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Tendencias metodológicas en el análisis de residuos.
Nuevas herramientas para el aumento de la productividad y la confianza en los resultados
Conferencia Web
Jose Juan RiveroEspecialistas de producto
Agilent Technologies, Spain
25 de Septiembre de 2020
Indice
Introducción
Aumento de productividad. Acelerando el análisis de residuos
Consideraciones sobre la técnica de Alta Resolución
Ventajas de la Alta Resolución
• Confirmación de falsos positivos
• Identificación de compuestos desconocidos
Indice
Introducción
Aumento de productividad. Acelerando el análisis de residuos
Consideraciones sobre la técnica de Alta Resolución
Ventajas de la Alta Resolución
• Confirmación de falsos positivos
• Identificación de compuestos desconocidos
Situación actual. Reto analítico
Niveles;
• 0.001-10 mg/Kg
Múltiples matrices
FDA
EPA
EU
Diversidad química:
• Compuestos apolares, polares, volátiles, no volátiles
Orígenes diferentes:
• Naturales
• Procesos industriales o de transformación
• Tratamientos para combatir las plagas
Múltiples técnicas:
• Cromatografía de gases/Líquidos
Desarrollo de estrategias eficaces mediante análisis conjunto por GC/MS/MS y LC/MS/MS y que superen las limitaciones actuales de muchas normativas(FDA/EPA/EU)
• Cuantificación, identificación y confirmación simultáneas
• Aumentar el número de residuos analizados
• Acortar los tiempos de análisis
• Mayor productividad, sensibilidad y calidad de resultados INCLUSO ENTRE MATRICES
Desarrollo de estrategias eficaces para determinación de residuos no target o desconocidos mediante análisis por GC/Q-TOF y LC/Q-TOF
• Cuantificación, identificación y confirmación simultáneas
• Aumentar el número de residuos analizados más allá de los conocidos.
• Realizar screening no dirigidos.
Aumentar la productividad con un software MS intuitivo y potente
• Revisión rápida y automática de resultados e informes: Más datos con menos recursos
• Cumplimiento de las normativas Comunitaritas e Internacionales
Tendencias en las estrategias del análisis de trazas de residuos
• El Fipronil es ilegal para la producción de alimentación
humana.
• Millones de huevos y productos derivados contaminados.
• Se reportaron productos contaminados en toda Europa a
excepción de dos países.
• Los huevos contaminados posiblemente se habían
comercializado durante un año.
https://ec.europa.eu/jrc/en/publication/brochures-leaflets/fipronil-eggs-factsheet-december-2017
https://www.sgs.com/en/news/2017/10/fipronil-in-eggs-another-food-issue-in-europe
Huevos contaminados con Fipronil en 2017 en Europa
Detectores selectivos
ECD/NCD/FID
Confirmación
con Masas
Cuantificación y Confirmación
con Masas/Masas
Aumento productividad, Inicio del LCMS
Mayor numero de materias activas
Aumento productividad. Popularización de los sistemas LCQQQ
Mayor numero de materias activas y acorte tiempos de análisis
Aumento sensibilidad manteniendo un mayor numero de materias activas y acorte tiempos de análisis
25 materias activas 1 hora 2 inyecciones
25 materias activas 1 hora 1 inyección (ppb altas)
60 materias activas 1 hora 1 inyección (±25 ppb)
125 materias activas 1 hora 1 inyección (±25 ppb)
500 materias activas 20 min (±5 ppb)
700 materias activas 20 min (±2 ppb)
80’s
90’s
2005
2010
Hoy dia
Documento SANTEDirectrices de la comisión Europea (Actual SANTE/12682/2019)
Indice
Introducción
Aumento de productividad. Acelerando el análisis de residuos
Consideraciones sobre la técnica de Alta Resolución
Ventajas de la Alta Resolución
• Confirmación de falsos positivos
• Identificación de compuestos desconocidos
Analizador P&EP 4.0GC/MS/MS Pesticides and Environmental Pollutants Analyzer
con ~1100 compuestos y ~8500 transiciones optimizadas incluyendo más de 710 pesticidas y productos de degradación, y otros contaminantes medioambientales.
Base de datos MRM
que facilita la creación de métodos de adquisición y cuantificación dMRM
GUI
separación con una mayor grado de confianza en la identificación y cuantificación de picos (CF y CP)
RetentionTime Locked
para tener una mayor versatilidad en modos de inyección (LVI)
Inyector Multimode
Backflush para obtener ciclos más rápidos de análisis y reducción de los mantenimientos del sistema
Tecnología de flujo capilar
Analizador de Pesticidas y Contaminantes ambientales 4.0
Ejemplo 7010: ~250 pesticidas en 20 min(0,5µl iny)
App Note 5991-5507EN
1ppb inyectada
Mejorando y construyendo sobre plataformas confiables
Horno de calentamiento por convención Horno de calentamiento directo
Guard chip Desechable
Columnas sin corte
Calentamiento directo
Modular Intuvo flow chips
Innovando en la productividad de GCUna nueva forma de hacer GC
Conexiones en clic y libres de férrulas
Cambios rápidos de columna
No cortes de columnas
¿Hasta donde se pueden acortar las metódicas?Intuvo/7010. (203 plaguicidas)
https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00216-017-0723-x
75 componentes coeluidos
60 componentes coeluidos
45 componentes coeluidos
Separación pares críticos e interferencias
Mismas transiciones ciproconazol y
clorobencilato, buena separación
Interferencia de matriz mejor resuelta
con rampa más rápida
Pocos puntos
Datos de Validación 12.4 min
2-Phenylphenol (Rt = 6.36 min) Chlorpyrifos-methyl (Rt = 9.14 min)
Antes de cambiar guard-chip
Después de cambiar guard-chip
No se necesita ajustar el Rt (Relock)
GC-Intuvo: Ventajas
Fenbuconazol (Rt = 16.41 min) Fludioxonil (Rt = 11.61 min)
Antes de cambiar guard-chip
Después de cambiar guard-chip
Mejora de la forma de pico
GC-Intuvo: Ventajas
Evolución de la columna
GC-Intuvo: Ventajas
Columna y Guard-chip nuevosColumna y Guard-chip
(500 inyecciones)Columna (500 inyecciones)
y Guard-chip nuevo
Mantenimiento más fácil y rápido cambiando guard-chip y columnas
GC-Intuvo: Ventajas
GC-7890 (antes de cortar columna) GC-Intuvo (antes de cambiar guard-chip)
Fludioxonil
Mantenimiento más fácil y rápido cambiando guard-chip y columnas
GC-Intuvo: Ventajas
Mantenimiento 7890 GC GC-Intuvo # Inyecciones
Cambiar Septum 1 min 1 min 250
Cambiar Liner 1 min 1 min 100
Cortar columna vs Cambiar
guard-chip15 min 2 min 500
Ajustar Rt 20+5 min 0 min 500/0
Cambiar columnas 20 min + vacío (2 h) 2 min 2500/2500
Tiempo total (min) 63 min + 2 h 6 min
Mantenimiento más fácil y rápido cambiando guard-chip y columnas
GC-Intuvo: Ventajas
Dynamic MRMAdquisicion de datos más eficiente
Más fácil de ver resultados cromatográficos en MassHunter Análisis Cualitativo
TS Cromatogram dMRM CromatogramaMiel ecológica
Dynamic MRM (dMRM)Un modo más intuitivo de usar MS
Más fácil de crear y editar métodos
• Añadir componentes es sencillo
• No trabaja con segmentos de tiempo
Métodos más eficientes
• optimiza los Dwell time
• Mejora la respuesta
Completamente automatizado
• Simle y sencillo
Dynamic MRM (dMRM)Interface de usuario
Tabla de compuestosVer todos los compuestos a la vez y
ordenar según sea necesario
Seleccione la
velocidad de datos
deseada aquí ...
…dwell times se ajusta
automáticamente aquí.
Encuentre y corrija fácilmente
las zonas "congestionadas"
JetClean Self-Cleaning Ion Source
• Respuesta constante durante meses o incluso años
• Reduce o elimina el tiempo de inactividad para la limpieza manual de fuentes
Fuente de iones autolimpiable JetCleanResultados cromatográficos de 2,5 ppb en miel ecológica
Sin
JetC
lean
Con J
etC
lean
Flu
jo=
0.1
5 m
L/m
inDBCP
MW 234
RT: 4.503min
RT: 4.636min
Parathion-methylMW 451
RT: 18.113min
RT: 18.091min
Flucythrinate-1MW 451
RT: 33.798min
RT: 33.776min
En modo de limpieza en línea:
• Mejora de la forma de los picos y de la línea de base para compuestos pesados que eluyen más tarde.
• Comparable% RSDs
• Sólo se observó una pequeña reducción en la respuesta máxima
Indice
Introducción
Aumento de productividad. Acelerando el análisis de residuos
Consideraciones sobre la técnica de Alta Resolución
Ventajas de la Alta Resolución:
• Confirmación de falsos positivos
• Identificación de compuestos desconocidos
Full Scan o Análisis Dirigido (Target)
Análisis por Espectrometría de Masas
La medida genera un espectro. La
Resolución es la anchura espectral
de cada especie transmitida.
Solo se transmite la estrecha ventana
espectral escogida.
La Resolución es la anchura de la ventana
escogida.
HRMS QTOFTradicionalmente
Triple Cuadrupolo
NECESIDAD y PROBLEMATICAOBJETIVO
Tecnica de Screening: Consideraciones
Obtener toda la información disponible de la muestra
Mínima manipulación de la muestra
Factores inherentes a la química de los compuestos (LC/GC)
Factores inherentes a la detección
Limitaciones de sensibilidad
Multiples familias de compuestos
Buena seleccion de la preparacion de la muestra
Información complementaria entre técnicas separativas
Plataformas de QQQ vs QTOF
Correcta selección de la técnica y
de preparación de la muestra
Estrategias de trabajo TRADICIONALES
Análisis de conocidos
en alcance
Análisis de desconocidosAnálisis de conocidos
fuera alcance
Análisis no
dirigidos
Análisis
dirigidos
Estrategias de trabajo
* Análisis de conocidos
y sospechosos
• Adquisición NO dirigida
Full Scan
* Procesado dirigido
Patrones / Librerías
Análisis Dirigido *
Screening Cuantitativo Screening Cualitativo
Screening Cuantitativo
y Cualitativo
Single/Triple Cuadrupolo Single/HRMS QTOFHRMS QTOF
* Dirigido por el contenido de la librería
* Análisis de conocidos
en alcance
• Adquisición dirigida
MRM
* Procesado dirigido
Patrones
Análisis dirigido
* Análisis de sospechosos
(conocidos, fuera de
alcance)
*Adquisición NO dirigida
Full Scan
* Procesado dirigido
Librerías
Análisis dirigido*
Estrategias de trabajo
Capacidad de Análisis Retrospectivo
Facilidad de inclusión de nuevos compuestos sin
desarrollo
Capacidad de ver “Desconocidos”, ¿Qué
más hay en mi muestra?
Ventajas Adicionales
Tecnica de Screening
• Si es posible, pero…
• Alcanzar la mayor cantidad de analitos disponibles – LIMITACION QQQ
• Uso de librerías MSMS – INTERFERENCIAS MATRICIALES
• Tecnica de deconvolución – SOLO DISPONIBLE FULL SCAN
• Necesidad de existencia de estándares – METABOLITOS o DEGRADACIONES
• Alta selectividad gracias a la alta resolución
• Interferencias matriciales se minimizan
• Completas bases de datos en masa exacta
• GC vs LC: Información estructural del EI vs Pattern Isotópico. >>> Alta fiabilidad
• Complementariedad de ambas técnicas
• Análisis retrospectivo
• Volumen de Datos : Software de procesado Rápido y Fiable.
HRMS QTOF
Triple Cuadrupolo
Técnicas de Screening
• Menor manipulación de la muestra:
• Inyección directa, o
• Extracción lo mas simple posible para no modificar la muestra
• Capacidad de extracción genérica
• Inyección en sistemas de alta resolución debido a la gran selectividad de la masa exacta
Requerimientos
HRMS QTOF
Análisis por Espectrometría de MasasFull Scan o Análisis Dirigido (Target)
(Q-)TOFTriple Cuadrupolo
Beneficios:
- Alta resolución espectral
- Exactitud de masas de ppm
- Capacidad de Análisis retrospectivo
Beneficios:
- Estándar en cuantificación
- La más alta Sensibilidad
- Excelente intervalo dinámico
Limitaciones:
- Baja resolución (unidad) espectral
- Baja exactitud de masas
- SIN capacidad de Análisis retrospectivo
Limitaciones:
- Sensibilidad hoy comparable a los QQQ.
- Intervalo dinámico comparable.
SANTE/11945/2015 (actual SANTE/12682/2019)
Criterio:
• Full Scan
• 2 ions @ 5 ppm
• Pico “Real”
• Co-elucion
• Confirmacion con standard
Screening de Pesticidas mediante GCQTOF
• Sistema GC8890B + QTOF 7250
• Backflush
• RTL
• MassHunter Analysis Screener
• PCDL (Espectros en HR y RTL)
Pesticide Screener
Nota de aplicación: 5991-5894EN
7250 GC-Q-TOF-MS
▪ Modo de Inyeccion: Solvent Vent (EtAc)
Ultra-inert Splitless inlet liner, with a glass wool frit
▪ Columnas: 2 x HP5MS-Inerte 15mx250µmx0.25µm
Condiciones del GC
▪ Tiempo de analisis: 20 min
▪ Tiempo de Post run (backflush): 3 min (310 ºC)
▪ Linea de transferencia: 280ºC
▪ RTL (Clorpirifos metil)
▪ Flujo constante 1ml/min
Condiciones del MS
▪ Resolucion de masas: 40.000 FWHM (m/z 263)
▪ Tipo de Ionizacion: EI (70 eV)
▪ Temp. Fuente: 260 ºC
▪ Modo de Adquision: Full Scan m/z rango 60-500 amu
▪ Veloc. Acquisition: 3 spectra/s (333.33 ms/spectrum)
0
50
100
150
200
250
300
350
0 5 10 15 20 25
Te
mp
(ºC
)
Run time (min)
Programa de horno
Condiciones Experimentales
Procesado de datos para extraer el máximo de información de “profile data” para un análisis más rápido
Quant 10: Conversión de Datos SureMass
Datos
Profile
Conversión de
Datos SureMassDatos
SureMass
– 3-5 min por muestra
– Ocurre automáticamente (*)
tras la adquisición
Óptimo en exactitud de masa
Históricamente más lento en
el procesado
Mejora en la velocidad de
procesado x 10
Exactitud de Masa a alta
abundancia
(*) Para el G6546. También compatible con
modelos anteriores de QTOF con un macro
post-adquisición
25/9/2020
Screening Target Cuantitativo y Cualitativo: Patrones y SospechososDesarrollo del Método
Preparación Muestra
• Sospechosos y patrones
Adquisición
• Full Scan GC
• Modo Q-RAI
• Modo All Ions
Crear Método desde PCDL
• Establecer Niveles de Calibración y parámetros de alarma
Analizar el Batch con Screener Tool
• Rápido análisis
• Fácil Informe
41
25/9/2020
Screening Target Cuantitativo y Cualitativo: Patrones y SospechososDesarrollo del Método
Analizar el Batchcon Screener Tool
• Rápido análisis
• Fácil Informe
42
25/9/2020
Screening Target Cuantitativo y Cualitativo: Análisis en Rutina
Preparación Muestra
• Sospechosos y patrones
Adquisición
• GC Full SCan
• Modo Q-RAI
• Modo All Ions
Analizar el Batch con Screener Tool
• Rápido análisis
• Fácil Informe
43
Indice
Introducción
Consideraciones en la preparación de la muestra
Consideraciones sobre la técnica de Alta Resolución
Ventajas de la Alta Resolución:
• Confirmación de falsos positivos
• Identificación de compuestos desconocidos
GC-QqQ-MS/MS
50 µg/kg Honey Sample
Ratio 40.7
Rt 8.94 min
Fenazaquin
Ratio 31.4
Rt 8.90 min
Fenazaquin
False positive
Fenazaquin in Honey matrix
Confirmación de falsos positivos
GC-QTOF
50 µg/kg Honey Sample
Fenazaquin in Honey matrix
Confirmación de falsos positivos
Rt 14.21 min
Mass Accuracy: 1.17 ppm
<5ppm
Fenazaquin
Rt 14.14 min
Mass Accuracy: 12.30 ppm
>5ppm
Fenazaquin?
Flujo de trabajo de Targets y sospechosos
September 25, 202047
Adquisicion en full-spectra
Screening de Desconocidos
Deconvolucion seguido por comparación en librerías
públicas…Ahora con Masa Exacta!
No
Metodo en Target
Screening Cuantitativode Targets
Screening de Sospechosos
Si¿Calibrado?
48
C14H20ClNO2Masa Exacta
Paso 1: Busqueda en libería:Formulas de Fragmentos de la librería (NIST, etc.)
Step 2: Comparación de masa exactaValor Medido (Source) comparado con la masa exacta más cercana (librería)
Maxima confianza en masa exacta con librerías de Masa Unitaria!
IDSeptember 25,
2020
c
Unknowns Screening Analysis of Beeswax Samples. NIST Library (Mass spectra of 240.000 compounds)
PCDL of Agilent (Accurate mass spectra and Retention time of 1.020 pesticides) Thymol Identification
C10H14O4 (mass 150.10447)
Library
spectrum
Sample
spectrum
Thymol
GC-QTOF-MS (Agilent 7250)
GC-QTOF-MS (Agilent 7250)Quantitative Analysis of Thymol in Beeswax Samples.
LINEARITY (Check from six levels)
R2 = 0.9994 > 0.99
Organic varroacide:
• Thymol
Thymol in Beeswax matrix
100 µg/kg Beeswax Sample
GC-QTOF-MS (Agilent 7250)
Mass Accuracy:
Rt 4.902 min
Thymol
Conclusiones finales
Situación
● Laboratorios de residuos requieren un alto rendimiento, no solo en
numero de muestras sino en numero de materias activas a analizar.
●Alta fiabilidad en Positivos pero también en los Negativos
●Capacidad de análisis retrospectivo
Retos
●El gran numero de matrices diferentes y analitos a abarcar
●El procesado de un lote de muestras puede ser una labor ardua
●Varios equipos para cubrir múltiples matrices
●Complementariedad de las técnicas de Alta Resolución.
Claves del HR
Resumen: Situacion y futuro del screening de residuos
●Posibilidad de abordar análisis Cualitativo y Cuantitativo a la vez
●Mejoras del software de trabajo en rutina
●Alta sensibilidad de los equipos actuales.
●Alta velocidad en procesado y manejo de datos.
…por su atención
jose.rivero@agilent.com
Teléfono de atención
902116890
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