICOS BACTERIAS TERMOFÍLICAS HONGOS TERMOFÍLICOS BACTERIAS MESOFÍLICAS
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2.2.4 Enzimas microbianas
Las enzimas son moléculas de proteínas que tienen la capacidad de facilitar y acelerar
las reacciones químicas, disminuyendo el nivel de la energía de activación propia de
la reacción (Mallig, 1998), además determinan la pauta en las reacciones químicas y
transformación de diferentes tipos de energía. Estas enzimas son importantes en
muchos procesos biotecnológicos en este caso especial, en el proceso de compostaje,
ya que por medio de estas, se degradan los diferentes sustratos orgánicos generando
un producto de importancia comercial.
Por otra parte, en el suelo se expresan diferentes actividades enzimáticas gracias a las
transformaciones biológicas que tienen lugar, desarrollando un papel bastante
importante. Una parte de las enzimas del suelo son, extracelulares siendo liberadas
durante el metabolismo y muerte celular; otras son intracelulares, formando parte de
la biomasa microbiana. También existen enzimas inmovilizadas que son las que
pueden mantener un nivel constante y estable de la actividad enzimática en el suelo,
independiente de la proliferación microbiana y de las formas usuales de regulación de
la síntesis y secreción de enzimas. Este tipo de enzimas inmovilizadas pueden
permanecer unidas a coloides minerales (arcillas) u orgánicos (sustancias húmicas)
siendo muy resistentes a los procesos de desnaturalización (Paolini, 2002).
Dado que la mayor cantidad de materia orgánica presente en el suelo es polimérica, la
descomposición del carbono depende de la producción celular de enzimas
microbianas que convierten compuestos complejos en productos más pequeños
(Ratledge, 1994; Kogel – Knabner, 2002; Nannipieri et al., 2002).
2.2.4.1 Proteasas
Son enzimas del grupo de las hidrolasas, que catalizan la hidrólisis de enlaces
peptídicos de otras proteínas y péptidos. Cuando estas moléculas son atacadas por las
proteasas, no se descomponen directamente a aminoácidos sencillos; su degradación,
siempre sigue un patrón que se puede resumir así: >proteína >proteosas >peptonas
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>péptidos >aminoácidos. Las proteasas se pueden clasificar de acuerdo a sus
propiedades catalíticas en exoproteasas (rompen hacia el extremo de la proteína
liberando los aminoácidos terminales) y endoproteasas (rompen hacia el interior de la
cadena peptídica liberando péptidos) (Granados et al., 2003). Una característica
importante que debe considerarse es el pH óptimo de la proteasa (Figura 4).
Figura 4. Mecanismos de acción de las proteasas (Rao y Col, 1998)
Las exoproteasas actúan solo al final de la cadena polipeptídica. Según el sitio de
acción del amino o carbono terminal se denominan en amino o carboxipeptidasas
respectivamente (Rao y Col, 1998).
La actividad de las aminopeptidasas se ve reflejada sobre el amino terminal libre de la
cadena polipeptídica, liberando un solo aminoácido residual, un dipéptido o un
tripéptido y las carboxipeptidasas, actúan sobre el carbono terminal de la cadena
polipeptídica, liberando un solo aminoácido o un dipéptido. Pueden dividirse dentro
de tres grupos mayores, según la naturaleza del aminoácido residual, del sitio de
acción de la enzima y son serina-carboxipeptidasas, metilo-carboxipeptidasas y
cisteína-carboxipeptidasas.
Según Rao & Col, (1998), las endopeptidasas se caracterizan por su acción
preferencial sobre los enlaces peptídicos de la región interna de la cadena, sin la
C O O
H2N +
+OH-
H2O + CN
OH
C
O
O H3N- +
+H+
C
O
OH H3N +
pH neutro
pH ácido
pH alcalino
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presencia de nitrógeno o carbono terminal. Este grupo de enzimas, está dividida en
subgrupos basados en el mecanismo catalítico: serina proteasas, aspártico proteasas,
cisteína proteasas y metilo proteasas.
Las serina-proteasas, presentan el aminoácido serina en su sitio activo y generalmente
se mantienen activas a pH neutro o alcalino con un óptimo entre siete y once; las
aspártico-proteasas, son también conocidas como proteasas ácidas, que dependen de
los residuos de ácido aspártico generados por su actividad metabólica, además la
mayoría de estas enzimas demuestran actividad a bajo pH entre tres y cuatro; las
cisteína-proteasas depende de la presencia de cisteína (cis) o histidina (his), tienen un
pH óptimo neutro, aunque algunas trabajan a pH ácido y por último, las metilo-
proteasas que es un grupo de enzimas muy diverso, se caracterizan por poseer un ión
metálico divalente para su actividad (Rao & Col, 1998).
2.2.4.2 Celulasas
Las celulasas son enzimas que clivan diferentes uniones en la molécula de celulosa,
dicho compuesto es un polisacárido estructural de las plantas constituído por largas
cadenas no ramificadas de recursos lineales D-glucosa unidos por enlaces
glicosídicos β (1-4) (Figura 5), esta molécula está estabilizada mediante puentes de
hidrógeno externos y su clivaje genera residuos de celobiosa, cortando el disacárido a
monómeros de glucosa.
Figura 5. Estructura de química de la celulosa. Moléculas de glucosa unidas por enlaces β-1,4
glucosídicos (Ballesteros, 2001)
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La degradación de la celulosa requiere un sistema enzimático complejo, ya que es
necesaria la utilización de varias enzimas que degraden este compuesto y producir
moléculas más simples para así, penetrar a la célula microbial. Las diferentes enzimas
que conforman este complejo, son listados en la Tabla 2.
Tabla 2. Características generales de las celulasas
Fuente: Uhlig, 1998
La presencia de complejos multienzimáticos aumenta significativamente la eficiencia
celular, la utilización de sustratos complejos con grandes diferencias, como son los
carbohidratos en las celulosas, hemicelulosas y pectinas, han desarrollado bacterias
de “hidrolasas multifuncionales” en la forma de complejos enzimáticos, los cuales
facilitan la utilización eficiente de estos sustratos (Guevara, 2003).
Las proteasas y las celulasas –entre otras enzimas- son las que permiten la adecuada
degradación de la materia orgánica y permiten producir un compuesto degradado y
bastante estable (Compost). Este tipo de microorganismos degradan eficientemente la
ENZIMA ACTIVIDAD PRODUCTO
EXOCELULASAS
Exo-biohidrolasa
1, 4 β-glucan celobiohidrolasa
Hidroliza los enlaces covalentes de los puentes glicosídicos, exponiendo a las exo y endoglucanasas del complejo Cx los grupos reductores y no reductores de las moléculas desacopladas de celulosa. Corta la celobiosa del extremo no reducido de la cadena glucano y de la celodextrina (fragmentos de celulosa con tres a seis residuos de glucosa).
Celobiosa
ENDOCELULASAS
Endoglucanasa
1,4-β-D glucan-4-glucanohidrolasa
Corta el enlace glicosídico β-1,4 al azar en las regiones internas de la cadena de celulosa y derivados. Rompe los puentes de hidrogeno entre cadenas polisacáridas adyacentes, con el efecto subsecuente de la hidrólisis penetrante de los cristales de celulosa.
Celobiosa +
Glucosa
β GLUCOSIDASA
Celobiosa β-D-glucosido-glucohidrolasa
Hidrolizan los dímeros de celobiosa a monómeros de glucosa
Glucosa
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celulosa en diferentes ambientes, pero los microorganismos aerobios se encargan del
reciclaje de material orgánico principalmente del suelo.
Criquet en 2002, cuantificó y caracterizó la actividad celulolítica en desechos
forestales, examinando factores como pH, temperatura, tipo de buffer y cantidad de
muestra, los cuales pueden afectar la cuantificación y actividad de esta enzima. Para
la extracción, utilizó el método propuesto por de Deng y Tabatabai (1994), midiendo
los azucares reductores mediante la técnica de Somogyi Nelson y en simultanea con
el método del ácido 3,5 dinitrosalisílico (DNS), comparando estas dos técnicas. De
esta manera, determinaron que la técnica de DNS no es una técnica sensible para la
cuantificación de azucares reductores en suelos. En cuanto al medio de extracción,
utilizó buffer acetato pues comprobó ser el ideal ya que presentó una mejor
recuperación de estas enzimas en el suelo a una temperatura de 50°C. Sin embargo,
ensayó con buffer citrato, considerado ser el mejor extractante de celulasas en suelos
aunque no presente la anterior característica.
Una herramienta adicional utilizada en esta investigación fueron los análisis
electroforéticos (PAGE), este modelo electroforético reveló que 2 isoenzimas pueden
estar relacionadas con 2 valores altos presentados por el buffer citrato utilizado para
la cuantificación de la actividad celulolítica
2.3 Métodos de determinación y seguimiento de humificación en suelos
Las sustancias húmicas que se encuentran en el medio natural son provenientes de
residuos de las plantas y animales en estado de descomposición, unidos a los
productos sintetizados por los microorganismos del suelo y ciertos intermedios de
dicha síntesis (Ayuso, 1995). Esta composición no es estable sino que representa un
gran dinamismo, por lo que más que un grupo de sustancias estamos ante un estado
de la materia orgánica, diferente según las condiciones de su formación.
Entre un 60% y un 90% de la materia orgánica del suelo está constituída por estos
materiales de naturaleza lignoproteíca (Gallardo, 1980).
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De acuerdo al seguimiento del proceso de humificación, es necesario realizar como
primera medida la extracción de sustancias húmicas formadas ya sea en el suelo o en
compost, para este fin, se usan métodos químicos que permiten extraer una parte de
las sustancias húmicas mediante el empleo de reactivos alcalinos, utilizando
preferiblemente la extracción directa con NaOH 0,1M y posteriormente,
cromatografía fraccionada (Qualls et al., 2003).
Variadas y modernas técnicas analíticas son usadas para la determinación de ácidos
húmicos y fúlvicos, posterior a su extracción, que incluyen métodos complejos como
el usado por Sequi et al. (1986), que propuso un sistema de purificación dependiendo
de la capacidad de absorción de ácidos húmicos y ácidos fúlvicos por parte del
polivinilo (PVP).
De Nobili et al. (1989), planteó un “electro-focusing”, esta técnica permite el
seguimiento de la producción de sustancias húmicas durante el proceso de
humificación por medio de la observación de los cambios en el perfil obtenido a
través del densitómetro de bandas formado por el núcleo de las sustancias húmicas.
Sin embargo, existen métodos mas sencillos como el de espectrofotometría de
fluorescencia que permite la determinación de estas mismas sustancias en solución
acuosa (Olk et al., 2000) y por otro lado, se usan de la análisis colorimétricós
empleando diferentes reactivos, el cual es basado en la propiedad de las sustancias
húmicas de oscurecer los colores como proceso del compostaje.
Ya metodologías mas específicas son realizadas para poder comprobar de que están
compuestas estas sustancias húmicas como análisis cromatográficos, espectroscopía
infrarroja y densidad óptica, el RMN 13C, la resonancia del espín electrónico, la
pirólisis-espectrofotometría de masas y la extracción de gases super critica (Schnizer,
1990; Konova (1966).
Por otro lado, se establecen métodos de determinación de microorganismos en el
suelo, las técnicas tradicionales de detectar la presencia de microorganismos en el
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suelo son los análisis de las muestras directamente en medios concretos. Las nuevas
técnicas incluyen el bioinformador inmunológico basada en la luz. La distribución
espacial de microorganismos específicos en una muestra puede determinarse por
medio del microscopio y de manera no invasiva empleando la hibridación
fluorescente insitu (HFIS -FISH) de microorganismos. La técnica más sensible,
específica y cada vez más utilizada, es el aislamiento directo y la amplificación del
ADN del suelo (efbpublic.org).
Si bien el suelo es el sistema biológicamente más diverso del planeta, no se cuenta
todavía con métodos satisfactorios para medir su biodiversidad. Se han sugerido
algunos índices basados en métodos moleculares estudiando grupos específicos de
microorganismos. Un enfoque práctico es el uso de características fenotípicas para
establecer un índice de biodiversidad. Basándose en los recuentos viables en caja se
puede determinar el número de morfotipos (colonias diferentes de bacterias) en las
muestras estudiadas y concluir cual de las muestras es más diversa que otra, lo que
permite comparar el impacto que diferentes manejos agrícolas que ejercen sobre la
diversidad microbiana. Utilizando la cinética de reasociación de moléculas de DNA,
se puede estudiar la diversidad de las poblaciones microbianas. El DNA purificado
del suelo se desnaturaliza para formar bandas simples. La tasa de reasociación de
estas bandas depende del número de secuencias similares (Uribe, 1999). Así, en una
comunidad con muchas especies, entre mayor sea la complejidad, mas lenta será la
reasociación de secuencias de ADN similares. Debido a que el ADN de simple banda
absorbe más fuertemente a 260 nm que el de doble banda, el grado de reasociación
puede medirse utilizando un espectrofotómetro (Torsvick et al, (1994); Paul y Clark,
1996).
2.3.1 Determinación de materia orgánica total en el suelo
El método mas usado para esta determinación es el propuesto por Walkley y Black
(1934) que se basa en la oxidación de la materia orgánica mediante un oxidante fuerte
como es el dicromato (Cr2O7) en presencia de ácido sulfúrico (H2SO4) y esta materia
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orgánica oxidada, se valora mediante una solución de sal de Mohr (Sal ferrosa FeSO4
7H2O). Este método usa 2 indicadores que son la difenilamina y el ácido fosfórico
(H3PO4) que permiten la unión del oxidante con la materia orgánica, mostrando de
esta manera el cálculo de la cantidad de materia orgánica presente en la muestra.
Walkley y Black determinaron que del contenido de materia orgánica total presente
en el suelo, solo el 58% pertenece al carbono oxidable, generando un cociente de 1,72
que permitirá realizar este cálculo más real.
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3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo general
• Realizar un seguimiento del proceso de humificación de compost inoculado
aplicado en suelo bajo condiciones de laboratorio determinando materia
orgánica por vía húmeda.
3.2 Objetivos específicos
• Evaluar el método de extracción enzimática propuesto por Lynch y Raphael
(1987) combinado con la técnica de DNS y TCA para la determinación de
actividades enzimáticas en el transcurso de 90 días en las matrices en estudio.
• Evaluar el método de determinación de materia orgánica por vía húmeda
propuesto por Walkley y Black (1934), en las matrices con diferente relación
compost:suelo, en el tiempo (0, 30, 60, 90 días).
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4. MATERIALES Y MÉTODOS
Este proyecto fue realizado en los laboratorios de Microbiología Ambiental y Suelos
y de Química Analítica de la Pontificia Universidad Javeriana. Las muestras de
compost trabajadas fueron obtenidas a partir de un proceso de compostaje en el
Relleno Sanitario Don Juanito de la ciudad de Villavicencio, manejado por la
empresa Bioagrícola del Llano S.A. E.S.P. Por otro lado, el muestreo de suelo fue
obtenido a partir de un cultivo de Stevia rebaudiana Bertoni situado en Puerto López-
Meta.
4.1 Recolección de muestras
4.1.1 Zonas de muestreo
La zona de muestreo del compost se encuentra situada en la ciudad de Villavicencio
departamento del Meta, ubicada en el piedemonte de la cordillera Oriental, en la
márgen derecha del río Guatiquía. Se localiza a una altura de 467 m.s.n y su
temperatura promedio es de 28°C; tiene una precipitación media anual de 3663 mm y
una humedad relativa del 77.8% (Manejo técnico del relleno sanitario Don Juanito
2004, citado por Galindo et al. (2005).
Por otra parte, se realizó el muestreo del suelo en el municipio de Puerto López
situado en el departamento del Meta. Su temperatura promedio anual es mayor a los
27°C, la precipitación promedio anual superior a los 2000 mm y la humedad relativa
superior al 75% (IDEAM, 1997).
4.1.2 Toma de muestras de compost
Las muestras fueron tomadas de una pila de compost que estaba compuesta de 60%
de residuos de plaza, 20% de contenido ruminal y 20% de poda, en tiempo de
maduración correspondiente a 75 días, con un tamaño aproximado de 2 m de largo
por 1.50 m de altura hasta completar 4 toneladas (Figura 6) y una temperatura
promedio de 32°C, ubicadas en el Relleno sanitario Don Juanito-Villavicencio
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(Meta). A partir de este se tomaron diferentes muestras de manera aleatoria de
aproximadamente 700 g para un total de 10 muestras, con un guante protector,
tratando de tomar muestras en el interior de la pila, para ello se retiró el material
superficial de la pila posteriormente, se depositaron en cantidades adecuadas para
realizar la prueba en bandeja y así, efectuar los diferentes análisis enzimáticos
(proteasas y celulasas) y químicos (pH y materia orgánica total).
Para el transporte y conservación de las muestras, se depositaron las muestras en
bolsas de papel kraft a su vez, protegidas en bolsas de autosellado y dispuestas en
nevera a 4°C hasta el momento de su análisis, para luego llevarlas a los Laboratorios
de Microbiología Ambiental y de Suelos y de Química Analítica.
Figura 6. Disposición de pilas de compost. Tratamiento 5 con 60% de residuos de plaza, 20% de
contenido ruminal y 20% de poda. Fuente: Autor 2006.
4.1.2.1 Análisis fisicoquímicos de la muestra
De los aproximadamente 700 g muestreados de compost, 100 g fueron destinados
para el análisis de los parámetros fisicoquímicos realizados por AGRILAB,
laboratorio registrado ante el ICA, con el fin de establecer humedad, cenizas, pérdidas
por volatilización, carbono orgánico oxidable, pH, densidad, conductividad eléctrica,
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retención de humedad, capacidad de intercambio catiónico, relación C/N, nitrógeno
total (NT), P2O5, -K2O, CaO, MgO, S, Fe, Mn, Cu, Zn, Bo, Na y residuos insolubles
en ácidos.
4.1.3 Toma de muestras de suelo
Las muestras de suelo fueron tomadas de un cultivo de Stevia rebaudiana Bertoni
ubicado en Puerto López-Meta (Figura 7), cavando aproximadamente 20 cm de
profundidad y recolectando la muestra, descartando material grande, como piedras,
raíces, tallos, etc., depositándolos en bolsas de papel y luego en bolsas de autosellado,
para inmediatamente almacenarlos a 4°C (Mondini et al., 2005). Estas muestras se
recolectaron aleatoriamente aproximadamente de 700 g para un total de diez muestras
para posteriormente, mezclarlas con el compost anteriormente muestreado y realizar
la prueba en bandeja.
Figura 7. Cultivo de Stevia rebaudiana Bertoni. Zona de muestreo ubicada en Puerto López-Meta.
Fuente: Autor 2006.
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4.1.3.1 Análisis fisicoquímicos de la muestra
De los aproximadamente 700 g muestreados de suelo, 100 g fueron destinados para el
análisis de los parámetros fisicoquímicos realizados por AGRILAB, laboratorio
registrado ante el ICA, con el fin de establecer textura, pH, humedad, conductividad
eléctrica, capacidad de intercambio catiónico, carbono orgánico, iones K, Ca, Mg,
Na, Al, Fe, Mn, Cu, Zn, Bo, P, SO4, porcentaje de saturación de Mg, Na, Al, K y Ca,
además de los índices de Ca/Mg, Ca/K, Mg/K y (Ca + Mg)/K.
4.2 Ensayos invitro
4.2.1 Preparación de las muestras
Antes de realizar esta prueba, se sometieron, separadamente, las muestras de compost
y suelo a un tamizado (tamiz #12= 170 µm ó 0,0661 pulg.), para reducir el tamaño de
partícula y que quedara uniforme.
Se prepararon 11 diferentes tratamientos a partir de cantidades de compost:suelo con
un peso final de 100 g y se depositaron en pequeñas bandejas de aluminio con
dimensiones de 11.5 x 21 cm. y diez réplicas por cada tratamiento, estas mezclas se
obtuvieron de la siguiente manera: T1 100:0; T2 90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5
60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10 10:90 y T11 0:100. Se tomaron
diferentes tiempos del proceso (0, 30, 60, 90 días) para así, realizar la técnica de
extracción propuesta por Lynch y Raphael (1987) para luego, determinar la actividad
proteolítica y celulolítica en cada uno de los montajes. Estos tratamientos se
cubrieron con vinipel para evitar la deshidratación de la mezcla.
Todas las bandejas permanecieron a temperatura ambiente aproximadamente a 19°C
y expuestas a la luz.
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4.2.2 Determinación de humedad de los tratamientos
Para esta determinación se pesaron 5 g de las diferentes muestras y se depositaron en
bolsas de papel kraft debidamente pesadas para luego colocar dichas bolsas en el
horno de secado a 80°C durante 24 horas, luego de las cuales se volvieron a pesar. El
porcentaje de humedad se determinó por medio de la ecuación (1) (Aguilera et al.,
2001):
100*sec
%frescoPeso
opesofrescoPesoHumedad
−= (1)
El mantenimiento de la humedad se hizo cada tres días y se llevó a capacidad de
campo (60%) que es la recomendada para sostener un cultivo y para conservar el
agua de la mezcla.
4.2.3 Determinación de pH en la mezcla compost:suelo
En la determinación de pH en la mezcla compost:suelo se utilizó la metodología
propuesta por Andrades (1996), reduciendo a la mitad el volumen de agua
desmineralizada y la cantidad de muestra a analizar, manejando una relación final de
1:24.
4.3 Determinación de materia orgánica en el suelo
4.3.1 Oxidación de materia orgánica total en el suelo por vía húmeda
Se determinó la materia orgánica total en el suelo por el método de Walkley y Black
(1934) que se basa en la oxidación con dicromato de potasio (K2Cr2O7) y ácido
sulfúrico (H2SO4).
Para esto, se secó aproximadamente 1 g de suelo en una bandeja de aluminio a una
temperatura de 105°C durante 2 horas, luego se pesaron tres réplicas idénticas de una
cantidad de aproximadamente 0.1 g, a continuación se añadió, con una pipeta aforada
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5 mL de K2Cr2O7 1N y 10 mL de H2SO4 concentrado en todos los vasos con las
muestras pesadas anteriormente. Los vasos se llevaron a calentar en una estufa a una
temperatura de 150°C durante 15 minutos, transcurrido este tiempo, se dejaron enfriar
las soluciones y se transfirió el contenido de cada vaso a respectivos balones aforados
de 50 mL, se completaron con agua destilada y por último se agitaron (Swift, 1996).
De las mezclas anteriores, se tomaron alícuotas de 10 mL que se transfirieron a
erlenmeyers de 100 mL, añadiendo a cada erlenmeyer 4 gotas de indicador de
difenilamina y 2 gotas de H3PO4 concentrado. Hecho el anterior procedimiento, se
tituló con sal de Mohr (Anexo 1) a una concentración de 0,034N, se aconseja titular
las muestras con la sal ferrosa recién preparada, ya que las sales se precipitan y eso
altera la determinación. Finalmente, la titulación de la muestra produjo un viraje de
color azul-violeta a verde esmeralda (Swift, 1996).
Por otra parte, con el objeto de determinar la normalidad exacta de la sal ferrosa, se
efectúa un blanco paralelo, a un sistema que no posee muestra de suelo, y que se
titula siguiendo el mismo protocolo recién descrito
Para la determinación de la materia orgánica total, ella se expresa como % COT (2),
(3):
22*
50
5*1*10 ++
=
FeFe
NVNmL (2)
Para las muestras:
)(722)(722)(722 2 MOFeT OCrKgmeqdeNOCrKgmeqdeNOCrKgmeqdeN −°+−°=−° +
gmeq
g
W
g
mL
mLNVNCOT
muestraFeFe −
−
= ++
4000
12*
100*
10
50**
50
5*1*10% 22 (3)
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Se supone que la materia orgánica del suelo contiene, por termino medio, un 58% de
carbono; así que la multiplicación del valor obtenido para el carbono por 1,77
(100/58) dará el % de materia orgánica (Faithfull, 2005).
4.4 Evaluación de la actividad enzimática cuantitativa
4.4.1 Extracción de proteasas
La extracción de proteasas se realizó según lo descrito por Lynch y Raphael (1987)
tomando submuestras de aproximadamente 15 g colectadas aleatoriamente de los
diferentes tratamientos y cada una de sus réplicas manejadas de las mezclas
compost:suelo, estas submuestras se llevaron a una congelación lenta (-55°C),
posteriormente se trituraron 5 g y se mezclaron con 50 mL de solución buffer fosfato
0.1 M (Anexo 2). Cada muestra se centrifugó a 16 000 g por 30 minutos en una
centrifuga refrigerada marca Biofuge-Sorvall.
El sobrenadante obtenido del anterior proceso, se transfirió a otro tubo de centrífuga
de 50 mL y se agregó a cada muestra 3 volúmenes de acetona a -15°C para precipitar
la proteína solubilizada, se repitió el proceso de centrifugación y el precipitado se
conservó ya que contenía las proteínas requeridas de las muestras analizadas. Este
último, se resuspendió en 30 mL de la solución buffer fosfato 0.1M (González et al.,
2004), seguido de la cuantificación de proteína utilizando el método del ácido
tricloroacético que más adelante será descrito.
4.4.1.1 Ensayo de la actividad proteolítica
A partir del extracto con enzimas obtenido, se tomó 1 mL y se diluyó en 9 ml de
buffer fosfato 0.1M (pH 7.2). Se tomó 1 mL de esta dilución y se adicionó a 1ml de
solución de caseína 1% m/v (Anexo 3) en buffer fosfato 0.1M pH 7,2 +/- 0,2. Cada
muestra se incubó durante 60 minutos a temperatura de 30°C en baño termostatado.
Terminado el periodo de incubación, se agregó 1 mL de ácido tricloroacético 15%
(TCA) m/v (Anexo 3) con el fin de precipitar la caseína no hidrolizada, además de
detener la reacción (Hubner, 1991), junto con el almacenamiento a 4° C durante 5
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minutos. La mezcla se centrifugó a 5 000 rpm por 5 minutos y a los sobrenadantes se
les leyó la absorbancia posteriormente, a 280 nm en espectrofotómetro de luz U.V.,
utilizando como blanco una solución que contenía 1 mL de solución de caseína 1%
m/v, 1 mL de TCA y 1 mL de buffer fosfato 0.1M (Carrascal et al., 2006). Los
resultados de esta prueba fueron expresados en UP, referidos a la cantidad de enzima
capaz de liberar un µmol de tirosina/minuto/mL bajo las condiciones de la prueba
(Hubner, 1991).
4.4.1.2 Curva patrón para la técnica del ácido tricloroacético
Se prepararon diferentes soluciones de tirosina (10 µmol/mL -100 µmol/mL) (Anexo
4) disueltos en agua destilada, con un volumen final de 3 mL, luego se determinaron
espectrofotométricamente las absorbancias de las soluciones patrón a 280 nm, en el
fotómetro UV; como blanco de la prueba se utilizó una solución que contenía 1 mL
de solución de caseína 1% m/v, 1 mL de TCA (ácido tricloroacético) y 1 mL de
buffer fosfato 0.1 M. Posteriormente, la mezcla se centrifugó a 5 000 rpm por 5
minutos. Las absorbancias fueron leídas a 280 nm en espectrofotómetro de luz U.V
(Hubner, 1991) y finalmente estos valores (Anexo 5), se reemplazaron en la ecuación
de la curva patrón de tirosina.
4.4.2 Extracción de celulasas
La extracción de celulasas se hizo de igual forma que la metodología para la
extracción de proteasas, en el numeral 4.4.1.
4.4.2.1 Ensayo de actividad celulolítica
A partir del extracto con enzimas obtenido, se tomó 1 mL y se adicionó 1 mL de
solución de carboximetilcelulosa (CMC) (Anexo 6) disuelta en buffer fosfato. La
mezcla final se incubó a temperatura de actividad en baño termostatado a 37ºC
durante 60 minutos (ó 6 horas a temperatura ambiente), según el caso, finalizando
este tiempo, se detuvo la reacción refrigerando a 4°C durante 5 minutos.
Posteriormente, se centrifugó la muestra por 10 minutos a 5 000 rpm, a partir del
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sobrenadante se realizó la metodología descrita en la Tabla 3 (Miller 1959; Pedroza,
2000).
Tabla 3. Determinación de la actividad celulolítica cuantitativa por el método de DNS.
Reactivo Blanco (mL)
Para cada una de las muestras (mL)
Sobrenadante de la técnica enzimática
- 0.25
Agua 0.25
-
Reactivo DNS 0.25
0.25
Calentar con agua hasta punto de ebullición por 5 minutos y frenar reacción colocando los tubos en hielo
Agua
2.5 2.5
Proteger los tubos de luz y leer en espectrofotómetro a 540 nm. Ajustar el cero de absorbancia con el blanco de la prueba
Fuente: Miller, 1959
Los resultados de esta prueba fueron reportados en Unidades Celulolíticas (UC),
definida como la cantidad de enzima que libera un µmol de glucosa por minuto por
litro, bajo las condiciones de la prueba.
4.4.2.2 Curva patrón para la técnica del ácido 3-5 dinitrosalisílico (DNS)
Se prepararon diferentes soluciones de glucosa (Anexo 7) (0,5 g/L- 2 g/L) disueltos
en agua destilada, con un volumen final de 3 mL, luego se determinaron
espectofotométricamente las absorbancias de las soluciones patrón a 540 nm.
Como blanco de la prueba, se utilizó una solución que contenía 0,25 mL de agua
destilada, 0,25 mL de reactivo de DNS (Anexo 8) y por último, 2,5 mL de agua
destilada. Las absorbancias se reemplazan en la ecuación de la curva patrón de
glucosa (Anexo 9).
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
41
4.5 Análisis estadístico
Teniendo en cuenta los datos obtenidos a partir de los análisis enzimáticos y químicos
de los tratamientos hechos, se aplicó un análisis de varianza ANOVA, analizando
variables como pH, carbono orgánico oxidable, actividad proteolítica, celulolítica.
Por medio del valor F obtenido se indicó la probabilidad de aceptar o rechazar la
hipótesis nula, para ello se formularon las siguientes hipótesis
H0: Las medias de todos los tratamientos/tiempos son iguales.
Hi: Existe por lo menos una media de todos los tratamientos/tiempos diferente de las otras.
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
42
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 Recolección de muestras
5.1.1 Toma de muestras
El muestreo efectuado para evaluar el seguimiento del proceso de humificación en
compost de residuos orgánicos domiciliarios, se realizó pasados 75 días del montaje
de la pila, reportando valores aproximados a los 32°C, según lo establecido por el
Relleno Sanitario Don Juanito.
Para realizar el muestreo del compost, se tomaron las muestras manualmente con un
guante protector cuando la temperatura se encontraba estable, corroborándose que el
proceso de compostaje realizado en Bioagrícola del Llano superaba las 9 semanas. El
origen del compost fue producto de la degradación de desechos del campo agrícolas,
rico en compuestos orgánicos (C y N) y presentó un estado físico sólido (Tabla 4).
La relación C/N proporciona una estimación directa de las fracciones biológicamente
degradables en el compost. Esta relación ha sido usada por distintos investigadores
como índice de estabilidad/madurez. En el proceso de compostaje, este índice
disminuyó a 11 al final del ensayo. Por lo general se considera maduro cuando la
relación C/N es menor de 25 o más cercano a 15 (Pascual et al., 1997), sin embargo
Sztern y Pravia (1999) aseguran que el coeficiente final de C/N para que un compost
se considere maduro y estable es del orden de 12 – 15. Bertoldi et al., 1996, sugieren
que este estado se presenta cuando la relación alcanza 10:1, es decir, no se presenta
alta actividad metabólica y la energía bioquímica disminuye como resultado de la
actividad enzimática de los microorganismos, índices un poco más bajos propone
Collis en 1971; y Palmisano y Barlaz (1996) que sugieren un índice de 10.
Por otra parte Muñoz (1994), asegura que una condición favorable del compost que
va ser incorporado al suelo es que presente una relación C/N de 10/12:1, por lo que
dicho producto sería apto para la aplicación en cultivos agrícolas y además, cumple
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
43
con los requerimientos estándares (<25:1) de Canadá, Chile, la Federal Compost
Quality assuranse Organization. Cabe aclarar que la NTCC-5167 no especifìca un
rango determinado para la relación C/N.
Tabla 4. Composición fisico-química del compost estable en base húmeda. Proveniente de un proceso de 75 días y con una composición de 60% de residuos de plaza, 20% residuos de poda y 20% de contenido ruminal. Comparación de resultados según la Norma Técnica Colombiana 5167, la Norma Chilena y la Norma Europea.
*BS: Base húmeda
Este valor tiene diversas desventajas como la variabilidad de los materiales que
inicialmente se usaron para el compostaje, además de su determinación analítica
debido a los procesos de secado y tamizado a los que son sometidas las muestras en el
laboratorio lo cual conlleva a pérdidas de N en forma amoniacal en los compost
inmaduros.
Parámetro Resultado NTC 5167 NCh 2880 Europea
Humedad 35% <35% ≥ 25 % MP y ≤ CMO
40%
Cenizas 13,6% - - - Pérdidas por volatilización
13,3% - - -
Carbono orgánico oxidable
8,16% 5 - 15% - -
pH 7,95 - - - Densidad (Base seca) 0,78 g/mL - - -
Conductividad eléctrica 15,6 dS/m - ≤ 5 mmho/cm - Retención de humedad 34,2% - - -
Capacidad de intercambio catiónico
14,2 me/100 g - - -
C/N 11 - - - Nitrógeno total (NT) 0,75% 10% mínimo ≥0,8% BS -
Fósforo total (P2O5) 0,55% 2% ≤ 0.1%
Sobre BS* -
Potasio total (K2O) 0,66% - - - Calcio total (CaO) 2,14% 10% mínimo - -
Magnesio total (MgO) 0,84% 10% mínimo - - Azufre total 902 p.p.m - - - Hierro total 2825 p.p.m - - -
Manganeso total 282 p.p.m - - - Cobre total 9,7 p.p.m - 50 p.p.m 100 p.p.m Zinc total 47 p.p.m - - - Boro total 7,8 p.p.m - - - Sodio total 1413 p.p.m - - -
Residuo insoluble en ácido
5,03% - - -
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
44
Restos de materia orgánica sin degradarse permanecieron en el compost y en el suelo,
desarrollándose baterías enzimáticas específicas para su degradación, es por esta
razón, que se midió el proceso de humificación por medio de la evaluación de la
actividad enzimática proteolítica y celulolítica que puede ser considerada como una
medida indirecta de este proceso y así, poderlo relacionar con el porcentaje de
carbono orgánico oxidable de cada uno de los tratamientos utilizados.
5.2 Procesamiento de muestras
5.2.1 Determinación de características fisicoquímicas
Las condiciones fisicoquímicas con las que cuenta el material inicial son
determinantes en el producto final. Por ello fueron tomadas muestras en el momento
inicial en el que se muestreó tanto el compost como el suelo. Los datos son mostrados
en la tabla 4 y 5, respectivamente.
Según la Norma Técnica Colombiana NTCC-5167, un abono orgánico debe tener un
contenido de humedad menor al 35%, según los datos dados por AGRILAB, el
contenido de humedad reportado para el compost final es el adecuado (Tabla 4). Por
otro lado, el análisis de carbono orgánico total al final del proceso fue bajo (8,16%)
debido a que el valor mínimo usado para abonos orgánicos según la NTCC-5167 es
de 15%. En cuanto al fósforo disponible (P2O5), se reportó un valor bastante bajo
(0,55%) con respecto al establecido por la norma NTCC-5167 de un mínimo de 2%
para ser considerado óptimo en un abono orgánico. El contenido de calcio (CaO) es
un factor favorable en la formación de agregados en el suelo, mejorando así la
estructura del mismo, por lo cual se considera que el dato reportado en la tabla 4 se
encuentra por debajo del valor óptimo respecto a la norma NTCC-5167.
De esta forma y según las características nutricionales del suelo y del compost, la
obtención de microorganismos productores de celulasas y proteasas se veía
favorecida por la composición inicial del montaje.
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
45
Tabla 5. Composición fisicoquímica del suelo. Proveniente de un cultivo de Stevia rebaudiana Bertoni en Puerto López-Meta.
Parámetro Resultado Textura Franco arcilloso Arena 58 % Limo 16 %
Arcilla 26 % pH 6,23
Humedad Media Conductividad eléctrica 0,25 Ds/m
Capacidad de intercambio catiónico (C.I.C)
3,17 me/100 g
Carbono orgánico 1,03 K 0,16 me/100 g 64 p.p.m Ca 1,85 me/100 g 371 p.p.m Mg 0,46 me/100 g 56 p.p.m Na 0,52 me/100 g 120 p.p.m Al 0,17 me/100 g 15 p.p.m Fe 50 p.p.m Mn 4 p.p.m Cu 0,50 p.p.m Zn 1,30 p.p.m B 0,03 p.p.m
P Fosfatos 21 p.p.m S Sulfatos 22 p.p.m
Sat Mg 14,6 % Sat Na 16,5 % Sat Al 5,4 % Sat K 5,1 % Sat Ca 58,4 % Ca/Mg 4,00 Ca/K 11,38 Mg/K 2,84
(Ca + Mg)/K 14,23
Con relación al suelo, la estructura determina su porosidad e infiltración de agua, así
como la disponibilidad de esta para las plantas y susceptibilidad de erosión del suelo
(Six et al., 2000) con este antecedente se puede sugerir que el suelo manejado en esta
investigación es de alta porosidad, debido a la gran cantidad de arena que este posee.
De esta manera, se concluye que este tipo de suelo es pobre en nutrientes orgánicos y
tiene una C.I.C y retención de agua muy bajo. En la tabla 5 se presentan los
respectivos análisis realizados. Este tipo de suelo se considera dentro de la
clasificación que realiza Oliver (1990) de los antrosoles, ya que los de esta clase han
soportado frecuentes y continuas influencias antrópicas, de esta manera se puede
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
46
clasificar el suelo de Puerto López, ya que es de un cultivo de Stevia rebaudiana
Bertoni.
Estos parámetros son importantes al momento de realizar el seguimiento del proceso
de humificación, sin embrago, existen diversos métodos que son utilizados para
analizarlo como actividad respiratoria, análisis de enzimas involucradas en el
proceso, pérdida de peso de los sustratos incorporados al suelo, aparición de
productos del metabolismo, recuentos de grupos fisiológicos, entre otros (Frioni,
1990).
De igual forma, la población microbiana del suelo y la desarrollada en el compost
participan en la formación de moléculas húmicas, catalizando distintas reacciones
bioquímicas, mediante baterías enzimáticas muy complejas que degradan la materia
orgánica presente. Estas enzimas son de carácter extracelular que pueden perdurar en
el suelo o en el compost adheridos a las partículas de arcilla, protegiéndose del ataque
microbiano Este fenómeno es altamente alterado por el microclima que existe en el
suelo, su estructura y atmósfera y la relación C/N. Por estos diversos factores, es
importante tenerlos en cuenta para obtener un buen desarrollo estas enzimas y de esta
manera, aportes significativos en esta investigación.
5.2.1.1 Determinación de pH
Se realizó la medición del pH al tiempo inicial, a los 30, 60 y 90 días, con el fin de
evaluar el grado de humificación del compost inoculado. Debido a que las enzimas
como las proteasas y las celulasas son mas activas a pH neutro, se favorece la
degradación de la materia orgánica del suelo y del compost. Se observó que la
fluctuación de los valores de pH es aproximadamente lineal y creciente con respecto
al contenido de materia orgánica (Figura 8).
Teniendo en cuenta que la materia orgánica se encontraba en alto grado de
descomposición en la pila, ya que tenia un proceso de 75 días de maduración, y
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
47
presentaba un pH estable de aproximadamente 8,25 (Tabla 6); se observa que a
medida que aumenta la cantidad de compost aumenta de igual forma el pH, esto es
probablemente debido a la formación de amoniaco por vía aerobia en un proceso
llamado amonificación o mineralización, en el cual ocurre una deaminación de las
proteínas y la descomposición de otros compuestos nitrogenados como la urea
(Richard, 1996).
0
2
4
6
8
10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Tratamientos
pH
Figura 8. Valores de pH de cada unos de los 11 tratamientos durante el primer muestreo.
De igual forma, esta característica es usada como indicador para determinar la
madurez del compost (Graves, 2000). A medida que va descendiendo la cantidad de
compost, es más bajo el nivel de pH, hasta llegar a un valor de pH de 6,46
correspondiente al tratamiento 10 (10 g de compost y 90 g de suelo). Los valores
bajos de pH en los tratamientos que están compuestos en su mayoría de suelo,
probablemente fueron producto de las altas concentraciones de aluminio presente, ya
que el aluminio en solución acuosa, produce una molécula que al oxidarse
nuevamente, libera altas concentraciones de iones hidronio (H+), generando de esta
manera, la disminución del pH.
C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S
10
8
6
4
2
0
pH
Tratamientos
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
48
Tabla 6. Medias de los valores de pH de cada uno de los 11 tratamientos del primer muestreo. Tratamientos pH
Compost 8,25 2 8,02 3 8,12 4 7,84 5 7,76 6 7,73 7 7,66 8 7,32 9 6,83 10 6,46
Suelo 6,23
[T1 100:0; T2 90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5 60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10 10:90; T11 0:100]
Por otra parte, analizando el seguimiento del pH durante los 90 días que duró el
proceso (Tabla 7 y Figura 9), se presentó una ligera tendencia de variación a los 30
días, en particular para los tratamientos 1, 9, 10 y 11, además de tendencia a
estabilizarse a los 60 y 90 días para todos los tratamientos.
Tabla 7. Medias de pH de las 11 réplicas de cada tratamiento por tiempo de muestreo durante los 90 días de seguimiento.
Tratamientos Tiempo 0 30 días 60 días 90 días Compost 8,32 7,87 8,14 8,18
2 8,11 8,06 7,92 7,91 3 8,18 8,03 8,00 7,85 4 7,75 7,78 7,75 7,79 5 7,68 7,74 7,87 7,87 6 7,70 7,71 7,70 7,64 7 7,74 7,59 7,67 7,62 8 7,15 7,36 7,45 7,59 9 7,09 6,67 6,99 7,20 10 6,63 6,36 6,69 6,86
Suelo 6,28 6,07 6,59 6,65
[T1 100:0; T2 90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5 60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10 10:90; T11 0:100]
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
49
6,00
6,50
7,00
7,50
8,00
8,50
1 2 3 4
Tiempo (dias)
pH
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11
0 30 60 90
Figura 9.Seguimiento de los valores de pH durante los 90 días del proceso de humificación.
[T1 100:0; T2 90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5 60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10 10:90; T11 0:100]
Estos valores graficados, demuestran que las desviaciones estándar son muy bajas
con respecto a la media del pH, lo cual se puede inferir que el método de
determinación de pH es preciso y confiable para este tipo de estudios (Anexo 9).
Para comprobar si existen diferencias altamente significativas entre tratamientos y a
lo largo de los tiempos de muestreo, se sugiere las siguientes hipótesis estadísticas:
H0: Las medias de todos los tratamientos son iguales.
Hi: Existe al menos una media significativamente diferente de las otras.
Según la tabla 8, se concluye que se rechaza la hipótesis nula que corresponde a que
durante todo el seguimiento del proceso de humificación se presentaron igualdades
significativas entre los tiempos y tiempos de muestreo, debido a que el estadístico de
prueba F es mayor al del valor crítico de F. En el caso de los tiempos de muestreo,
concluye que aunque no es alta la variación presentan disparidad. Por otro lado,
comparando estos dos valores en cuanto a los diferentes tratamientos, se presenta una
gran diferencia entre los valores de pH de cada tratamiento, por esta razón, se
produce una probabilidad muy baja, indicando que hay una altísima diferencia entre
8,5
8,0
7,5
7,0
6,5
6,0
C
0 30 60 90
pH
Tiempo (Días)
S
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
50
las dos de las medias de algún par de tratamientos por lo menos, debido posiblemente
a la diferencia en materia orgánica de cada tratamiento, a un nivel de confianza del
95%. Estas fluctuaciones pueden ser causadas por el metabolismo propio de los
microorganismos, debido a que en los primeros tratamientos presentados que
presentan una mayor cantidad de compost, es decir, de materia orgánica, son los que
le proveen las características nutricionales y de esta manera, aumentan su
metabolismo, generando un aumento en la temperatura, lo que puede explicar estas
variaciones.
Tabla 8 ANOVA. Seguimiento del pH durante todos los 90 de proceso
Origen de las variaciones
Suma de cuadrados
Grados de libertad
Promedio de cuadrados
F Prob Valor critico para F
Tiempos de muestreo
0,189 3 0,063 3,38 0,031 2,92
Tratamientos 13,958 10 1,396 74,7 2,11x10-18 2,16 Error 0,561 30 0,019 Total 14,708 43
Se rechaza la hipótesis nula , existen diferencias significativas entre las medias de los 11 tratamientos y entre los 4 tiempos de muestreo a lo largo de todo el proceso
El mantenimiento de la humedad de los diferentes tratamientos se realizó por medio
de un aspersor, liberando pequeñas gotas de agua en todas direcciones garantizando
así, una homogeneidad en la humedad a la que esta sometida la bandeja. Con los
datos arrojados de pH, se observa que hubo una buena distribución del agua en los
montajes, ya que los valores de pH de cada tratamiento fueron similares, pues de lo
contrario, es factible que se hubieran presentado cambios bruscos de pH. Se puede
argumentar que un exceso de agua generaría un ambiente de anaerobiosis y por ende,
mal olor y una ausencia de agua bajaría la actividad de los microorganismos
aeróbicos y el proceso se ralentiza.
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
51
5.2.1.2 Determinación de carbono orgánico oxidable
Es de anotar que es muy recomendable la determinación de carbono orgánico en
compost por vía húmeda, debido a que la descomposición de los carbonatos y la
pérdida de agua de las arcillas falsearían los resultados, es por esto que se recurre a su
determinación por vía húmeda. Otro método para la determinación de materia
orgánica es por medio de la vía seca (calcinación). Este es más efectivo que el de vía
húmeda, debido a que hay menos interferencias en este método, además del
tratamiento térmico por calcinación. En cuanto al suelo de Stevia rebaudiana Bertoni
se sabe que tiene carbonatos y por esto se recurre a la vía húmeda, que aunque es
menos efectiva en términos de oxidación de la materia orgánica es más fiable pues en
ella no ocurriría una reacción que fuera indeseable cuando se realice la
determinación. Esta determinación incluye o cuantifica sustrato presente y biomasa
presente en cada tratamiento.
Se puede observar que durante todo el proceso de humificación, el carbono orgánico
no disminuyó en gran medida (Figura 10), sin embargo, en la Figura 11 se muestran
los coeficientes de variación presentados con respecto a la materia orgánica del
primer muestreo, corroborándose de esta manera, que los tratamientos 9, 10 y 11
fueron los que presentaron cambio drásticos en cuanto a esta determinación. Se
observa que en el tratamiento 9, el coeficiente aumentó al día 30, esto demuestra
mayor desarrollo y crecimiento microbiano en este tratamiento, concluyendo, que el
consumo de materia orgánica se ve reemplazada por la producción de biomasa a
expensas de la biomasa muerta.
Por último, la disminución del porcentaje de materia orgánica en los 11 tratamientos
durante los 90 días del proceso llegó al 1% pero aun así, se mantuvo constante la
actividad proteolítica y lo contrario con la actividad celulolítica, que disminuyó
notablemente en todo el proceso, lo que quiere decir que el suelo mantiene su
fertilidad natural basado en su cubierta vegetal autóctona y en su reciclado de materia
orgánica.
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
52
024681012141618202224262830
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Tratamientos
% MO
Tiempo cero 30 dias 60 dias 90 dias
Figura 10. Determinación de materia orgánica durante los 90 días del proceso. Determinación
mediante el método de Walkley & Black, 1934
0
0,20,4
0,60,8
11,2
1,4
0 30 60 90
Tiempo (dias)
Coeficiente de variación
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11
Figura 11. Coeficiente de variación Vs. Tiempo. Con la finalidad de observar los cambios que
existen a lo largo del proceso de humificación.
0 30 60 90 Tiempo (Días)
C
30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S
Tratamientos
% CO
S
1,4 1,2 1
0,8 0,6 0,4 0,2 0
Coeficien
te de variación
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
53
5.2.2 Cuantificación de la actividad proteolítica
Para llevar a cabo la cuantificación de la actividad proteolítica, se realizó la curva de
calibración de tirosina reportando un coeficiente de correlación de 0,9737, mostrando
una tendencia lineal de la curva y así mismo, el comportamiento colineal de los datos
(Figura 12).
y = 0,008x - 0,1845
R2 = 0,9737
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
30 40 50 60 70 80 90 100
Concentración de tirosina (µmol/mL)
Absorbancia 280 nm
Figura 12. Curva de calibración de tirosina. Para la cuantificación de proteínas.
Durante los 90 días de seguimiento, se tomaron en total 110 muestras por cada tiempo
de muestreo que fueron sujetas a extracción de proteasas y celulasas y posterior
evaluación de actividad enzimática proteolítica mediante la técnica del acido
tricloroacético y evaluación de actividad celulolítica mediante la técnica de
carboximetilcelulosa (CMC) 1% m/v.
La batería enzimática de las proteasas es muy importante, ya que es considerada
como el indicador del potencial proteolítico del suelo; además; revela su capacidad de
degradación de proteína, como se puede observar en los datos propuestos en la matriz
utilizada, ya sea en compost o en suelo, se presentan actividades enzimáticas bastante
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
30 40 50 60 70 80 90 100
Concentración de Tirosina (µmol/mL)
Absorb
ancia 280 nm
Y = 0,008x – 0,1845 R2 = 0,9737
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
54
altas debido a que el compost manejado es rico en materia orgánica, lo que no sucede
con el suelo.
El método de cuantificación de la actividad proteolítica empleado en esta
investigación presenta algunas objeciones en el sentido de considerar que como se
sabe, las proteasas que hidrolizan la caseína pueden estar generalmente asociadas con
la materia orgánica no humificada del suelo (Bonmati, 1998). Es por esto que las
proteasas unidas al humus por una parte, están protegidas contra la proteólisis, pero
por otra parte, son menos afines a los sustratos de gran peso molecular, como la
caseína. El aumento de la actividad proteolítica, al comienzo del proceso, es decir en
los primeros 30 días (Tabla 9 y 10) (Figura 13 y 14), es debido a que puede existir
gran cantidad de materia orgánica mineralizable que induce la proliferación
microbiana y la producción de mayor cantidad de enzima, que transforman esa
materia orgánica.
Tabla 9. Medias de los valores de UP/min/g de cada uno de los 11 tratamientos del primer muestreo.
Tratamientos UP/min/g Compost 4133,00
2 4062,50 3 4796,00 4 4757,00 5 4750,50 6 4186,00 7 4287,00 8 4075,00 9 4100,50 10 4138,00
Suelo 4208,00 [T1 100:0; T2 90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5 60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10
10:90; T11 0:100]
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
55
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Tratamiento
UP/min/g
Figura 13. Actividad proteolítica del primer muestreo (tiempo cero)
Aunque se mostró una gran actividad proteolítica, el valor máximo presentado fue al
termino de los 30 días (Figura 14), lo cual permite concluir que las enzimas se
mantienen con una viabilidad bastante notable aproximadamente a los 100 días de
proceso de compostaje (sumando los 75 días del proceso de compostaje), teniendo en
cuenta que los valores fueron muy cercanos entre si, con dos matrices completamente
diferentes como lo son el suelo y el compost. Además de poseer una elevada
actividad microbiana y consecuentemente a la gran concentración de proteínas y
péptidos liberados debido a la muerte de los microorganismos, por la disminución de
sustrato residual, lo que se observa en la oxidación de la materia orgánica (Figura 11).
Tabla 10. Medias de los valores de UP/min/g de cada uno de los 11 tratamientos del segundo muestreo (30 días).
Tratamientos UP/min/g Compost 4769,00
2 4750,00 3 4694,50 4 4704,00 5 4686,00 6 4806,00 7 4739,50 8 3943,83 9 4742,50 10 4734,50
Suelo 4481,50 [T1 100:0; T2 90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5 60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10
10:90; T11 0:100]
C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S
Tratamiento
6 000
5 000
4 000
3 000
2 000
1 000
0
UP/m
in/g
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
56
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Tratamientos
µmol/mi
Figura 14. Actividad proteolítica del segundo muestreo (30 días)
De esta manera, se regulan los procesos de mineralización del nitrógeno catalizando
la hidrólisis de proteínas a polipéptidos y de oligopéptidos a aminoácidos,
manteniendo notablemente la actividad exhibiendo valores altos como 4806
UP/min/g. Posteriormente los valores disminuyeron los 90 días del proceso,
generando así, diferencias significativas durante todo el proceso (Tabla 11 y Figura
15).
Tabla 11. Medias de la actividad proteolítica de las 11 réplicas de cada tratamiento por tiempo de muestreo durante los 90 días de seguimiento.
UP/min/g Tratamiento
Tiempo cero 30 días 60 días 90 días Compost 4133,00 4769,00 3839,50 4164,30
2 4062,50 4750,00 3847,00 4059,50 3 4796,00 4694,50 3885,00 4164,50 4 4757,00 4704,00 4013,50 4235,50 5 4750,50 4686,00 3743,00 4164,50 6 4186,00 4806,00 3870,50 4159,50 7 4287,00 4739,50 3834,00 4217,50 8 4075,00 3943,83 3838,50 4166,63 9 4100,50 4742,50 4231,00 4156,00 10 4138,00 4734,50 3859,50 4192,00
Suelo 4208,00 4481,50 3810,00 4164,60 [T1 100:0; T2 90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5 60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10
10:90; T11 0:100]
C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S
Tratamiento
UP/m
in/g
6 000
5 000
4 000
3 000
2 000
1 000
0
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
57
3000
3500
4000
4500
5000
0 30 60 90
Tiempo (dias)
UP/min/g
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11
Figura 15. Seguimiento de la actividad proteolítica durante los 90 días del proceso. [T1 100:0; T2 90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5 60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10
10:90; T11 0:100]
Para comprobar si existen diferencias altamente significativas entre tratamientos y a
lo largo de los tiempos de muestreo, se sugiere las siguientes hipótesis estadísticas:
H0: Las medias de todos los tratamientos son iguales.
Hi: Existe al menos una mediana significativamente diferente.
El análisis estadístico sugiere que entre los ensayos realizados en todos los tiempos de
muestreo, se observaron diferencias significativas en cuanto a la actividad proteolítica
de las matrices en estudio, sin embargo a lo largo de los 90 días del proceso de
humificación se mantuvo, la actividad proteolítica en forma constante (Figura 15).
Probablemente esto es debido a que las enzimas no se pudieron desnaturalizar, por la
unión a arcillas y a las sustancias húmicas, además de considerar los interferentes que
este método posee como los ya mencionados. Se recomienda realizar el proceso de
humificación durante un tiempo más prolongado, para poder observar en mejor forma
las diferencias en las actividades proteolíticas.
0 30 60 90
Tiempo (Días)
5 000
4 500
4 000
3 500
3 000
UP/m
in/g
C S
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
58
Se concluye esto, gracias al dato estadístico de prueba F ya que es mayor al del valor
crítico de F y de esta manera, se rechaza la hipótesis nula que corresponde a la
igualdad de las medias de todos los tratamientos (Tabla 12).
Tabla 12 ANOVA. Seguimiento de la actividad proteolítica durante todos los 90 de proceso
Origen de las variaciones
Suma de cuadrados
Grados de libertad
Promedio de cuadrados
F Prob Valor critico para F
Tiempos de muestreo
3245103,5 3
1081701,18 28,47 6,505x10-09 2,92228
Tratamientos 532562,12 10 53256,2119 1,402 0,2269288 2,16458 Error 1139673,1 30 37989,1023 Total 4917338,7 43
Se rechaza la hipótesis nula , existen diferencias significativas entre las medias de los 11 tratamientos a lo largo de todo el proceso
Por otro lado, al adicionar materia orgánica fresca, que aunque ya sea un producto
generado por el compostaje, esta puede aun tener características ideales que le
proveen las suficientes fuentes de nutrición a los microorganismos, lo que genera
mayor biomasa y así, disminuye la materia orgánica disponible, es decir, la que es
determinada mediante el protocolo propuesto por Walkley y Black en 1934.
5.2.3 Cuantificación de la actividad celulolítica
La curva de calibración de glucosa (Anexo 10) (Figura 16) generó un factor de
correlación R2 0,9979 indicando la estrecha relación entre los valores entre el eje X
que corresponde a la concentración de glucosa en g/L y el eje Y que corresponde a las
absorbancias obtenidas a 540 nm, que finalmente se ve representada en la tendencia
lineal de los datos. Es bien sabido que el valor del R2, en los casos de las curvas de
calibración, debe estar muy cercano a 1 (Steel y Torrie, 1980).
Durante los 90 días de seguimiento, se tomaron en total 110 muestras por cada tiempo
de muestreo que fueron expuestas a la extracción y posterior evaluación enzimática
celulolítica mediante la técnica de DNS. Cabe anotar que los valores de absorbancias
resultantes, fueron promediados, puesto que se consideraron réplicas.
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
59
Figura 16. Curva de calibración de glucosa. Para la cuantificación de azucares reductores (glucosa).
Después de realizar la extracción de celulasas, se procedió a realizar la determinación
con estas dos técnicas (DNS y Somogyi Nelson), observándose que la concentración
de azúcar reductor presente en cada tiempo de muestreo aumentó en la lectura con
DNS. Este resultado no parece coincidir con el propuesto por Deng y Tabatabai
(1994) quienes propusieron que el método de DNS no es lo bastante específico como
lo es el método de Somogyi Nelson, ya que sugieren que es el ideal para cuantificar
actividad celulolítica en suelos.
Sin embargo, para corroborar o contrastar esta aseveración, se usó una matriz con un
alto contenido de materia orgánica para evidenciar reacciones enzimáticas altas, y se
aplicaron los dos protocolos propuestos y las respectivas técnicas de cuantificación.
Los protocolos estudiados fueron los propuestos por Deng y Tabatabai (1994) y
Lynch y Raphael (1987) y en cuanto a las técnicas de cuantificación, se estudiaron
DNS y Somogyi Nelson.
En el método de extracción empleado en la presente investigación (Lynch y Raphael,
1987), se observó notablemente que es más sensible para la técnica de DNS que para
la de Somogyi Nelson (Tabla 13).
0 0,5 1 1,5 2 2,5 Concentración de glucosa (g/L)
0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
y = 0,3713x + 0,1083
R2 = 0,911
00,10,20,30,40,50,60,70,80,9
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Concentración de glucosa (g/L)
Abs 540 nm
0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
Absorba
ncia 54
0 nm
0 0,5 1 1,5 2 2,5 Concentración de glucosa (g/L)
Y = 0,3713x + 0,1083 R2 = 0,911
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
60
Tabla 13. Comparación de 2 métodos de extracción y cuantificación de azucares reductores. Deng y Tabatabai Lynch y Raphael
DNS SN DNS SN
Media 0,03216667 0,3095 0,12966667 0,1725 DS 0,02550621 0,00288097 0,00287518 0,00350714 Varianza 0,00065057 8,3E-06 8,2667E-06 1,23E-05
Con lo anterior se puede concluir que en el protocolo usado en la presente
investigación se observan mejores resultados en cuanto a precisión y las diferencias
en exactitud, se pueden ajustar empleando un factor de corrección que considera las
diferencias en extracción, además de las diferencias en el desarrollo de la especie
absorbente y su naturaleza. Se observa que la cuantificación de azucares reductores
con la técnica de DNS presenta una menor desviación estándar que en la técnica de
Deng y Tabatabai, además hay menor dispersión de los datos con respecto a la media
obtenida de la técnica (Figura 17 y 18).
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
1 2 3 4 5 6
Réplicas
Abs 540 nm
DNS SN
Figura 17 .Valores obtenidos por la técnica de DNS y Somogyi Nelson. Desviación estándar de las 6 replicas realizadas por medio de la técnica de extracción de Deng y Tabatabai (1994).
1 2 3 4 5 6 Réplicas
0,4
0,3
0,2
0,1
0
-0,1
Absorb
ancia 540 nm
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
61
0
0,05
0,1
0,15
0,2
1 2 3 4 5 6
Réplicas
Abs 540 nm
DNS SN
Figura 18. Valores obtenidos por la técnica de DNS y Somogyi Nelson. Desviación estándar de las 6 replicas realizadas por medio de la técnica de extracción de Lynch y Raphael (1987)
Por otra parte, investigaciones realizadas por Kourtev et al (2002) mencionan que un
comportamiento normal de un proceso de degradación de materia orgánica, la
actividad celulolítica iniciaría con un aumento debido a la gran concentración de
sustrato presente, a medida del paso del tiempo, disminuiría con la reducción de
concentración de sustrato y los productos de la reacción van siendo tomados por los
microorganismos, con lo que la actividad enzimática tiende a disminuir. Sin embargo,
en un proceso de humificación ya de un material que está en un paso intermedio de
degradación (compost) y un suelo que tiene muy bajo porcentaje de materia orgánica
no sucede de esta manera, debido a que en el proceso de compostaje la totalidad o
gran parte de los sustratos son degradadas por las respectivas enzimas intra o
extracelulares hasta generar monómeros, posterior a esta degradación de materia
orgánica fresca ocurre la humificación, en donde se considera que el compost se
encuentra estable y de gran valor comercial, es por esto que la actividad celulolítica
es baja, ya que no hay casi sustrato que degradar. A este nivel, se encuentran las
sustancias húmicas y fúlvicas que pudieran ser cuantificadas para la medición directa
del grado de humificación en este tipo de materiales.
Partiendo de los resultados obtenidos en las pruebas de actividad enzimática
cuantitativa, se efectuaron análisis de ANOVA con el fin de estimar las diferentes
Absorb
ancia 540 nm
1 2 3 4 5 6 Réplicas
0,2
0,15
0,1
0,05
0
Absorb
ancia 540 nm
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
62
causas de variación entre tiempos y tratamientos. De esta manera, se definieron las
hipótesis estadísticas presentadas en este ítem.
H0: Las medias de todos los tratamientos son iguales.
Hi: Existe al menos una media significativamente diferente de las otras.
Este resultado esta condicionado por el valor calculado de F, si este es superior al
valor crítico de F se rechaza la hipótesis nula, con una confiabilidad del 95%.
Observando los datos graficados en el tiempo cero (Figura 19) se observa que hay
presencia de actividad celulolítica, debido a que en el compost utilizado aun
quedaban residuos de celulosa y hemicelulosa como sustrato capaz de proveer las
fuentes nutricionales a los microorganismos para que puedan liberar las enzimas
celulolíticas, además el suelo de Stevia rebaudiana Bertoni es un suelo que es rico en
microorganismos celulolíticos y porque es una matriz que posee materia orgánica por
el material vegetal en degradación caído provenientes de las cosechas.
0,0020,0040,0060,0080,00100,00120,00140,00160,00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Tratamientos
UC/min/g
Figura 19. Actividad celulolítica obtenida de cada uno de los 11 tratamientos del primer
muestreo.
C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S Tratamientos
160 140 120 100 80 60 40 20 0
UC/m
in/g
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
63
Este tiempo de muestreo produjo valores altos como 139,946 UC/min/g hasta el valor
mas bajo que fue de 106,878 UC/min/g (Tabla 14) presentando diferencias
apreciables durante todo el muestreo. La mayor producción de celulasas se observó
en el tratamiento dos que está compuesto de 90 g de compost y 10 g de suelo.
Tabla 14. Medias de la actividad celulolítica de las 11 réplicas de cada tratamiento del tiempo cero
Tratamientos UC/min/g Compost 123,619
2 139,946 3 116,247 4 119,692 5 106,878 6 126,857 7 116,385 8 136,915 9 120,656 10 117,074
Suelo 119,210
[T1 100:0; T2 90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5 60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10 10:90; T11 0:100]
En el segundo muestreo se presentaron cantidades mas altas de actividad celulolítica
(Tabla 15 y Figura 20), exhibiendo valores que van desde valores altos como 158,064
UC/min/g y valores mínimos de 126,512 UC/min/g.
Tabla 15. Medias de la actividad celulolítica de las 11 replicas de cada tratamiento del segundo muestreo (30 días).
Tratamientos UC/min/g Compost 126,512
2 133,815 3 143,184 4 158,064 5 140,290 6 137,121 7 149,797 8 142,495 9 144,630 10 143,046
Suelo 149,591
[T1 100:0; T2 90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5 60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10 10:90; T11 0:100]
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
64
0,00
30,00
60,00
90,00
120,00
150,00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Tratamientos
UC/min/g
Figura 20. Actividad celulolítica obtenida de cada uno de los 11 tratamientos del segundo
muestreo (30 dias)
En el tercer muestreo, es decir, cuando se cumplieron los 60 días, se evidenció
estabilidad en la actividad celulolítica (Tabla 16 y Figura 21) reportando valores
máximos de 139,119 UC/min/g y mínimos como 110,254 UC/min/g.
Tabla 16 Medias de la actividad celulolítica de las 11 replicas de cada tratamiento del tercer muestreo (60 días)
Tratamientos UC/min/g Compost 128,028
2 122,379 3 110,254 4 126,374 5 110,598 6 117,074 7 126,650 8 128,165 9 126,994 10 120,105
Suelo 139,119
[T1 100:0; T2 90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5 60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10 10:90; T11 0:100]
C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S Tratamientos
UC/m
in/g
150
120
90
60
30
0
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
65
0,00020,00040,00060,00080,000100,000120,000140,000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Tratamientos
UC/min/g
Figura 21. Actividad celulolítica obtenida de cada uno de los 11 tratamientos del segundo
muestreo (60 días)
Aunque se presentó una disminución notable en la actividad celulolítica (Tabla 17),
presentó valores máximos de 105,569 UC/min/g y valores mínimos de 80,837
UC/min/g, durante el ultimo muestreo hecho (90 días) (Figura 22).
Tabla 17. Medias de la actividad celulolítica de las 11 replicas de cada tratamiento del cuarto muestreo (90 días)
Tratamientos UC/min/g Cosmpot 105,569
2 102,538 3 98,680 4 93,995 5 95,304 6 91,653 7 90,000 8 88,897 9 84,351 10 80,837
Suelo 80,837
[T1 100:0; T2 90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5 60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10 10:90; T11 0:100]
UC/m
in/g
C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S Tratamientos
140 120 100 80 60 40 20 0
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
66
0,000
20,000
40,000
60,000
80,000
100,000
120,000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Tratamientos
UC/min/g
Figura 22. Actividad celulolítica obtenida de cada uno de los 11 tratamientos del segundo
muestreo (90 días)
Analizando los datos resultantes se puede inferir que en cada uno tiempos manejados,
tanto en el tiempo inicial como en el cuarto muestreo (Tabla 18) se observa que hay
una actividad celulolítica notable, mostrando mayor viabilidad durante los primeros
60 días (Figura 23). En este último muestreo disminuye la actividad celulolítica
debido probablemente a que este tipo de enzimas poseen efecto represor de los
productos de degradación de la celulosa, como celobiosa, ciclodextrinas y glucosa
(Warren, 1996), todas estas moléculas posiblemente fueron liberadas o producidas en
mayor cantidad que la glucosa. Un aspecto interesante es que la actividad proteolítica
del suelo pudo ser un efecto represor en la actividad de las celulasas (Criquet, 2002).
Tabla 18. Medias de la actividad celulolítica de las 11 réplicas de cada tratamiento por tiempo de muestreo durante los 90 días de seguimiento.
UC/min/g Tratamiento
Tiempo 0 30 días 60 días 90 días Compost 123,619 126,512 128,028 105,569
2 139,946 133,814 122,379 102,538 3 116,247 143,188 110,254 98,68 4 119,692 158,064 126,374 93,995 5 106,878 140,29 110,598 95,304 6 126,857 137,121 117,074 91,653 7 116,385 149,797 126,65 89,999 8 136,915 142,495 128,165 88,897 9 120,656 144,63 126,994 84,35 10 117,0734 143,046 120,105 80,837
Suelo 119,21 149,59 139,119 80,837
UC/m
in/g
C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S Tratamientos
120
100
80
60
40
20
0
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
67
100
110120
130140
150
160
170
0 30 60 90
Tiempo (dias)
UC/min/g
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11
Figura 23. Seguimiento de la actividad celulolítica durante los 90 días del proceso. [T1 100:0; T2 90:10; T3 80:20; T4 70:30; T5 60:40; T6 50:50; T7 40:60; T8 30:70; T9 20:80; T10 10:90; T11
0:100]
El análisis estadístico (Tabla 19) sugiere que entre los ensayos realizados en todos los
tiempos de muestreo, se observaron diferencias significativas en cuanto a la actividad
celulolítica de las matrices en estudio.
Tabla 19 ANOVA. Seguimiento de la actividad celulolítica durante todos los 90 de proceso
Origen de las variaciones
Suma de cuadrados
Grados de libertad
Promedio de cuadrados
F Prob Valor critico para F
Tiempos de muestreo
14369,331 3 4789,77695 59,28 1,02x10-12 2,92228
Tratamientos 582,7465 10 58,27465 0,72 0,6984305 2,16458 Error 2424,1705 30 80,8056844 Total 43
Se rechaza la hipótesis nula , existen diferencias significativas entre las medias de los 11 tratamientos a lo largo de todo el proceso
Se concluye esto, gracias al dato estadístico de prueba F ya que es mayor al del valor
crítico de F (Tabla 19) y de esta manera, se rechaza la hipótesis nula que corresponde
a la igualdad de las medias de todos los tratamientos.
Esta técnica presenta grandes ventajas debido a que las actividades enzimáticas se
evidencian en mejor forma dado a que las enzimas extraídas fueron incubadas en un
0 30 60 90 Tiempo (Días)
UC/m
in/g
170 160 150 140 130 120 110 100 0
C S
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
68
sistema líquido-líquido el cual conduce al complejo enzima-sustrato y
consecuentemente a la medición de la actividad celulolítica, lo contrario pasa con el
ensayo hecho por Criquet (2002) que asegura una unión no muy estrecha debido al
sistema sólido-liquido.
Sin embargo se presentan muchas desventajas en este tipo de técnicas, una de ellas es
la cantidad de submuestra usada para la extracción, ya que esta no superó los 5 g
debido a las limitaciones de los materiales usados en cuanto a lavados y extracciones
con grandes volúmenes de acetona.
Aunque muchos autores, entre ellos el del actual protocolo, González et al., (2004),
Deng y Tabatabai (1994) y Mondini y Cayuela (2005) usaron 5 g de suelo para
realizar las extracciones de diferentes enzimas encontradas en este, obteniendo muy
buenos resultados, otros autores como Criquet (2002) usaron 1 g y Kandeler et al
(1999) solo usa 300 mg debido a que adicionan diferentes tipos de sustrato a un
extracto de compost con el fin de analizar el desarrollo de las enzimas sobre estas
substancias.
Por otra parte, como el suelo usado es de naturaleza arcillosa, puede ocurrir que las
partículas minerales que lo componen, interactúen con estas enzimas modificando sus
propiedades catalíticas o inhibiendo su actividad (Quiquampoix et al., 1993).
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69
6. CONCLUSIONES
- El seguimiento del proceso de humificación mediante la determinación de
carbono orgánico, actividad proteolítica y celulolítica fue exitoso.
- La técnica de extracción de Lynch y Raphael (1987) permitió una buena
recuperación enzimática a partir de matriz suelo o mezclas con compost.
- El método propuesto de Walkley & Black (1934) de determinación de
carbono orgánico por vía húmeda en matriz de suelo y compost analizado,
permitió obtener resultados altamente satisfactorios, a pesar de que porcentaje
de carbono orgánico en las muestras de compost y suelo fue bajo.
- No hay diferencias entre los tratamientos manejados de manera que si se
aplica cualquiera de estos, se mostrará actividades enzimáticas altas.
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
70
7. PERSPECTIVAS
- Es recomendable usar otro tipo de sustrato proteíco diferente a la caseína 1%
m/v para determinar la actividad proteolítica, debido a las numerosas
interferencias que este aporta.
- Para complementar la presente investigación, sería conveniente realizar una
extracción de sustancias húmicas para poder evaluar con detalle el proceso de
humificación de compost inoculado y poderlo relacionar con la producción de
proteasas y celulasas.
- Es recomendable realizar el seguimiento por mucho más tiempo y en
intervalos más cortos para poder ver en forma más amplia las diferencias entre
actividades enzimáticas.
- Para corroborar los resultados referentes a la actividad enzimática sería
aconsejable comprobar la correspondencia contra una metodología que utilice
sustratos fluorogénicos, que aunque sea mucho más costosa, es más confiable.
- Estudiar con mayor profundidad la relación que existe entre contenido de
materia orgánica o naturaleza de la matriz y actividad enzimática de cada
matriz en el tiempo.
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
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__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
80
ANEXO 1 ● Sal ferrosa (Mohr)
- Pesar 12,0432 g de FeSO4 7H2O y disolver en 4 L de agua destilada fría.
- Almacenar en un frasco ámbar.
Observaciones
- Preparar el reactivo el mismo día de uso, de lo contrario las sales que lo componen
se precipitarán y el resultado no seria significativo.
- Adicionar el agua destilada fría, de lo contrario el hierro se oxidará.
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
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ANEXO 2 ● Preparación de buffer fosfato 0,1M (Galindo et al., 2005).
- Pesar 14,2 g de Na2HPO4 en un vaso de precipitado de 250 mL y disolver en 200
mL con agua destilada.
- Por otro lado, pesar 12 g de NaHPO4 en un vaso de precipitado de 250 mL y
disolver en 200 mL con agua destilada.
- Posteriormente, se mezcla las anteriores soluciones y se ajusta el pH a 7,0 ± 2,0,
transvasar a un balón aforado de 1000 mL y enrasar con agua destilada.
Observaciones
- Homogenizar muy bien cada una de las soluciones fosforadas, si es necesario
calentar en horno microondas.
- Dejar enfriar las soluciones para poder enrasar a 1000 mL con agua destilada, de lo
contrario el volumen variará.
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
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ANEXO 3
● Preparación de la solución de caseína hidrolizada
- Pesar 10 g de caseína en un vaso de precipitado de 250 mL y disolverlo en 200 mL
de buffer fosfato 0,1M.
- Verter la anterior mezcla en un balón volumétrico de 1000 mL y enrasar.
- Disolver en baño termostatado a 37ºC durante 1 hora.
Observaciones
- Guardar a 4°C la solución de caseína hidrolizada para evitar contaminación y así,
interfiera en la cuantificación de actividad proteolítica.
� Preparación del ácido tricloroacético (TCA) al 15% m/v
- Pesar 15 g de ácido tricloroacético en un vaso de precipitado de 50 mL.
- Disolver en 30 mL de agua destilada.
- Enrasar hasta 100 mL en un balón volumétrico con agua destilada.
Observaciones
- Manejar este reactivo con las medidas de seguridad necesarias, ya que es altamente
tóxico e irritante.
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
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ANEXO 4
● Preparación de la solución stock de tirosina 100 µmol/mL
- Pesar 0,01g de tirosina en balanza analítica; 0,0052 g de NaH2PO4 y 0,0022 g de
Na2HPO4.
- Disolver en agua destilada los anteriores compuestos hasta obtener 50 mL y
verterlos en un balón volumétrico de 100 mL y enrasar con agua destilada.
Las soluciones de concentración mas baja (de 10 en 10 hasta 100) se preparan de
acuerdo a la aplicación de la formula V1C1 = V2C2, teniendo en cuenta que el
volumen final de cada una es de 3 mL.
Concentración Tirosina (µmol/mL)
Solución stock Tirosina (mL)
Agua destilada (mL)
10 0,3 2,7 20 0,6 2,4 30 0,9 2,1 40 1,2 1,8 50 1,5 1,5 60 1,8 1,2 70 2,1 0,9 80 2,4 0,6 90 2,7 0,3 100 3,0 0
(Galindo et al., 2005).
Como blanco de la prueba se utiliza una solución que contiene 1 mL de solución de
caseína 1% m/v (ó 2 mL de solución de caseína en buffer fosfato 0,1M sin adición de
1 mL de buffer fosfato 0,1M), 1 mL de TCA y 1 mL de Buffer fosfato 0.1M;
posteriormente la mezcla se centrifuga a 5000 rpm por 5 minutos. La prueba se lee a
280nm en espectrofotómetro de luz U.V.
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
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ANEXO 5
● Promedio de absorbancias para la determinación de la curva patrón de tirosina
Réplicas Concentración
Tirosina (µmol/mL) 1 2 3 Promedio
10 0 0 0 0 20 0 0 0 0 30 0,025 0,026 0,027 0,0260 40 0,173 0,175 0,175 0,1743 50 0,213 0,213 0,212 0,2127 60 0,277 0,276 0,276 0,2763 70 0,416 0,416 0,414 0,4153 80 0,42 0,419 0,419 0,4193 90 0,504 0,503 0,502 0,5030 100 0,64 0,637 0,639 0,6387
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
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ANEXO 6
● Preparación de carboximetilcelulosa (CMC) al 1% m/v en buffer fosfato 0,1M
- Pesar 1,0 g de carboximetilcelulosa (CMC) en un vaso de precipitado de 250 mL y
disolverlo lentamente en 50 mL de buffer fosfato 0,1M (solución tampón).
- Calentar esta solución en horno microondas durante 1 minuto, o hasta que se
disuelva bien el sustrato, ajustar el pH a 7,0 ± 2,0.
- Enrasar a 100 mL con buffer fosfato 0,1M en un balón volumétrico.
Observaciones
- Procurar que la CMC quede totalmente disuelta antes de trasvasar al balón
volumétrico, de lo contrario todo el sustrato quedará sólido en el vaso de precipitado
y así, cambiará la concentración de la CMC.
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
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ANEXO 7
● Preparación de la solución stock de glucosa 2 g/L
- Pesar 2 g de glucosa anhidra en balanza analítica y disolver en 500 mL de agua
destilada utilizando un balón volumétrico de 1000 mL, homogenizar y completar
hasta 1000 mL con agua destilada.
● Preparación de la solución stock de glucosa (0,5 – 2 g/L)
- Empleando la fórmula de V1.C1 = V2.C2, se preparan 6 soluciones que tengan un
volumen final de 2 mL.
Concentración glucosa (g/L)
Solución concentrada Glucosa (mL)
Agua destilada (mL)
0,5 0,5 1,5 0,7 0,7 1,3 1 1,0 1,0
1,5 1,5 0,5 1,7 1,7 0,3 2 2 -
__________________________________________________________________ Seguimiento del proceso de humificación en compost inoculado
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ANEXO 8
● Preparación del reactivo de DNS
Esta técnica se fundamenta en la oxidación de la glucosa. Esta molécula en solución
permanece en forma estable, es decir, cíclica, para que ocurra una oxidación se
requiere un calentamiento y que la molécula de glucosa esté en forma lineal y quede
el grupo aldehído expuesto para su posterior oxidación.
Características como la alcalinidad del medio se requiere para que se oxide, para ello
se adiciona NaOH. Este NaOH en solución acuosa se ioniza liberando Na+ y OH- y
así, forma ácido glucónico. Con ayuda del Tartrato de Na y K se reemplaza el - NO2
del carbono 3 del ácido 3-5 dinitrosalicílico por un grupo - NH2 y forma 3 amino – 5
nitrosalicílico que aumenta su color de acuerdo a la cantidad de glucosa oxidada.
Procedimiento
- Depositar 50 mL de agua destilada en un vaso de precipitado de 250 mL.
- Adicionar 1,6 g de NaOH y disolver mediante agitación magnética a temperatura
ambiente.
- Posteriormente adicionar lentamente 43,8 g de Tartrato de sodio y potasio hasta
disolverse por completo.
- Adicionar 1 g de ácido dinitrosalicílico y completar con agua destilada hasta 100
mL en un balón aforado.
- Dejar en agitación toda la noche en un frasco oscuro.
Observaciones
- La técnica se lee a una absorbancia de 540 nm.
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ANEXO 9 ● Medias y desviación estándar de los valores de pH obtenidos de cada uno de los 11 tratamientos del primer muestreo
0,01,02,03,04,05,06,07,08,09,0
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11
Tratamientos
pH
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ANEXO 10
● Promedio de absorbancias a 540 nm para la determinación de azucares reductores por el método de DNS
Concentración glucosa g/L
Abs 540 nm
0,5 0,195 0,7 0,434 1 0,567
1,5 0,625 1,7 0,724 2,0 0,852
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