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Tema 18. Condiciones de la actividad enzimática: Dependencia de la Temperatura y el pH.
1. Efecto de la temperatura sobre la velocidad de reacción.
1.1.Teoría de Arrhenius y la Teoría de las velocidades absolutas de reacción de Eyring: Equivalencia.
1.2. Dependencia de la temperatura en reacciones enzimáticas
2. Efecto del pH sobre la actividad enzimática
3. Deducción de los pKa de los aminoácidos del centro activo
4. Efecto del pH sobre la ionización del substrato
1. Efecto de la Temperatura sobre la Velocidad de Reacción
Según la mecanica estadística la “Energía cinética media” (Ec) de un conjunto de moléculas es función de la temperatura actual, T.
* Si la reacción tiene lugar a una temperatura T1 ==> hay un grupo de moléculas con “energía suficiente” para reaccionar después de una colisión eficaz.
* A una temperatura más elevada, T2, (T2 >T1), el número de moléculas con “energía suficiente” es mayor.
La velocidad de las reacciones químicas es fuertemente dependiente de la temperatura
La mínima energía que deben tener las moléculas para poder colisionar de manera efectiva, se denomina “Energía de activación” (Ea).
Ec f(v) = ½ mv2 ≥ Ea
Como se observa en la figura, a medida que aumenta la temperatura, aumenta el número de moléculas con energía suficiente (Ec > Ea), es decir, con velocidad
suficiente, para colisionar eficientemente
v -> Ea
-Según la Mecánica clásica:
-Por otro lado: Ec f(T)
* A partir de una serie de datos experimentales, Arrhenius observó que el ln de la cte de velocidad, lnk, era función
lineal del inverso de la temperatura absoluta, 1/T, y propuso la siguiente relación matemática:
O en forma exponencial:
k = A e- (Ea/RT)
Si representamos: lnk frente a 1/T,
y = b - mx
TR
EaAk
1lnln
* En la ec. de Arrhenius :
A es una constante que tiene las mismas unidades que la constante de
velocidad y representa la frecuencia de las colisiones eficaces entre las moléculas de los reactantes.
R es la constante universal de los gases (8,315 J K-1 mol-1)
T es la temperatura absoluta
Ea es la llamada energía de activación de Arrhenius
Energía debe suministrarse a las moléculas reaccionantes para obtener un choque eficaz.
NOTA: Es conveniente tener en cuenta no es una deducción basada en una teoría preestablecida, sino que fue expresada a partir de observaciones experimentales, sin un
modelo teórico previo.
k = A e- (Ea/RT)
En el supuesto de que A y Ea sean independientes de la temperatura, podemos calcular la razón de las dos constantes k1/k2 a dos temperaturas diferentes, T1 y T2, que difieren en 10ºC.
Aplicando logaritmos:
A la razón de las dos constantes k1/k2 a dos temperaturas diferentes, suele denominársele Q10.
Ea valor experimental 50-100 kJ/mol
Q10 2 a 4 al variar 10 C
Duplica o cuadriplica la velocidad de reacción cada 10 grados
11RT
Ea
eAk
22RT
Ea
eAk
21
21
12
2
1 TRT
TTEa
RT
Ea
RT
Ea
eek
k
21
21
2
1ln
TRT
TTEa
k
k
1.1.Teoría de Arrhenius y la Teoría de las velocidades absolutas de reacción de Eyring: Equivalencia.
- Continuemos considerando una reacción del tipo: S PAproximación experimental de
Arrhenius
- Tomando ln de ambas ecuaciones tendremos:
R
S
RT
HB eeh
Tkk
##
TR
Ea
eAk1
Teoría de las velocidades absolutas de reacción de Eyring (TEMA 5)
TR
EaAk
1lnln
R
S
RT
HhTkk B
##
lnlnlnln
Derivando respecto de la temperatura, (Ea, H# y S# independientes de la temperatura)
De donde,
- Esta ecuación es muy útil, desde el punto de vista práctico, pues nos permite obtener el valor de la entalpía de activación, H#
Nota: el valor de Ea lo podemos calcular experimentalmente, a partir de la pendiente de la representación de lnk 1/T
2
1ln
TR
Ea
dT
kd
2
#1ln
RT
H
TdT
kd
Aproximación experimental de Arrhenius
Teoría de las velocidades absolutas de reacción de Eyring (TEMA 5)
2
#
2
11
RT
H
TTR
Ea
#HRTEa
- Sustituyendo el valor H# en la ecuación de Eyring:
- Comparando esta ecuación con la de Arrhenius, se obtiene el siguiente valor para la constante A∞:
La ecuación anterior nos permite calcular el valor de S#.
R
S
RT
HB eeh
Tkk
##
R
S
RT
EaB eeeh
Tkk
#
TR
Ea
eAk1
R
SB eeh
TkA
#
Valor experimental
1ln#
Tk
ARS
B
Los valores de entalpía de activación, H#, y de entropía de activación, S#, son de una gran utilidad.
Información sobre la naturaleza del estado de transición y del mecanismo de reacción.
- El valor de H#, generalmente es positivo, lo que significa que para formar el estado de transición deben tensionarse o distorsionarse algunos enlaces, consumiendo calor
(energía).
- Generalmente, un valor de entropía de activación, S#, alto y negativo sugiere que en el estado de transición las moléculas que han reaccionado adoptan conformaciones
mucho más ordenadas que las que tenían en el estado elemental.
Cálculo de la energía libre de Gibbs G# a una T determinada
1.2. Dependencia de la temperatura reacciones enzimáticas
Vmax función lineal de la [E] y de la kcat función lineal de la temperatura ??
Kcat es función de la temperatura (Ecuación de Eyring)
Naturaleza proteica de las enzimas Procesos de desnaturalización
Incremento de temperatura reacción enzimática
1. Aumento de la velocidad (reacción química) Ley de Arrhenius
2. Desnaturalización proteica
[N] [D]
[N] [D]
R
oDS
RT
oDH
oD
eeeK
KRTG
N
DK
RT
G
D
DoD
D
ln
DK
EoN
1
Entalpia y Entropia estandar de desnaturalización de la enzima
Ensayamos el efecto de la temperatura en condiciones de velocidad máxima
Vmax= kcat [N]
[Eo] = [N] + [D]
Equilibrio de desnaturalización:Constante de equilibrio
ND
KD
Kcat y KD Función de la temperatura
R
oDS
RT
oDH
R
oDS
RT
oDH
ee
Aekcat
ee
EoAeV
RT
Ea
RT
Ea
1
1
1
max
Vmax= kcat [N]
KD es grande
Temperatura>>>>
Vmax y la Kcat
Temperaturas >Temperatura de transición
50% N y 50% D
KD es muy pequeña
Varian según Arrehnius
Tiende a 0
R
oDS
RT
oDH
ee
Eo
K
EoN
D1
1
TR
Ea
eAk1
Temperaturas <<
Enzima de un cangrejo de alaska
Quimiotripsina porcina
Enzima Bacteria de Yellowstone
Vmax
Temperatura
Desnaturalización
Comportamiento según Arrhenius
Energía de activación y parametros termodinámicos de la reacción enzimática:
Se obtienen en el rango de temperaturas donde no hay fenómenos de desnaturalización
Temperatura
Ln Vmax
1/T1/Tc
R
Em a22
R
Em a11
Graficas de Arrhenius discontinuas: Cambios conformacionales asociados a la temperatura
Enzimas asociadas a membranas. Tc temperatura cambio de conformación de los fosfolipidos asociados a la proteína en la membrana
2. Efecto del pH sobre la actividad enzimática
Vmax
pH
1 3 5 7 9 1 3 5 7 9 1 3 5 7 9
pH pH
Enzimas: Ácidas Neutras Alcalinas
pKa
-COOH 3,0-3,2
- -COOH 3,0-5,0
-imidazolio 5,5-7,0
-NH3 7,5-8,0
SH 8,0-8,5
Fenol 9,8-10,5
Guanidinio 11,6-12,6
pKa de aminoácidos que pueden estar implicados en el centro activo
Interior de la proteína
pKa cambios de hasta 2 unidades
Modelo comportamiento de una enzima con dos residuos ionizables que interviene en el centro activo.
EEHHEH 121
SESEHSHEH 121
PEH 1
+ S + S + S
K1 K2
Ks1 Ks2kcat
Substrato no ionizable en el rango de pH
K1 y k2 constantes de disociación de los grupos protonizables
Ks1 y Ks2 constantes de disociación de las diferentes especies químicas forman complejos la E y S
Km constante de Micaelis de formación del único complejo que da el producto EH1-
H
Ks
Ks
HSEH
H
K
K
HEHEo
SEH
EHSKm
KsH
KsSEHSE
Ks
HSEHSHEH
H
KEHE
K
HEHHEH
SESEHSHEHEEHHEHEo
21
11
1
21
12
11
1
1
1
121
21
1121
121121
Los diferentes complejos se expresan en función de [H+] y las contantes de disociación
Valores de los distintos complejos
Sustituyendo y sacando factores comunes
SEH
HSEKs
SHEH
HSEHKs
EH
HEK
HEH
HEHK
1
21
1
12
21
11
2
1
Valor de la constante de Michaelis
HKs
KsH
HK
KH
SKm
kcatEovo
HKs
KsH
HK
KH
SKm
EoSEH
S
KmSEHEH
SEH
EHSKm
21
11
1
21
11
1
2
1
2
1
1
11
1
1
De esta expresión tenemos que obtener el valor de
SEHkcatvo 1
SEH 1
H
Ks
Ks
HSEH
H
K
K
HEHEo
21
11 1
2
11
A partir de la ecuación de balance de masas de la enzimas y el valor de Km
Multiplicando y diviendo por la expresión
S
HKs
KsH
HK
KH
Km
S
HKs
KsH
Vvo
H
Ks
Ks
H
21
1
12
11
max
21
1
2
1
Expresión general que representa el comportamiento de la velocidad de una enzima con dos restos aminoácidos protonizables y su forma activa es
pH puede modificar tanto la Vmax como la Km
SEH 1
Eo
EH
f
HK
KHf
HK
KH
VVmpH
SKm
S
HK
KH
Vvo
KsK
KsK
1
2
1
1
21
1
11
21
1
max
21
1
max
2
1 Presencia de Substrato no modifica los pKa de los grupos ionizables de la enzima
No se modifica la Km sólo la Vmax
f - Función de Michaelis
A [S] saturantes
Fracción de la enzima en la forma EH1-
Da los productos de la reacción
Valor entre 0 y 1
f
1
pH
1
0,5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pK1 pK2
[H+]<<<K1 y [H+]>>>K2
Vmax no se modifica [H+] muy altas ó muy bajas
Vmax tiende a 0
f
1
pH
1
0,5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pK1
f
1
pH
1
0,5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pK2
Otras Formas activas
EH1H2E=
22111
H
KK
H
Kf
221
2
1K
H
KK
Hf
3. Deducción de los pKa de los aminoácidos del centro activo
A pH bajo
f
11
0,5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pK1 pK2
2
1
11
15,0
1
21
1
11
pKpH
pKpH
KHf
HK
KHf
A pH alto
Para el modelo enzima diprótica y en su forma EH1-
Sólo pueden hacerse cuando la diferencia entre los dos pK sea al menos 3,5 unidades
de pH de diferencia
pH
Linearización de la ecuación de la velocidad máxima en función de la variación de pH
2max
log
1max
log
1
max
21
1
max
pKpHV
VmpH
pKpHV
VmpH
H
K
V
VmpH
HK
KH
VVmpH
Se desprecia 1 como sumando y K2/[H+]
A pH bajos
A pH altos
Se desprecia 1 como sumando y [H+]/K1
maxlogV
VmpH0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pK1 pK2
pH
}{ -log2
Confirmados por otras técnicas:
Modificación química específica de aa, mutagenesis dirigida, etc
HEEH
EHS PEH + S
K1
kcat
Km
max
1
maxmax
1
max
111
11
max
VSV
Km
V
K
SV
KmK
Hv
SKm
S
KH
Vv
pH
pH
Cálculo del pKa para una Enzima monoprotica
1/[H+]
1/vpH-1/K1
4. Efecto del pH sobre la ionización del substrato
HSSH
EHS PE + S Km
KH
kcat
Sólo se ioniza el substrato
So= S- + SH
H
H
H
H
H
pKpHKm
KmpH
HKSo
Km
HKSo
Vv
H
KSHSo
H
KSHS
log
1
1max
1
Sólo varia la Km
Obtener el pKH
H
KKmKmpH H1
SoHK
Km
SoV
H
1
max
Generalmente fenómenos poco frecuentes
¿Y si se ionizan tanto la enzima como el subtrato? Tarea
RESUMEN
El calor aumenta la velocidad de las reacciones. Arrhenius descubrió experimentalmente la ley de dependencia de la constante de velocidad de una reacción con la temperatura. Para la mayoria de las reacciones químicas la constante de velocidad aumenta de 3,0 a 4,0 veces al aumentar 10° C la temperatura.Mediante la ecuación experimental de Arrhenius puede determinarse la Ea o energía de activación de Arrhenius, energía que ha de comunicarse a las moléculas para que tengan un choque eficaz.
Las reacciones catalizadas por enzimas siguen la ley de Arrhenius. La naturaleza proteica limita el calentamiento progresivo para aumentar la velocidad, pues se puede llegar a la desnaturalización de la proteínaExperimentalmente, se obtiene Ea y a partir de ella se puede obtener el valor de los parámetros termodinácos de la reacción enzimática como la entalpia, entropía y energía libre de activación.
TEMPERATURA
pHLas enzimas ensayadas in vitro a diferentes pH se comportan como: enzimas ácidas, neutras y básicas.Las curvas de actividad enzimática frente a variaciones de pH puede darnos información sobre los pKa de los residuos de aminoácidos implicados en la catálisis.La función de Michaelis de las enzimas con residuos ionizables se ajustan muy bien a los comportamientos experimentalesCuando el substrato no influye en la ionización de la enzima, solamente la Vmax se verá afectada.En el caso de que sea solamente el substrato el que se ionice en el rango de pH estudiado, solamente se verá modificada la constante de Michaelis.
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