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TESIS DOCTORAL

ANALISIS SEROLOGICO Y MOLECULAR DEL SISTEMA

HLA Y SU RELACION CON LA SUSCEPTIBILIDAD A

LUPUS ERITEMATOSO SISTEMICO (LES) EN LA

POBLACION ESPAÑOLA.

AUTOR M” Dolores de Juan Echávarri

DIRECTOR: Dr. Antonio Amaiz Villena

LUGAR DE RIZALIZACION: Servicio de Inmunologia

Hospital Universitario

“12 de Octubre”

FACULTAD DE FARMACIA

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

1994

1

Amis padres, con todo mi cariño.

II

AGRADECIMIENTOS

INDICE

INTRODUCCION

1. SISTEMAHLA ................................................ 1

1.1. El sistema HLA. G.eneralidades. ............................. 1

1.2. Antígenos HLA .......................................... 2

1.2.1. Antígenos de clase 1 ................................ 2

1.2.2. Antígenos de clase II ............................... 3

1.2.3. Antígenos de clase III: componentes de la vía clásica y alternativa

del complemento. ................................. 5

1.2.4. Otras proteinas relacionadas con el sistema H LA. .......... 6

1.3. Genes del sistema HLA. ................................... 6

1.3.1. Estructura de los genes I-ILA de clase 1 .................. 7

1.3.2. Estructura de los genes de clase II ..................... 7

1.3.3. Estructura de los genes de clase III ..................... 9

1.3.4. Otros genes de la región de clase III .................... 10

1.4. Estudio del polimorfismo del sistema HLA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

1.4.1. Polimorfismo serológico del sistema HLA. . . . . . . . . 11

1.4.2. Polimorfismo genético de restricción: RESTRICTION

FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (RFLP) . . . . . . ll

1.4.3. Asociación de antígenos HLA de clase II- RFLPs y polimorfismo de

secuencia de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2. SISTEMA HLA Y ENFERMEDAD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2.1. Mecanismos de asociación HLA-enfermedad. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

2.2. Inmunogenética HLA de las enfermedades del tejido conectivo. . . . . . . 16

3.SUCEPTIBILIDAD GENETICA A LUPUS ERITEMATOSO SISTEMICO (LES98

3.1. El sistema mayor de histocompatibilidad y LES . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

3.1.1. Déficit de factores del complemento en el LES. . . . . . . . . . . . 23

3.1.2. Sistema HLA, aspectos clínicos y serológicos del LES. . . . . . . 25

OBJETIVOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

PACIENTES Y METODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

1. DETERMINACION DEL FENOTIPO HLA .......................... 29

1.1. Antígenos de clase 1: HLA-A,-B,-C,-Bw4 y Bw6 .................. 29

1.2. Antígenos de clase II: HLA-DR, -DQ. . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

1.3. Determinación de los alotipos del complemento: factores Bf, C2 y C4. 31

2. DETERMINACION GENICA (RFLP) DE LOS ALELOS DE LOS LOCI HLA-

DRB, DQAI, DQBl (clase II) y C4 (clase III). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

2.1. Obtención de sondas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

2.1.1. Amplificación de sondas, lisado y obtención de plasmidos puros 32

2.1.2. Digestión de plásmidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

2.1.3. Electroelución y purificación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

2.1.4. Sondas utilizadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

2.2. Obtención de fragmentos de restricción

(Southern blot) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

2.2.1. Extracción de ADN genómico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

2.2.2. Digestión con enzimas de restricción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

2.2.3. Electroforesis en geles de agarosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

2.2.4. Transferencia a filtros de nylon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

2.2.5. Marcaje radiactivo de las sondas (random priming) . . . . . . . . 40

2.2.6. Hibridación de filtros de nylon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

2.2.7. Exposición y revelado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

2.2.8. Deshibridación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

2.3. Interpretación de los patrones de RFLP de los loci HLA-DRB,DQA,DQB

(clase II) y C4 (clase III). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

2.3.1. Patrones de RFLP DRB/Taq 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

2.3.2. Patrones de RFLP DQA/Taq 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

2.3.3. Patrones de RFLP DQB/Taq 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

2.3.4. Patrones de RFLP C4 y 21-OH/Taq 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

3. ASIGNACION DE SECUENCIAS DEL EXON 2 DE DQAl Y DQBl A PARTIR

DE LOS RFLPs de HLA-DQ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

4. DETERMINACION DE AUTOANTICUERPOS ANTI- NUCLEARES EN

SUERO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

4.1. Inmunofluorescencia indirecta (IFI). Determinación de anticuerpos anti-

nucleares y anti- DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

4.2. Determinación de anticuerpos anti-antígenos extraibles del núcleo

(ENA). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

4.2.1. Determinación de ENA por CIE e ID. . . . . . . . . . . . . . . . . 48

4.2.2. Determinación de ENA por Inmunoblotting . . . . . . . . . . . . 49

S.SELECCION DE INDIVIDUOS ................................... 50

5.1. Sanos no relacionados ..................................... 50

5.2. Pacientes afectos de Lupus Eritematoso y familias. ................ 50

5.2.1. Clasificación de los enfermos en grupos según aspectos clínicos.51

6. ANALISIS ESTADISTICO ....................................... 52

6.1. Cálculo de riesgo relativo (R.R.) y fracción etiológica (6). .......... 53

6.2. Programa estadístico ...................................... 54

7. PREPARACION DE SOLUCIONES UTILIZADAS .................... 56

RESULTADOS .............................................. ..5 9

1. FENOTIPOS Y GENOTIPOS ESTUDIADOS ......................... 59

1.1.

1.2.

1.3.

1.4.

1.5.

1.6.

Fenotipos HLA-DR , DQ y alogenotopos obtenidos en una muestra de

individuos sanos no relacionados. ........................... 59

Fenotipos HLA-DR y DQ y alogenotopos obtenidos en unas muestra de

enfermos afectos de LES. ................................ 59

Secuencias de DQAI y DQBI. ............................. 59

Correlación tipaje HLA clase II, serologia-RFLPs. .............. 59

Descripción de “nuevos ” DNA- HLA DR-RFLPs .............. 60

Alotipos de los factores C4 y Bf del complemento. .............. 62

1.7. Genes del factor C4 y 21-OH. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

2. PRINCIPALES MANIFESTACIONES CLINICAS Y SEROLOGICAS

(AUTOANTICUERPOS) EN LOS ENFERMOS DE LES. . . . . . . . . . . . 63

3. ASOCIACIONES MAS RELEVANTES DEL SISTEMA HLA Y LES EN UN

GRUPO DE LA POBLACION ESPAÑOLA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

3.1. Antígenos de clase 1,II y LES (GNPD+ y GNPD-) . . . . . . . . . . . . . . . . 63

3.1.1. Asociaciones serológicas significativas . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

3.1.2. Frecuencia de alogenotopos de DRB, DQA y DQB. . . . . . 64

3.1.3. Análisis de secuencias DQA y DQB . . . . . . . . . . . . . . . . 65

3.2. Antígenos de clase III y LES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

3.2.1. Frecuencia de alotipos Bf y C4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

3.2.2. Distribución de genotipos C4 y 21-OH . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

3.3. Valores de la fracción etiológica (6) y riesgo relativo (RR) en los

diferentes marcadores de susceptibilidad a LES. . . . . . . . . . . . . . . . 67

3.4. Asociaciones mas relevantes entre el sistema HLA y las manifestaciones

delLES.............................................. 67

3.4.1. Asociación HLA-aspectos clínicos del LES . . . . . . . . . . . . . . . 69

3.4.2. Respuesta de autoanticuerpos mediada por antígenos HLA de clase

II. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

3.5. Lupus Eritematoso Sistémico y/o sus manifestaciones clínicas en 10 familias

con al menos un afecto de LES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

DISCUSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...74

1.

2.

3.

4.

5.

Contribución del sistema HLA a la susceptibilidad a padecer LES. . . . . . . 74

Ausencia de concordancia entre marcadores HLA que definen la susceptibilidad

a LES en diferentes poblaciones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

Factores del complemento implicados en la patología renal GNPD en LES. 79

Inmunogenética de las respuestas autoinmunes anti-Sm/RNP y Ro/La. . . . . 81

Estudios de familias multiplex. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

CONCLUSIONES ............................................. 83

REFERENCIAS ............................................... 85