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Tesis Isabel Fortes
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Isabel Mara Fortes Cuenca
Huspedes alternativos de tomato chlorosis virus: epidemiologa,
patologa y diversidad gentica en pimiento, presencia en patata y desarrollo
de un sistema gentico en Nicotiana benthamiana
Mlaga, 2010Tesis doctoral
Facultad de Ciencias Departamento de Biologa Celular, Gentica y Fisiologa
Huspedes alternativos de tomato chlorosis virus: epidemiologa, patologa y diversidad gentica en pimiento, presencia en patata y desarrollo de un
sistema gentico en Nicotiana benthamiana
Memoria de Tesis Doctoral presentada por Isabel Mara Fortes Cuenca
para optar al grado de
Doctora en Biologa
Director Jess Navas Castillo
Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterrnea La Mayora IHSM-UMA-CSIC
Mlaga, 2010
Don Jess Navas Castillo, Doctor en Ciencias Biolgicas, Investigador Cientfico del Consejo Superior de Investigaciones Cientficas y Profesor Asociado del Departamento de Biologa Celular, Gentica y Fisiologa de la Universidad de Mlaga, INFORMA que la Licenciada Isabel Mara Fortes Cuenca ha realizado bajo su direccin en el Laboratorio de Virologa de la Estacin Experimental La Mayora, integrada actualmente en el Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterrnea La Mayora (IHSM-UMA-CSIC) el trabajo que con el ttulo Huspedes alternativos de tomato chlorosis virus: epidemiologa, patologa y diversidad gentica en pimiento, presencia en patata y desarrollo de un sistema gentico en Nicotiana benthamiana se presenta en esta memoria y que constituye su Tesis Doctoral para aspirar al grado de Doctora en Biologa.
Y para que as conste y tenga los efectos que correspondan en cumplimiento de la legislacin vigente, firma el presente informe en Algarrobo-Costa (Mlaga), junio de 2010.
Fdo. Dr. Jess Navas Castillo
D. Jos Becerra Ratia, Director del Departamento de Biologa Celular, Gentica y Fisiologa de la Universidad de Mlaga,
Autoriza la presentacin de la Tesis Doctoral titulada Huspedes alternativos de tomato chlorosis virus: epidemiologa, patologa y diversidad gentica en pimiento, presencia en patata y desarrollo de un sistema gentico en Nicotiana benthamiana, realizada por la Licenciada Isabel Mara Fortes Cuenca para optar al Ttulo de Doctora en Biologa.
Mlaga, junio de 2010
Fdo. Jos Becerra Ratia
Este trabajo se ha llevado a cabo en el Laboratorio de Virologa de la Estacin Experimental La Mayora, integrada actualmente en el Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterrnea La Mayora (IHSM-UMA-CSIC), gracias a una beca predoctoral de Formacin de Personal Investigador del Ministerio de Educacin y Ciencia y ha sido financiado por los proyectos de los Planes Nacionales de I+D+I AGL2004-06959-C04-01 y AGL2007-66062-C02-01/AGR.
AGRADECIMIENTOS
AGRADECIMIENTOS
Bueno, pues ya estoy delante del orderandor para escribir los agradecimientos. Esto es difcil para m, pues quien me conoce sabe que no me gusta mucho expresar mis sentimientos. As que mi agradecimiento es mucho mayor que el que puedo expresar, a todas las personas que de un modo u otro me habis ayudado durante todos estos aos y habis hecho que en mi estancia en La Mayora haya distrufado muchsismo, tanto en los momentos de trabajo como en otros.
Gracias Jess, por confiar en m, por estar siempre disponible, ayudarme en todo y por darme esta oportunidad que para m ha significado mucho no slo a nivel profesional sino en lo personal.
Gracias Enrique por todos tus consejos, disponibilidad y ayuda.
Por supuesto, a quienes tengo que agradecer muchsimas cosas son a mis compaeros de Virologa. Muchas gracias Mara Victoria porque sin t el laboratorio no funcionara igual, gracias por preocuparte siempre por m y todos nosotros y por tu cario. Gracias Carmen por ayudarme tanto en el da a da en el laboratorio (gracias por ayudarme con tus consejos con el clon infectivo) y por estar siempre dispuesta con una sonrisa a contestar cualquier duda. Gracias Elena por tus consejos con las plantas y las inoculaciones, (fuiste la que me ense a coger mosca) y por hacerme reir con tus cosas de petarda. Gracias Beln por la tranquilidad que transmites y porque has trado la cordura al laboratorio, que a veces estamos todos un poco locos. Gracias Anelise por ser como eres, me ha encantado ser tu compaera de bancada, y muchas gracias por nuestras charlas. Eres una maqui. Gracias Juan por escucharme alguna vez que otra y ayudarme con tus consejos. Gracias Reme por ser siempre tan detallista, por ayudarme cuando lo he necesitado y no voy a olvidar nuestro momento pizza en el hotel de Almera cuando fuimos de muestreo. Gracias Diego por todas las charlas, confidencias y agobios que hemos compartido durante todos estos aos. Debajo de esa fachada, en el fondo se esconde una buena persona. Cuando lleg a La Mayora fue Helena la que me ense lo que estaba haciendo hasta que ya despegu yo sola, como ella me dice. Gracias Helena por estar siempre dispuesta a ayudar, por haber compartido tantos momentos juntas en el transcurso de esta tesis y haber sido la alegra y chicharrilla del laboratorio. Gracias Patri por tu alegra y tus abrazos. Gracias Gloria, ya que mi tesis contnua tu trabajo, y por ayudarme siempre en todo lo que he necesitado. Gracias a Roco por ayudarme con las plantas y las inoculaciones. Gracias Paco, el ltimo en llegar, por lo que me he redo contigo y los videos de youtube que me enseas para distraerme un ratito.
Gracias a gente que ha estado o est en el laboratorio de estancia, a Rita, Kelly, Elvira y Leo, con los que he compartido risas y buenos momentos.
En estos ltimos meses, desde que me sent a escribir esta tesis he estado en el cuartito y he compartido mucho tiempo y momentos con gente de Fruti. Gracias a Librada por ayudarme en lo que he necesitado, por aguantar mis locuras y mis canciones horteras. Gracias a Caro por tu alegra y simpata, me he redo mucho con vosotras. A Jorge por tus puntos que an hoy me sorprenden.
Gracias a Emilio y Fernando por tantos momentos que recuerdo con vosotros en La Mayora. Gracias Emilio por la alegra que transmites, por tu comprensin y por decirme que soy..( ja ja). Gracias Fernando por los ratos de charla, tus confidencias, por ayudarme en tantas cosas y aguantarme cuando te he dado la tabarra sobre todo con los problemas del ordenador. Sin vosotros dos La Mayora ya no es lo mismo.
Quera dar las gracias a gente que me ha ayudado cada ao en los muestreos, tanto a los tcnicos: Manolo Berenguer, Rafa Gmez y los tcnicos de Almera y Murcia, como a todos los compaeros que me han acompaado y ayudado: Helena, Anelise, Reme, Jess, Juanfra.
Gracias Mara Jos, por preocuparte siempre por cmo me va. Mil gracias a Severiano, Miguel ngel y Gonzalo por ayudar tanto en los invernaderos y ser tan eficientes. A Fali y Marta, por ayudarme con la estadstica. Gracias Antonio Cordn por atenderme siempre que lo he necesitado y resolverme mis dudas.
Gracias al resto de gente de Fruticultura, Mejora y Micologa y resto de La Mayora con los que he compartido algn momento, comidas, desayunos, charlas, y que sera difcil nombrarlos a todos: Mariola, Yolanda, Toi, Luis, Gabi, Xabi, Paola, Lourdes, Davinia, Roco, Carmelina, Pablo.
Gracias a Lola por tantsismas cosas, por ayudarme tanto, por haber compartido tantas cosas contigo y por informarme de la beca.
Gracias a los que sin formar parte de La Mayora, os habis preocupado por m, habis intentado comprender lo que hago en mi trabajo y me habis hecho pasar buenos momentos. Gracias a Juan y Vero por su apoyo.
Gracias a la familia de Seba por preocuparse siempre por m.
Gracias a mi hermano, Inma y mis sobrinos por darme tantos momentos de alegra.
A mis padres tengo muchsimas cosas que agradecerle, prcticamente todo lo que soy. Gracias pap y mam porque me habis enseado muchos valores en esta vida, me habis ayudado y me segus ayudando tanto que jams podr agradecerlo suficientemente.
A ti Seba te doy las gracias por apoyarme cada da, quererme muchsimo, subirme el nimo cuando lo he necesitado y hacerme sentir siempre especial.
Slohacefaltaquedisfrutesdepequeasalegrasparaquetellevenaunagranfelicidad
AmispadresASeba
LLegar a la meta no es vencer, lo importante es el camino y en l, caer, levantarse, insistir, aprender
RESUMEN
RESUMEN
El objetivo general de esta tesis doctoral es ampliar nuestro conocimiento
sobre el amarilleo del tomate, una enfermedad viral emergente en muchas zonas del
mundo, causada por dos virus pertenecientes al gnero Crinivirus (familia
Closteroviridae), tomato chlorosis virus (ToCV) y tomato infectious chlorosis virus
(TICV). En espaa, ToCV es el virus prevalente asociado a los amarilleos de tomate.
ToCV se transmite por tres especies de mosca blanca (Bemisia tabaci, Trialeurodes
vaporariorum y T. abutilonea ) y causa importantes epidemias en tomate en el sur y
sudeste peninsular y las Islas Canarias desde 1997. Adems, este virus infecta de
forma natural cultivos comerciales de pimiento en Espaa. ToCV posee un genoma
con la organizacin tpica de un crinivirus, formado por dos molculas de RNA
lineales y de polaridad positiva denominadas RNA1 y RNA2. El RNA 1 codifica
protenas relacionadas con la replicacin viral, mientras que el RNA 2 codifica
protenas involucradas en la proteccin del genoma, movimiento viral, y otras
funciones todava no identificadas. Adems, protenas codificadas por ambos RNAs
poseen actividad supresora del silenciamiento gnico.
En este trabajo se ha determinado la importancia que pueden tener las
infecciones de ToCV en pimiento. Por una parte, se ha estudiado la incidencia de la
enfermedad en las principales zonas de cultivo de las provincias de Murcia, Almera
y Mlaga, mediante muestreos sistemticos llevados a cabo desde 2006 a 2008. La
incidencia de ToCV en pimiento se ha mostrado variable segn las zonas y aos
estudiados. Adems, se ha desarrollado un sistema de inoculacin en condiciones
controladas mediante B. tabaci que ha puesto de manifiesto diferencias en la
susceptibilidad a la infeccin entre variedades as como la sintomatologa y las
prdidas de produccin que el virus ocasiona. Las plantas de pimiento infectadas
con ToCV presentaron una apreciable reduccin de altura y sntomas de amarilleo
internervial en hojas de altura media y basales, las cuales adems se apreciaban
ligeramente engrosadas, enrolladas longitudinalmente y quebradizas al tacto. Es de
destacar la significativa reduccin de produccin en las plantas infectadas como
consecuencia de un menor nmero de frutos y menor tamao de los mismos.
En este trabajo se describe por primera vez un nuevo husped experimental y
natural de ToCV, la patata. La confirmacin de la patata como husped experimental
de ToCV se ha llevado a cabo mediante la transmisin por B. tabaci en condiciones
controladas. A su vez, en los tubrculos procedentes de plantas infectadas se ha
detectado la presencia de ToCV mediante hibridacin molecular de improntas de
cortes transversales de yemas de tubrculos, as como en las plantas de patata
desarrolladas a partir de tubrculos infectados. Finalmente, se ha puesto de
manifiesto que las plantas de patata pueden actuar como fuente de inculo para la
infeccin de plantas de tomate mediante la transmisin por B. tabaci.
Con anterioridad a este trabajo se haba estudiado la variabilidad gentica de
poblaciones naturales de ToCV procedentes de distintas zonas de la cuenca del
Mediterrneo, habindose determinado la presencia de dos variantes de secuencia
nucleotdica del RNA1, denominadas I y II. En este trabajo se amplia el estudio de
la variabilidad gentica del RNA1 a una mayor coleccin de aislados obtenidos de
tomate y pimiento procedentes de cultivos comerciales del sudeste peninsular
(Murcia, Almera y Mlaga). Los datos obtenidos confirman la existencia de los dos
genotipos descritos y la asociacin de una subpoblacin del tipo I con las
infecciones de pimiento. Por otra parte, experimentos llevados a cabo mediante
pases sucesivos por tomate y pimiento de un aislado de ToCV apoyan la existencia
de fenmenos de adaptacin al husped sugeridos por los anlisis de secuencia.
Finalmente, se ha iniciado el desarrollo de un sistema gentico de ToCV
basado en la obtencin de clones infectivos completos de cDNA correspondientes a
los RNA1 y RNA2 del aislado espaol AT80/99. El anlisis de la infectividad se ha
realizado mediante la inoculacin de transcritos obtenidos in vitro en protoplastos de
Nicotiana benthamiana. Hasta el momento, los experimentos llevados a cabo han
permitido demostrar la replicacin del RNA1 de ToCV en ausencia del RNA2.
ABREVIATURAS
ABREVIATURAS VIRUS BYV beet yellows virus CMV cucumber mosaic virus CTV citrus tristeza virus CYSDV cucurbit yellow stunting disorder virus GLRaV-1 grapevine leafroll associated virus 1 GLRaV-1 grapevine leafroll associated virus 2 GLRaV-3 grapevine leafroll-associated virus 3 LChV little cherry virus LIYV lettuce infectious yellows virus PepMV pepino mosaic virus PMMV pepper mild mottle virus PLRV potato leafroll virus PVA potato virus A PVS potato virus S PVX potato virus X PVY potato virus Y PYVV potato yellow vein virus SPCSV sweet potato chlorotic stunt virus TAV tomato aspermy virus TBSV tomato bushy stunt virus TICV tomato infectious chlorosis virus TMV tobacco mosaic virus ToCV tomato chlorosis virus ToMV tomato mosaic virus ToTV tomato torrado virus TRV tobacco rattle virus TSWV tomato spotted wilt virus TYLCV tomato yellow leaf curl virus
OTRAS ABREVIATURAS BAC cromosomas artificiales bacterianos cDNA DNA complementario CP protena de la cpsida CPm protena menor de la cpsida dNTP desoxinucletido dsRNA RNA de doble cadena dRNA RNA defectivo gRNA RNA genmico g fuerza centrfuga relativa HEL dominio helicasa Hsp70h protena homloga a las protenas de choque trmico de 70 KDa Kb kilobase kDa kilodalton MTR dominio metiltransferasa nt nucletido ORF marco abierto de lectura PCR reaccin en cadena de la polimerasa pb pares de bases PEG polietilenglicol PRO dominio proteasa RdRp RNA polimerasa dependiente de RNA RNasa ribonucleasa rNTP ribonucletidos RT transcripcin reversa sgRNA RNA subgenmico U unidad de actividad enzimtica UTR regione no traducida
NDICE
NDICE
INTRODUCCIN Y OBJETIVOS.. 3 EL CULTIVO DEL TOMATE.. 3
EL CULTIVO DEL PIMIENTO 4
EL CULTIVO DE LA PATATA 5
VIRUS CAUSANTES DEL AMARILLEO DEL TOMATE.... 6
FAMILIA CLOSTEROVIRIDAE....... 7
Caractersticas generales.. 7
Taxonoma 8
Organizacin genmica 10
Mecanismos de expresin gnica. 16
Ciclo de infeccin de los closterovirus............. 17
Escenario evolutivo de la familia Closteroviridae 19
EL VIRUS DEL AMARILLEO DEL TOMATE
(TOMATO CHLOROSIS VIRUS, ToCV) 20
Organizacin genmica 20
Transmisin de ToCV por vectores.. 22
Sntomas en tomate............... 24
Gama de huspedes.............. 26
Distribucin geogrfica 28
Diagnstico.. 30
GENERACIN DE CLONES INFECTIVOS DE VIRUS DE RNA... 31
Clones infectivos de virus de la familia Closteroviridae. 34
VARIABILIDAD Y EVOLUCIN DE LAS POBLACIONES
DE VIRUS DE PLANTAS 39
Mecanismos generadores de diversidad gentica en los genomas virales... 39
Procesos que determinan la estructura gentica de las poblaciones virales. 42
Variabilidad gentica dentro de la familia Closteroviridae..... 45
OBJETIVOS.. 49
CAPTULO 1. INFECCIONES DE TOMATO CHLOROSIS VIRUS EN
PIMIENTO: INCIDENCIA EN EL SUDESTE PENINSULAR Y EXPRESIN
DE SNTOMAS EN CONDICIONES CONTROLADAS 1.1. ANTECEDENTES.. 53
1.2. MATERIAL Y MTODOS. 54
1.2.1. Muestreos de campo 54
1.2.2. Deteccin de ToCV. 54
1.2.3. Transmisin de ToCV a tomate a partir de plantas de pimiento
infectadas de forma natural........................... 57
1.2.4. Desarrollo de un sistema de infeccin de pimiento con ToCV
mediante Bemisia tabaci... 58
1.2.4.1. Inoculacin de ToCV en pimiento utilizando distinto
nmero de insectos. 58
1.2.4.2. Inoculacin de ToCV en diversas variedades de pimiento y
estudio del efecto de la infeccin viral... 58
1.2.5. Evaluacin de sntomas.. 60
1.3. RESULTADOS....... 61
1.3.1. Incidencia de ToCV en cultivos de pimiento y tomate de las
provincias de Mlaga, Almera y Murcia..... 61
1.3.2. Deteccin de ToCV en plantas de tomate inoculadas mediante
Bemisia tabaci a partir de pimiento.. 63
1.3.3. Influencia del nmero de adultos de Bemisia tabaci sobre la
eficiencia de transmisin de ToCV a pimiento. 64
1.3.4. Susceptibilidad a ToCV de diversas variedades de pimiento. 65
1.3.5. Determinacin de la sintomatologa inducida por la infeccin por
ToCV en pimiento........ 66
1.3.5.1. Anlisis del efecto de ToCV sobre la altura de las plantas 66
1.3.5.2. Sntomas foliares asociados a la infeccin por ToCV... 68
1.3.5.3. Efecto de la infeccin por ToCV en la produccin de
plantas de pimiento. 71
1.4. DISCUSIN 73
CAPTULO 2. LA PATATA (SOLANUM TUBEROSUM), UN NUEVO
HUSPED DE TOMATO CHLOROSIS VIRUS
2.1. ANTECEDENTES.. 83
2.2. MATERIAL Y MTODOS 84
2.2.1. Muestreos de campo, aislado viral y poblacin de mosca blanca.. 84
2.2.2. Deteccin de ToCV 84
2.2.3. Inoculacin de ToCV en plantas de patata mediante Bemisia tabaci. 85
2.2.4. Deteccin de ToCV en tubrculos de patata mediante hibridacin
molecular . 86
2.2.5. Inoculacin de plantas de tomate con ToCV a partir de plantas
de patata.... 86
2.3. RESULTADOS... 87
2.3.1. Infeccin natural de ToCV en patata.. 87
2.3.2. Infeccin de plantas de patata inoculadas con ToCV mediante
Bemisia tabaci.. 88
2.3.3. Presencia de ToCV en tubrculos de patata y en las plantas
desarrolladas a partir de ellos... 90
2.3.4. Infeccin de ToCV en plantas de tomate inoculadas a partir de
plantas de patata 92
2.4. DISCUSIN.... 93
CAPTULO 3. ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD GENTICA DEL RNA1 DE
TOMATO CHLOROSIS VIRUS EN TOMATE Y PIMIENTO: POSIBLE
IMPLICACIN DE FENMENOS DE ADAPTACIN AL HUSPED 3.1. ANTECEDENTES.. 101
3.2. MATERIAL Y MTODOS 102
3.2.1. Material vegetal.. 102
3.2.2. Diagnstico de ToCV...... 108
3.2.3. Extraccin de RNA total. 108
3.2.4. Regiones del genoma de ToCV analizadas. 108
3.2.5. Diseo de los iniciadores empleados en la sntesis y amplificacin
de cDNAs mediante RT-PCR... 109
3.2.6. Sntesis y amplificacin de cDNAs del RNA1 de ToCV mediante
RT-PCR 110
3.2.7. Secuenciacin de los productos de amplificacin.. 111
3.2.8. Anlisis de las secuencias nucleotdicas. 111
3.2.9. Anlisis de la secuencia nucleotdica del aislado MM8 de ToCV
procedente de pimiento en tomate y pimiento.................................................. 112
3.3. RESULTADOS... 115
3.3.1. Variabilidad nucleotdica en el RNA1 de ToCV 115
3.3.2. Anlisis filogentico de las regiones genmicas analizadas... 116
3.3.3. Influencia del husped en la estructura genmica de la poblacin
de ToCV 123
3.3.4. Implicacin de fenmenos de adaptacin al husped en la
variabilidad del RNA1 de ToCV.. 124
3.4. DISCUSIN 127
CAPTULO 4. DESARROLLO DE UN SISTEMA DE CLONES
INFECTIVOS DE TOMATO CHLOROSIS VIRUS 4.1. ANTECEDENTES.. 137
4.2. MATERIAL Y MTODOS 139
4.2.1. Aislado viral... 139
4.2.2. Extraccin de RNA de doble cadena.. 139
4.2.3. Sntesis y amplificacin de DNAs complementarios (cDNAs) a los
RNAs genmicos de ToCV.. 140
4.2.3.1. Sntesis y amplificacin de cDNAs del RNA1. 140
4.2.3.2. Sntesis y amplificacin de cDNAs del RNA2.. 143
4.2.4. Obtencin de clones de los RNA1 y RNA2 completos de ToCV.. 147
4.2.4.1. Construccin de un clon completo del RNA1 de ToCV... 147
4.2.4.2. Construccin de un clon completo del RNA2 de ToCV... 148
4.2.5. Transcripcin in vitro del RNA1 y RNA2 de ToCV.. 150
4.2.6. Aislamiento, cultivo e inoculacin de protoplastos de mesfilo
de hoja de Nicotiana benthamiana... 150
4.2.7. Extraccin de RNA total de protoplastos de Nicotiana benthamiana 152
4.2.8. Sntesis de sondas marcadas con digoxigenina.. 153
4.2.9. Anlisis mediante northern blot. 153
4.3. RESULTADOS... 154
4.3.1. Obtencin de clones de cDNA del RNA1 de ToCV.. 154
4.3.2. Obtencin de clones de cDNA del RNA2 de ToCV.. 158
4.3.3. Anlisis de los transcritos obtenidos in vitro correspondientes
al RNA1 y RNA2 de ToCV.. 165
4.3.4. Anlisis de la replicacin de transcritos obtenidos in vitro del RNA1
y RNA2 de ToCV en protoplastos de Nicotiana benthamiana.... 170
4.4. DISCUSIN 174
CONCLUSIONES.. 183 BIBLIOGRAFA 187
INTRODUCCIN Y OBJETIVOS
Introduccin y objetivos
INTRODUCCIN Y OBJETIVOS
Las virosis constituyen uno de los problemas ms serios que afectan a la
agricultura moderna, provocando el deterioro de la planta, disminuciones en la
productividad y productos de baja calidad. A diferencia de otros microorganismos,
como hongos o bacterias, no es posible aplicar tratamientos curativos contra los
virus y en ello radica la dificultad de su control. Como consecuencia del constante
intercambio de material vegetal y la desaparicin de barreras comerciales, cada vez
son ms los cultivos hortcolas que se ven afectados por enfermedades vricas. El
hecho de que muchos virus sean capaces de transmitirse mediante vectores dificulta
an ms su control. Entre los vectores ms importantes estn los insectos,
destacando los pulgones, las moscas blancas y los trips. Una estrategia
frecuentemente empeada para el control de las virosis es la lucha contra los insectos
vectores mediante tratamientos con insecticidas. La utilizacin indiscriminada de
esta estrategia puede traer consigo la generacin de poblaciones de insectos
resistentes y la destruccin de la fauna auxiliar autctona, adems de un impacto
negativo sobre el medio ambiente. En la mayora de los casos, la utilizacin de
control biolgico de los vectores y la introduccin de resistencia gentica son las
mejores alternativas para el control de las enfermedades virales. Para ello, es
fundamental poseer un conocimiento profundo de la biologa de los virus y sus
vectores, de la variabilidad natural que presentan las poblaciones virales y de las
interacciones entre los virus y las plantas husped.
EL CULTIVO DEL TOMATE
El tomate (Solanum lycopersicum L., familia Solanaceae) es una planta
perenne que cultivada se comporta como anual. Su centro de origen es la regin de
los Andes, actuales Colombia, Ecuador, Per, Bolivia y Chile. Su domesticacin y
cultivo comenz en Mxico, que se considera un centro secundario de
diversificacin.
3
Introduccin y objetivos
El tomate es uno de los principales cultivos hortcolas en extensin y
produccin a nivel mundial, con una superficie cultivada de 5.227.883 hectreas y
una produccin de 129.649.883 toneladas (FAO, 2008). El principal productor
mundial es China (33.811.702 toneladas). Espaa es el segundo pas productor
europeo, tras Italia, con 55.300 hectreas cultivadas y 3.664.1000 toneladas de
produccin. Las zonas donde se concentra el cultivo son Extremadura, Islas
Canarias, Murcia, Almera, Granada, Sevilla y Mlaga (MAPA, 2008). La mayor
parte de nuestra produccin se dedica a la exportacin para su consumo en fresco en
los pases europeos. Por tanto, la importancia del tomate en la agricultura espaola
es manifiesta, de ah que sea de gran inters disponer de medidas de control eficaces
frente a las enfermedades que afectan a este cultivo y que limitan su produccin,
como son numerosas virosis. En Espaa, las principales enfermedades virales que
afectan al cultivo del tomate estn causadas por cucumber mosaic virus (CMV)
(Jord et al., 1992), tomato spotted wilt virus (TSWV) (Jord, 1993), el complejo de
especies relacionadas con tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) (Moriones y
Navas-Castillo, 2000; Daz-Pendn et al., 2010), tomato mosaic virus (ToMV)
(Alonso et al., 1989), potato virus Y (PVY) (Aramburu et al., 2006), tomato
chlorosis virus (ToCV) (Navas-Castillo et al., 2000), pepino mosaic virus (PepMV)
(Aguilar et al., 2002) y tomato torrado virus (ToTV) (Verbeek et al., 2007).
EL CULTIVO DEL PIMIENTO
El pimiento (Capsicum annuum L.) es una planta herbcea perenne, con ciclo
de cultivo anual, perteneciente a la familia Solanaceae. Originario de la zona de
Bolivia y Per, su cultivo ya se haba difundido en el siglo XVI en Espaa, desde
donde se distribuy al resto del Viejo Mundo.
Actualmente, el mayor productor mundial es China, seguido de Mxico,
Turqua, Indonesia y Espaa. En Espaa, el pimiento es uno de los cultivos
hortcolas ms importantes, siendo ste el pas con mayor produccin de la Unin
4
Introduccin y objetivos
Europea (1.059.500 toneladas) (FAO, 2008). Las provincias espaolas con una
mayor produccin de pimiento son Almera, Murcia, Ciudad Real, Cdiz y Mlaga
(MAPA, 2008). Los virus que mayoritariamente infectan los cultivos de pimiento en
Espaa son los tobamovirus pepper mild mottle virus (PMMV), tobacco mosaic
virus (TMV) y ToMV (Alonso et al., 1989), PVY (Prez et al.,1995), TSWV (vila
et al., 1991), CMV (Avilla et al., 1996) y tomato bushy stunt virus (TBSV) (Luis-
Arteaga et al., 1996). Recientemente, se ha mostrado que el pimiento tambin es
husped de una serie de virus emergentes transmitidos por mosca blanca, TYLCV
(Reina et al., 1999; Morilla et al., 2005), ToCV (Lozano et al., 2004) y ToTV
(Amari et al., 2008).
EL CULTIVO DE LA PATATA
La patata (Solanum tuberosum L., familia Solanaceae) se origin en la
cordillera andina y lleg a Europa en el siglo XVI a travs de Espaa y las Islas
Britnicas. Es una planta herbcea, dicotilednea, provista de un sistema caulinar
areo y otro subterrneo constituido por los tubrculos.
La patata es uno de los cultivos ms importantes en todo el mundo, con una
produccin anual de 314.140.107 toneladas en 18.192.405 hectreas de superficie
cultivada (FAO, 2008). Actualmente, el mayor productor mundial es China, seguido
de Rusia, India y Estados Unidos. En Espaa, la produccin de patata se concentra
en Castilla y Len, Andaluca, Galicia, Pas Vasco y la Rioja (MAPA, 2008).
A diferencia de la mayora de cultivos hortcolas, la patata se reproduce
vegetativamente mediante tubrculos, que actualmente se producen en la mayor
parte de los pases desarrollados en condiciones de estricto control sanitario de las
enfermedades que puedan transmitir. Se han descrito alrededor de 40 virus capaces
de infectar el cultivo de la patata (Jeffries, 1998), de los cuales los ms importantes
son potato leafroll virus (PLRV), potato virus X (PVX), PVY y potato virus S (PVS)
(de Bokx y van der Want, 1987; Stevenson et al., 2001).Adems, existe un nmero
5
Introduccin y objetivos
de virus emergentes que constituyen una amenaza reciente para el cultivo de la
patata, como son tobacco rattle virus (TRV) y los crinivirus potato yellow vein virus
(PYVV) y tomato infectious chlorosis virus (TICV) (Wei et al., 2009).
VIRUS CAUSANTES DEL AMARILLEO DEL TOMATE
Se conocen ms de cincuenta especies virales capaces de infectar tomate,
pertenecientes a numerosas familias y transmitidas por diversos vectores como
nemtodos, pulgones, moscas blancas y trips.
A finales de los aos 80 del siglo pasado se observ en cultivos de tomate de
California un sndrome que se denomin desorden de la hoja amarilla o
amarilleo (Duffus et al., 1994). Los sntomas presentados por las plantas afectadas
se caracterizaban por la aparicin de manchas clorticas internerviales que aparecan
inicialmente en las hojas inferiores y que posteriormente se extendan hacia la parte
superior de la planta. Inicialmente, esta sintomatologa se atribuy a desrdenes
fisiolgicos o nutricionales e incluso a fitotoxicidad por pesticidas, aunque tambin
se sospech de una posible causa viral, puesto que su aparicin se asoci a la
presencia de mosca blanca. Los anlisis iniciales de las plantas que mostraban los
sntomas citados pusieron de manifiesto la presencia de un nuevo crinivirus (gnero
Crinivirus, familia Closteroviridae) al que se denomin tomato infectious chlorosis
virus (TICV), transmitido por la mosca blanca Trialeurodes vaporariorum (Duffus
et al., 1996).
Posteriormente, los estudios llevados a cabo con plantas de tomate con
sntomas similares procedentes del estado de Florida revelaron la existencia de otro
crinivirus, tomato chlorosis virus (ToCV) (Wisler et al., 1998b). La principal
diferencia biolgica entre ambos virus es la capacidad de ToCV para ser transmitido
por tres especies de mosca blanca, T. vaporariorum, T. abutilonea y Bemisia tabaci,
mientras que TICV se transmite slo por T. vaporariorum, as como un rango de
huspedes diferente. Adems de tomate, TICV puede infectar otros cultivos como
6
Introduccin y objetivos
patata, alcachofa, lechuga y varias especies ornamentales como petunia y especies
silvestres (Duffus et al., 1996).
En 1997 se observaron de forma espordica en cultivos de tomate bajo
plstico de las provincias de Almera y Mlaga sntomas inusuales y similares a los
descritos para las infecciones de ToCV y TICV. Los anlisis llevados a cabo
pusieron de manifiesto que el agente causal era ToCV (Navas-Castillo et al., 2000)
(ver ms adelante). En verano de 2001 se identific en cultivos de tomate de la
provincia de Castelln afectados de amarilleo la presencia de TICV, que
posteriormente fue detectado en Alicante y Murcia (Font et al., 2003). Este virus
tambin se ha encontrado en nuestro pas infectando las malas hierbas Chenopodium
murale y C. album (Font et al., 2004). Recientemente se ha obtenido la secuencia
nucleotdica completa de un aislado de TICV de California (Wintermantel et al.,
2009) y del RNA2 de aislados de Espaa y California (Orlio y Navas-Castillo,
2009).
La organizacin genmica, sintomatologa, gama de huspedes y distribucin
geogrfica de ToCV se describen en un apartado posterior de esta introduccin.
FAMILIA CLOSTEROVIRIDAE
Caractersticas generales
La familia Closteroviridae comprende virus de plantas filamentosos con
genomas de RNA de cadena sencilla que presentan el mayor tamao entre los virus
de RNA de plantas. Los virus de esta familia estn limitados fundamentalmente a
clulas del parnquima floemtico del hospedador, aunque en algunas interacciones
especficas hospedador-virus algunas clulas del mesfilo pueden infectarse
(Medina et al., 1999; Karasev, 2000). En muchos casos, esta restriccin tiene como
consecuencia un bajo rendimiento en la purificacin viral, lo que, unido al gran
7
Introduccin y objetivos
tamao del RNA genmico y la incapacidad de ser transmitidos mecnicamente, ha
limitado el estudio y caracterizacin de estos virus.
Los miembros de la familia Closteroviridae se transmiten de manera
semipersistente por insectos incluidos en tres familias del orden Homoptera, que
determinan los tres gneros existentes en esta familia, Closterovirus, transmitidos
por pulgones (Aphididae), Crinivirus, por moscas blancas (Aleyrodidae) y
Ampelovirus, por pseudocccidos (Pseudococcidae) (Karasev, 2000).
Estos virus infectan numerosos cultivos de gran importancia econmica como
ctricos, remolacha, tomate, lechuga, patata, batata, vid, pia, cerezo, etc., as como
especies ornamentales y silvestres. Generalmente, los sntomas de las enfermedades
causadas por los miembros de esta familia recuerdan a ciertas deficiencias
nutricionales y a senescencia prematura. Entre estos se incluyen amarilleos,
amoratamientos, aclaramiento de las venas y en ocasiones reduccin del crecimiento
y marchitamiento, que en algunos casos pueden dar lugar al colapso final de la
planta (Karasev, 2000).
Taxonoma
El principal carcter biolgico que separa los tres gneros de la familia
Closteroviridae (Closterovirus, Crinivirus y Ampelovirus) es el vector que los
transmite de forma natural (Karasev, 2000; Martelli et al., 2002). Las caractersticas
ms importantes de cada uno de estos gneros se describen a continuacin y su
estructura genmica se muestra en la figura 1.
Gnero Closterovirus. Los viriones tienen un tamao que oscila entre 1250 y 2200
nm de longitud y contienen una nica molcula de RNA de cadena sencilla, de
polaridad positiva y lineal de entre 15,5 y 19,3 kb. La especie tipo del gnero es Beet
yellows virus (BYV). Este gnero incluye virus transmitidos exclusivamente por
pulgones de manera semipersistente e infectan especies dicotiledneas. Algunos de
8
Introduccin y objetivos
sus miembros son transmitidos mediante inoculacin mecnica, aunque con
dificultad.
Gnero Ampelovirus. El tamao de sus viriones oscila entre 1400 y 2200 nm de
longitud y contienen una nica molcula de RNA de cadena sencilla, de polaridad
positiva y lineal de entre 16,9 y 19,5 kb. La especie tipo del gnero es Grapevine
leafroll associated virus-3 (GRLaV-3). En este gnero se incluyen virus que infectan
especies dicotiledneas y monocotiledneas y que son transmitidos de manera
semipersistente por pseudocccidos. Ninguno de ellos es transmisible por
inoculacin mecnica.
Gnero Crinivirus. El genoma est constituido por RNA de cadena sencilla, de
polaridad positiva y lineal de entre 15,3 y 19 kb de tamao, dividido en dos
molculas, a las que se denomina RNA1 y RNA2, siendo ambas necesarias para
llevar a cabo la infeccin. Los dos RNAs se encapsidan por separado en partculas
virales cuyos tamaos oscilan entre 650-850 nm y 700-900 nm de longitud,
respectivamente. En el caso de PYVV, su genoma se encuentra dividido en tres
molculas, denominndose a la tercera RNA3. Los genes localizados en el RNA1
codifican protenas relacionadas con la replicacin, mientras que en el RNA2, y
RNA3 en PYVV, se encuentran genes que codifican protenas implicadas en la
proteccin del genoma, el movimiento del virus y la interaccin con el vector. Tres
especies de mosca blanca estn implicadas en la transmisin de crinivirus (B. tabaci,
T. vaporariorum y T. abutilonea).
9
Introduccin y objetivos
Clos
tero
viru
sAm
pelo
viru
sC
riniv
irus
Figura 1. Organizacin genmica de especies virales representativas de los gneros que integran la familia Closteroviridae. BYV, Beet yellows virus; CTV, Citrus tristeza virus; LIYV, Lettuce infectious yellows virus; SPCSV, Sweet potato chlorotic stunt virus; GLRaV-3, Grapevine leafroll-associated virus-3 (Adaptado de Dolja et al., 2006).
Organizacin genmica
La mayor cantidad de material gentico que poseen los miembros de esta
familia en comparacin con otros virus de plantas se traduce en una mayor
complejidad estructural y variacin gentica. Por una parte, los viriones
filamentosos de los virus pertenecientes a esta familia son inusualmente largos y
complejos (Dolja et al., 2006). Sus partculas virales estn compuestas por al menos
cinco protenas que se ensamblan en una estructura en serpiente de cascabel
(rattlesnake), con un largo cuerpo de morfologa uniforme y una cola corta y
segmentada (Agranovsky et al., 1995; Febres et al., 1996; Tian et al., 1999; Dolja,
2003; Dolja et al., 2006). En la figura 2 se muestran imgenes de las partculas
virales de BYV, la especie tipo del gnero Closterovirus, obtenidas mediante
microscopa electrnica de transmisin (A) o microscopa de fuerza atmica (B) que
pone de manifesto la estructura segmentada de la cola (C).
10
Introduccin y objetivos
Cola
Cola Cuerpo Extremocuerpo
Figura 2. Morfologa de los viriones de beet yellows virus. A: Micrografa electrnica de dos viriones con las colas marcadas mediante tcnicas inmunolgicas empleando un antisuero especfico de la protena CPm (flechas). B: Imagen de una partcula viral obtenida mediante microscopa de fuerza atmica. C y D: Reconstruccin tridimensional de los extremos del virin obtenida mediante microscopa de fuerza atmica (Adaptado de Dolja, 2003).
En el genoma de los closterovirus se distinguen dos bloques principales de
genes, uno constituido por los implicados en la replicacin y otro integrado por
aquellos relacionados con la proteccin del genoma, el movimiento viral y la
interaccin con el vector. El bloque de genes implicados en la replicacin se localiza
aproximadamente en la mitad 5 del genoma de los virus monopartitos, gneros
Closterovirus y Ampelovirus, y en el RNA1 de las especies del gnero Crinivirus. El
producto del marco abierto de lectura (open reading frame, ORF) situado ms
cercano al extremo 5 codifica una poliprotena que posee los dominios proteasa
(PRO), RNA metiltransferasa (MTR) y RNA helicasa (HEL). Adems de la funcin
autoacataltica de PRO esta protena estara implicada en la activacin de la
replicasa viral o proteccin del RNA ante la degradacin por parte del sistema de
defensa de la planta (Dolja et al., 2006). La RNA polimerasa dependiente de RNA
(RdRp) est codificada por el siguiente ORF, denominado ORF1b, que
11
Introduccin y objetivos
probablemente se expresa mediante el desplazamiento de la pauta de lectura del
ribosoma un nucletido (+1 ribosomal frameshift) (Agranovsky et al., 1994;
Karasev et al., 1995). As, la traduccin del RNA genmico dara lugar a dos
protenas de gran tamao, una que abarca los dominios MTR- HEL, y otra que
incluira adems el dominio RdRp. La segunda poliprotena se produce en menor
cantidad debido a la baja eficiencia del desplazamiento del ribosoma, cuantificada
en un 2% en BYV (Agranovsky, 1996). El mdulo MTR-HEL-RdRp est
universalmente conservado en toda la superfamilia de virus , en la que se incluyen virus con genoma de RNA de polaridad positiva (Koonin and Dolja, 1993; Dolja et
al., 2006).
El bloque de genes relacionado con la proteccin del genoma, el movimiento
viral y la interaccin con el vector, se localiza en la mitad 3 del genoma de las
especies virales de los gneros Closterovirus y Ampelovirus y en el RNA2 (y
RNA3) de las especies del gnero Crinivirus. En este bloque se incluyen los genes
que codifican una protena hidrofbica de unos 6 kDa, una protena homloga a las
de la familia Hsp70 de eucariotas (Hsp70h), una protena de unos 60 kDa, la
protena de la cpsida (CP) y la protena menor de la cpsida (CPm) (Dolja et al.,
2006). Este bloque es indispensable para el movimiento del virus y es exclusivo de
los miembros de esta familia (Dolja et al., 1994).
La protena p6 posee un dominio transmembrana, se localiza en el retculo
endoplasmtico y estara implicada en las funciones del movimiento del virus de
clula a clula (Alzhanova et al., 2000; Peremyslov et al., 2004b).
La protena de la cpsida cubre aproximadamente el 95% del RNA viral,
formando el cuerpo helicoidal de los viriones filamentosos y flexuosos. La cola, que
ocupara el 5% restante, est integrada por las protenas CPm, como componente
principal, y p60 y Hsp70h, como componentes menores. Se ha propuesto que la cola
constituye un dispositivo de propulsin del virin hacia los plasmodesmos, gracias a
12
Introduccin y objetivos
la interaccin de la protena Hsp70h con el citoesqueleto de la clula (Peremyslov et
al. 1999, 2004a; Napuli et al. 2000, 2003; Satyanarayana et al., 2000, 2004;
Alzhanova et al. 2001). En el caso de BYV, la protena p20 tambin forma parte de
la cola del virin (unida a Hsp70h) y es necesaria para el transporte sistmico del
virus a travs del floema (Prokhnevsky et al., 2002).
Se ha postulado que los ORFs CPm y p60 se originaron mediante la
duplicacin del gen de la protena CP, lo que explica que en las regiones carboxilo-
terminal de estas protenas se encuentren los residuos Ser, Arg y Asp conservados en
las protenas de la cpsida de los virus filamentosos de plantas (Boyko et al., 1992;
Napuli et al., 2003). La protena CPm est implicada en el movimiento clula a
clula, en la formacin de la cola de virin y en la transmisin de las partculas
virales por B. tabaci al menos en el caso de LIYV (Tian et al., 1999; Alzhanova et
al., 2001, 2007).
La protena Hsp70h, cuyo origen es eucariota, es homloga a las chaperonas
celulares de la familia de choque trmico Hsp70. En esta protena se distinguen dos
regiones, una amino-terminal y otra carboxilo-terminal. En la primera de ellas se
encuentra un dominio ATPasa altamente conservado, mientras que la segunda
presenta un dominio de unin a sustrato con menor grado de conservacin
(Agranovsky et al., 1991; Boorstein et al., 1994). Ambos dominios estn implicados
en el ensamblaje del virin (Alzhanova et al., 2001, 2007). Esta protena ejerce un
papel fundamental en la translocacin intracelular del virin anclndose a los
plasmodesmos en asociacin con el citoesqueleto de actina de la clula (Medina et
al., 1999; Prokhnevsky et al., 2005). En BYV, la protena Hsp70h acta de manera
cooperativa con la protena p64 (homloga a p59 de crinivirus), que actuara como
cochaperona, para facilitar la incorporacin de la protena CPm e interviene en la
definicin de la longitud apropiada de la cola que encapsida aproximadamente unos
700 nt de la regin 5 terminal del RNA genmico, donde deben localizarse seales
reconocidas por la protena CPm (Peremyslov et al. 2004a; Satyanarayana et al.,
13
Introduccin y objetivos
2004; Alzhanova et al., 2007). Se ha propuesto que la cola del virin es un
dispositivo que se origin y evolucion para facilitar el movimiento de los genomas
de gran tamao de los closterovirus, tanto clula a clula como de manera sistmica
(Alzhanova et al., 2001; Prokhnevsky et al., 2002, 2005; Dolja, 2003).
A pesar de que este bloque de genes est conservado en toda la familia, no
ocurre lo mismo con el orden de los distintos genes. En los gneros Ampelovirus y
Crinivirus, el ORF CPm se sita en direccin 3 respecto al ORF CP, mientras que
en el gnero Closterovirus el orden es inverso y su tamao es significativamente
menor.
Aparte de estas funciones, en distintos miembros de la familia
Closteroviridae se han descrito protenas implicadas en la supresin del
silenciamiento gnico, como son la protena p21 de BYV (Reed et al., 2003; Ye y
Patel, 2005; Chiba et al., 2006), las protenas p20, p23 y CP de CTV (Lu et al.,
2004) y p24 de grapevine leafroll-associated virus-2 (GLRaV-2) (Chiba et al.,
2006). En el gnero Crinivirus se han descrito con esta funcin la protena p22 y una
protena homloga a la RNasa III de sweet potato chlorotic stunt virus (SPCSV)
(Kreuze et al., 2005), las protenas p22, CP y CPm de ToCV (Caizares et al., 2008)
y la protena p25 de cucurbit yellow stunting disorder virus (CYSDV) (Kataya et al.,
2009).
Las secuencias de los extremos 5 y 3 no codificantes (untranslated regions,
UTR) de los genomas de los virus de RNA de cadena sencilla lineal y sentido
positivo contienen elementos, que actan en cis, implicados en el inicio de la sntesis
de las cadenas positivas y negativas genmicas y de los RNAs subgenmicos.
Asmismo, controlan el inicio de la traduccin, el ensamblaje de los viriones, la
regulacin de la expresin gnica y el movimiento dentro del husped (Duggal et
al., 1994; Buck, 1996; Turner y Buck, 1999; Miller y Koev, 2000; Dreher y Miller,
2006).
14
Introduccin y objetivos
Las secuencias de los extremos 5-UTR estn implicadas en distintos
procesos del ciclo viral, aunque la informacin disponible sobre los elementos
reguladores es escasa. Por analoga con los elementos descritos en el extremo 3 de
la cadena positiva, las estructuras del extremo 3 de la cadena negativa
(complementaria al extremo 5 de la positiva) deben actuar como promotores de la
sntesis de la cadena positiva (Guan et al., 1997; Sivakumaran y Kao, 1999; Nagy y
Pogany, 2000; Panavas y Nagy, 2003; Panavas et al., 2003). En CTV se ha
demostrado la implicacin de las estructuras secundarias predichas en este extremo
(Lpez et al., 1998), en la replicacin y la posibilidad de que en su estructura
primaria se encuentren seales para el inicio del ensamblaje del virin (Gowda et
al., 2003b).
La regin del extremo 3-UTR de genomas virales de RNA de polaridad
positiva est implicada en el inicio de la replicacin del RNA viral, conteniendo los
motivos y estructuras implicados en distintas funciones relacionadas con la sntesis
de la cadena de polaridad negativa, tanto en su estructura primaria como secundaria
(Dreher, 1999). A diferencia de otros virus de plantas, en el extremo 3 de los
miembros de la familia Closteroviridae no se han identificado estructuras similares a
las presentes en RNA mensajeros eucariotas, como son las colas poliA o
plegamientos semejantes a los que adoptan los RNAs transferentes. En el caso de
CTV, esta regin est altamente conservada en todos los genotipos caracterizados
(Lpez et al., 1998) y se han identificado una serie de estructuras en horquilla
implicadas en la replicacin, algunas de las cuales forman parte integral de la seal
de replicacin mientras que otras no son esenciales para este proceso pero s parecen
contribuir a su mayor eficiencia (Satyanarayana et al., 2002a). En la mayora de los
crinivirus caracterizados se han descrito estructuras similares en el extremo 3-UTR
consistentes en cuatro estructuras en horquilla y uno o dos pseudonudos (Kreuze et
al., 2002; Livieratos et al., 2004, Lozano, 2007). Este extremo estara implicado,
adems de en el inicio de la sntesis de la cadena negativa, en la estabilidad del
15
Introduccin y objetivos
RNA, ensamblaje y regulacin de la sntesis del RNA y su traduccin (Dreher,
1999).
Mecanismos de expresin gnica
Los genomas virales constituidos por RNA de cadena sencilla, lineal y
polaridad positiva, poseen una doble funcin. Por una parte son utilizados
directamente como RNA mensajero y a su vez sirven como molde para la sntesis de
la cadena de polaridad negativa que se genera como intermediario durante la
replicacin del genoma viral. Los closterovirus utilizan varios mecanismos para
regular su expresin gnica: procesamiento proteoltico de la poliprotena codificada
por el ORF1a, deriva ribosomal en la expresin de la RdRp codificada por el ORF1b
y expresin de RNAs subgenmicos (sgRNAs) 3 co-terminales (Karasev, 2000;
Dolja, 2003; Dolja et al., 2006). Esta compleja combinacin de estrategias no se ha
descrito en ningn otro grupo de virus de plantas (Koonin y Dolja, 1993).
Los genes que se encuentran en la mitad 3 del genoma de closterovirus y
ampelovirus o en el RNA2 (y RNA3) de crinivirus se expresan mediante la sntesis
de sgRNAs 3 co-terminales con el RNA genmico, que actan como RNAs
mensajeros a partir de los cuales se traduce el gen que ocupa la posicin 5 terminal
(Hilf et al., 1995; Kreuze et al., 2002). En CTV se ha demostrado que la produccin
de los sgRNAs permite la regulacin de la expresin de cada gen de forma
independiente, tanto en tiempo como en cantidad (Navas-Castillo et al., 1997).
Aunque se han localizado las secuencias reguladoras de la expresin de los sgRNAs
en el extremo 5 (Karasev et al., 1997; Aylln et al., 2003), no se ha podido
determinar si se trata de secuencias promotoras o secuencias terminadoras, por lo
que se han denominado elementos controladores (Gowda et al., 2001, 2003a; Aylln
et al., 2004). Cada elemento controlador induce la formacin no slo de los sgRNAs
de polaridad positiva y negativa, sino tambin RNAs de polaridad positiva que se
16
Introduccin y objetivos
extienden desde el extremo 5 del gRNA a los extremos 5 de los elementos
controladores (Gowda et al., 2001).
Las plantas infectadas con closterovirus a menudo acumulan RNAs
defectivos (dRNAs) que contienen los extremos 5 y 3 del gRNA pero carecen de
una porcin variable de la regin central. Estos dRNAs han sido descritos en CTV
(Mawassi et al., 1995a y b; Yang et al., 1997a y b; Aylln et al., 1999a) y en el
RNA2 de LIYV (Rubio et al., 2000). Se ha sugerido que muchos dRNAs de CTV
pueden ser el resultado de la recombinacin de un sgRNA con zonas distantes en el
extremo 5 de su genoma (Bar-Joseph et al., 1997). En PYVV se han descrito dos
dRNAs de estructura ms compleja formados por regiones procedentes de las tres
molculas de RNA (Eliasco et al., 2006). Adems, en CTV se han descrito dRNAs
de gran tamao anlogos al RNA1 y RNA2 del genoma de crinivirus,
respectivamente (Che et al., 2002, 2003).
En virus animales, combinaciones de estrategias de expresin similares se
han descrito en arterivirus y coronavirus, pero no parece existir relacin filogentica
entre stos y los closterovirus, por lo que dicha similitud podra deberse a
fenmenos de convergencia evolutiva (Agranosky et al., 1994).
Ciclo de infeccin de los closterovirus
La mayora de los virus de esta familia son inoculados en las plantas
mediante insectos. Adems, pueden ser transmitidos por injerto y algunos de ellos
por transmisin mecnica (Karasev, 2000). El inicio del ciclo de replicacin requiere
la desencapsidacin de la partcula viral seguido de la traduccin del genoma viral,
que generar la poliprotena que suministrar los componentes proteasa y replicasa
que formarn los complejos de replicacin asociados a las membranas del retculo
endoplasmtico. A continuacin se sintetizar la cadena negativa del RNA
genmico que ser utilizada para la sntesis tanto de las cadenas positivas del
genoma como de los sgRNAs, que se exportarn al citosol. La traduccin de los
17
Introduccin y objetivos
genomas sintetizados generar la proliferacin de los complejos de replicacin y
simultneamente comenzar el ensamblaje de los viriones al acumularse las
protenas estructurales (Dolja et al., 2006).
Los viriones realizan el movimiento clula a clula a travs de los
plasmodesmos y un transporte sistmico a travs del floema. El movimiento de los
viriones dentro de la clula se realizara gracias a la capacidad de la protena
Hsp70h, presente en la cola, de interaccionar con los microfilamentos de actina y
transportar a los viriones hacia los plasmodesmos, de manera que este movimiento
sera direccional, quedando las colas insertadas en los canales de los plasmodesmos
(Medina et al., 1999; Prokhnevsky et al., 2005). Se ha postulado que los viriones se
desencapsidan al atravesar estos canales, lo que permite que los ribosomas se unan a
los extremos 5 desnudos al entrar en la nueva clula y as comenzar
inmediatamente el proceso de traduccin (Doja et al., 2006).
El ciclo de expresin gnica y replicacin, ensamblaje del virin y
movimiento clula a clula dura aproximadamente un da (Dolja et al., 2006) y se
repite hasta que la infeccin alcanza las clulas acompaantes que tienen conexin a
travs de los plasmodesmos con los elementos cribosos, lo que permite al virus ser
transportado gracias a la corriente del floema a largas distancias hasta llegar a los
rganos sumidero (tallos, hojas y races). Las protenas que intervienen en el
transporte sistmico son p20 y PRO en BYV (Peng et al., 2002; Prokhnevsky et al.,
2002). El establecimiento de la infeccin sistmica supone al menos dos semanas
para las especies que infectan plantas herbceas y hasta varios meses para las de
huspedes leosos (Dolja et al., 2006).
El secuestro masivo del retculo endoplasmtico suele causar citotoxicidad,
que se manifiesta como aclaramiento de las venas, amarilleo y enrollado de las hojas
y marchitamiento (Dolja et al., 2006). Los supresores de silenciamiento gnico
18
Introduccin y objetivos
codificados por el genoma viral tambin contribuyen al fenotipo de la enfermedad al
interferir con procesos del desarrollo de la planta (Dolja et al., 2006).
Escenario evolutivo de la familia Closteroviridae
Dolja et al. (2006) han propuesto que la lnea monofiltica de los
closterovirus desciende de un virus de plantas perteneciente a la superfamilia de
virus cuyo genoma codificaba una protena con actividad replicasa tpica con los dominios MTR-HEL-RdRp, una pequea protena hidrofbica de movimiento y una
nica protena (CP) que constitua la cpsida filamentosa. Este progenitor dara lugar
al ltimo ancestro comn de los closterovirus al adquirir varios genes nuevos, como
el dominio PRO y la regin genmica situada entre los dominios MTR y HEL. A su
vez, la protena Hsp70h pudo ser incorporada mediante recombinacin con un RNA
mensajero celular y la protena p59 se originara por duplicacin del gen de la
protena CP. Este ancestro probablemente sera transmitido por insectos. Las tres
lneas actuales de closterovirus, correspondientes a los tres gneros aceptados,
evolucionaron por adaptacin a los distintos tipos de insectos vectores (Karasev,
2000). Las protenas CPm se originaron en este momento a partir de la duplicacin y
divergencia de la CP. Seguidamente, se incorporaron algunos genes adicionales
especficos y conservados dentro de cada gnero, como es el caso del gen que
codifica la protena p21 en el gnero Closterovirus y los genes que codifican las
protenas p9 y p27 en el gnero Crinivirus. De igual manera, algunas de las especies
virales adquirieron genes exclusivos.
Parece ser que la inusual plasticidad gentica de los closterovirus, frente a la
mayor conservacin del genoma de virus de RNA de menor tamao, est
condicionada por la expansin de su genoma, lo que les permite una mayor
capacidad de adaptacin a nuevos nichos ecolgicos, tanto huspedes y vectores
como condiciones medioambientales cambiantes (Dolja et al., 2006)
19
Introduccin y objetivos
EL VIRUS DEL AMARILLEO DEL TOMATE (TOMATO CHLOROSIS
VIRUS, ToCV)
Organizacin genmica
Hasta la actualidad, se han secuenciado los genomas completos de tres
aislados de ToCV, de Florida (Wintermantel et al., 2005), Espaa (Lozano et al.,
2006b, 2007) y Grecia (Kataya et al., 2008), lo que ha permitido determinar su
organizacin genmica (Fig. 3). ToCV posee un genoma constituido por dos
molculas de RNA, lineales y de sentido positivo que se encapsidan por separado en
viriones largos y flexuosos, ambas necesarias para que el virus sea capaz de infectar
sistmicamente una planta. El RNA 1 est constituido por 8594-8595 nt y
fundamentalmente codifica protenas relacionadas con la replicacin viral, mientras
que el RNA 2, con 8242-8247 nt codifica protenas involucradas en la proteccin del
genoma, movimiento viral y otras funciones todava no identificadas.
El RNA1 est formado por cuatro potenciales ORFs flanqueados por dos
UTRs situados en los extremos 5 y 3 de la molcula (Fig. 3). El ORF1a codifica
una protena que contiene los dominios PRO, MTR y HEL conservados entre las
protenas asociadas con la replicacin viral en todos los miembros de la familia
Costeroviridae (Karasev, 2000). El ORF1b codifica la protena RdRp, que se
traduce por desplazamiento del ribosoma en un nucletido durante la traduccin (+1
frameshift). El ORF2 codifica una protena de 22 KDa, que se ha descrito como un
fuerte supresor de silenciamiento gnico (Caizares et al., 2008). El ORF3 codifica
un pptido con un posible dominio transmembrana similar a otras protenas situadas
en el extremo 3 de los crinivirus, cuya funcin es desconocida.
El RNA 2 de ToCV codifica nueve ORFs flanqueados por dos UTRs situados
en los extremos 5 y 3 de la molcula (Fig. 3). Esta molcula incluye el bloque de
cinco genes caractersticos de la familia Closteroviridae que estaran implicados en
la proteccin del genoma, movimiento viral e interaccin con el vector. Este bloque
20
Introduccin y objetivos
de genes est formado por el ORF4 que codifica la protena p4, rica en residuos
hidrofbicos, el ORF5 que codifica una protena Hsp70h, el ORF7 que codifica la
protena p59, y el ORF9 y ORF10 que codifican las protenas CP y CPm,
respectivamente. Se ha descrito la actividad supresora de silenciamiento gnico de
las dos ltimas protenas (Caizares et al., 2008). El ORF6 de ToCV codifica la
protena p8, con tamao, posicin genmica y secuencia similar a protenas de otros
miembros de este gnero (Livieratos et al., 2004; Orlio y Navas-Castillo, 2009). El
ORF8 codifica la protena p9, que se encuentra nicamente en los miembros del
gnero Crinivirus y hasta el momento se desconoce su funcin. El ORF 11 codifica
la protena p27, que no posee ORFs homlogos en los otros dos gneros de la
familia, por lo que podra ser exclusivo de crinivirus (Dolja et al., 2006). Por ltimo,
el ORF12 codifica la protena p7, que no presenta similitud significativa con
ninguna protena codificada por los genomas de otros crinivirus, por lo que podra
ser exclusiva de ToCV (Wintermantel et al., 2005; Lozano et al., 2006b).
Cada uno de los extremos 5-UTR del RNA1 y RNA2 est constituido por
301 y 238 nucletidos respectivamente, con una identidad nucleotdica del 33%
entre ambos. Los primeros nucletidos son idnticos en el RNA1 y RNA2,
fenmeno caracterstico tanto del gnero Crinivirus como de otros grupos de virus
con genomas segmentados. La secuencia nucleotdica de los extremos 3-UTR del
RNA1 y RNA2 presenta un alto grado de conservacin, como sucede en el resto de
crinivirus (Wintermantel et al., 2005; Lozano et al., 2006b, 2007), a excepcin de
LIYV, en el que se ha propuesto que sus extremos tengan alguna funcin distinta a
la del resto de virus de este gnero (Aguilar et al., 2003).
21
Introduccin y objetivos
ORF1a ORF2
35
Figura 3. Representacin esquemtica de la organizacin genmica de la secuencia nucleotdica del RNA1 y RNA2 de tomato chlorosis virus. Los marcos abiertos de lectura (ORFs) se muestran como cajas que aparecen encima, debajo o sobre la lnea que representa el RNA genmico, dependiendo del marco de lectura en el que se encuentren. PRO, motivo proteasa; MTR, motivo metiltransferasa; HEL, motivo helicasa; RdRp, RNA polimerasa dependiente de RNA; Hsp70h, protena homloga de la familia Hsp70; CP, protena de la cpsida; CPm, protena menor de la cpsida.
Transmisin de ToCV por vectores
ToCV se transmite en la naturaleza de manera semipersistente por las
especies de mosca blanca B. tabaci, T. vaporariorum y T. abutilonea (Wisler et al,
1998b), de las cuales slo las dos primeras se encuentran en Europa (Jones, 2003)
(Fig. 4). Este tipo de transmisin, en el que la adquisicin e inoculacin viral
normalmente ocurre en el floema de la planta, es no circulativa, es decir, el virus no
necesita ser translocado dentro de rganos internos del vector para ser transmitido,
aunque el periodo de adquisicin es mayor que en la transmisin no persistente (Ng
y Falk, 2006b). En un estudio de Wintermantel y Wisler (2006) se ha demostrado
que la eficiencia de la transmisin de ToCV as como la persistencia del virus en el
RdRp
ORF3
p22
p6
ORF1b
MTRPRO HEL
RNA1
RNA2
5 CP
p59 CPm
ORF5 ORF6
Hsp70h p8
ORF8ORF7 ORF9 ORF10 ORF11
p9p27p4
ORF4 ORF12
p73
22
Introduccin y objetivos
vector es variable entre las diferentes especies de mosca blanca que lo transmiten.
En este trabajo se observ que B. tabaci biotipo B y T. abutilonea presentan mayor
eficiencia de transmisin que B. tabaci biotipo A y T. vaporariorum. ToCV se
mantiene hasta 5 das en T. abutilonea, 2 das en B. tabaci biotipo B y slo un da en
B. tabaci biotipo A y T. vaporariorum. Se ha comparado la eficiencia de transmisin
de ToCV y TICV mediante T. vaporariorum en infecciones simples y mixtas, no
encontrndose diferencias significativas (Dalmon et al., 2009). Adems, se ha
comprobado que la coinfeccin de ambos virus altera el patrn de acumulacin de
cada uno de ellos de una manera especfica de husped y la eficiencia de transmisin
depende de la concentracin viral en la planta utilizada como fuente de inculo
(Wintermantel et al., 2008).
CBA
Figura 4. Individuos adultos de Bemisia tabaci (A), Trialeurodes vaporariorum (B) y T. abutilonea (C).
Desde el ltimo cuarto del siglo pasado las poblaciones de B. tabaci han
aumentado de manera significativa en muchas zonas del mundo, especialmente en
las regiones con clima tropical, subtropical, rido y mediterrneo (Morales, 2007).
No se conocen las causas de este incremento aunque se especula sobre una
combinacin de factores como son el uso abusivo de insecticidas orgnicos
sintticos que provoca la aparicin de poblaciones resistentes, la intensificacin de
las prcticas agrcolas de tipo monocultivo, el transporte de material vegetal
infestado entre pases e incluso el cambio climtico global (Lacasa et al., 1998;
Wisler et al., 1998a). Desde la dcada de 1990, las poblaciones de T. vaporariorum
23
Introduccin y objetivos
parecen estar siendo desplazadas progresivamente por las de B. tabaci en distintas
zonas del mundo (Clix et al., 1996; Berdiales et al., 1999).
En la especie B. tabaci existen variantes denominadas biotipos,
indistinguibles morfolgicamente, pero con caractersticas biolgicas diferenciales
que incluyen la gama de plantas husped (Brown et al., 1995; Guirao et al., 1997).
Se ha sugerido que la rpida y reciente dispersin de B. tabaci en todo el mundo
podra deberse al desplazamiento de algunos de los biotipos autctonos por el
biotipo B, con mejor capacidad de adaptacin (Bedford et al., 1994). En nuestro
pas, a diferencia de lo que se ha descrito en otros, el biotipo mayoritario no es el B
sino un biotipo que es probablemente autctono de la regin mediterrnea, el biotipo
Q (Banks et al., 1998; Simn et al., 2001). En Norte Amrica, por ejemplo, s ha
tenido lugar el desplazamiento del biotipo A preexistente por el B (Wisler et al.,
1998a).
Existe poca informacin acerca de los determinantes virales de los miembros
de la familia Closteroviridae implicados en la transmisin por vectores. Los trabajos
desarrollados hasta el momento indican que la protena CPm de closterovirus est
implicada en el proceso de transmisin (Tian et al., 1999) y que las diferencias
encontradas en la secuencia y el tamao de esta protena pudieran estar implicadas
en la especificidad de estos virus por la especie de mosca blanca (Livieratos et al.,
2001). Se ha sugerido que las protenas CPm de BYV y CTV tambin estaran
implicadas en la transmisin por los vectores, en este caso pulgones (Agranovsky et
al., 1995; Febres et al., 1996).
Sntomas en tomate
Los sntomas producidos por ToCV en tomate consisten en manchas
clorticas irregulares que evolucionan hacia una clorosis internervial que aparece
inicialmente en las hojas inferiores y que posteriormente se extiende hacia la parte
superior de la planta. A veces aparecen manchas de color prpura y necrosis. Las
24
Introduccin y objetivos
hojas viejas se enrollan longitudinalmente y adquieren textura quebradiza (Fig. 5).
Estos sntomas son similares a los producidos por TICV en tomate (Duffus et al.,
1996; Wisler et al., 1998a).
A
B
Figura 5. Sntomas de amarilleo en plantas de tomate causados por la infeccin por tomato chlorosis virus. A: Amarilleo internervial en hojas adultas de una planta infectada (derecha) junto a una planta asintomtica (izquierda). B: Planta de tomate totalmente afectada por amarilleo (derecha) junto a una planta asintomtica (izquierda).
La produccin puede verse disminuida debido a la reduccin de la capacidad
fotosinttica de las plantas afectadas. En ocasiones se observa una reduccin en el
nmero y tamao de los frutos (Wisler et al., 1998a), as como aborto floral y falta
de cuajado de frutos o retraso en la maduracin y falta de coloracin adecuada de los
mismos (Lozano et al., 2006a). El sndrome de amarilleo causado por ToCV puede
ser confundido con desrdenes fisiolgicos o nutricionales e incluso con
fitotoxicidad por pesticidas (Wisler et al., 1998b).
25
Introduccin y objetivos
Gama de huspedes
Adems de tomate, ToCV infecta de manera natural otras especies de la
familia Solanaceae, as como algunas de las familias Chenopodiaceae y Compositae
(Tabla 1). La gama de huspedes experimentales de ToCV es ms amplia,
comprendiendo al menos 25 especies pertenecientes a ocho familias, e incluye
algunos cultivos importantes, plantas ornamentales y malas hierbas (Tabla 2). Los
sntomas producidos por ToCV varan dependiendo del husped pero normalmente
consisten en un amarilleo internervial y sntomas similares a los producidos en
tomate (Wintermantel y Wisler, 2006). Estos huspedes, al actuar como reservorios
naturales del virus, podran influir en la epidemiologa de la enfermedad en tomate u
otros cultivos.
Tabla 1. Huspedes naturales de ToCV (Wisler et al., 1998b; Louro et al., 2000b; Font et al., 2004; Lozano et al., 2004; Tsai et al., 2004; Trenado et al., 2007).
Familia Especies susceptibles Chenopodiaceae Chenopodium album L.
C. murale L. Compositae Zinnia elegans Jacp.
Solanaceae Solanum lycopersicum L. S. nigrum L. Capsicum annuum L. Datura stramonium L. Physalis ixocarpa Brot. P. peruviana L.
26
Introduccin y objetivos
Tabla 2. Huspedes experimentales de ToCV (Morris et al., 2006; Wintermantel y Wisler, 2006; Trenado et al., 2007).
Familia Especies susceptibles Aizoaceae Tetragonia expans Murr. Amaranthaceae Gomphrena globosa L. Apocynaceae Vinca rosea L. Chenopodiaceae Beta macrocarpa Guss.
Chenopodium capitatum (L.) Asch. C. murale L. Spinacia oleracea L.
Compositae Callistephus chinensis (L.) Nees Calendula officinalis L.
Plumbaginaceae Limonium latifolium (J.E. Sm.) Kuntze Solanaceae Solanum lycopersicum L.
S. nigrum L. S. acaule Bitter Nicotiana benthamiana Domin. N. clevelandii Gray N. edwardsonii Christie & D.W. Hall N. glutinosa L. N. megalosiphon Huerch & Muell. N. tabacum L. Petunia hybrida Vilm. Physalis alkekengi L. P. ixocarpa Brot. P. peruviana L. P. wrightii Gray Cyphomandra betacea (Cav.) Sendt
Umbelliferae Anthriscus cereifolium (L.) Hoffm.
En el ao 1999 se observaron por primera vez plantas de pimiento cultivadas
en invernadero en la provincia de Almera con sntomas de amarilleo internervial en
hojas adultas que recordaban a los ocasionados por crinivirus en otros cultivos.
Adems, estas plantas presentaban abarquillado de las hojas, acortamiento de los
entrenudos, reduccin de la altura, falta de vigor y aborto floral (Fig. 6). En estos
cultivos tambin eran frecuentes fuertes infestaciones de la mosca blanca B. tabaci,
27
Introduccin y objetivos
lo que unido a la sintomatologa observada y a la presencia en zonas prximas de
cultivos de tomate con altas incidencias de amarilleo, hizo sospechar de la posible
infeccin por ToCV de las plantas sintomticas. El anlisis molecular confirm la
presencia de ToCV en las plantas de pimiento que presentaban el sndrome
anteriormente descrito, siendo sta la primera descripcin mundial de pimiento
como husped natural de este virus (Lozano et al., 2004).
AB
Figura 6. Sntomas observados en plantas de pimiento cultivadas en invernadero asociados a las primeras infecciones por ToCV detectadas en Espaa en la provincia de Almera. A: Manchas clorticas internerviales en hojas y abarquillado hacia el haz. B: Reduccin del crecimiento de las plantas. La flecha indica una planta sintomtica.
Distribucin geogrfica
ToCV fue detectado por primera vez en 1989 en cultivos de tomate de Florida
que mostraban un sndrome que se denomin desorden de la hoja amarilla (yellow
leaf disorder) o amarilleo, y se ha identificado en otras zonas de Estados Unidos
como Colorado y Louisiana (Wisler et al., 1998b). Posteriormente, este virus se
detect en Espaa (Navas-Castillo et al., 2000), Portugal (Louro et al., 2000a), Italia
28
Introduccin y objetivos
(Accotto et al., 2001), Grecia (Dovas et al., 2002), Puerto Rico (Wintermantel et al.,
2001), Marruecos (Hanafi, 2002), Taiwn (Tsai et al., 2004), Israel (Segev et al.,
2004), Francia (Dalmon et al., 2005), Chipre (Papayiannis et al., 2006), Lbano
(Abou-Jawdah et al., 2006), Islas Reunin (Delatte et al., 2006), Sudfrica (EPPO,
2006), Mxico (Alvarez-Ruiz et al., 2007), Islas Mayotte (Mass et al., 2008),
Turqua (evik y Erki, 2008), Brasil (Barbosa et al., 2008), Cuba (Martnez-Zubiaur et al., 2008), Islas Mauricio (Lett et al., 2009), Costa Rica (Castro et al.,
2009) y Japn (Hirota et al., 2010) (Fig. 7).
Figura 7. Distribucin mundial de ToCV.
En 1997 se observaron de forma espordica en los cultivos de tomate bajo
plstico de las provincias de Almera y Mlaga sntomas inusuales y similares a los
descritos para las infecciones de ToCV y TICV (Duffus et al., 1996; Wisler et al.,
1998b). En aos posteriores el nmero de plantas afectadas por este sndrome
aument de manera notable en muchos invernaderos. Los sntomas observados,
junto con su distribucin en campo y asociacin con la presencia de la mosca blanca
B. tabaci, hizo sospechar de la implicacin de algn virus transmitido por este
29
Introduccin y objetivos
insecto. Anlisis llevados a cabo mediante tcnicas moleculares confirmaron que
ToCV era el agente causal de esta sintomatologa (Navas-Castillo et al., 2000).
Desde entonces, se han sucedido epidemias anuales de amarilleo en el sur y sudeste
peninsular e Islas Canarias, con incidencias cada vez mayores, alcanzndose con
frecuencia infecciones del 100% (Lozano et al., 2006a). Hasta el momento se ha
encontrado ToCV en las provincias de Barcelona, Castelln, Valencia, Alicante,
Murcia, Almera, Granada, Cdiz, Mlaga, Sevilla, Islas Baleares, Santa Cruz de
Tenerife y Gran Canaria (Font et al., 2003, 2004; Lozano et al., 2006a).
ToCV tambin ha sido detectado puntualmente en Espaa y Portugal
infectando poblaciones naturales de las malas hierbas Solanum nigrum y Datura
stramonium (Louro et al., 2000b; Font et al., 2004).
Diagnstico
Los sntomas que ToCV y TICV producen en tomate son muy similares y
prcticamente indistinguibles, pero puede diferenciarse entre ambos utilizando
plantas indicadoras. As, Nicotiana benthamiana y N. clevelandii presentan
amarilleos internerviales cuando estn infectadas por TICV o ToCV, pero
nicamente TICV induce manchas necrticas (Wisler et al., 1998b). Este
diagnstico biolgico, que implica la transmisin mediante insectos vectores, no
slo es tedioso sino que requiere varias semanas para obtener los resultados y no es
prctico para el anlisis de un gran nmero de muestras.
Para el diagnstico rutinario de numerosos virus de plantas se han aplicado
con xito mtodos serolgicos como la tcnica inmunoenzimtica ELISA. Se han
producido antisueros policlonales frente a TICV (Duffus et al. 1996, Wisler et al.,
1998b) y frente a la protena de la cpsida de ToCV (Jacquemond et al., 2008), que
se han utilizado para el diagnstico de muestras de tomate infectadas de forma
natural y experimental. No obstante, se han encontrado problemas de diversa
naturaleza en la produccin de los antisueros y en el desarrollo del test ELISA: i) las
30
Introduccin y objetivos
protenas de la cpsida de ToCV y TICV parecen tener escasas propiedades
inmunognicas, ii) son termosensibles y iii) se obtuvieron regularmente falsos
negativos, particularmente con ToCV. Esto hace que el test ELISA no sea
plenamente fiable para el diagnstico rutinario de estos virus (Jacquemond et al.,
2008).
Una alternativa a los mtodos serolgicos y que se ha aplicado con xito para
el diagnstico de virus de plantas es la hibridacin molecular con sondas marcadas
con digoxigenina. En el caso de ToCV se ha descrito la produccin de sondas
especficas de los genes Hsp70h y CP para el diagnstico en dot-blot o en improntas
de secciones transversales de peciolo de hoja (Louro et al., 2000a; Lozano et al.,
2006a).
Tambin se han desarrollado mtodos de deteccin de ToCV mediante
transcripcin reversa del RNA viral y posterior amplificacin mediante PCR. Se han
diseado iniciadores degenerados del gen Hsp70h que amplifican los genomas de
ToCV y TICV (Navas-Castillo et al., 2000) e iniciadores especficos de este gen y el
de la protena CP de ToCV (Louro et al., 2000a, Trenado et al., 2007). Dovas et al.
(2002) desarrollaron un mtodo basado en RT-PCR mltiple para la deteccin
simultnea de ambos virus; el proceso se realiza en dos pasos, RT-PCR usando
iniciadores degenerados para amplificar una regin del gen Hsp70h de ambos virus,
seguido de PCR nested mediante iniciadores especficos de cada uno de ellos.
Jacquemond et al. (2008) han desarrollado una RT-PCR mltiple con iniciadores del
gen CP para la deteccin de ToCV y TICV en un nico anlisis, permitiendo as la
deteccin de infecciones mixtas.
GENERACIN DE CLONES INFECTIVOS DE VIRUS DE RNA
La disponibilidad de clones infectivos de virus de RNA constituye una
herramienta muy valiosa para el estudio de distintos aspectos de su biologa. De
hecho, ha facilitado especialmente el estudio de aquellos virus que se encuentran en
31
Introduccin y objetivos
la planta a ttulos muy bajos o cuya purificacin resulta muy complicada, adems de
presentar una ventaja para el estudio y manejo de aquellos virus transmitidos por
vectores. Esta herramienta permite manipular el genoma viral mediante mutaciones,
deleciones, inserciones y llevar a cabo experimentos de complementacin que
proporcionan informacin relevante sobre la biologa del virus (expresin gnica,
replicacin y movimiento) y sobre la interaccin virus-planta (Boyer y Haenni,
1994).
Los clones infectivos de virus de plantas de RNA de polaridad positiva
consisten tpicamente en un cDNA complementario al RNA genmico del virus y
una secuencia promotora de la transcripcin fusionada a su extremo 5 en un
plsmido bacteriano que acta como vector de clonacin.
Los principales pasos a seguir para la obtencin de un clon infectivo as como
algunas de las limitaciones ms comunes encontradas durante su desarrollo se
describen brevemente a continuacin. El primer paso consiste en la sntesis de un
cDNA complementario a la longitud total del genoma viral. La forma ms habitual
de obtenerlo es mediante una reaccin de transcripcin reversa sobre una
preparacin de virus purificado o extraccin de RNA total de planta infectada
utilizando un iniciador especfico del extremo 3 del genoma viral. La existencia de
estructuras secundarias en el molde de RNA viral puede complicar la obtencin de
la cadena sencilla de cDNA (Boyer y Haenni, 1994). Una vez obtenida, la primera
cadena de cDNA se convierte mediante PCR en cadena doble, iniciando la sntesis
con un segundo iniciador complementario al extremo 5 del RNA viral. Para facilitar
pasos posteriores, en los extremos de los iniciadores se suelen situar dianas de
restriccin para permitir realizar clonacin dirigida del cDNA en un vector adecuado
(Boyer y Haenni, 1994). La obtencin de un clon infectivo a partir de un genoma de
RNA de gran tamao presenta dificultad ya que la fidelidad de las transcriptasas
reversas y las DNA polimerasas decrece proporcionalmente con la longitud del
RNA (Lai, 2000). Existen alternativas como generar varios cDNAs con regiones
32
Introduccin y objetivos
solapantes que unidos cubran la longitud total del genoma (Dawson et al., 1986).
Factores como el empleo de polimerasas termoestables de alta fidelidad y altamente
procesivas o incluso la cepa de virus con la que se trabaja puede en ocasiones influir
directamente en la infectividad del cDNA generado. Adems, una vez obtenido el
cDNA pueden surgir problemas de distinta naturaleza en los pasos posteriores que
dificulten la clonacin en s, como problemas de toxicidad en E. coli del cDNA
clonado (Boyer y Haenni, 1994) y la falta de vectores de clonacin adecuados para
genomas de gran tamao (Lai, 2000). Algunos de estos problemas se han resuelto
mediante la introduccin de intrones de planta (Yamshchikov et al., 2001),
utilizando vectores de bajo nmero de copia (Gritsun y Gould, 1998) o vectores
BAC (cromosomas artificiales bacterianos) (Almazn et al., 2000). Otro problema a
evitar es la presencia de nucletidos no virales en los extremos 5 y 3 del transcrito
que pueden reducir la infectividad (Boyer y Haenni, 1994).
En cuanto al promotor de transcripcin, un aspecto crtico en el desarrollo de
un clon infectivo es decidir si el cDNA va a ser expresado en un sistema in vitro o in
vivo. Si la expresin del cDNA va a realizarse in vitro, la seleccin del promotor
(procedente en la mayora de los casos de bacterifagos) ser muy importante ya que
puede afectar directamente al rendimiento de la transcripcin y a la secuencia de los
extremos terminales de los transcritos (Boyer y Haenni, 1994). Los promotores ms
utilizados son los de las RNA polimerasas de los bacterifagos T7, SP6 y T3. La
estrategia ms utilizada, por su simplicidad y eficacia, es la fusin del promotor al
cDNA viral por medio de PCR, introduciendo su secuencia en el iniciador del
extremo 5 precediendo a la secuencia del virus. Por otro lado, en el extremo 3 de la
secuencia viral se suele situar una diana de restriccin, para digerir el plsmido y
establecer la finalizacin de la transcripcin. Una vez obtenido el transcrito, ste
podr ser utilizado para la inoculacin de plantas (mediante inoculacin mecnica) o
de protoplastos (mediante electroporacin o mtodos qumicos como la utilizacin
de polietilenglicol). Varios parmetros pueden influir en la infectividad de los
33
Introduccin y objetivos
transcritos: i) la heterogeneidad de la poblacin generada, ii) la presencia de
mutaciones y iii) la secuencia de los extremos 5 y 3 (presencia de nucletidos no
virales, necesidad de una estructura cap en el extremo 5 o una cola poli-A en el
extremo 3).
Para introducir el cDNA en la planta y lograr su transcripcin in vivo existen
dos alternativas principales, la infeccin mediante Agrobacterium tumefaciens
(agroinoculacin) y el bombardeo de partculas (biolstica). En la agroinoculacin
(Grimsley et al., 1986), el cDNA se sita bajo el control de un promotor de
transcripcin constitutivo (normalmente el promotor del RNA 35S de cauliflower
mosaic virus) y una seal de terminacin (como el terminador nos del gen de la
nopalina sintetasa de A. tumefaciens). La construccin resultante se introduce en un
vector binario que posee la secuencia repetida de los bordes izquierdo (left border,
LB) y derecho (right border, RB) del T-DNA. Durante la infeccin provocada por
A. tumefaciens, una copia de la regin del T-DNA situada entre LB y RB es
transferida al ncleo de la clula. Una vez all, acta la maquinaria de transcripcin
y, en su caso, de poliadenilacin y finalmente el RNA viral es trasladado al
citoplasma donde se inicia la infeccin viral.
Por otro lado, en la metodologa basada en la biolstica, que se ha utilizado
para la infeccin de plantas con RNA viral (Klein et al., 1987) y cDNA (Gal-On et
al., 1995), la inoculacin se lleva a cabo mediante el disparo de microproyectiles de
oro o tungsteno que van recubiertos de DNA, que se introducen directamente en el
ncleo de la clula. En este caso, el cDNA tambin se sita bajo el control de un
promotor de transcripcin y contiene una seal de terminacin.
Clones infectivos de virus de la familia Closteroviridae
Los miembros de la familia Closteroviridae poseen los genomas de RNA de
mayor tamao entre los virus de plantas. Esto determina que la obtencin de clones
34
Introduccin y objetivos
infectivos de estos virus sea un proceso especialmente dificultoso debido a la
concatenacin de algunos de los problemas mencionados en el apartado anterior.
Hasta el momento, se ha logrado la construccin de clones de cDNA
completos e infectivos de slo cuatro especies de esta familia, tres del gnero
Closterovirus, BYV (Peremyslov et al., 1998), CTV (Satyanarayana et al., 1999) y
GLRaV-2 (Liu et al., 2009), y uno del gnero Crinivirus, LIYV (Klaassen et al.,
1996). En el caso de CTV, BYV y LIYV, la infectividad se logr en primer lugar
mediante la inoculacin de transcritos generados in vitro a partir de promotores de
RNA polimerasas de bacterifagos (SP6, T3) en protoplastos de N. benthamiana o
N. tabacum. La disponibilidad de estos clones ha permitido determinar las funciones
de algunos de los mltiples genes que conforman el genoma de estos virus.
Mediante la inoculacin de transcritos obtenidos in vitro de clones infectivos
de BYV en protoplastos de N. tabacum y anlisis mutacionales se ha identificado
que los genes ORF1a y ORF1b son esenciales para la replicacin del RNA y que la
protena p21 funciona como un intensificador de este proceso (Peremyslov et al.,
1998). Utilizando modificaciones de estos clones que incluan el gen GUS (-glucuronidasa) fusionado a diversos genes virales, se ha determinado la cintica de
transcripcin de los genes Hsp70h, CPm, CP, p64, p21 y p20 de este virus
(Hagiwara et al., 1999). Utilizando diversos mutantes se ha determinado que la
protena CP es esencial en la encapsidacin del cuerpo del virin (Alzhanova et al.,
2001) y las protenas CPm, Hsp70 y p64 en la encapsidacin de la cola (Alzhanova
et al., 2001; Napuli et al., 2003). Mediante la inoculacin mecnica de transcritos
obtenidos in vitro a partir de construcciones con GFP (green fluorescent protein) de
mutantes de BYV en Claytonia perfoliata o N. benthamiana se observ que las
protenas CP, CPm Hsp70h, p64 y p6 son esenciales para el movimiento intercelular
del virus (Peremyslov et al., 1999; Alzhanova et al., 2000; Napuli et al., 2003).
35
Introduccin y objetivos
En el caso de CTV, mediante la delecin de los 10 genes del extremo 3, se
obtuvo un clon infectivo eficiente y ms fcilmente manipulable (Satyanarayana et
al., 1999), y por tanto se determin que estos genes no son esenciales para la
replicacin viral. Mediante anlisis mutacionales en el extremo 3-UTR se
determin que esta regin est implicada en una correcta replicacin del virus
(Satyanarayana et al., 2002a). La obtencin y manipulacin de diversos
minireplicones en los que se suprimieron o mutaron distintas regiones genmicas
codificantes tambin ha permitido avanzar en el conocimiento de la regulacin
gnica. Se han caracterizado los elementos controladores de los sgRNAs de los
genes CP y CPm y se ha determinado que cada elemento produce tres sgRNAs, uno
de polaridad positiva 5 terminal y dos de polaridad positiva y negativa 3 terminales
(Gowda et al., 2001). Adems, se ha localizado un elemento controlador en el
extremo 5 del genoma de CTV que produce sgRNAs 5 y 3 terminales (Gowda et
al., 2003a). Deleciones en el gen que codifica la protena p23 pusieron de manifiesto
su influencia en la acumulacin asimtrica del las cadenas de RNA positivas y
negativas de CTV as como la regin implicada en ello (Satyanarayana et al.,
2002b). Mediante la utilizacin del sistema gentico de CTV tambin se han
determinado las protenas implicadas en un eficiente ensamblaje del virin, como
son la CP, CPm, Hsp70h y p61 (Satyanarayana et al., 2000) as como el extremo 5-
UTR (Gowda et al., 2003b). Se ha observado la encapsidacin del virus por parte de
la CPm en ausencia de la CP, mientras que en presencia de Hsp70h y p61 se
restringe la encapsidacin a unos 630 nt del extremo 5 (Satyanarayana et al., 2004).
A pesar de que tanto los niveles de replicacin como la cantidad de viriones
formados en protoplastos de N. benthamiana es muy baja, la amplificacin mediante
pases sucesivos a nuevos lotes de protoplastos se ha utilizado para la obtencin de
cantidades suficientes de viriones para la posterior inoculacin mecnica en plantas
de ctricos (Satyanarayana et al., 2001). Esto ha permitido poner de manifiesto que
las protenas p33, p18 y p13 no estn implicados en el movimiento, mientras que
mutaciones en los genes que codifican las protenas p6 o p20 impidieron la infe
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