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Tema:13CINÉTICA ENZIMÁTICA : REACCIONES REVERSIBLES. Reversibilidad en el mecanismo de Michaelis-Menten : Ecuación de velocidad reversible 2. Relación de Haldane 3. Validez de la asunción del estado estacionario. - PowerPoint PPT Presentation
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Tema: 13 CINÉTICA ENZIMÁTICA : REACCIONES REVERSIBLES
1.Reversibilidad en el mecanismo de Michaelis-Menten: Ecuación de velocidad reversible
2. Relación de Haldane
3. Validez de la asunción del estado estacionario
Hasta ahora, en todos los modelos cinéticos estudiados, hemos considerado que la última reacción era irreversible, …..
k1 k2
E + S === ES --------- E + P k-1
…… sin embargo, esta última reacción también puede ser reversible, y de hecho en la mayoría de las reacciones
bioquímicas lo es.
1. Reversibilidad en el mecanismo de Michaelis-Menten
k1 k2
E + S === ES === E + P k-1 k-2
Ecuación de velocidad para reacciones reversible
Es evidente que el mecanismo de Michaelis-Menten, tal y como lo hemos venido usando, es incompleto, y que debemos considerar
también la reversibilidad de la última reacción. Con lo que el nuevo modelo tendrá la siguiente forma.
k1 k2
E + S === ES === E + P k-1 k-2
d(ES)/dt = k1[E][S] + k-2[E][P] – k2[ES] – k-1[ES]
y considerando condiciones de estado estacionario, tendremos:
d(ES)/dt = 0Luego,
k1[E][S] + k-2[E][P] – k2[ES] – k-1[ES] = 0
d[ES]/dt = k1[E][S] + k-2[E][P] – k2[ES] – k-1[ES] = 0
k1([Eo] – [ES])[S] + k-2([Eo] – [ES])[P] – (k2 + k-1)[ES] = 0
k1[Eo][S] – k1[ES][S] + k-2[Eo][P] – k-2[ES][P] = (k2 + k-1)[ES]
k1[Eo][S] + k-2[Eo][P] = (k1[S] + k-2[P])[ES] + (k2 + k-1)[ES] (k1[S] + k-2[P])[Eo] = (k1[S] + k-2[P] + k2 + k-1)[ES]
Despejando [ES],
Intenten despejar [ES]
Recuerden: [E] = [Eo] – [ES]
1221
21
kkPkSk
EoPkSkES
Como se trata de una reacción reversible, la velocidad neta a la que se forma el producto, P, será igual a la velocidad en el
sentido directo () menos la velocidad en el sentido inverso ():
v = k2[ES] – k-2[E][P]
k1 k2
E + S ES E + P k-1 k-2
PESEokESkv )(22
Sustituyendo el valor de [ES]:
Sumando estas fracciones, y poniendo denominador común, obtenemos un numerador que una vez simplificado conduce a la
siguiente expresión:v
PkkPkSk
EoPkSkEok
kkPkSk
EoPkSkkv )(
1221
212
1221
212
1221
2121
kkPkSk
PEokkSEokkv
En el caso particular en el que [P] = 0,
(dividir numerador y denominador por k1).
¿Les recuerda esta ec. alguna otra?
k1k2[Eo][S] – k-1k-2[Eo][P]v = ------------------------------------------ (k1[S] + k-2[P] + k2 + k-1)
Ecuación exactamente igual a la obtenida con la aproximación del estado estacionario de Brigg y Haldane.
SKm
SVv
max
121
21
kkSk
SEokkv
1
12
2
kkk
S
SEokv
¿Qué forma tomara la ecuación de velocidad (reversible) cuando [S] = 0? .
Si bien, con pleno rigor, [S] debería sustituirse por [So] ya que para [P] = 0, la [S] = [So]
NOTA: Es importante tener en cuenta que esta simplificación es posible porque [P] = 0, y no porque hayamos hecho asunción alguna sobre k-2, ya que k-2[P] = 0 si [P] = 0,
independientemente del valor de k-2.
1221
2121
kkPkSk
PEokkSEokkv
En el caso particular en el que [S] = 0,
dividir numerador y denominador por k-2
k1k2[Eo][S] – k-1k-2[Eo][P]v = ------------------------------------------ (k1[S] + k-2[P] + k2 + k-1)
Ecuación exactamente igual a la obtenida con la aproximación del estado estacionario de Brigg y Haldane.
PKmp
PVv
max
2
12
1
kkk
P
PEokv
122
12
kkPk
PEokkv
Kmp
* La anterior ecuación …
la “ecuación reversible general” de la ecuación de velocidad de Michaelis-Menten.
Esta ecuación, respecto de las anteriores, presenta la ventaja de que no se refiere a ningún tipo de mecanismo concreto, y puede
considerarse como puramente empírica.
De hecho existen mecanismos cinéticos mucho más complejos que los que hemos considerado hasta ahora, y que conducen a
ecuaciones totalmente equivalentes a la que hemos obtenido más arriba.
1221
2121
kkPkSk
PEokkSEokkv
2. Relación de Haldane
Cuando una reacción química está en equilibrio, la velocidad de reacción neta es cero, ya que la velocidad de formación () es
igual a la velocidad de descomposición (), y así, si denominamos [Seq] y [Peq] a las concentraciones del S y del P en el equilibrio, sustituyendo en la “ecuación reversible general”:
Para que esta ec. sea = 0 basta con que:
1221
2121
kkPkSk
PEokkSEokkv
eqeq
eqeq
reordenando,
obtenemos,(k1k2[Eo][Seq] = k-1k-2 [Eo][Peq])
(k1k2[Eo][Seq] – k-1k-2 [Eo][Peq]) = 0
k1k2/k-1k-2 = [Eo][Peq]/[Eo][Seq]
k1k2/k-1k-2 = [Peq]/[Seq]
k1k2 --------- k-1k-2
k-1k2 --------- k-1k2
KmP
= 1 x --------- KmS
k2 x ------ k-1
kcat
k-cat
Luego,
k1k2/k-1k-2 = (kcat KmP)/(k-cat KmS) = [Peq]/ [Seq] = Keq
kespecif./k-especif. = Keq
kcat KmP
---------------- = kespecif. x 1/k-especif. =[Peq]/ [Seq] = Keq KmS k-cat
k1k2 --------- k-1k-2
k-1k2 --------- k-1k2
KmP
= ---------
1 x --------- KmS
k2 x ------ k-1
kcat
k-cat
* Esta relación es válida para cualquier mecanismo reversible y que contemple la formación de un sólo complejo intermedio.
* Para mecanismos más complejos, que contemplen la formación de más de un complejo intermedio se obtienen relaciones más
complejas pero similares.
Relación, muy importante en la cinética enzimática y que se conoce como relación de Haldane.
Permite conocer la constante de equilibrio de la reacción a partir de constantes cinéticas
- La relación de Haldane nos permite obtener la constante de equilibrio, Keq, de la reacción a partir de las constantes cinéticas .
Y por extensión, podemos, también calcular el valor de G’º de la reacción a partir de las constantes cinéticas enzimáticas, ya que:
G’º = -RT ln Keq
Relación de Haldane.
Las constantes cinéticas son fáciles de calcular experimentalmente.
3. Validez de la asunción del estado estacionario
En la deducción de la ecuación de Michaelis-Menten, hemos supuesto que se “alcanzaba un estado estacionario”, en el que
d[ES]/dt = 0.
¿Lo aceptamos tal cual? NO
La ecuación:
d[ES]/dt = k1([Eo] – [ES])[S] – k-1[ES] – k2[ES]
es integrable por sí, si consideramos que [S] es constante.
k1 k2
E + S === ES --------- E + P k-1
NOTA: es instructivo intentar obtener una ecuación de velocidad bajo estas condiciones, es decir, sin admitir la existencia de un
estado estacionario, sobre todo porque esto nos ayudará a entender la validez de esta asunción.
d[ES]/k1[Eo][S] – (k1[S] + k-1 + k2)[ES] = dt
Resolviendo, obtenemos,
at
kkSk
ESkkSkSEok
)(
(ln
211
2111
)(
ln
)(
(ln
211211
211 11
kkSk
SEokt
kkSk
ESkkSkSEok
Calculando el valor de la constante a
,
)(
ln
)(
(ln
211211
211 11
kkSk
SEokt
kkSk
ESkkSkSEok
tkkSk
SEok
ESkkSkSEok
tkkSkSEokESkkSkSEok
SEoktkkSkESkkSkSEok
)((
ln
)(ln(ln
ln)((ln
211211
211211
211211
1
1
11
11
que simplificando y reordenando nos da
Operando y tomando exponenciales a ambos lados, tendremos,
y resolviendo para [ES],
- ((k1[S] + k-1 + k2)[ES]/(k1[Eo][S])) = -1 + e– (k1[S] + k-1 + k2)t
((k1[S] + k-1 + k2)[ES]/(k1[Eo][S])) = 1 - e– (k1[S] + k-1 + k2)t
(k1[S] + k-1 + k2)[ES] = (k1[Eo][S]) (1 - e– (k1[S] + k-1 + k2)t)
tkkSkeSEok
ESkkSkSEok )211(211
1
1 (
)(
)1)((
21
)(
1
2111
kkSk
eSEokES
tkkSk
La velocidad de reacción, como sabemos, viene dada por.v= k2[ES]- Sustituyendo,
v = k2[Eo] ((k1[S]) (1 - e– (k1[S] + k-1 + k2)t))/(k1[S] + k-1 + k2)
Y dividiendo por k1 numerador y denominador,
k2[Eo] ([S] (1 - e– (k1[S] + k-1 + k2)t)) v = ---------------------------------------------- [S] + (k-1 + k2)/ k1)
Km
Vmax
)(
)1)((
21
)(
221
2111
kkSk
eSEokkESkv
tkkSk
Luego,
Vmax ([S] (1 - e– (k1[S] + k-1 + k2)t)) v = ---------------------------------------------- [S] + Km
Cuando en esta ecuación, t se hace muy grande (t -> ), el término exponencial tiende a e-, es decir a cero, y la ecuación anterior se transforma en una ecuación exactamente igual a la
de Michaelis-Menten.
Ahora bien, el que el término exponencial pueda llegar a ser despreciable dependerá también en gran parte del valor de (k1(S) + k-1 + k2), así pues,desde un punto de vista real, ¿cuánto tiene
que vale t para que esto se cumpla?
¿Qué hará falta para que esta ecuación sea igual a la que obtuvimos a partir de la presunción de estado estacionario?
= 0
Un sencillo calculo, demuestra que para valores de t > 5 ms (5 10-3 s)
El término exponencial tiene un valor < 0,01
Veámoslo,Si admitimos para (k1(S) + k-1 + k2) un valor de 1000 s-1, valor por otro lado razonable desde un punto de vista práctico, obtendremos:
-para t =4 ms -> e-4 = 0,018-para t = 5ms -> e-5 = 0.007
* En otras palabras, tras unos pocos de milisegundos, ambas ecuaciones son prácticamente indistinguibles
desde un punto de vista práctico.
En la deducción de esta última ecuación hemos supuesto que la [S] era constante, lo que no es totalmente cierto, pues al
comenzar la reacción S comienza a consumirse.
Sin embargo, si partimos de una situación en la que [S] >> [Eo], como generalmente hacemos cuando trabajamos en condiciones
de estado estacionario, la cantidad de S consumido durante el tiempo en que tarda en alcanzarse el estado estacionario, es
insignificante, por lo que podemos despreciarlo sin miedo alguno a cometer o introducir algún error o inexactitud.
RESUMEN
Con la condición de estado estacionario se pueden obtener una ecuación cinética que describe los procesos enzimáticos reversibles
1221
2121
kkPkSk
PEokkSEokkv
Se convierte en una ecuación cinética irreversible cuando se utilizan concentraciones de Productos igual a cero
Relación de Haldane
Permite conocer la constante de equilibrio de la reacción a partir de constantes cinéticas Esta relación es válida para cualquier mecanismo reversible y que contemple la formación de un sólo complejo intermedio
Keqk
k
espec
espec
Se ha demostrado la validez del modelo del sistema estacionario
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