Tarea de Microbiologia 3 Tinciones

Brandon Steven Caballero SandovalMicrobiologa GeneralQ.F.B. 4 Rosa Salgado Brito

Fundamentos de la tincin de GramLa tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en Bacteriologa para la visualizacin de bacterias, sobretodo en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo danes Christian Gram, que desarrollo la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndolo bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color morado, y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.La tincin de Gram es usada para clasificar bacterias sobre la base de sus formas, tamaos, morfologas y reaccin Gram (color). A nivel del laboratorio es til como test para un rpido diagnostico presuntivo de agentes infecciosos, tanto en muestras como en cultivos en crecimiento, y adicionalmente sirve para valorar la calidad de la muestra clnica. Las bacterias se tien gram positivas (+), gram negativas (-) o no se tien debido a sus diferencias en la composicin de su pared y arquitectura celular. Las bacterias gram (+) tienen una gruesa capa de pptidoglucano y gran cantidad de cidos teicicos que no son afectados por la decoloracin con alcohol y/o acetona, reteniendo el colorante inicial acomplejado con iodo y visualizndose en distintos grados de tonos desde el violeta al azul claro, dependiendo de si la naturaleza de su pared celular est intacta o daada (por tratamientos antibiticos, edad celular.). Las bacterias gram (-) tienen en su pared celular una delgada capa de pptidoglucano ligada a una membrana externa por molculas de lipopolisacridos. Esta membrana externa es daada por el alcohol y/o acetona de la decoloracin, permitiendo que el primer colorante acomplejado con iodo escape y sea reemplazado por el contra-colorante. Clsicamente los reactivos utilizados para la realizacin de la tincin de gram han sido el cristal violeta como colorante inicial, la solucin de lugol para acomplejar a este, el alcohol y/o acetona para la decoloracin y la safranina o fucsina bsica como contra-coloranteExisten una serie de puntos con respecto a un buen control de calidad de las tinciones de Gram, y que deben ser tenidas en cuenta antes de su realizacin, a saber: Diariamente se debe comprobar que no existen precipitados ni cristales en la solucin de cristal violeta. Si los hay, filtrar antes de su uso. La estabilidad de la solucin de cristal violeta, alcohol y/o acetona, safranina o fucsina bsica es de 1 ao y la de la solucin de lugol de 6 meses, todas ellas conservadas e frascos cerrados. (la evaporacin puede alterar su efectividad) a temperatura ambiente. Ciertos procedimientos de laboratorio pueden dificultar la interpretacin de extensiones demasiado gruesas, uso de portas que no han sido prelavados o desengrasados, sobrecalentamiento en la fijacin y excesivos lavados durante la tincin. Todos los anteriores son causas comunes de pobres resultados en la tincin de Gram Debe tenerse en cuenta que no todos los microorganismos observados en una tincin pueden ser cultivados, y al contrario, alguno no observados pero presentes consiguen ser recuperados en el cultivo. Interpretaciones. Otras consideraciones importantes que deben ser revisadas e inspeccionadas por microscopia tras la realizacin de la tincin son: Como regla para evidenciar una buena decoloracin y teniendo en cuenta la fuente de la muestra, el fondo de la tincin deber ser claro o ligeramente gran (-). Si hay leucocitos se observaran completamente gram (-), y si hay levaduras tipo Cndida completamente gram (+). Para una buena interpretacin de la tincin, el grosor de la extensin debe permitir que aparezcan ms de 2 clulas solapadas unas encimas de otras. Examinar la tincin en busca de evidencias de inflamacin (clulas polimorfo-nucleadas, clulas mono-nucleadas y/o hemates) La presencia de clulas epiteliales, bacterias de la flora, restos alimenticios, segn el producto patolgico que estemos observando, puede indicar una mala obtencin de este. En cuanto a la reaccin gram y caractersticas morfolgicas de los microorganismos visualizados, estas son: Positiva: Violeta fuerte o azul claro Negativo: roja o rojo (en el caso de carbol fucsina el rojo ser intenso) Variable: microorganismos parcialmente positivos y negativos. Puede ser debido a una mala extensin, fijacin o tincin, presencia de clulas viejas, dao en la pared celular o por particularidades espaciales de la pared celular de ciertos microorganismos Neutro: No toman ningn color, siendo generalmente el fondo alrededor de ellos de un ligero gram (-). Los microorganismos puede ser intracelulares. Esta reaccin gram ha sido vista en tinciones de muestra clnica en donde estn presentes elementos fngicos o algunas especies de micobacterias. Otras caractersticas: A examinar en el gran son si la tincin de los microorganismos es homognea, bipolar, en cuentas o gotas punteada, en barras o irregular.

Tipos de tinciones

Las tinciones puede dividirse en simples, diferenciales, selectivas o vitales. En el primer caso se aplica un solo colorante, de manera que todas las clulas se observaran de un solo color. En la tincin diferencial se utiliza ms de un colorante y permite diferenciar a las clulas tenidas por su afinidad a uno u otro compuesto de este tipo. Cuando se aplica la tincin selectiva el colorante tiene afinidad por una estructura particular del microorganismo. Cuando se tien microorganismos vivos se est aplicando una tincin vital.Tincin de Schaeffer y Fulton (Tincin de esporas)La esporulacin no es un mecanismo de multiplicacin en bacterias, pues usualmente por cada clula se produce solo una endospora. En algunos casos excepcionales se puede producir ms de una espora, por ejemplo. Metanobacterium polyspora una arqueobacteria no cultivable actualmente y anaerobacter polyendosporus un bacilo Gram positivo que puede presentar ms de 7 endosporas por clula. Por otra parte, los actinomicetales. Un grupo especial de bacterias, forman numerosas exosporas como forma de multiplicacin.Las endosporas son formas de resistencia, altamente deshidratadas y con una serie de cubiertas muy poco permeables, esto hace que sean difciles de teir, excepto si se calienta la preparacin para permeabilizarlas, sin embargo, pueden evidenciarse en preparaciones a fresco o con diversas tinciones, pues las esporas aparecen como estructuras refringentes no coloreadas. Las esporas son producidas por Bacillus Clostridium, Sporosarcina, Sporolactobacillus y desulfotomaculum, gneros de bacterias Gram positivas, aunque recientemente han sido descritas en algunas bacterias Gram negativas. Las endosporas son ms resistentes a condiciones adversas, entre ellas calor, radiaciones, desinfectantes y otras, que las clulas vegetativas y las exosporas. Se producen en condiciones nutricionales que favorecen el proceso de esporulacin. La endospora ocupa una posicin caracterstica de la clula, puede ser terminal, subterminal o central. La localizacin y el tamao de la espora varia con la especie bacteriana y generalmente estas caractersticas son de valor para su identificacin. Conforme el desarrollo de la espora se completa, la clula vegetativa se desintegra y libera la espora. Las endosporas bacterianas son muy resistentes a los procedimientos de tincin usuales. La aplicacin de un solo colorante a una clula bacteriana que contiene una endospora, solo tie la clula, pero la espora se mantiene incolora, para lograr introducir el colorante dentro de la espora es necesario aplicar calor. La tincin de Schaeffer y Fulton emplea verde malaquita como colorante primario, el cual es eliminado posteriormente del resto de la clula bacteriana, pero no de la espora, mediante un enjuague con agua. Como contra-tincin se emplea safranina, la cual tie la clula vegetativa. Tincin de Sheaffer Fulton Es usada para colorear biometra hemtica, para esporas esta tambin es conocida como la de Wright. La tincin de Sheaffer Fulton observa. Esporas Cuerpos fructferos Conidias Clulas gemantesTie endosporas de color verde (verde de malaquita) y cuerpo de bacterias en color rojo (safranina o fucsina), sirve para diferenciar endosporas y bacterias. Las endosporas son clulas especializadas, no reproductivas, producidas por unas pocas bacterias de la divisin Firmicute. Su funcin primaria es ofrecer resistencia en contra de la radiacin (ultravioleta, X y gamma), a la desecacin, a la lisozima o tambin llamada muramidasa (enzima), al calor, a los desinfectantes qumicos y a la trituracin mecnica. Las endosporas se encuentran comnmente en el suelo y el agua donde sobreviven durante largos periodos de tiempo. En resumen, son estructuras de resistencia compuesta de mltiples protenas.)Tincin con tinta china Identificacin de bacterias con capsula. Tincin de Ziehl - NeelsenEl fundamento de esta tcnica diferencial se basa en la propiedad de la pared celular de algunas bacterias del orden. Actinomycetales. Tratndose de la capacidad de resistir a la decoloracin con un alcohol y un acido fuerte cuando han sido previamente teidas, lo cual se debe a la presencia de cidos micolicos en su pared celular. El resto de las estructuras de estas bacterias son similares a los de las bacterias Gram positivas. Existen dos variantes de esta tcnica; una llamada en caliente y la otra en frio (o de Kinyoun). Cualquiera de las dos tcnicas citadas consiguen, ya sea por el calor o aumentando el tiempo de contacto, que la fucsina penetre profundamente y pueda resistir la accin decolorante de una solucin de acido alcohol, apareciendo los bacilos de color rosa sobre un fondo azul..Las bacterias acido alcohol resistentes (BAAR), tras la unin de la fucsina, resisten la decoloracin orgnica posterior y se vern teidas de rosa. El resto de las bacterias se decoloran y se tien con azul de metileno.