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Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco
GUADALAJARA, JALISCO, OCTUBRE 2013
CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A. C.
BIOMARCADORES PARA EL DIAGNÓSTICO TEMPRANO DE CÁNCER DE MAMA; BÚSQUEDA E
IDENTIFICACIÓN
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADEMICO DE
MAESTRO EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA
EN LA ESPECIALIDAD DE BIOTECNOLOGÍA PRODUCTIVA
PRESENTA
BIOL. ENEIDA ARACELY LÓPEZ ARIAS
Tutor: Rodolfo Hernández Gutiérrez
Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco
La presente tesis de maestría se llevó a cabo gracias a la beca
CONACYT otorgada a la Biol.
Eneida Araceli López Arias, Reg. No. 275806/223658 y al
financiamiento al proyecto “Búsqueda e identificación de
biomarcadores de cáncer de mama y desarrollo de un chip (prototipo)
para el diagnóstico temprano”, otorgado por el fondo sectorial de
investigación en salud y seguridad social-2007, No. 0700226, del Dr.
en C. Rodolfo Hernández Gutiérrez
Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco
Guadalajara, Jalisco, a 25 de octubre de 2013 Dr. Carlos Rubio González Director de Posgrado PICYT-CIDESI Querétaro Los abajo firmantes miembros del comité tutorial del estudiante Lic. en Biol. Eneida Araceli
López Arias, una vez leída y revisada la Tesis titulada “Biomarcadores para el diagnóstico
temprano de cáncer de mama, búsqueda e identificación” aceptamos que la referida tesis
revisada y corregida sea presentada por el alumno para aspirar al grado de Maestro en Ciencia
y Tecnología en la opción terminal de Biotecnología Productiva durante el Examen de Grado
correspondiente.
Y para que así conste firmamos la presente a los ocho días del mes de Febrero del año dos mil
trece.
Dr. Rodolfo Hernández Gutiérrez Dra. Ana Laura Márquez Aguirre
Tutor académico Asesor
Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco
Guadalajara, Jalisco, a 25 de octubre de 2013
Dr. Carlos Rubio González Secretario Técnico del PICYT PICYT-CIDESI Querétaro Los abajo firmantes, miembros del Jurado de Examen del Lic. En Biol. Eneida Araceli
López Arias, una vez leída y revisada la Tesis titulada “Biomarcadores para el diagnóstico
temprano de cáncer de mama, búsqueda e identificación”, aceptamos que la referida tesis
revisada y corregida sea presentada por el alumno para aspirar al grado de Maestro en Ciencia
y Tecnología en la opción terminal de Biotecnología Productiva durante el Examen de Grado
correspondiente.
Y para que así conste firmamos la presente a los veintidós días del mes de Febrero del año dos
mil trece.
Dr(a). Alejandro Canales Aguirre Dr(a). Erika Nahomy Marino Marmolejo Presidente Secretaria
Dr. en C. Rodolfo Hernández Gutiérrez Vocal
Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco
1
RESUMEN
El cáncer de mama es la segunda neoplasias con mayor incidencia, (por debajo del cáncer
cervico-uterino) en nuestro país y es también una de las primeras causas de muerte en mujeres
de 30 a 65 años de nuestro país. La detección temprana del cáncer de mama es de gran
importancia tanto para realizar tratamientos eficaces que permitan mejorar el pronóstico de la
enfermedad y brindar una mejor expectativa de vida. Se han realizado muchos esfuerzos con el
fin de encontrar marcadores útiles para diagnóstico, de manera más eficaz, sencilla y
específica.
El principal objetivo de este trabajo fue analizar las muestras de pacientes de cáncer de mama
en etapas tempranas (Etapa II), utilizando técnicas de alta resolución de separación de
proteínas con la finalidad de establecer perfiles proteicos tanto de personas normales, como
de personas en etapas iniciales de la enfermedad. Con ayuda de estos perfiles se podrá
establecer un análisis comparativo de geles bidimensionales a partir de proteínas séricas para
la identificación de proteínas diferenciales. La identificación de proteínas diferenciales de
ambos grupos es esencial para el establecimiento de marcadores tempranos diacríticos del
cáncer de mama, razón por la cual este análisis fue complementado con los ensayos de
Western Blot. Además mediante el análisis por espectrometría de masas (MS) se identificaron
tanto proteínas diferenciales como Antígenos Asociados a Tumor (AAT).
Para los estudios comparativos de mapas proteómicos se utilizaron 20 sueros de mujeres sanas
y fueron comparados con 20 sueros de mujeres con cáncer de mama; una vez obtenidos estos
mapas proteómicos el análisis se realizó in silico por medio del programa computacional PD
Quest Advanced Software, se observaron y se identificaron algunas proteínas, por debajo de
los 40 KDa y con pI en un rango de pH entre 4 - 6; las proteínas encontradas bajo estos rangos
fueron algunos tipos de apoliproteínas y cadena 2 haptoglobina entre otras.
Para la identificación de AAT se utilizaron 20 sueros de individuos sanos y 25 de mujeres con
cáncer de mama, Proteínas séricas de individuos sanos se utilizaron para realizar ensayos de
electroforesis y electrotransferencia a membranas de nitrocelulosa, Las membranas
conteniendo estas proteínas se incubaron con sueros de pacientes con cáncer de mama y sueros
de personas sanas, estos ensayos permitieron identificar algunas proteínas interesantes entre
las que destaca la proteína Alfa 1 Antritripsina
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3
INDICE DE CONTENIDO
RESUMEN .................................................................................................................................. 1
ABSTRACT ................................................................................................................................ 2
INDICE DE CONTENIDO ......................................................................................................... 3
INDICE DE FIGURAS, GRAFICAS Y TABLAS ..................................................................... 6
LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................................... 8
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 10
2. ANTECEDENTES ............................................................................................................ 12
2.1. GENERALIDADES. .................................................................................................. 12
2.1.1. DEFINICIÓN DE CÁNCER. .............................................................................. 12
2.1.2. CARACTERÍSTICAS DEL CÁNCER Y CÉLULAS CANCEROSAS ............ 12
2.1.3. VÍAS DE SEÑALIZACIÓN ............................................................................... 14
2.1.3.1. DESARROLLO DEL CÁNCER ..................................................................... 15
2.1.4. GENETICA DEL TUMOR ................................................................................. 19
2.1.4.1. GENES ASOCIADOS AL CÁNCER (PROTOONCOGENES, ONCOGENES Y ANTIONCOGENES) ................................................................................................ 19
2.1.5. RESPUESTA INMUNE FRENTE AL TUMOR ................................................ 21
2.1.5.1. ANTÍGENOS TUMORALES ......................................................................... 22
2.1.5.2. AUTOANTICUERPOS ................................................................................... 23
2.2. CÁNCER DE MAMA ................................................................................................ 23
2.2.1. DEFINICIÓN ...................................................................................................... 23
2.2.2. EPIDEMIOLOGÍA .............................................................................................. 24
2.2.3. FACTORES DE RIESGO ................................................................................... 26
2.2.4. BIOLOGÍA DE LA MAMA ............................................................................... 27
2.2.4.1. FISIOLOGÍA DEL CANCER DE MAMA ..................................................... 28
2.2.4.2. CLASIFICACIÓN DE CÁNCER DE MAMA ............................................... 29
2.2.4.3. ETAPAS DE CÁNCER DE MAMA ............................................................... 31
2.2.4.4. PROTEÍNA ASOCIADA AL CÁNCER DE MAMA .................................... 34
2.2.5. DIAGNOSTICO DEL CANCER DE MAMA .................................................... 34
2.3. MARCADORES TUMORALES ............................................................................... 37
2.3.1. DEFINICIÓN ...................................................................................................... 37
2.3.2. CLASIFICACIÓN ............................................................................................... 37
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4
2.3.3. MARCADORES TUMORALES DE CÁNCER DE MAMA ............................ 38
2.3.3.1. ANTÍGENOS ASOCIADOS AL TUMOR (AATS) EN CÁNCER DE MAMA……. ................................................................................................................. 39
2.4. PROTEÓMICA .......................................................................................................... 41
2.4.1. DEFINICIÓN ...................................................................................................... 41
2.4.2. TÉCNICAS DE ESTUDIO Y CLASIFICACIÓN .............................................. 42
2.4.2.1. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL ....................................................... 43
2.4.2.2. ESPECTROMETRÍA DE MASAS ................................................................. 43
2.5. INMUNO-PROTEÓMICA ......................................................................................... 44
3. JUSTIFICACIÓN .............................................................................................................. 45
4. HIPOTESIS ....................................................................................................................... 46
5. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 47
5.1. .................................................................................................................................. 47
6. METODOLOGÍA .............................................................................................................. 48
6.1. DISEÑO DE EXPERIMENTAL ................................................................................ 48
6.1.1. CRITERIOS DE INCLUSIÓN PARA LOS PACIENTES ..................................... 48
6.1.2. MODELO ESTADÍSTICO ..................................................................................... 49
6.2. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................... 49
6.2.1. OBTENCIÓN DE LOS SUEROS ....................................................................... 49
6.2.2. INTERPRETACIÓN DE MASTOGRAFÍA ....................................................... 50
6.2.3. CLASIFICACIÓN DE LOS SUEROS ............................................................... 51
6.2.4. ESTANDARIZACIÓN DE LA DOBLE DIMENSIÓN (2-DE) DE LOS SUEROS ............................................................................................................................ 51
6.2.5. DEPLESIÓN DE SUEROS ................................................................................. 52
6.2.6. DOBLE DIMENSIÓN ........................................................................................ 52
6.2.6.1. PREPARACIÓN DE LOS SUEROS PARA LA PRIMERA DIMENSIÓN .. 52
6.2.6.2. PRIMERA DIMENSIÓN ................................................................................ 52
6.2.6.3. ELECTROFORESIS DE DOBLE DIMENSIÓN ........................................... 53
6.2.7. ANALISIS DE DOBLE DIMENSIÓN ............................................................... 54
6.2.8. INMUNO-BLOT DE DOBLE DIMENSIÓN ..................................................... 54
6.2.8.1. ELECTROTRANSFERENCIA DE 2-DE Y BLOQUEO DE MEMBRANA 54
6.2.8.2. INCUBACIÓN DEL PRIMER, SEGUNDO ANTICUERPO Y REVELADO DE LA MEMBRANA ................................................................................................... 54
6.2.9. ANALISIS POR INMUNOBLOT DE SUEROS DE PACIENTES ................... 55
6.2.9.1. ELECTROELUSIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE 2-DE ................................ 55
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5
6.2.9.2. ELECTROTRANSFERENCIA 1-D Y BLOQUEO DE LA MEMBRANA . 55
6.2.9.3. INCUBACIÓN CON SUEROS DE PACIENTES .......................................... 55
6.2.10. ANÁLISIS DE DOBLE DIMENSIÓN E INMUNO-BLOT .......................... 56
6.3. IDENTIFICACIÓN MEDIANTE ESPECTOMETRIA DE MASAS (MS) ....... 56
7. RESULTADOS ................................................................................................................. 57
7.1. CLASIFICACIÓN DE LOS SUEROS ....................................................................... 57
7.2. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL Y OBTENCION DE MAPAS PROTEOMICOS ................................................................................................................... 59
7.3. ANALISIS DE MAPAS PROTEOMICOS ................................................................ 60
7.3.1. ANALISIS POR ESPECTROMETRIA DE MASAS ......................................... 66
7.4. ENSAYOS DE INMUNO-BLOT BIDIMENSIONALES (3-D) ............................... 66
7.4.1. ANALISIS POR ESPECTROMETRIA DE MASAS ......................................... 70
7.5. ENSAYOS DE INMUNO-BLOT 1-D ....................................................................... 71
7.5.1. ANALISIS ESTADISTICO DE LOS RESULTADOS POR INMUNO-BLOT 74
8. DISCUSIÓN ...................................................................................................................... 78
9. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 83
10. PERSPECTIVAS ........................................................................................................... 84
11. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 85
12. APÉNDICE .................................................................................................................... 91
13. ANEXOS ...................................................................................................................... 106
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6
INDICE DE FIGURAS, GRAFICAS Y TABLAS FIGURAS Fig. 1. Etapas características en el desarrollo del cáncer (Tomado de Luque y Herraez 2002). .................................................................................................................................. 18
Fig. 2. Imagen de la mama, en la cual se muestra la estructura anatómica (Tomada de Novartis Oncology). .................................................................................................................. 30
Fig. 3. Imagen de la mama, en la cual se muestra la etapa 0 y I del cáncer de mama (Tomada de Novartis Oncology). ................................................................................................. 31
Fig. 4. Imagen de la mama, en la cual se muestra la etapa IIA y IIB del cáncer de mama (Tomada de Novartis Oncology). ................................................................................... 32
Fig. 5. Imagen de la mama, en la cual se muestra la etapa IIIA, IIIB y IIIC del cáncer de mama (Tomada de Novartis Oncology) .................................................................................... 33
Fig. 6. Imagen de la mama, en la cual se muestra la etapa IV del cáncer de mama (Tomada de Novartis Oncology). ..................................................................................................... 33
Fig. 7. Toma de una muestra de sangre para la obtención de suero. ................................... 50
Fig. 8. Kit para deplesión de proteínas abundantes (Sigma). ............................................. 51
Fig. 9. Equipo Ettan IPGphor3 donde se realiza la primera dimensión o Isoelectroenfoque. 53
Fig. 10. Equipo para electroforesis Mini-Protean Tetra Electrophoresis System .................. 54
Fig. 11. Imagen de un mapa proteómico perteneciente a un individuo control .................... 60
Fig. 12. Imagen representativa de un mapa proteómico perteneciente un paciente con cáncer de mama. .............................................. 60
Fig. 13. Imagen representativa obtenida de PDQuest advanced V.8.0.1 en la cual se muestra una comparación del gel master (parte superior izquierda) con los mapas proteómicos tanto de individuos sanos (parte superior), como de pacientes con cáncer de mama (parte inferior). .. 60
Fig. 14. A. Imagen en 2D representativa de un individuo sano, con su vista tridimensional (B). C. Imagen en 2D representativa de un paciente con cáncer de mama con su vista tridimensional (D). ....................................................................................................... 63
Fig. 15. A Vista tridimensional de una fracción de los mapas proteómicos de un individuo sano y B de un paciente con cáncer de mama. ................................................................. 64
Fig. 16. A Vista tridimensional de una fracción de los mapas proteómicos de un individuo sano y B de un paciente con cáncer de mama. ................................................................. 66
Fig. 17. Inmuno-blot en 2-DE en el cual se utilizó un suero de individuo sano. Se puede observar arriba (A) el gel bidimensional del cual fueron transferidas las proteínas a la membrana; abajo (B) se observa el inmuno-blot con suero de un individuo sano como primer anticuerpo, en el cual se puede ver claramente que no se encontraron anticuerpos. .............. 68
Fig. 18. Inmuno-blot en 2-DE en el cual se utilizó el suero (108) de un paciente con cáncer de mama en etapa II. Se puede observar arriba (A) el gel bidimensional del cual se transfirieron las proteínas a la membrana; abajo (B) se observa el inmuno-blot en el cual es claramente visible la presencia de varios anticuerpos presentes en los sueros con cáncer de mama en etapa II (marcados con flechas). ............................................................................................. 68
Fig. 19. Inmuno-blot en 2-DE en el cual se utilizó el suero (109) de un paciente con cáncer de mama en etapa II. Se puede observar arriba (A) el gel bidimensional del cual se transfirieron las proteínas a la membrana; abajo (B) se observa el inmuno-blot en el cual es visible la presencia de anticuerpos en menor número provenientes de los sueros con cáncer de mama en etapa II (marcados con flechas). .................................................................................... 70
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7
Fig. 20. Gel bidimensional de poliacrilamida teñido con azul de coomassie, del cual se cortaron las proteínas para ser sometidas al análisis por MS. Puntas de flecha. ................... 70
Fig. 21. Electroforesis unidimensional, se muestra en el gel de poliacrilamida (carril 2) la proteína identificada, aislada de los geles bidimensionales, y caracterizada por MS como A1AT. Presenta un peso molecular aproximado de 50 KDa. MPM carril 1. ....................... 72
Fig. 22. Inmuno-blot 1-D (panel B), se muestra la membrana con la proteína A1AT (carril 2) identificada, aislada de los geles bidimensionales y caracterizada por MS que fue reconocida por mAb-A1AT. Panel A comparación de la electroforesis unidimensional (fig. 19) con el inmuno-blot 1-D. ......................................................................................................... 72 Fig. 23A. Inmuno-blot en 1-D en donde el análisis se realizó con sueros de individuos sanos en la membrana de nitrocelulosa que contenía solamente la proteína A1AT aislada de geles de 2-DE. 23B. Inmuno-blot en 1-D en donde el análisis se realizó con sueros de pacientes con cáncer de mama en etapaII en la membrana de nitrocelulosa que contiene solamente la proteína A1AT aislada de geles de 2-DE……………………………………………………...74 GRAFICAS Gráfica 1. Gráfica de incidencia y mortalidad de los principales tipos de cáncer en mujeres reportados a nivel mundial (Parkin 2002). ...................................................................... 24
Gráfica 2. Grafica del número de incidencias de cáncer de mama a nivel mundial. .............. 24
Gráfica 3. Estadística de incidencia de cáncer de mama en México (SSA). ......................... 25
Gráfica 4. Estadística de incidencia de cáncer de mama en Jalisco (SSA). .......................... 25
Gráfica 5. Representación porcentual de los sueros obtenidos y su clasificación. ................ 57
Gráfica 6. Representación porcentual de la subclasificación de los sueros obtenidos........... 58
TABLAS Tabla 1. Clasificación de los estados BI-RADS ............................................................... 50
Tabla 2. Clasificación del total de los sueros obtenidos para el estudio .............................. 57
Tabla 3. Subclasificacion de los sueros BI-RADS 4-6 ..................................................... 58
Tabla 4. Tabla representativa de la comparacion de mapas proteomicos controles vs cáncer de mama. ......................................................................................................................... 60
Tabla 5. Tabla en la cual se muestra el total de los puntos en los geles (proteinas) que resultaron significativos ................................................................................................ 61
Tabla 6. Resultado del analisis por espectrometria de masas de las proteinas identificadas. .. 70
Tabla 7. Resumen estadistico de las edades de individuios sanos y con cancer de mama. ..... 74
Tabla 8. Resultado de AAT positivos y negativos para ambos grupos encontrados en los ensayos inmunoproteomicos. ......................................................................................... 75
Tabla 9. Resultados para X2 con los positivos y negativos de ambos grupos. ..................... 76
Tabla 10. Resumen estadisticos para X2 ......................................................................... 76
Tabla 11. Resultado de AAT positivos y negativos para ambos grupos encontrados en los ensayos inmunoproteomicos. ......................................................................................... 77
Tabla 12. Porcentaje de deteccion de AATs para ambos grupos ........................................ 77
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LISTA DE ABREVIATURAS CaMa Cáncer de mama
2-DE Electroforesis bidimensional
SDS Duodecil sulfato de sodio
SDS-PAGE Sodiun duodecil sulfate poliacrilamide gel electrophoresis
KDa Kilodalton
µl Micro litros
PM Peso molecular
MPM Marcador de peso molecular
IEF Isoelectroenfoque
PI Punto isoeléctrico
IPG Gradiente inmovilizado de pH
MS Espectrometría de masas
WB Western blot
MT Marcador tumoral
IgG Inmunoglobulina tipo G
IgA Inmunoglobulina tipo A
IgM Inmunoglobulina tipo M
IgD Inmunoglobulina tipo D
CEA Antígeno carcinoembrionario
AAT(s) Antígeno(s) asociado(s) a tumor
AHSG Alfa 2 glicoproteína
A1ATP Alfa 1-antitripsina
HER 2 Receptor 2 del Factor de crecimiento Epidérmico Humano
BRCA-1 Breast Cancer 1
BRCA-2 Breast Cancer 2
mAb Anticuerpo monoclonal
ADN Ácido desoxirribonucleico
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ARN Ácido ribonucleico
CMH Complejo mayor de histocompatibilidad
EGF Factor de crecimiento epidérmico
RMN Resonancia magnética
TAC Tomografía axial computarizada
PET Tomografía por emisión de protones
HRP Peróxidasa de rábano picante
PBS Tampón fosfato salino
H2O2 Peróxido de hidrogeno
PSA Persulfato de amonio
CIBO Centro de Investigaciones Biomédicas de Occidente
INC Instituto Nacional del Cáncer
OMS Organización Mundial de la Salud
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1. INTRODUCCIÓN
Se ha reportado que más de 11 millones de personas son diagnosticadas con algún tipo de
cáncer cada año alrededor del mundo, sin embargo el cáncer de mama es el más frecuente en
la mujer del mundo occidental, con aumento de su incidencia en los últimos años, sobre todo
en la población más joven (<40 años). En México su aumento ha sido de 2001 a 2011 mayor
al 133% y en caso particular del estado de Jalisco en más de un 142%. (SSA 2011). Existen
aproximadamente más de 100 tipos de cáncer y cada uno de ellos puede presentar diferentes
subtipos (Casal, 2008).
La técnica más útil para el diagnóstico del cáncer de mama es la mastografía y aunque esta ha
contribuido de manera importante a reducir el número de muertes, resulta no ser lo
suficientemente sensible, pues ocurre que durante las primeras etapas (I y II) del cáncer de
mama las pequeñas lesiones de mama (entre 1 a 3 cm) no pueden ser detectables
especialmente en mujeres jóvenes que no pueden ser sometidas de manera frecuente a este
estudio; o en mujeres que presentan tejido mamario denso. El diagnóstico temprano de cáncer
es difícil debido a la ausencia de síntomas específicos en etapas tempranas así como al
limitado conocimiento de la etiología y la oncogénesis. Sin embargo la detección del cáncer de
mama en etapas iníciales contribuye de manera significativa a la disminución de los índices de
morbilidad y mortalidad, esto se traduce en el incremento en la respuesta positiva a los
tratamientos y en un aumento en la calidad de vida para el paciente y su familia. (Michael et
al. 2006).
Ante este reto se han desarrollado nuevas técnicas de investigación que ayudan a buscar y
probar nuevos y mejores métodos de investigación para el diagnóstico, una de ellas es la
proteómica, entendiendo como proteoma al conjunto de proteínas que se obtienen de la
traducción de los genes de un organismo vivo bajo condiciones y tiempos específicos. La
proteómica se constituye como una herramienta valiosa en la búsqueda de biomarcadores
específicos para la detección de un gran número de enfermedades incluyendo el cáncer (Liao
et al. 2008). Actualmente la proteómica se utiliza para describir la totalidad del análisis
funcional de los productos génicos, desde su localización a gran escala o el mecanismo de la
expresión de miles de proteínas simultáneamente hasta el estudio de su dinámica y sus
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11
interacciones; por otra parte se le ha dado el término de oncoproteómica al estudio de las
proteínas y sus interacciones con células cancerosas (Cho. 2007, Casal. 2008); así se tiene que
es posible encontrar nuevas moléculas como proteínas marcadoras o indicadoras que revelen
un estadio temprano del cáncer.
La búsqueda de estas proteínas se realiza por medio de técnicas proteómicas e inmuno-
proteómicas la cual viene dada en primer término por la introducción de electroforesis en
doble dimensión (2-DE) y en segundo término por la introducción de espectrometría de masas
(MS) para su identificación, así como las técnicas de Western Blot (Liao et al. 2008).
El suero sanguíneo es una fuente valiosa para la búsqueda de proteínas marcadoras de
procesos fisiológicos específicos. Es fácil de obtener y refleja el estado de salud de un
individuo, ya que las proteínas son secretadas por las células al torrente sanguíneo en
respuesta a un estado fisiológico y/o proceso patológico específico, por lo cual ha sido
ampliamente utilizado para el diagnóstico de diversas enfermedades (Barba et al. 2007). El
suero, contiene varios cientos de proteínas con concentraciones que van de 60-80 mg de
proteína por ml (Marck et al. 2005).
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12
2. ANTECEDENTES
2.1.GENERALIDADES.
2.1.1. DEFINICIÓN DE CÁNCER.
De acuerdo a la OMS el cáncer es un término genérico para un grupo de más de 100
enfermedades que pueden afectar a cualquier parte del organismo. Otros términos utilizados
son neoplasias y tumores malignos (OMS 2007).
El cáncer ocurre debido a la proliferación acelerada, desordenada y no controlada de células
dañadas o alteradas a nivel genético, y que además están estrechamente asociadas con defectos
en las proteínas que se encargan de traducir señales, las cuales actúan normalmente
suprimiendo o estimulando la continuidad del ciclo celular, y que pueden pertenecer a
distintos tejidos. Una de las características que define el cáncer es la división rápida de células
anormales que crecen más allá de sus límites normales y pueden invadir zonas adyacentes del
organismo o diseminarse a otros órganos en un proceso llamado metástasis (Stryer et. al.,
2008).
2.1.2. CARACTERÍSTICAS DEL CÁNCER Y CÉLULAS CANCEROSAS
En las células eucarióticas el control de la división celular tiene que estar regulado por la
duplicación de cromosomas, la citocinesis y además los componentes del aparato mitótico se
deben formar y funcionar en el momento adecuado del ciclo celular; así que cuando la célula
alcanza una masa crítica se divide produciendo dos células hijas más pequeñas las cuales en
condiciones apropiadas crecerán y se dividirán. Conforme las células avanzan a través de este
ciclo celular deben tener lugar dos procesos clave, de manera precisa y coordinada: 1) el
material genético debe duplicarse, 2) las dos copias del material genético deben distribuirse
fielmente entre las dos células hijas (Gardner et. al. 2007).
En gran parte el estudio de los factores que llevan a la transformación de una célula normal a
una célula neoplásica ha sido posible gracias al desarrollo de cultivos celulares in vitro. La
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13
transformación maligna puede observarse cuando fibroblastos primarios o líneas celulares
inmortalizadas (preneoplásicas, contienen alteraciones en el cariotipo y presentan la enzima
telomerasa) son tratadas con ciertos virus tumorales, o con carcinógenos químicos o físicos. Se
caracterizan por su crecimiento autónomo, sin regulación; dichas células proliferan a alta
densidad celular y a veces en ausencia de factores de crecimiento. Además las células
transformadas son más esféricas y pueden crecer sin adherirse a la matriz celular; la mayoría
de las células transformadas son inmortales. Otra característica importante de las células
cancerosas es su inestabilidad genómica y su heterogeneidad cromosómica dentro un tumor
(Orozco 2000).
La célula cancerosa difiere notablemente de una célula normal en los mecanismos que
bloquean el avance del ciclo celular, es decir; una serie de eventos coordinados que involucran
periodos sucesivos de replicación del ADN y de división celular. En el ciclo celular podemos
distinguir la fase G1 entre la mitosis (o fase M) y la replicación del ADN o fase S,
posteriormente a la fase de síntesis de ADN tenemos la fase G2 y finalmente la fase M. en la
fase G aumenta la masa y volumen celular y se establecen los puntos de bloqueo y control
negativo del ciclo celular; es generalmente en la fase G1 cuando las células detienen su
zproliferación y se retiran del ciclo celular, estas células; ahora en fase G0 pueden iniciar el
proceso de diferenciación celular, lo anterior se puede inducir en células normales carentes de
factores de crecimiento; por el contrario las células transformadas no entran a la fase G0
cuando se eliminan los factores de crecimiento. Dos tipos de proteínas son de gran
importancia en la regulación del ciclo celular: 1) la ciclinas que varían en concentración
durante el ciclo celular y 2) las cinasas dependientes de ciclinas. Los factores de crecimiento
activan la expresión de ciclinas necesarias para la transición entre G1 y S; algunas ciclinas
pueden estar sobre expresadas o alteradas estructuralmente en ciertas neoplasias. Además
algunos genes que codifican inhibidores de las cinasas dependientes de ciclinas pueden estar
dañados en canceres humanos. Si el ADN celular sufre algún daño por algún compuesto
carcinógeno, el ciclo celular se detiene hasta que se repare el daño; si el daño al ADN es muy
grande y no se puede reparar, la célula sufre apoptosis (muerte celular programada). La falta
de apoptosis observada en ciertos tipos de células tumorales parece ser uno de los factores que
se relacionan con su inestabilidad genética, con su resistencia a las drogas quimioterapéuticas
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14
y en parte con el crecimiento del tumor. Por lo anterior se sugiere que un defecto en algún
punto de control del ciclo celular tiene un papel importante en la oncogénesis (Orozco 2000).
Otra gran diferencia entre células cancerosas y células normales es el grado de diferenciación
que presentan, la diferenciación se puede definir como la expresión o represión de un conjunto
de genes como resultado de la expresión de un grupo específico de factores de transcripción,
durante la diferenciación terminal las células ya no se dividen y se retiran del ciclo celular,
pero en los canceres no se encuentra un alto grado de diferenciación. La diferenciación celular
es importante ya que de esta se puede inferir el tipo de cáncer que se presenta o se diagnostica,
debido a que el cáncer puede originarse de cualquier tipo de célula y en cualquier tejido se
clasifica en tres subtipos principales:
Sarcomas. Afectan el tejido conectivo como son huesos, cartílagos, nervios, vasos
sanguíneos, músculos y tejido adiposo.
Carcinomas. Afectan a los tejidos epiteliales como la piel, epitelio de los órganos, tejido
glandular de mama y próstata.
Linfomas. Que afectan los tejidos formadores de células sanguíneas, (inflamación de ganglios
linfáticos, invasión del bazo, medula ósea, sobreproducción de células blancas inmaduras)
(Wolfgan 2005).
2.1.3. VÍAS DE SEÑALIZACIÓN
La transducción de señales permite la comunicación a nivel celular. Las señales van desde los
ambientes extracelulares e intracelulares, así como de otras células. Las células responden a
estas señales en una variedad de formas, principalmente mediante la modificación de los
niveles de proteína, actividades y ubicación. Los niveles de proteína son controlados por las
tasas de transcripción, traducción y proteólisis, mientras que las actividades de las proteínas se
ven afectadas por modificaciones covalentes y las interacciones no covalentes con otras
proteínas y moléculas pequeñas. Las vías de transducción de señales regulan la diferenciación,
división y muerte en los organismos maduros y en desarrollo. Algunas vías son comunes a
todas las células, pero otros son específicos de células especializadas (por ejemplo, la síntesis
y secreción de insulina por el páncreas, la migración y la fagocitosis por los neutrófilos) y el
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15
comportamiento anormal de las células enfermas (por ejemplo, la invasión, y el crecimiento de
las células cancerosas). La mayoría de las señales son iniciadas por ligandos y son detectadas
por los receptores a los que se unen. La unión de un ligando a un receptor estimula la actividad
de las proteínas, necesarias para continuar con la transmisión de la señal a través de la
formación de complejos multiproteícos y la generación de pequeñas moléculas de segundos
mensajeros. La integración de las señales de múltiples vías determina la respuesta definitiva de
la célula de competencia y las señales complementarias.
A la vista de su complejidad no es sorprendente que las vías de transducción de señales fallen
a veces causando patologías o enfermedades (Luque et. al. 2002).
2.1.3.1. DESARROLLO DEL CÁNCER
El cáncer se manifiesta de formas variables, ampara más de 100 formas de la enfermedad
dependiendo de las circunstancias, el tipo de cáncer o tejido afectado (incluso dentro de un
mismo tejido se pueden encontrar muchas variedades de cáncer con distintas morfologías y
grados de malignidad), así como de la edad de la persona entre otras. A grandes rasgos su
desarrollo puede agruparse en tres etapas con posibles sub-etapas de difícil delimitación; pero
favorablemente los mecanismos moleculares de las distintas formas de cáncer son similares
(Orozco et. al. 2000).
1. Tumor primario benigno. Llamado tumorogénesis, carcinogénesis tumoral o
transformación neoplásica, es la más estudiada y mejor conocida. Inicia con la llamada
“célula progenitora de cáncer” que surge en un determinado tejido por la mutación de
algún gen, su proliferación da lugar a un clon de células mutadas (clon neoplásico) este
comienzo monoclonal es la primer característica del cáncer. A pesar del origen común las
células del clon inicial se hacen genéticamente distintas por la acumulación de nuevas
mutaciones; así la mutación iniciadora confiere a la célula susceptibilidad tumoral es
decir, una predisposición selectiva para la proliferación desmedida. La acumulación en las
células hijas de sucesivas mutaciones en los genes implicados en el control del ciclo
celular o de apoptosis que favorezcan la proliferación o la inmortalidad conduce
progresivamente a las propiedades genéticas anormales del cáncer.
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16
2. Cáncer in situ. Corresponde a la situación en que las células del tumor primario no han
escapado del tejido donde se originaron, ya que el tumor todavía carece de capacidad
invasiva y su pronóstico clínico es en general benigno. Solo resulta grave en aquellos
casos donde, por su localización, afecte a vasos sanguíneos, músculos o nervios críticos.
3. Tumor maligno. Es la etapa que caracteriza y define el cáncer, en esta etapa la célula
neoplasia se convierte en una célula cancerosa aquí ocurre la progresión y propagación del
tumor. A pesar de su trascendencia es la menos estudiada durante los últimos años se le ha
prestado mayor atención y se han llegado a conocer en parte sus aspectos moleculares.
Puede dividirse en varias sub-etapas de difícil clasificación (Luque et. al. 2002).
a. Invasividad o escape celular. Las células constituyentes de tejidos normales se
mantienen doblemente adheridas entre sí por medio de uniones intracelulares y a
uniones de las células con el espacio o matriz extracelular. Esta es una estructura
formada por proteínas fibrosas como colágeno y elastina, las cuales son secretadas
por la propia célula que actúan a modo de soporte. En estas interacciones intervienen
proteínas transmembranales llamadas integrinas; por su dominio intracelular, las
integrinas se unen a los filamentos de actina del citoesqueleto de cada célula mientras
que a través de su dominio extracelular tienen afinidad por proteínas receptoras de
células vecinas (adhesión célula-célula) y por proteínas fibrosas de la matriz
extracelular (adhesión célula-matriz). En el cáncer ambos tipos de adhesión se ven
alterados y como consecuencia la célula puede desprenderse del tejido,
convirtiéndose así en una célula invasora de otros tejidos; esta liberación es
consecuencia también de la acción de enzimas proteolíticas (proteasa) específicas que
destruyen la matriz extracelular. Entre ellas son destacables las metaloproteasas de
matriz extracelular, las cuales degradan casi todos los componentes de la matriz
extracelular por lo que intervienen en procesos fisiológicos de remodelación tisular
tales como desarrollo embrionario, crecimiento óseo y cicatrización. La actividad
proteasa aumenta especialmente en neoplasias malignas, posiblemente como
consecuencia de un aumento en la biosíntesis de estas enzimas.
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17
b. Vascularización o angiogénesis. Este proceso consiste en la capacidad de un tejido
para formar una red vascular propia, mediante el desarrollo de nuevos vasos
sanguíneos por mecanismos cuyos detalles se conocen aun de manera incompleta. Por
este mecanismo las células tumorales producen agentes angiogénicos que actúan
sobre células endoteliales vecinas para dar lugar a la formación de una nueva red de
venas, arterias y capilares; ello permite que un tumor crezca mucho y rápidamente al
asegurar la llegada de oxígeno y nutrientes. La vascularización puede favorecer la
migración de algunas células cancerosas al torrente circulatorio para difundirse a
otros tejidos donde generara una metástasis.
c. Formación de tumor secundario o metástasis. Mediante la diseminación celular
las células del tumor primario pueden fijarse en tejidos normales para multiplicarse y
diferenciarse en ellos dando lugar al tumor secundario o metástasis. Esta etapa es de
enorme gravedad clínica y constituye una nota distintiva letal e irreversible del tumor
maligno porque supone la destrucción del tejido sano que rodea a las células
tumorales y por consiguiente la dificultad de su eliminación (Luque et. al. 2002).
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18
Fig. 1. Etapas características en el desarrollo del cáncer (Tomado de Luque y Herraez 2002).
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19
2.1.4. GENETICA DEL TUMOR
La división celular como todos los demás procesos biológicos están bajo control genético,
ciertos genes deben regular el proceso de división celular en respuesta a señales intracelulares,
intercelulares y ambientales. Estos genes reguladores están indudablemente sujetos a
mutación, como todos los demás genes. Cabría esperar que las mutaciones que suprimen la
función de estos genes reguladores conduzcan a la división anormal de las células, ya sea
incapacidad para dividirse del todo, o la incapacidad de parar la división (Gardner 2007).
2.1.4.1.GENES ASOCIADOS AL CÁNCER (PROTOONCOGENES, ONCOGENES Y ANTIONCOGENES)
Hasta la fecha no se conocen los detalles de cómo la división celular está controlada, ni se han
identificado todos los genes que regulan este proceso. Sin embargo, los estudios recientes de
genes virales denominados oncogenes (del griego onkos, que significa tumor) que pueden
ocasionar la pérdida del control normal de la división celular ha conducido a la identificación
de un conjunto de genes homólogos denominados protooncogenes; estos pueden convertirse
en oncogenes celulares tumorígenos por mutación o asociándose con nuevas secuencias
reguladoras por medio de procesos de recombinación. Por otro lado se tiene la presencia de
genes supresores de tumor los cuales regulan negativamente el crecimiento celular y son
denominados como antioncogenes. El descubrimiento de estos ha permitido explicar el cáncer
a nivel molecular (Wolfgan 2005).
Protooncogenes. Desempeñan funciones importantes para el crecimiento celular, codifican
proteínas muy diversas; como son: 1) factores de crecimiento (c-cis), receptores de factores de
crecimiento (c-fms y c-erbB), 2) los que codifican proteínas que se unen al GPT con actividad
GTPasa (c-H-ras, c-k-ras y N-ras; 3) los que codifican a proteínas cinasas, ya sea proteínas
cinasas específicas para tirosina (c-abl, c-fes, c-gfr, c-fps, c-ros, c-src y c-yes) o a proteínas
cinasas específicas para serina/treonina (c-mil, c-mos, y c-raf) y 4) y proteínas nucleares que
actúan como factores de replicación o de transcripción activando genes importantes en el
crecimiento normal de la célula (c-fos, c-jun, c-erbA, c-myc, y posiblemente c-myb y c-ets);
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20
estos son los cuatro grupos en los que se clasifican. Cabe mencionar que los protooncogenes
han sido conservados a través de la evolución (Gardner et. al. 2007).
Oncogenes. Cuando los protoncogenes se alteran molecularmente se transforman en
oncogenes activados, o forma mutada de genes normales. Estas alteraciones se pueden dar por:
mutación, arreglo génico y amplificación génica, y con frecuencia se puede presentar más de
una de estas alteraciones. Las más comunes son translocaciones y mutaciones puntuales; en
otros tipos tumorales como neuroblastomas, cáncer cervico-uterino y mamario, la activación
de protooncogenes se da por amplificación del ADN. La mayoría de estudios sobre oncogenes
provienen de estudios de virus de ARN que inducen tumores, llamados retrovirus, estos
almacenan su información genética en una cadena sencilla de ARN la cual se transforma por
medio de transcriptasa inversa en ADN después de infectar la célula que hospedante. El más
conocido es el Sarcoma de Rous (en pollos) que origina cáncer en los tejidos (sarcoma) y que
además lleva un oncogén activado llamado v-src que induce el cáncer; al suprimir este gen se
origina el mismo modo v-src pero no oncogénico (Stryer et.al. 2008, Wolfgan 2005, Gardner
2007).
Existen más de 100 oncogenes sin embargo solo se mencionaran algunos, como el oncogén c-
myc, ayuda en la transformación celular, su expresión depende de factores de crecimiento;
aumenta durante el ciclo celular por lo que se sugiere puede ser componente de la
proliferación celular normal. También tiene importantes dominios en la región amino-
terminal de sus proteínas N-Myc, C-Myc L-Myc; además myc interacciona con proteínas
como Max para controlar genes inductores de apoptosis. Otro oncogén importante es ras, a
esta familia (Ha-ras, Ki-ras, N-ras) se le caracteriza por el potencial transformante de proteínas
como p21, se sabe que Ras también actúa traduciendo señales del exterior al interior de la
célula. Otro gen de reciente importancia bcl-2 o su proteína Bcl-2 por su sobreexpresión que
confiere resistencia a la apoptosis, su expresión abundante se puede deber a alteraciones en
p53 ya que es la encargada de suprimirlos, bcl-2 actúa sinérgicamente con c-muy en la
generación de células malignas, pero el exceso de Bcl2 puede suprimir la apoptosis inducida
por c-myc por lo que facilita la proliferación celular (Stryer et.al. 2008, Wolfgan 2005,
Gardner 2007).
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21
Antioncogenes. Originan la acción contraria a los oncogenes, llamados también genes
supresores de tumor; de manera normal codifica una proteína que detiene la proliferación, o
induce la apoptosis. Una mutación de este gen da lugar al cáncer. Los más estudiados son el
gen retinoblastoma (rb) y el gen p53.
El producto del gen rb 1 es una fosfoproteína nuclear (pRb) cuyo control del ciclo celular es
negativo al unirse a E2F e inactivar la transcripción; pRb está regulada negativamente por
cinasas dependientes de ciclinas (cdks), a su vez estas por reguladores negativos de
proliferación celular. pRb controla el ciclo celular y participa en diferenciación celular de
tejidos, recientemente se ha observado que aumenta la inmunogenicidad, disminuye la
angiogénesis y suprime la invasividad del tumor.
La proteína p53 participa como reparador en dos formas: 1) deteniendo la fase G1, antes de la
división celular, 2) causando apoptosis cuando se ha extendido el daño genético (en este caso
su concentración se mantiene elevada mucho tiempo). Se puede inhibir su función por
deleciones, inserciones y mutaciones puntuales.
Existes otros genes supresores como son p16 que puede ser inactivado en algunos canceres por
metilación de su región promotora. El BRCA1 y BRCA2 que se encuentra en forma aberrante
y predispone al cáncer mamario y el HNPCC que presenta alteraciones en las secuencias
repetidas del DNA y se encuentra en el cáncer colorectal hereditario (Orozco 2000, Luque
2002).
2.1.5. RESPUESTA INMUNE FRENTE AL TUMOR
Observaciones clínicas y experimentales han establecido que aunque las células tumorales se
derivan de células huésped, los tumores desencadenan una respuesta inmune.
En experimentos realizados en ratones a los cuales a los cuales les induce sarcoma por medio
de metilcolantreno, se observó que cuando se trasplanta en otros ratones el tumor crece, sin
embargo al replantarlo nuevamente en el ratón inicial el tumor es rechazado. Por lo que la
inmunología de los tumores implica que células tumorales expresan antígenos que son
reconocidos como extraños por el sistema inmunitario adaptativo y esta respuesta esta
mediada principalmente por linfocitos T. Sin embargo la respuesta inmunitaria no puede
prevenir por completo el crecimiento tumoral debido a que las células tumorales son similares
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22
al huésped ya que provienen de estas, por lo que en la mayoría de los tumores solo se
expresan algunos antígenos que pueden ser reconocidos como no propios; por otra parte el
rápido crecimiento y diseminación de los tumores pueden superar la capacidad del sistema
inmunitario. Bajo este conocimiento se han previsto inmunoterapias antitumorales para
tratamiento, potencializando esta respuesta antitumoral (Burnester et.al. 2003).
2.1.5.1. ANTÍGENOS TUMORALES
Se han identificado diversos antígenos antitumorales que pueden ser reconocidos por linfocitos T y
B y que además provocan una respuesta inmunitaria adaptativa (de aquí que se pueden utilizar
como componentes de vacunas, y los anticuerpos generados para la inmunoterapia).
Los antígenos que se expresan en células tumorales pero no en células normales son denominados
Antígenos Específicos de Tumores. Los antígenos tumorales que se expresan también en las
células normales son denominados Antígenos Asociados a Tumores (AATs) son constituyentes
celulares normales cuya expresión es aberrante o está regulada de forma anormal. Existe un método
reciente para la identificación de antígenos tumorales que reconocen específicamente a los
anticuerpos del suero de los pacientes con cáncer denominado análisis serológico de la expresión
del ADN complementario recombinante (SEREX). Existe la posibilidad de que los antígenos
tumorales que son reconocidos por los linfocitos T sean los principales inductores de la inmunidad
antitumoral; porque anticuerpos tumorales no reconocen a los péptidos asociados al CMH (son los
antígenos que reconocen linfocitos T); la mayor parte del conocimiento está limitado a antígenos
que reconocen linfocitos T citotóxicos (CD8), y recientemente se han intentado identificar a los que
son reconocidos por linfocitos cooperadores (CD4). Algunos antígenos tumorales se producen por
mutaciones oncogénicas de los genes normales, estos productos son sintetizados en el citoplasma de
las células tumorales como cualquier otra proteína citosólica por lo que pueden entrar en la vía del
procesamiento de antígenos de clase I, y además en la vía del procesamiento de antígenos de clase
II en células presentadoras de antígenos (que han fagocitado células tumorales muertas). Debido a
que los genes alterados no están presentes en células normales, los péptidos derivados no inducen
autotolerancia y pueden estimular respuestas mediadas por linfocitos T.
Los antígenos tumorales pueden ser sintetizados por genes mutados aleatoriamente y sus
productos no se relacionan con el fenotipo transformado. Actualmente se sabe por los
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23
experimentos de sarcomas inducidos que antígenos tumorales son péptidos derivados de
proteínas propias mutadas y que son presentados en forma de complejos peptídicos-MHC de
la clase I capaces de estimular a los linfocitos T citotóxicos. Estos antígenos son muy variados
por lo que los carcinógenos que inducen tumores pueden producir mutaciones de forma
aleatoria en cualquier gen del huésped y la vía presentadora de antígenos del CMH de la clase
I puede presentar péptidos de cualquier proteína citosólica mutada en cada tumor. En el cáncer
humano se ha demostrado que las proteínas mutadas del huésped pueden actuar como
antígenos tumorales (Abbas et.al. 2008).
2.1.5.2. AUTOANTICUERPOS
Son anticuerpos desarrollados por el sistema inmunitario que actúa directamente en contra de
uno o más antígenos del propio organismo. Muchas enfermedades autoinmunes tienen su
etiopatogenia en la sobreproducción de este tipo de anticuerpos, casos típicos son el lupus
eritematoso sistémico y la artritis reumatoide. En el caso de canceres se ha demostrado la
presencia de estos debido a que algunas proteínas pueden presentarse después de la traducción
de forma aberrante (mal plegada, defectos en la glicosilación, fosforilación.) o en una mayor o
menor cantidad de la normal, dando lugar a antígenos que se asocian a los tumores y
originando una respuesta inmune en contra de ellos (Abbas et.al. 2008).
2.2. CÁNCER DE MAMA
2.2.1. DEFINICIÓN
Se le nombra cáncer de mama al crecimiento anormal e incontrolado de las células que forman
los conductos de la mama donde se forma la leche. Los tumores que se originan en este tipo de
tejidos reciben el nombre de carcinomas, este término se aplica a las neoplasias malignas de la
mama que se originan en estirpes celulares de origen epitelial o glandular y no a las que son
generadas por células de estirpe mesenquimal llamados sarcomas (Muñoz et. al. 2007).
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24
2.2.2. EPIDEMIOLOGÍA
El cáncer es un problema de salud pública mundial, más de 11 millones de personas son
diagnosticadas cada año y se estima que habrá 16 millones de casos para el 2020 (William,
2007). Ocasiona 7.6 millones de muertes al año, y se tiene un estimado de 11.4 millones de
decesos para 2030 (OMS 2007).
Según lo reportado por (Cancer Stats 2011) entre los diferentes tipos de cáncer existen
diferencias para los dos géneros, en el caso de las mujeres los canceres más frecuentes son:
cáncer de mama, cérvico-uterino, colon, pulmón y estomago (Grafica 1).
A Nivel mundial el cáncer de mama ocupa el primer lugar de ocurrencia dentro de las
neoplasias malignas. Anualmente se reportan en Europa alrededor de 150 mil casos, en USA
cerca de 200 mil y en México 8 mil (Parkin 2002).
Gráfica 1. Gráfica de incidencia y mortalidad de los principales tipos de cáncer en mujeres reportados a nivel mundial (Parkin 2002).
Gráfica 2. Grafica del número de incidencias de cáncer de mama a nivel mundial.
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25
Series10
2,000
4,000
6,000
8,000
10,000
2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012
3,3914,076 4,223 4,462
5,2726,162
7,4608,032 7,989 8,153
9,347 9,565
Casos de cáncer en México
0
500
1000
1500
2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012
153
795
400548
806704
920 906789
10431132
1301
Casos de cáncer en Jalisco
En México el cáncer de mama es un problema de salud importante, representa la segunda
neoplasia más frecuente en la mujer, pero en los últimos años se han incrementado el número
de casos, superando al cáncer cérvico-uterino (Revista de epidemiologia SSA 2001-2012).
Durante los últimos 9 años el incremento de casos de cáncer de mama ha sido mayor a 200%
En Jalisco el número de casos a partir de 2001 hasta 2010 ha aumentado de 153 casos a 1043
es decir que representa casi un 700% estos datos pueden dar una idea alarmante de este rápido
incremento.
Gráfica 3. Estadística de incidencia de cáncer de mama en México (SSA).
Gráfica 4. Estadística de incidencia de cáncer de mama en Jalisco (SSA).
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26
2.2.3. FACTORES DE RIESGO
Se reconocen varios factores de riesgo para que una mujer pueda o no desarrollar cáncer de
mama. Sin embargo en la mayoría de las mujeres afectadas no es posible identificar factores
de riesgo específicos. Los antecedentes familiares de cáncer de mama multiplican el riesgo por
dos o tres. Algunas mutaciones, sobre todo en los genes BRCA1, BRCA2 y p53, se asocian a
un riesgo muy elevado de ese tipo de cáncer. Sin embargo, esas mutaciones son raras y
explican solo una pequeña parte de la carga total de cáncer mamario (IARC 2008, Lacey et. al.
2009).
El cáncer de mama es un tumor hormonodependiente, por lo que cualquier factor que aumente
la exposición a estrógenos, va aumentar el riesgo de padecer cáncer de mama. Entre estos
factores encontramos los factores reproductivos asociados a una exposición prolongada a
estrógenos endógenos, como: menarquia precoz, menopausia tardía, primer embarazo tardío
(si ocurre es después de los 30 años aumenta el riesgo 2-5 veces con respecto a las que tienen
el primer embarazo antes de los 20 años), por lo que figuran entre los factores de riesgo más
importantes; la no lactancia y nuliparidad (1.5 veces) también presentan un factor. La
hormonoterapia sustitutiva parece tener un riesgo asociado de 1.3. No existen estudios
definitivos con respecto al papel de los anticonceptivos orales. Las hormonas exógenas
parecen tener efectos, por lo que las usuarias de anticonceptivos orales y de tratamientos de
sustitución hormonal pueden tener un riesgo asociado (de 1.3 en el caso de la
hormonoterapia), que las mujeres que no usan esos productos. (IARC 2008, Lacey et. al.
2009).
Danaei y colaboradores (2005) calcularon la contribución de diversos factores de riesgo
modificables, exceptuando los factores reproductivos, a la carga global de cáncer de mama.
Los autores concluyen que el 21% de todas las muertes por cáncer de mama registradas en el
mundo son atribuibles al consumo de alcohol, el sobrepeso u obesidad, y la falta de actividad
física. Esa proporción fue mayor en los países de ingresos altos (27%), y el factor más
importante fue el sobrepeso y la obesidad. En los países de ingresos bajos y medios, la
proporción de cánceres de mama atribuibles a esos factores de riesgo fue del 18%, y la falta de
actividad física fue el factor determinante más importante (10%).
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27
La diferente incidencia del cáncer de mama en los países desarrollados y los países en
desarrollo puede explicarse en parte por los efectos de la alimentación, aunados a la mayor
edad del primer embarazo, el menor número de partos y el acortamiento de la lactancia (Peto,
2001). La creciente adopción de modos de vida occidental en los países de ingresos bajos y
medios es un determinante importante del incremento de la incidencia de cáncer de mama en
esos países. La exposición a agentes químicos o carcinógenos tanto en el trabajo como en el
ambiente. En el tabaco se han encontrado más de 50 agentes carcinógenos, los epidemiólogos
indican que el 30% de las muertes se debe al hábito de fumar; sin embargo este hábito
conjuntamente afecta a las personas expuestas al humo de los fumadores (fumadores pasivos).
En algunos alimentos y en el aire de algunas ciudades también se han detectado algunos
carcinógenos (Orozco et. al. 2000).
Sin embargo el factor de riesgo principal del cáncer de mama es la edad; la mayoría de los
cánceres de mama ocurren en mujeres de más de 50 años y las mujeres de más de 60 años son
las que presentan el riesgo más elevado (INC 2008).
2.2.4. BIOLOGÍA DE LA MAMA
La mama es una estructura llamada “glándula” de origen ectodérmico y constituye la
característica fundamental de los mamíferos, su función es la de alimentar a sus crías con el
producto de su secreción (leche); esta glándula esta fija a la piel, es la que le da forma y la
sujeta; está situada en la parte anterior del tórax y puede extenderse en medida variable por su
cara lateral. La mayor parte de la masa de la mama está constituida por tejido glandular y
adiposo. Durante el embarazo y la lactancia el tamaño de la mama aumenta debido al
crecimiento del tejido glandular. Está formada por un conjunto de quince a veinte lóbulos, que
a su vez forma lobulillos los cuales están formados por un promedio diez a cien acinos
(estructurados por células de secreción láctea), se encuentran unidos entre sí por tejido
conectivo; y su función principal consiste en producir leche durante el periodo de lactancia.
Estos lóbulos y lobulillos están unidos por una serie de conductos mamarios denominados
“ductos o conductos galactóforos” revestidos por epitelio cuboideo o cilíndrico los cuales
terminan en el pezón, así mismo la mama contiene vasos sanguíneos cuya función consiste en
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28
proporcionar sangre a la glándula y a los vasos linfáticos encargados de recoger la linfa que
confluyen en pequeñas formaciones denominadas ganglios linfáticos. Aunque la anatomía de
la mama es similar en todos los casos su consistencia y volumen puede variar mucho de una
mujer a otra debido a la proporción de tejido graso que rodea a la glándula mamaria. Por otro
lado desde el nacimiento hasta la edad adulta experimenta cambios; durante la pubertad crece
hasta adquirir su tamaño definitivo, luego en la edad reproductiva sufre cambios temporales
debido a los ciclos menstruales; durante la menopausia los niveles hormonales descienden lo
que provoca que gran parte de la glándula mamaria se atrofie y sea sustituida por grasa. Sin
embargo el cambio más grande que puede presentar es durante el embarazo y la lactancia,
pues durante este periodo el tejido glandular se activa para producir la leche, de manera que la
mama puede llegar a duplicar su volumen con gran facilidad, pero al término de este periodo
también puede llegar a sufrir una atrofia súbita que le suponga una pérdida de volumen incluso
menor al tamaño inicial (Masiá et.al. 2009).
2.2.4.1. FISIOLOGÍA DEL CANCER DE MAMA
La variante más habitual del cáncer de mama es la que se inicia en las células epiteliales de los
conductos galactóforos. Cuando el cáncer progresa rompe la membrana basal, invadiendo
ductos, lóbulos adyacentes y grasa mamaria, llegando a los ganglios linfáticos intramamarios e
invadiendo la pared de los vasos. Puede extenderse infiltrando y ulcerando piel y pezón,
afectando los linfáticos subdérmicos, produciendo la llamada piel de naranja. En profundidad
puede afectar la fascia del pectoral y la pared torácica. La tasa de crecimiento del tumor es
constante desde el inicio, y se estima una media de 5 años hasta que se hace el tumor palpable.
La localización más frecuente es en el cuadrante supero-externo (48%), seguido de
retroareolar (17%), supero-interno (15%) e inferiores (17%). Su incidencia es algo superior en
la mama izquierda que en la derecha. Un 3% presentan afectación multicéntrica o masiva de la
mama (Fig. 2) (NBCO 2009).
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29
2.2.4.2. CLASIFICACIÓN DE CÁNCER DE MAMA
Existen diferentes tipos de cáncer de mama, cada uno recibe el nombre de la parte de la mama
en la que comienzan a desarrollarse las células cancerosas. El carcinoma ductal es el tipo más
común. Comienza en las células de los conductos. El carcinoma lobular es otro tipo de cáncer
de mama que comienza en los lóbulos y lobulillos (donde se produce la leche). Si el tumor
permanece dentro del conducto o lobulillo, se lo conoce como carcinoma in situ; el tumor que
se disemina fuera del conducto o lobulillo se conoce como carcinoma infiltrante o invasivo.
Carcinoma ductal in situ. Es el diagnóstico clínico más temprano que se puede hacer
del cáncer de mama y con frecuencia se diagnostica con una mamografía de detección
que revela pequeñas áreas de calcificación en el seno. Se origina en las paredes de los
conductos mamarios, es un cáncer muy localizado que no es capaz de producir
metástasis aunque es agresivo localmente, puede extirparse fácilmente. Raramente las
pacientes sospechan que tienen cáncer de mama. Si este tipo de cáncer no recibe
tratamiento, aproximadamente el 30 por ciento de las pacientes desarrollarán cáncer de
mama invasivo en un promedio de 10 años a partir del diagnóstico inicial, pero si es
tratado casi todos las estudios señalan que se tiene una tasa de curación del 98-99%.
(NBCO 2009; Masiá 2009)
Fig. 2. Imagen de la mama, en la cual se muestra la estructura anatómica (Tomada de Novartis Oncology).
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30
Carcinoma ductal infiltrante. Es el cáncer de mama invasivo más común, y
representa el 80 por ciento de los casos. La forma característica del carcinoma ductal
infiltrante es un bulto muy duro que tiene bordes irregulares y parece estar anclado en
los tejidos circundantes. Se inicia en el conducto mamario pero logra atravesarlo y
pasar a los tejidos de la mama. Es posible que la piel que cubre la zona, o que el pezón
se retracte (NBCO 2009; Masiá 2009).
Carcinoma lobular in situ. Se origina en los lóbulos y su diagnóstico es controvertido
ya que se considera que el carcinoma lobular in situ es un indicador de mayor riesgo de
desarrollar cáncer de mama invasivo, pero es posible que no sea un precursor directo
del mismo. Esta anomalía por lo general está ampliamente distribuida en toda la mama
y con frecuencia se presenta en ambos senos de manera simultánea. (NBCO 2009)
Carcinoma lobular infiltrante. Este tipo de cáncer representa aproximadamente el 10
por ciento de todos los cánceres malignos invasivos es muy parecido al carcinoma
ductal infiltrante excepto que este se encuentra en el lóbulo. Se presenta con mayor
frecuencia en mujeres de entre 45 y 56 años de edad. El tumor crece en la última parte
de los lóbulos donde se produce la leche. Por lo general no aparece en las mamografías
por lo que es difícil diagnosticarlo, esto debido a sus características pero al tocarlo
podría sentirse como un engrosamiento del cuadrante superior exterior del seno (desde
el pezón hasta la axila) a medida que va infiltrando las paredes de los lóbulos. (NBCO
2009; Masiá 2009)
Finalmente existen otros tipos de cáncer de mama poco común:
Carcinoma inflamatorio. Involucra la piel del seno. Este tipo de cáncer representa
menos del 4 por ciento de todos los cánceres de mama que se diagnostican cada año. Sin
embargo se comporta de forma agresiva y crece con rapidez, los síntomas físicos del
carcinoma inflamatorio incluyen enrojecimiento de la piel del seno y una hinchazón
general del mismo. En algunos casos es posible que esté presente también un bulto o
masa. (NBCO 2009; Masiá 2009)
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31
Enfermedad de Paget. Afecta la piel del pezón y/o la areola con una apariencia de
eccema. Esta enfermedad puede estar asociada o no a un carcinoma ductal, pero tiene
incidencia muy baja; es menor al 1% de los cánceres de mama (Masiá 2009)
2.2.4.3. ETAPAS DE CÁNCER DE MAMA
Los oncólogos clasifican y diagnostican el cáncer de acuerdo a sus etapas, sin embargo para
determinar cada etapa del cáncer de mama se consideran tres factores importantes de su
desarrollo.
1. Tamaño del tumor. El tamaño de un tumor primario es una de las principales
características de diferenciación.
2. Estado ganglionar. Si hay presencia o ausencia de células cancerosas en los ganglios.
3. Metástasis. Si es que el cáncer se ha difundido desde la mama afectada hasta otra zona del
organismo como son tejido blando (mama opuesta, ganglios linfáticos lejanos o piel),
hígado, pulmones, cerebro y huesos.
Etapa 0
El carcinoma ductal o lobular in situ es el cáncer de mama muy temprano que no se ha
diseminado fuera del conducto o lobulillo.
Etapa I
El tumor mide dos centímetros o menos y no se ha diseminado fuera de la mama (Fig. 3).
Fig. 3. Imagen de la mama, en la cual se muestra la etapa 0 y I del cáncer de mama (Tomada de Novartis Oncology).
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Etapa IIA
El tumor mide dos centímetros o menos y se ha diseminado a los ganglios linfáticos axilares, o
mide de 2 a 5 centímetros pero no se ha diseminado a los ganglios axilares
Etapa IIB
El tumor mide de 2 a 5 centímetros y se ha diseminado a los ganglios linfáticos axilares, o
mide más de 5 centímetros y se encuentra únicamente en la mama (Fig. 4).
Etapa IIIA
No se encuentra tumor en la mama pero se ha diseminado a los ganglios linfáticos axilares que
están adheridos entre sí a otras estructuras, o el tumor mide 5 centímetros o menos y se ha
diseminado a los ganglios linfáticos axilares que están adheridos entre sí a otras estructuras, o
el tumor puede medir más de 5 centímetros y se ha diseminado a los ganglios linfáticos
axilares que pueden estar adheridos o no a otras estructuras.
Etapa IIIB
El tumor se ha diseminado a tejidos cercanos a la mama, ya sea la piel o la pared torácica
incluidas las costillas y músculos del tórax; y puede haberse diseminado a los ganglios
linfáticos dentro de la zona de la mama o debajo del brazo.
Fig. 4. Imagen de la mama, en la cual se muestra la etapa IIA y IIB del cáncer de mama (Tomada de Novartis Oncology).
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Etapa IIIC
El tumor se ha diseminado a los ganglios linfáticos debajo de la clavícula y cerca del cuello, y
puede haberse diseminado a los ganglios linfáticos de la zona de la mama o debajo del brazo y
a los tejidos cercanos de las mama (Fig. 5).
Etapa IV
Ocurre metástasis es decir que el tumor se ha diseminado a otros órganos del cuerpo, con más
frecuencia a los huesos, pulmones, hígado o cerebro (Fig.6).
Fig. 5. Imagen de la mama, en la cual se muestra la etapa IIIA, IIIB y IIIC del cáncer de mama (Tomada de Novartis Oncology)
Fig. 6. Imagen de la mama, en la cual se muestra la etapa IV del cáncer de mama (Tomada de Novartis Oncology).
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34
2.2.4.4. PROTEÍNA ASOCIADA AL CÁNCER DE MAMA
Receptores de estrógeno. Las hormonas estrógeno cumplen una función vital en la fisiología
reproductiva, ya que al unirse a sus receptores dentro de las células estimula el crecimiento y
la diferenciación celular (factores de crecimiento epidérmico o EGF), desencadenando la
proliferación de células que recubren las glándulas mamarias y preparándolas para producir
leche durante el embarazo. De igual manera promueve la proliferación de las células que
forman el revestimiento interior o endometrio, del útero, con lo que lo dispone para la posible
implantación del embrión. Los receptores de estrógeno son factores de transcripción ligando-
dependientes que se unen como homodímeros a sitios específicos de unión simétrica del ADN;
las interacciones ejercidas por el dominio de la proteína controlan la actividad del receptor.
Receptores inactivos se conservan en el citosol y son capaces de entrar en el núcleo solo
después de la unión del ligando y un posterior cambio conformacional. Al modular la
actividad de los factores de transcripción los estrógenos estimulan la proliferación celular.
Desafortunadamente y a pesar de los efectos benéficos importantes, también ocasiona daño.
Durante cada ciclo menstrual el estrógeno en condiciones normales desencadena la
proliferación celular que forma el revestimiento interior de las glándulas mamarias; si el
embarazo no ocurre los niveles de estrógeno disminuyen dramáticamente al final de cada
ciclo, en ausencia de estos las células de las glándulas que han proliferado se deterioran y
mueren; esto significa cientos de ciclos de división y muerte celular repetida en un periodo de
vida ocasionando un riesgo para la proliferación de células anormales o dañadas (Molina
2001, Márkes 2002, Wolfman 2005)
2.2.5. DIAGNOSTICO DEL CANCER DE MAMA
La mejor arma en la lucha contra el cáncer de mama es la detección temprana del tumor ya
que aumentarán las posibilidades de éxito del tratamiento, pues los oncólogos afirman que
puede ser hasta un 100% curable. Existen diferentes técnicas para su detección aunque
lamentablemente no son 100% efectivas. Estas son algunas de las principales con las que se
cuentan:
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35
Autoexploración o tacto. Esta técnica es de las primeras medidas y consiste en la
propia observación y palpación del seno, sirve para determinar la presencia de
alguna alteración en forma o tamaño normal del pecho.
Exploración clínica. La exploración clínica, incluye la inspección y
palpación tiene una especificidad de 90%, sin embargo muchos cánceres podrían
pasar inadvertidos al tener una sensibilidad entre el 40 y el 70%. Es útil con el
complemento de la mamografía para aquellas lesiones sin calcificaciones,
imperceptibles para el estudio radiológico o para detectar los tumores que aparecen
en el intervalo entre mamografías. El valor predictivo positivo oscila entre el 4 y el
50%. (Kösters. 2003).
Radiografía o Rayos X. Es una prueba sencilla de radiografía para observar si
existe alguna anomalía que deba ser considerada.
Mastografía. Esta técnica ha sido y sigue siendo una de las pruebas más eficaces
para el diagnóstico, el mastógrafo emplea rayos X de baja potencia; se realiza a
mujeres mayores de 40 años, la sensibilidad es aproximadamente del 70-80% y su
especificidad se encuentra alrededor del 5% -10%, (Chapman et. al. 2007); sin
embargo el valor predictivo de la mastografía disminuye cuando los pacientes
presentan tejido mamario denso, lesiones pequeñas y en mujeres pre-menopaúsicas
(Elmore et al. 2005), de igual manera cabe mencionar que estos porcentajes
dependen en gran medida del personal que opera e interpreta los resultados.
Biopsia. Es el diagnóstico definitivo que confirma el cáncer de mama esta prueba
consiste en tomar una muestra del tejido afectado para realizarle un análisis
histológico; la biopsia se puede realizar a través de diferentes pruebas según el tipo
de tumor y su localización (Muñoz et. al. 2007), las más comunes son:
a. Punción con aguja fina. Se realiza una pequeña punción de la masa tumoral a
través de la piel con una aguja finísima, suele realizarse de forma ambulatoria y
sin necesidad de anestesia.
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36
b. Biopsia con aguja gruesa. La punción se realiza con una aguja de mayor calibre
permitiendo obtener muestras de mayor tamaño y con mayor facilidad.
c. Biopsia abierta quirúrgica. Se extrae un fragmento del tejido tras realizar una
incisión en la mama.
Existen también algunas otras técnicas a las que no todas las mujeres pueden tener acceso por
ser demasiado costosas, como lo son:
Ecografía de mama. Esta técnica es complementaria, se realiza por medio de un
aparato que emite ultrasonidos los cuales terminan transformándose en imágenes.
Resonancia magnética nuclear (RMN). Es una técnica de imágenes muy
sofisticada se emplean ondas magnéticas para crear imágenes altamente precisas en
el interior de la mama, y aunque detecta con mucha exactitud también puede llegar
a confundir lesiones benignas con cáncer (NCCN 2007).
Tomografía axial computadorizada (TAC). Esta técnica obtiene imágenes
mediante rayos X que permiten el estudio de todo el cuerpo con gran facilidad, se
le usa mayormente para observar hasta qué punto se ha extendido el cáncer de
mama y diagnosticar posibles metástasis (Esserman et. al. 2007).
Tomografía por emisión de positrones (PET). Esta herramienta es de las más
sofisticadas y solo se indican en casos muy específicos, consiste en utilizar radio-
fármaco capaz de fijarse en zonas cancerosas, y para localizar posibles metástasis
que no se pueden detectar mediante otras técnicas (SIGN 2005).
Marcadores tumorales. Permiten detectar la actividad del tumor y las posibles
metástasis a distancia, ya que al ser sustancias que segrega el metabolismo del
tumor se pueden encontrar en la sangre y orina del paciente (INC 2007).
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37
2.3. MARCADORES TUMORALES
Las transformaciones de una célula normal a una célula cancerosa se relacionan con la
alteración de los genes encargados de la regulación y expresión de proteínas (Tzu-Chia Lai et
al. 2010). Por lo que el entendimiento de esta relación contribuye al estudio de nuevas técnicas
de diagnóstico, como es el caso de marcadores tumorales; así mismo los avances de la biología
molecular han permitido descubrir nuevos marcadores que ya se han incorporado a la práctica
clínica y que brindan una importante información acerca del comportamiento biológico del
tumor.
2.3.1. DEFINICIÓN
Un biomarcador es una molécula biológica que "marca" o indica los cambios que pueden ser
medibles y/o detectables, ya sean bioquímicos, fisiológicos o morfológicos asociados a una
enfermedad o patología.
Los marcadores tumorales (MT) son indicadores bioquímicos de la presencia de un tumor.
Incluyen antígenos de superficie celular, proteínas citoplasmáticas, enzimas y hormonas. En la
práctica clínica el término se utiliza referido a moléculas que pueden ser detectadas en plasma,
fluidos corporales, tumores sólidos, células tumorales circulantes, ganglios linfáticos y médula
ósea (Coronato et. al. 2002).
2.3.2. CLASIFICACIÓN
En los últimos años se ha ampliado el espectro de marcadores en cáncer de mama, debido a los
avances de la biología molecular que está estudiando a profundidad los eventos de la
carcinogénesis, la progresión tumoral y los mecanismos de producción de la metástasis. Estos
marcadores pueden clasificarse en base a sus características biológicas (Coronato et. al. 2002):
Marcadores de proliferación: están presentes en determinadas fases del ciclo
celular. Factores de crecimiento y hormonas: estimulan el crecimiento tumoral.
Receptores: su sobreexpresión o su presencia alterada puede estar presente en
algunos tipos de células tumorales.
Receptores para estrógenos (RcE): cuya presencia es indicadora para asentar
una terapia hormonal.
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38
Angiogénesis y factores del microambiente: favorecen la progresión de la
neoplasia.
Moléculas de adhesión y expresión de proteasas: permiten la invasión y la
metástasis.
Oncogenes y genes supresores: su amplificación o sobrexpresión se asocia con
la desregulación del crecimiento y la apoptosis.
Proteínas inducidas por estrógenos.
Mucinas: su detección en la circulación se utiliza como índice de enfermedad.
2.3.3. MARCADORES TUMORALES DE CÁNCER DE MAMA
Se han establecido algunos marcadores diagnósticos, pronósticos y predictivos que han
contribuido de manera importante al diagnóstico y tratamiento; dentro de estos se han
reportado biomarcadores de tipo genético para cáncer de mama como HER-2 (Receptor 2
del factor de crecimiento epidérmico humano), es una proteína la cual participa en el
crecimiento normal de las células y es encontrada en altas concentraciones ante la presencia de
un tumor, este proto-oncogén se sobre-expresa aproximadamente en 20-25% de los casos de
cáncer de mama primario frecuente mente en carcinoma in situ, y además tiene un pronóstico
desfavorable, se le relaciona con un estado agresivo del mismo, así como con presencia de
ganglio positivos (Tanja Fehm et. al. 2007). Los biomarcadores genéticos BRCA-1 y BRCA-2
se han encontrado en mujeres con riesgo de predisposición hereditaria a padecer la
enfermedad, se ha observado que se encuentra presente entre el 5-10% de los casos que se
diagnostican; codifican fosfoproteínas nucleares que interactúan con múltiples procesos
biológicos incluyendo fundamentalmente reparación del ADN dañado, regulación de la
transcripción, duplicación del centrosoma y regulación negativa del ciclo celular. Por lo tanto
funcionan como activos inhibidores de la progresión neoplásica (Laronga et. al. 2007). Las
mutaciones de BRCA-1 están asociadas a aparición de cáncer de mama en mujeres entre 40 y
50 años y también con el riesgo de padecer otros tumores, por ejemplo de ovario. Las
mutaciones de BRCA-2 están asociadas a la aparición de cáncer a edades más avanzadas, entre
60 y 70 años, y en la población en general con la predisposición de padecer cáncer de mama
en varones, de ovario, vejiga, próstata y páncreas (Lee et. al. 1999).
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39
El oncogén p53 el cual es un gen supresor de tumor cuya función es eliminar e inhibir la
proliferación anormal de las células, en situaciones normales se encuentra en bajos niveles,
pero en situaciones tumorales se ve sobre expresado, debido a que es un factor de
transcripción y que regula la transcripción de un conjunto de genes que son clave para generar
tumores, no solamente se encuentra presente en neoplasias de mama sino que está presente en
distintos tipos de cáncer. Basados en este tipo de receptores o moléculas, el cáncer de mama
puede diferenciarse en varios tipos, como HER2/neu positivos, se encuentran aquellos que
permiten la reclasificación de cáncer de mama: receptor de estrógenos (RE), receptor de
progesterona (RP) y HER/neu; un tercer grupo de cáncer que no se encuentra o se clasifica
dentro de estos tres grupos y que por ello se han denominado triple negativo y los cuales
presentan la peculiaridad de ser más agresivos y para los cuales no existen tratamientos
específicos (Awadallah et. al. 2004).
En la mayoría de los casos, el cáncer solamente puede ser diagnosticado mediante una biopsia
(la cual consiste de extraer algunas células del tumor para que puedan ser analizadas mediante
pruebas inmunohistoquimicas y verse por medio de un microscopio si son o no cancerosas).
Este tipo de marcadores tumorales pueden ser útiles para determinar si el cáncer es probable.
Y si el cáncer ya se encuentra propagado al momento de su detección, los marcadores
tumorales pueden servir así mismo para determinar en dónde se originó (Desmetz et. al.
2009).
2.3.3.1. ANTÍGENOS ASOCIADOS AL TUMOR (AATs) EN CÁNCER DE MAMA
Por los motivos descritos en el párrafo anterior, identificar marcadores tumorales específicos
y que sean capaces de provocar una respuesta inmune temprana en contra del tumor, parece
ser una condición ideal para el diagnóstico temprano en el cáncer de mama.
Se ha reportado en la literatura Autoanticuerpos o Antígenos Asociados a Tumor (AATs).
Los tumores expresan una gran variedad de proteínas que son aberrantes o están reguladas en
forma anormal, por lo que son capaces de producir una respuesta inmune; estudios han
demostrado que la presencia de estos AAT puede surgir meses o incluso años antes del
diagnóstico clínico de un tumor (Tong et. al. 2009, Chapman et al. 2007), y por consiguiente,
en el suero se puede encontrar la presencia de estos AAT (Pereira-Faca SR et. al. 2007).
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40
A la fecha se ha reportado que proteínas como CA27.29, CA15.3 y MUC1 se alteran durante
cambios malignos en las glándulas mamarias por la acción de glicosilación (adición de
carbohidratos a la proteína) o incrementando su expresión; sin embargo no es específica para
cáncer de mama ya que una proporción de pacientes con neoplasia de próstata, ovario y
páncreas también presentan elevación en los niveles de esta mucina. El 50% de las pacientes
de cáncer de mama en estadio IV y entre el 10 y 20% en estadio II, presentan valores elevados
en alguna de estas proteínas, tiene un 23% de sensibilidad y un 69 % de especificidad para
cáncer de mama, (Kirmiz et. al. 2006). La presencia de anticuerpos contra el proto-oncogén c-
erbB-2/HER2/neu, solo se ha visto en el 11% de los casos (Disis & Cheever 1997). El
antígeno carcinoembrionario (CEA) sólo ha sido descrito para la detección o el monitoreo de
un estado avanzado del cáncer (Park et al. 2008). Se ha observado la presencia de
autoanticuerpos anti-p53 en el 15% de los pacientes con cáncer de mama (Lenner et. al.1999;
Soussi et. al. 2000). Actualmente se han reportado anticuerpos contra ciclofilina A, que
pertenece a un grupo de proteínas con actividad peptidil-prolil cis-trans isomerasa (PPIA),
identificado como receptor intracelular para la ciclosporina A. La formación de auto-
anticuerpos en pacientes con cáncer de mama es del 80%. TPI (triosa fosfato isomerasa) es
una enzima de expresión ubicua en tejidos con alta actividad glucolítica, de igual manera se ha
reportado la formación de autoanticuerpos en el 90% de los pacientes con cáncer de mama
(Desmetz et. al. 2009; Tamesa et. al. 2009). FKBP52 es una proteína de unión de la familia de
las inmunofilinas, estas proteínas están involucradas en la regulación de la respuesta inmune y
en procesos celulares básicos como el plegamiento de las proteínas. Es una proteína es una
prolil cis-trans isomerasa y se le relaciona con el cáncer de mama, el 72.8% de los pacientes
generen auto-anticuerpos contra FKBP52 esto debido a que se asocia con dos proteínas de
choque térmico (Hsp90 y Hsp70) desempeñando un una función en el tráfico intracelular de
hormonas esteroideas. La peroxirredoxin 2 o PRDX2 es una enzima perteneciente la familia
de los antioxidantes de peroxirredoxina, las cuales reducen el peróxido de hidrógeno y los
hidroperóxidos de alquilo. Esta enzima tiene una función protectora antioxidante en las células
y contribuye con la actividad antiviral de las células T CD8(+). Puede tener un efecto de
proliferación en el desarrollo del cáncer, se reportado que el 64.9% de pacientes presentan
auntoanticuerpos contra esta proteína (Desmetz et. al., 2009). De igual manera se han
reportado anticuerpos contra 2-HS Glycoproteina (AHSG) los cuales están presentes en un
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41
79% de pacientes con cáncer de mama (Kyo Yi et. al. 2009). Se ha sugerido que esta proteína
tiene actividad biológica como antagonista del factor de crecimiento transformante β1; está
asociado con la progresión de tumoral así como inmunosupresor hospedero. AHSG bloquea el
factor de crecimiento transformante β1 uniéndose a los receptores celulares de superficie y
suprime la señalización del factor de crecimiento transformante β. Desde este punto de vista la
formación de autoanticuerpos puede neutralizar la función de AHSG que normalmente
suprime la progresión del cáncer de mama (Kyo Yi et. al. 2009).
2.4. PROTEÓMICA
Las proteínas son lo que se podría llamar los arquitectos de la vida, pues son cruciales en los
procesos celulares de todos los seres vivos. Las proteínas están implicadas en la catálisis de las
reacciones químicas celulares, en el transporte de moléculas, transducción de señales, la
segregación del material genético, la producción y el manejo de energía. El trabajo celular
vital necesita de muchos tipos diferentes de proteínas.
La proteómica es la nueva etapa en la investigación biológica que emana naturalmente como
continuación de la genómica; pero vinculada fuertemente a esta, la genómica y los genomas
no responden de qué manera se da el funcionamiento del organismo, mientras que el genoma
de un individuo permanece constante a lo largo de su vida, el proteoma es dinámico y
cambiante, según la edad, condición y tipo celular entre otros; por lo tanto es necesario
estudiar las proteínas (Mojica et. al. 2003).
2.4.1. DEFINICIÓN
La proteómica es el estudio y caracterización del todo el conjunto de proteínas expresadas de
un genoma (proteoma). Puede definirse como el estudio sistemático de secuencias de
proteínas, su expresión, cantidad, isoformas, estado de modificación postraduccional,
interacción con otras proteínas, actividad bioquímica, función celular, localización subcelular
y estructura en algún momento dado de algún tipo de célula. Por otra parte se le ha dado el
término de oncoproteómica al estudio de las proteínas y sus interacciones con células
cancerosas (Cho. 2007).
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42
2.4.2. TÉCNICAS DE ESTUDIO Y CLASIFICACIÓN
El proteoma de una célula varía según el estado en el que se encuentre la célula, si se encuentra
en una situación de estrés, bajo el efecto de fármacos o de una hormona. Así, en cada momento
y en cada tipo celular el perfil de proteínas expresadas será diferente. Las técnicas de la
proteómica abordan el estudio de este conjunto de proteínas. La Proteómica permite identificar,
categorizar y clasificar las proteínas con respecto a su función y a las interacciones que
establecen entre ellas. De este modo, se pueden caracterizar las redes funcionales que establecen
las proteínas y su dinámica durante procesos fisiológicos y patológicos. La proteómica se está
aplicando en la identificación de nuevos marcadores para el diagnóstico de enfermedades, la
identificación de nuevos fármacos, la determinación proteínas involucradas en al patogenia de
enfermedades y el análisis de procesos de transducción de señales (BioMol 2007).
La proteómica puede ser clasificada de varias formas, de acuerdo con el interés del
investigador:
a) Proteómica de expresión. Es el estudio cualitativo y cuantitativo de las proteínas en
procesos biológicos complejos que involucran cambios en su expresión. Se puede comparar
la expresión del proteoma completo o subproteomas para identificar proteínas nuevas o que
aumenten su expresión, que a su vez pueden ser etiquetadas como biomarcadores específicos
de una enfermedad. b) Proteómica estructural. Mapear la estructura de los complejos
proteínicos o de las proteínas presentes en organelos celulares específicos. Identificar todas las
proteínas que forman un complejo proteínico u organelo como el núcleo o la mitocondria;
determinar su localización subcelular y la arquitectura total de la célula.
c) Proteómica funcional. Describir las funciones realizadas por las proteínas codificadas en
el genoma. Identificar las interacciones proteína-proteína en un complejo proteínico o
subproteoma, al determinar las vías de esas interacciones y finalmente inferir la participación
funcional de proteínas individuales. Las estrategias proteómicas específicas y dirigidas
utilizadas en la proteómica funcional pueden dar información muy importante sobre el
señalamiento de proteínas, mecanismos de enfermedad o interacciones de proteína-droga
(Oliva et. al. 2007).
Las técnicas más usadas en la proteómica se basan en la electroforesis bidimensional y en la
espectrometría de masas.
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43
2.4.2.1. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
La electroforesis es la técnica central para analizar un número grande de proteínas al mismo
tiempo. La técnica electroforética es relativamente antigua, fue inventada hace más de 50 años
por Tiselius, y en 1956 Smithies y Poulik describieron el primer gel en dos dimensiones
(mapas proteómicos); mientras que en 1975 Patrick O´Farell optimizo el proceso de
separación de 2D. Actualmente la electroforesis 2D permite obtener mapas proteómicos los
cuales se emplean en estudios comparativos de patrones proteicos de diferentes individuos;
por ejemplo un patrón de proteínas de un individuo sano frente a un individuo enfermo, o de
un mismo individuo expuesto a diversas condiciones ambientales o experimentales.
La electroforesis bidimensional es la técnica que permite la separación de mezclas complejas
de proteínas, la separación se hace en dos etapas consecutivas; en la primera dimensión se
efectúa el isoelectroenfoque utilizando gradientes inmovilizados de pH, es decir; las proteínas
se separan en función de su carga, avanzando en un campo eléctrico hasta alcanzar un valor de
pH igual a su punto isoeléctrico (donde su carga es igual a cero). En la segunda dimensión la
separación de las proteínas se hace en presencia de dodecil-sulfato de sodio (SDS) y las
proteínas son separadas entre sí en función de su masa molecular. La correcta preparación de
las muestras es frecuentemente el paso más importante para un resultado exitoso y la
visualización de este resultado muestra el conjunto de proteínas presentes en la mezcla inicial
(Hanash 2003, Mojica et. al. 2003, BioMol 2007).
2.4.2.2. ESPECTROMETRÍA DE MASAS
La espectrometría de masas es una herramienta útil en la identificación de las proteínas ya que
complementa las técnicas de la proteómica. Las manchas del gel son extraídas y cada una es
tratada con tripsina para producir un patrón característico de péptidos que se identifican por
MS. La espectrometría de masas se fundamenta en la separación de partículas moleculares por
su diferente masa (en este caso la masa de los péptidos producidos por digestión con tripsina)
la cual es medida con gran precisión. Los espectrómetros de masas tienen dos partes: una
fuente de iones (MALDI o ESI) y otra un aparato medidor (cuádruplos, trampas iónicas, y
TOF). Las combinaciones de estas técnicas más utilizadas son:
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MALDI-TOF-MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight Mass
Spectrometry) o Espectrometría de masas basada en la desorpcion ionización asistida por una
matriz solida de rápida ocurrencia. Esta identificación de proteínas ocurre cuando están
inmovilizadas en una membrana o en una matriz de un gel.
MALDI o ESI-MS Electro Spray Ionization Mass Spectrometry) o espectrometría de masas
por ionización en electroatomizado. Esta técnica analiza proteínas inmovilizadas en
membranas o eluídas y digeridas en geles.
Los datos que salen de la técnica de espectrometría de masas son fingerprints o huellas
digitales de péptidos separados por su masa. La identificación de las proteínas se hace por
aprendizaje de máquina, refiriendo los patrones particulares de MS a una base de datos
(Domol y Hebersold 2006).
2.5. INMUNO-PROTEÓMICA
El “Western Blot” es una técnica utilizada para identificar y localizar proteínas en función de
su capacidad para unirse a anticuerpos específicos. Primero las proteínas son separadas por
electroforesis unidimensional o bidimensional; posteriormente las proteínas se transfieren a
una membrana de nitrocelulosa manteniendo el mismo patrón que en el gel; esta transferencia
es incubada posteriormente con los anticuerpos específicos para finalmente ser mostradas
mediante un sustrato que revela por coloración (Liu et al. 2008).
La técnica de “Western blot” permite detectar proteínas del interés dentro de una mezcla
compleja de proteínas. Así mismo puede proporcionar información sobre el tamaño de la
proteína (con respecto a un marcador de tamaño o escala en kDa), y también da información
sobre la expresión de proteínas (con respecto a un control como muestra no tratada o de otro
tipo de muestra). Se han publicado algunos artículos en los que se utilizan ensayos de
“Western Blot” combinados con técnicas proteómicas (Kyo Yi et al. 2009, John A. Mclntyre
et al. 2009, Liu et al. 2008) en los cuales se reportan proteínas/antígenos asociados a tumor en
algunos tipos de canceres.
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45
3. JUSTIFICACIÓN
Al igual que ocurre en el caso de la genómica, la proteómica aplicada al cáncer se ha
centrado fundamentalmente en la búsqueda de marcadores tumorales de tipo proteico
expresados diferencialmente en tumores, de la misma forma que ocurre con la búsqueda de
nuevos blancos terapéuticos (Hanash 2003); ya que el suero sanguíneo provee información de
gran valor para esta búsqueda debido a que contiene gran cantidad de proteínas (Barba et. al.
2007), esta es una fuente ideal para nuestros fines. Se han reportado a nivel experimental
pruebas para detectar el cáncer de manera temprana, sin embargo la mayoría de los
biomarcadores tumorales están muy lejos de ser sensibles y específicos
Es de gran relevancia la búsqueda e identificación de biomarcadores que sean más sensibles y
específicos, que aplicados a nuevos métodos rápidos y sencillos, permitan identificar el cáncer
de mama en etapas tempranas, para poder de esta manera contribuir en un diagnóstico
oportuno y brindar una mejor calidad de vida para las mujeres que presenten Cáncer de mama,
se sabe que si el cáncer de mama es diagnosticado y tratado cuando aún se encuentra
específicamente en la mama, es decir en etapas I y II, la tasa de éxito del tratamiento es
cercana al 100%. El uso de la mastografía ha demostrado su eficacia puesto que se ha
observado una reducción de la mortalidad entre un 20 y 35% en mujeres con edades entre 40 y
69 años. La sensibilidad de la mastografía es alrededor del 70%-80% y su especificidad del
5%-10%, pero estos porcentajes dependen del personal que opera e interpreta los resultados,
sin contar con que su valor de predicción disminuye cuando algunas mujeres presentan tejido
mamario denso, lesiones pequeñas o se encuentran en estado pre-menopaúsico; por lo que
estos estudios proteicos de los sueros de mujeres con cáncer de mama e individuos sanos
mediante proteómica e inmuno-proteómica; permitirá identificar proteínas (biomarcadores) las
cuales estén relacionadas de manera directa a lesiones mamarias tempranas, y por consiguiente
que tengan el potencial para ser utilizadas en nuevos métodos de diagnóstico no invasivo, así
mismo puedan ser usadas como pruebas de tamizaje y/o apoyo para los métodos utilizados en
la actualidad como la mastografía y la biopsia. Propiciando la obtención de diagnósticos en
etapas tempranas y por consecuencia una mejor respuesta y efectividad de los tratamientos.
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46
4. HIPOTESIS
Mediante el análisis comparativo de mapas proteómicos y ensayos diferenciales de inmuno-
blot es posible encontrar marcadores tumorales en sueros de mujeres con cáncer de mama en
etapas tempranas.
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47
5. OBJETIVOS
5.1. GENERAL:
Identificar y caracterizar marcadores tumorales provenientes de sueros de pacientes con cáncer
de mama en etapas tempranas.
5.1.1. PARTICULARES:
5.1.1.1. Clasificar las muestras de sueros de pacientes con cáncer de mama en
etapas tempranas, así como de individuos sanos.
5.1.1.2. Obtener los mapas proteómicos de pacientes con cáncer de mama y de
individuos sanos.
5.1.1.3. Comparar estos mapas proteómicos mediante análisis in silico, e identificar
proteínas diferenciales
5.1.1.4. Identificación de autoantígenos y autoanticuerpos asociados a cáncer de
mama.
5.1.1.5. Caracterizar las proteínas encontradas.
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48
6. METODOLOGÍA
6.1. DISEÑO DE EXPERIMENTAL
La etapa de los experimentos dio inicio en el mes de septiembre de 2008 y finalizo en
septiembre de 2010, para este estudio se seleccionaron dos grupos comparativos: individuos
sanos los cuales se utilizaron como controles y pacientes con cáncer de mama los cuales
fueron las muestras de interés.
En este diseño se plantearon dos vías:
1) Obtener mapas proteómicos, en donde se consideraron un total de 20 muestras controles y
20 muestras de cáncer.
2) Ensayos de inmuno-blot con un total considerado de 20 muestras para los controles y 20
para cáncer.
6.1.1. CRITERIOS DE INCLUSIÓN PARA LOS PACIENTES
De las muestras sanguíneas se obtuvieron los sueros, provenientes de la clínica de displasias
del Centro Médico Nacional de Occidente (CMNO) del estado de Jalisco. En pacientes
(mujeres) con cáncer de mama vírgenes, es decir; recién diagnosticadas y sin tratamiento
alguno, como son quimioterapia, radioterapia y/o cirugía. Y en individuos sanos voluntarios
que no presentaban ningún tipo de lesión o enfermedad. La donación de sangre fue de mujeres
con edades de 25 a 60 años que fueron inicialmente diagnosticadas mediante mastografía y el
diagnostico posteriormente confirmado por biopsia. Estas mujeres en un inicio se realizaron el
estudio de rutina por mastografía, y tras ser diagnosticadas se clasificaron por el estado de la
neoplasia que presentaban; las muestra de sangre fueron tomadas solamente después de
obtener el consentimiento informado por escrito para este estudio.
Las muestras de sangre obtenidas de individuos sanos fueron de mujeres donantes voluntarias
a las cuales también se les realizaron los estudios de rutina para comprobar su buen estado de
salud, al igual que con las pacientes de cáncer se les informo de los fines de este estudio (ver
anexos).
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49
6.1.2. MODELO ESTADÍSTICO
De acuerdo a las características para este estudio en donde las muestras son variables de tipo
cualitativo con comparación entre los dos grupos: Individuos sanos vs Pacientes con cáncer de
mama, se determinó que los modelos estadístico más adecuados serían:
1) Para la comparación de los mapas proteómicos se realizó un análisis in sillico en donde el
software utiliza el modelo de Carl Gauss y “t-Test” o “t-Student” con una confiabilidad
del 95%
2) Para inmunoblot se plantearon: a) Modelo binomial Bernoulli (no paramétrico) ya que se
consideró adecuado debido sus características en donde el espacio muestral contiene
solamente dos resultados posibles que se denominan éxito (E) y fracaso (F), este nos
ayudara a determinar en qué porcentaje es posible encontrar AATs en los pacientes con
cáncer de mama. b) Prueba de Ji-cuadrada (X2), es una prueba de independencia y de
ajuste en la estimación de las varianzas, en donde tenemos dos variables aleatorias
independientes con una distribución normal, la cual nos ayudara a identificar que tanto
influye el estado de salud de los pacientes con cáncer de mama para la búsqueda de AATs
(Gutiérrez 2008., Gil. 1998).
Para analizar las que edades de ambos grupos no fueran un factor que influyera en los
resultados se utilizó una prueba t-Test la cual determina la diferencia entre las medias de las
dos poblaciones con una confiabilidad del 95%.
6.2. MATERIALES Y MÉTODOS
6.2.1. OBTENCIÓN DE LOS SUEROS
Las muestras de sangre fueron obtenidas por personal de CIBO-IMSS, se tomaron del
antebrazo de las pacientes con cáncer de mama y de voluntarias sanas, se utilizaron tubos
vacutainer de 5ml para ser posteriormente centrifugadas a 3,000rpm/15min 20oC, para obtener
el suero. Una vez obtenidos los sueros se almacenaron en tubos Eppendorf alícuotas de 500µl
del suero a -72oC hasta el momento de su uso.
Fig. 7. Toma de una muestra de sangre para la obtención de suero.
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50
6.2.2. INTERPRETACIÓN DE MASTOGRAFÍA
El diagnóstico inicial se realizó por medio de BI-RADS (Breast Imaging Report and Database
System) que es el reporte estándar de interpretación a mastografía o rayos X. Este reporte se
encuentra dividido en 6 categorías las cuales se describen en la siguiente tabla:
Tabla 1. Clasificación de los estados BI-RADS
Diagnóstico
BI-RADS: Reporte estándar de interpretación a mastografía o RX
BIRADS 0
Negativo, no es posible detectar alguna patología
BIRADS I
No maligno sin ganglios ni alteraciones 0% probable
BIRADS II
Negativo a malignidad, hallazgos benignos (ganglios, calcificaciones), 0% de posibilidades de cáncer.
BIRADS III
Probable benignidad, requiere control a 6 meses. (Nódulos circunscritos o algún grupo pequeño de calcificaciones). 2.24% de posibilidades de cáncer.
BIRADS IV
Resultado dudoso de malignidad. Requiere una confirmación histopatología. Consta de 3 grados de acuerdo con su porcentaje de malignidad que van del 3 al 94%
BIRADS V
Alta sospecha de malignidad. Requiere biopsia para confirmar diagnóstico. > de 95% de posibilidades de malignidad.
BIRADS VI
Malignidad comprobada mediante biopsia.
La confirmación inicial del diagnóstico que se obtuvo por medio de BI-RADS se realizó en la
unidad de radiología del Centro Médico Nacional de Occidente del Instituto Mexicano del
Seguro Social, y el diagnóstico definitivo mediante biopsia por ensayos de
inmunohistoquímica.
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51
6.2.3. CLASIFICACIÓN DE LOS SUEROS
Dentro de los datos que se obtuvieron, se encuentra la edad de los pacientes, la fecha en la que
se tomó la muestra, la fecha de diagnóstico y el tipo de diagnóstico. Las muestras de suero
fueron obtenidas y procesadas en el centro de investigaciones biomédicas de occidente
(CIBO). Se clasificaron de acuerdo al número de pacientes y al estado que presentaban (Ver
anexos)
6.2.4. ESTANDARIZACIÓN DE LA electroforesis de proteínas en DOBLE DIMENSIÓN (2-DE) DE LOS SUEROS
Para poder realizar el análisis comparativo de los sueros por 2-DE se estandarizaron las
condiciones de electroforesis en dos dimensiones y la preclarificación de los sueros; esto
debido a que el suero contiene cientos de proteínas con concentraciones que van de 60-80 mg
de proteína por ml (Mark et. al. 2005). La albumina en el suero humano representa más del
60% de la proteína total presente en este, por lo que esta alta concentración oscurece la
detección de proteínas de baja abundancia (Adkins et. al. 2002). Para que estos sueros puedan
ser fácilmente utilizados y de manera confiable es indispensable eliminar o por lo menos
disminuir significativamente estas proteínas abundantes como son, albumina,
inmunoglobulinas (IgG, IgA, IgM, IgD), Transferina, Fibrinogeno, Macroglobulinas,
Antitripsina, Haptoglobulina, Glycoproteína acida, Ceroloplasmina, Apoliproteínas entre otras
(Pietrowska et. al. 2009).
Para este fin se utilizaron 3 métodos:
1. ProteoSeek™ Albumin/IgG Removal Kit (Pierce).
2. Proteoprep® 20 Plasma Inmunodepletion Kit (Sigma-Aldrich).
Fig. 8. Kit para deplesión de proteínas abundantes (Sigma).
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52
3.
4.
5. Columna Superdex 75 10/300GL (GE Healtcare).
Se siguieron los protocolos de fabricante cada uno de los kits evaluados. Los mejores
resultados se obtuvieron con el kit Proteoprep® 20 Plasma Inmunodepletion, por lo que este
método fue el que se utilizó para la reducir la cantidad de proteínas mayoritarias los sueros.
6.2.5. DEPLESIÓN DE SUEROS
Se tomaron 30µl de suero y se mezclaron con buffer de equilibrio proveniente del kit, estas
mezclas fueron ultra-sonicadas durante 20 min en un ultrasonicador Branson 5510, las
muestras se concentraron en un concentrador de vacío “Speedvac Vacufuge™ Eppendorff”,
durante 1h /30°C. Posteriormente las muestras de sueros se pasaron 2 veces por la columna del
kit incubando durante 15 min cada vez; estos sueros pasados por la columna se precipitaron
con acetona fría 1:4 v/v, 1h. /4°C; y finalmente fueron centrifugadas a 9,000 rpm/10 min a
4°C. (Ver apéndice)
6.2.6. DOBLE DIMENSIÓN
6.2.6.1.Preparación de los sueros para la primera dimensión
La pastilla de proteínas obtenida se re-solubilizó en un volumen final de 125µl de Buffer de
hidratación el cual contiene: solución de rehidratación (Urea 7M, Thiourea 2M, CHAPS),
DTT 1M e IPG Buffer (4-7) 20mM; con cantidades de 118.0µl, 6.125µl y 0.875µl
respectivamente. Se utilizaron tiras de gradiente inmovilizado de pH (IPG) lineales de 7cm,
gradiente pH 4-7 (Bio-Rad). La muestra se dejó hidratando en las tiras IPG durante 16 horas.
6.2.6.2.Primera dimensión
Las tiras IPG con el contenido de muestras de suero se colocaron en la charola del
isoelectroenfoque y fueron cubiertas con aceite mineral (Bio-Rad). Las condiciones de corrida
del Isoelectroenfoque (IEF) fueron las siguientes: 1 Stp 300V/2:30 min, 2 Grd 1000V/0:30
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53
min, 3 Gd 5000V/1:30 min, 4 Stp 5000V/0:35 min. En el equipo Ettan IPGphor3 (GE
Healtcare) Figura 9.
Una vez terminada la electroforesis en 1-D por medio del IEF, las tiras IPG fueron
equilibradas con buffer de equilibrio (ver apéndice) y DTT (1% w/v) por 20 min y
posteriormente con buffer de equilibrio y Yodoacetamida (2.5% w/v) por 20 min.
6.2.6.3.Electroforesis segunda dimensión
La electroforesis se realizó en geles preparativos (con un pozo a lo largo del gel) de
poliacrilamida a una concentración 13% (ver apéndice). En el equipo Mini-Protean Tetra
Electrophoresis System (Bio-Rad). Se colocaron las tiras IPG en la parte superior del gel para
la separación de las proteínas por peso molecular y se colocaron marcadores de peso
molecular (Broad Range de Bio-Rad) y se sometieron a 130V/90 min Figura 10.
Fig. 9. Equipo Ettan IPGphor3 donde se realiza la primera dimensión o Isoelectroenfoque.
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54
Finalmente los geles de poliacrilamida fueron teñidos con un kit de plata (compatible con la
técnica de MS) para visualizar las proteínas (Proteo Silver™ Stain Kit de Sigma-Aldrich).
(Ver apéndice).
6.2.7. ANALISIS DE DOBLE DIMENSIÓN
Las imágenes de los geles obtenidos mediante electroforesis bidimensional fueron capturadas
con el equipo Molecular Imager ® Gel Doc XR ™ (BioRad) y analizados con el software
Quantity One Software (Bio-Rad) para calcular el peso molecular de las proteínas. El análisis
in sillico de los mapas proteómicos fue realizado con software PDQuest Advanced 8.0.1 (Bio-
Rad).
6.2.8. INMUNO-BLOT DE DOBLE DIMENSIÓN
6.2.8.1.Electrotransferencia de 2-DE y bloqueo de membrana
Se realizaron ensayos de inmunoblot en doble dimensión. Los geles 2-DE al 13% que
contenían las proteínas aun sin teñir, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa
(Amersham™ Hybond™-ECL-GE Healthcare), en el equipo para electrotransferencia Electro-
eluter (Bio-Rad) a 100v/1h. Terminada la transferencia de las proteínas se bloqueó la
membrana con leche al 5% / PBS-Tween20 0.5% durante 16h. Se realizaron 4 lavados con
20 ml de PBS-Tween20 0.1%.
6.2.8.2.Incubación del primer, segundo anticuerpo y revelado de la membrana
Las membranas posteriormente fueron incubadas con el anticuerpo primario: sueros de
pacientes con cáncer de mama y sueros controles (individuos sanos); a una dilución 1:200
(100µl suero en 20ml PBS-Tween20 0.5%) durante 18h a 4ºC. Se realizaron nuevamente 4
lavados con 20 ml de PBS-Tween20 0.1%.
Fig. 10. Equipo para electroforesis Mini-Protean Tetra Electrophoresis System
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55
Se incubo el anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa de rábano picante (“horseradish
peroxidase-conjugates goat anti-human immunoglobulin”, Jackson) a una dilución 1:2000 por
2,5 h. Se realizaron 5 lavados con 20 ml de PBS-Tween20 0.05%. La reacción se visualizó
mediante quimioluminiscencia con revelador de color para HRP (Hot Rabbit Peroxidasa) de
BioRad. (Ver apéndice), finalmente se detuvo la reacción con agua corriente.
6.2.9. ANALISIS POR INMUNOBLOT DE SUEROS DE PACIENTES
6.2.9.1.Electroelusión de las proteínas de 2-DE
Para validar de manera individual lo que se observó de las membranas obtenidas por inmuno-
blot en 2-DE, se realizaron ocho geles 2-DE; los cuales contenían las proteínas
correspondientes las manchas reveladas en los ensayos anteriores de inmuno-blot, estas fueron
removidas de los geles 2-DE, se les realizo una electro-elución (ver apéndice) para separarlas
del gel de poliacrilamida por un periodo de 4 horas a 10 mA en el “Electro-Eluter”-422
(BioRad).
6.2.9.2. Electrotransferencia 1-D y bloqueo de la membrana
A todo el purificado de la proteína que se obtuvo mediante electroelusión, se le realizo
electroforesis de 1-D en un gel preparativo (un solo poso a lo largo del gel) de poliacrilamida
al 11%. Las proteínas separadas mediante SDS-PAGE fueron transferidas a una membrana de
nitrocelulosa (Amersham™ Hybond™-ECL-GE Healthcare), en el equipo para
electrotransferencia “Mini Trans-Blot” (Bio-Rad) 100v/1h. Se bloqueó la membrana con leche
al 5% / PBS-Tween20 0.05% durante 16h. Se realizaron 4 lavados con 20 ml de PBS-
Tween20 0.1%.
6.2.9.3. Incubación con sueros de pacientes
Después de bloquear, se obtuvieron pequeñas fracciones (en tiras) de la membrana de
nitrocelulosa y se incubaron durante 18 horas a 4 ° C, con sueros de 20 controles (individuos
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56
sanos) y 25 pacientes con cáncer de mama, utilizados de manera individual para las tiras
(1:100 dilución), las membranas fueron lavadas con PBS-Tween20 0,1%.
6.2.9.4. Incubación del segundo anticuerpo
La membrana se incubó 3 horas con el anticuerpo (“conjugated goat anti-human” IgG (H + L)
marcado con biotina (KPL), dilución 1:5000, se realizaron 4 lavados con PBS-Tween20 0,1%,
y fueron incubadas posteriormente con HRP-estreptavidina peroxidasa (KPL) por 30 minutos.
Se visualizaron por quimioluminiscencia con la solución de revelado HRP (BioRad).
6.2.10. Análisis de doble dimensión e inmuno-blot
El análisis para los ensayos de inmuno-blot fue realizado por medio del software Stat Graphics
Centurion v15.1.0.2
6.3. IDENTIFICACIÓN MEDIANTE ESPECTOMETRIA DE MASAS (MS)
Las proteínas observadas de 2-DE y por inmuno-blot fueron cortadas de los geles y enviadas
para identificación por MS. Los puntos de gel fueron desteñidos según Gharahdaghi y
colaboradores (1999), se lavó con varios cambios de agua. El agua fue eliminada y
reemplazada con 100µl 0,01 DTT/0.1M Tris, pH 8,5, el tubo fue colocado en calentamiento a
55ºC durante 1-2h. Se enfrió a temperatura ambiente, el líquido fue retirado y reemplazado
con 100µl 0,015 iodoacetamida/0.1M Tris, pH 8,5. Se dejó reaccionar durante 30 min. en
oscuridad, después el líquido se retiró y el gel se lavó con buffer 2X 30% acetonitrilo/0.05M
Tris, pH 8,5 por 15 minutos en agitación. El gel posteriormente fue deshidratado en remojo
durante unos minutos con 200µl de acetonitrilo. El acetonitrilo se eliminó y el gel se secó
completamente por 30 minutos en el concentrador Vacufuge (Eppendorf). Los geles fueron
rehidratados con 0.020µg y tripsina 0.1µg Lys-C (Roche Applied Science) en la cantidad
mínima de 0,025 M Tris, pH 8,5, luego los tubos fueron colocados en calentamiento de 32 ° C
toda la noche. Los péptidos se extrajeron con buffer 2X 50µl 50% de acetonitrilo / 2% de TFA
y los extractos combinados se secaron, luego se resuspendió en una solución matriz de 10 mg /
ml de solución de ácido 4-hidroxi-α-cyanocinnamic 50% acetonitrilo 0.1% TFA además de
dos normas internas, angiotensina e insulina bovina, a la solución matriz. Estando
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57
completamente seco, se lavó dos veces con agua. El análisis MALDI-MS se realizó en el
resumen con un PerSeptive Voyager DE-Pro espectrómetro de masas en el modo lineal. Para
la búsqueda de péptidos las masas medias de los péptidos se introdujeron en la base de datos
Genpept.
7. RESULTADOS
7.1. CLASIFICACIÓN DE LOS SUEROS
Se obtuvieron un total de 148 sueros de mujeres, los sueros obtenidos se clasificaron de la
siguiente manera: 57 sueros pertenecen al grupo control (individuos sanos), 26 se
encuentran en BI-RADS 0-3 y 65 se encuentran en BI-RADS 4-6. (Tabla 2).
Tabla 2. Clasificación del total de los sueros obtenidos para el estudio
Total Controles BI-RADS 0-3
BI-RADS 4-6
148 57 26 65
Gráfica 5. Representación porcentual de los sueros obtenidos y su clasificación.
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58
Dentro de la clasificasion BI-RADS 4-6 donde hay 65 pacientes se realizo una nueva
subclasificacion, de los cuales 11 de los pacientes resultaron benignos, 1 se presenta en
primera etapa de cancer de mama , 32 en segunda etapa, 3 en tercera etapa y el resto de 18 el
diagnostico no fue confirmado (Tabla 3).
Tabla 3. Subclasificacion de los sueros BI-RADS 4-6
BI-RADS 4-6 Benignos Etapa 1 Etapa 2 Etapa 3 No confirmados
65 11 1 32 3 18
Dentro del grupo BI-RADS 4-6 que es el grupo de alto riesgo de presentar cáncer de mama
(ver tabla 1) se seleccionaron los sueros que se quedaron dentro de la clasificación como etapa
II para realizar los ensayos de doble dimensión e inmuno-blot.
Gráfica 6. Representación porcentual de la subclasificación de los sueros obtenidos.
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59
7.2. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL Y OBTENCION DE MAPAS PROTEOMICOS
Debido a que el proteoma total del suero humano representa muchos cambios, el análisis se
dificulta ya que estos cambios interfieren con la técnica de doble dimensión, para reducir esta
complejidad y enriquecer proteínas de baja abundancia, se realizó la reducción de proteínas
mayoritarias de los sueros por medio del kit Proteoprep20, una vez obtenidos los sueros de la
de esta manera, se procedió con la electroforesis bidimensional la cual consiste en separar a las
proteínas primero por su punto isoeléctrico, y segundo por peso molecular. Finalmente se
obtuvieron los mapas proteómicos bidimensionales teñidos por medio de un kit de plata
compatible con MS.
Se obtuvieron un total de 20 sueros provenientes de individuos sanos y 20 de pacientes con
cáncer de mama en etapa II.
A continuación se muestran las imágenes representativas los mapas proteómicos
pertenecientes a un suero de un individuo sano (utilizado como control), y un suero de
paciente con cáncer de mama en los cuales se pueden observar las proteínas séricas separadas
en un gradiente con pI de 4-7 y en un gel de poliacrilamida al 13%, ambos teñidos con plata
(Figuras 11 y 12).
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60
A. Control B. Cáncer de mama
7.3. ANALISIS DE MAPAS PROTEOMICOS
Una vez obtenidos los mapas, el análisis in sillico de estos se realizó por medio el software
PDQuest Advanced 2-D Analisys Software V.8.0.1.
Se hizo un análisis comparativo de los mapas proteómicos por medio del software para
encontrar el número de puntos (proteínas) presentes en cada gel y las diferencias significativas
entre estos (Figura 13).
Tabla 4. Tabla representativa de la comparacion de mapas proteomicos controles vs cáncer de mama.
Experimento: comparación
Create Experiment on disk: 6 gels
Detect member 1: 'suero 2a v1' Detect member 2: 'suero 4a v1' Detect member 3: 'suero 7a v1'
Detection parameter: 'suero 2a' Detection parameter: 'suero 2a' Detection parameter: 'suero 2a'
Fig. 12. Imagen representativa de un mapa proteómico perteneciente un paciente con cáncer de mama.
Fig. 11. Imagen de un mapa proteómico perteneciente a un individuo control
Fig. 13. Imagen representativa obtenida de PDQuest advanced V.8.0.1 en la cual se muestra una comparación del gel master (parte superior izquierda) con los mapas proteómicos tanto de individuos sanos (parte superior), como de pacientes con cáncer de mama (parte inferior).
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61
Make gel image Make gel image Make gel image
Smoothing: Adaptive 3x3 Smoothing: Adaptive 3x3 Smoothing: Adaptive 3x3
Background removal: Floating Ball 77 Background removal: Floating Ball 77 Background removal: Floating Ball 77
Consistent spot detection with
sensitivity: 2.2423
Consistent spot detection with
sensitivity: 1.6988
Consistent spot detection with
sensitivity: 1.5435
Gaussian fit spots Gaussian fit spots Gaussian fit spots
Total number of spots: 1422 Total number of spots: 1326 Total number of spots: 1376
Detect member 4: 'suero 111 v1' Detect member 5: 'suero 122 v1' Detect member 6: 'suero 70 v1'
Detection parameter: 'suero 2a' Detection parameter: 'suero 2a' Detection parameter: 'suero 2a'
Make gel image Make gel image Make gel image
Smoothing: Adaptive 3x3 Smoothing: Adaptive 3x3 Smoothing: Adaptive 3x3
Background removal: Floating Ball 77 Background removal: Floating Ball 77 Background removal: Floating Ball 77
Consistent spot detection
with sensitivity: 1.6600
Consistent spot detection with
sensitivity: 2.0093
Consistent spot detection
with sensitivity: 1.5047
Gaussian fit spots Gaussian fit spots Gaussian fit spots
Total number of spots: 1402 Total number of spots: 1310 Total number of spots: 1308
Tabla 5. Tabla en la cual se muestra el total de los puntos en los geles (proteinas) que resultaron diferentes
Comparación: 'Todos los puntos validos'
Automatically normalize Experiment Automatic: analysis
Method: 'All valid spots' Added quantitative analysis set
Name: Quant control vs cancer
Spots: 429
Added statistical analysis set Added union Analysis Set Added intersection Analysis Set
Name: T-Test control vs cancer Name: Union of all auto sets Name: Intersection of all auto sets
Spots: 69 Spots: 471 Spots: 27
En la tabla 4 se muestran el total de puntos encontrados en los geles, el número de estos nos
indica geles con buen contenido de proteínas las cuales fueron bien realizados mediante esta
técnica y que pueden además utilizarse confiablemente para esta comparación, así como el
número de proteínas que tienen en común.
La tabla 5 muestra el número de proteínas que pudieron ser diferenciadas y validadas por
medio de la prueba t, la unión de todo el conjunto e intersección de este mismo.
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62
Se pudieran considerar las 69 proteínas para un análisis más fino y detallado. Este análisis
conlleva el manejo experimentado del software y de conocimientos especializados en análisis
estadísticos, motivo por el cual utilizamos los mapas proteómicos para el análisis con las
proteínas de baja abundancia.
Posteriormente se realizó una comparación particular entre los geles bidimensionales para
identificar las diferencias significativas existentes entre los dos grupos de estudio (Sanos vs
Cáncer). La imagen 14 que se muestra, es representativa de un individuo sano (control), en la
cual se puede observar el mapa proteómico del cual se seleccionó por medio de un recuadro
(rojo) para obtener un acercamiento en una vista tridimensional de las proteínas analizadas por
medio de comparación. De la misma manera se puede observar la imagen representativa de un
paciente con cáncer de mama (etapa II), al cual se le realizo el mismo análisis comparativo.
A. Control B. Control
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63
C. Cáncer D. Cáncer
Se ha reportado que el mayor número de proteínas diferenciadas como biomarcadores se
encuentran en rangos de mediano a bajo peso molecular. En este análisis se observaron
algunas diferencias entre individuos sanos y pacientes con cáncer de mama en etapa II; las
cuales se obtuvieron en mayor importancia por debajo de los 35 KDa. Los resultados fueron
analizados mediante el uso del software PD Quest advanced V.8.0.1.
En la figura 15 se pueden observar de un total de 5 proteínas con diferencias, 3 proteínas con
PM aproximado de 29, 30 y 24 KDa y rango de PI entre 5 – 6 (marcadas en color rojo) en los
individuos sanos, la cuales no se aprecian en los pacientes con cáncer de mama (marcadas en
color negro), una proteína presente en los pacientes con cáncer con PM aproximado de 29
KDa y PI en un rango de pH aproximado de 5, (marcado en color rojo) que no presentas los
individuos sanos (marcados en color negro); y una proteína que se aprecia en menor cantidad
en los pacientes con cáncer de mama con PM aproximado a los 22 KDa y PI entre 4.5
(marcado en color azul) respecto a los controles (marcado en color verde). A estas imágenes
se les realizó una vista tridimensional de una fracción de los mapas proteómicos. En el
recuadro seleccionado en la parte inferior (rojo) se muestran las diferencias de algunas
proteínas que se compararon en los pacientes de cáncer de mama.
Fig. 14. A. Imagen en 2D representativa de un individuo sano, con su vista tridimensional (B). C. Imagen en 2D representativa de un paciente con cáncer de mama con su vista tridimensional (D).
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64
A. Control B. Cáncer
En la figura 16 se pueden observan 2 proteínas presentes en individuos sanos las cuales
presentan un PM aproximado de 15 y 22 KDa y con un rango de PI cercano a 4.5 y 5
(marcadas en color rojo), las cuales se encuentran ausentes en los pacientes con cáncer de
mama (marcadas en color negro), 2 proteínas presentes en personas con cáncer de mama PM
aproximado a 27 KDa y PI entre 4.3 (marcadas en color rojo) respecto a los individuos sanos
(marcados en color negro), y dos proteínas que se encuentran en mayor cantidad en pacientes
con cáncer de mama, PM aproximado a 15 y 18 KDa y PI entre 4 y 4.5 (marcadas en color
azul) respecto a los individuos sanos (marcados en color verde). A estas imágenes de igual
manera se les realizó una vista tridimensional de una fracción de los mapas proteómicos. En el
Fig. 15. A Vista tridimensional de una fracción de los mapas proteómicos de un individuo sano y B de un paciente con cáncer de mama.
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65
recuadro seleccionado en la parte inferior (rojo) se muestran las diferencias de algunas
proteínas que se compararon en los pacientes de cáncer de mama.
A. Control
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66
B. Cáncer
7.3.1. ANALISIS POR ESPECTROMETRIA DE MASAS
Las proteínas identificadas en los mapas proteómicos y señaladas con diferencias que
figuran como significativas fueron cortadas del gel de poliacrilamida, se colocaron en
microtubos de manera individual, se etiquetaron y se mandaron para su identificación
mediante espectrometría de masas, los resultados de este análisis no fueron concluyentes
debido a que por algún factor como pudo ser mal manejo, contaminación o posible
degradación, las proteínas no pudieron ser identificadas. Sin embargo de acuerdo al PM y PI
de las proteínas identificadas en los mapas proteómicos, y contrastando de acuerdo a lo
reportado en el artículo (Hannah et.al. 2004), se puede inferir que se tratan de algunos tipos de
apolipoproteinas AI, apolipoproteinas II y apolipoproteinas CII y III, transtiretina;
haptoglobina cadena α 2.
7.4. ENSAYOS DE INMUNO-BLOT BIDIMENSIONALES (3-D)
Como se mencionó en el apartado de materiales y métodos se realizaron ensayos de inmuno-
blot en 2-DE con sueros de individuos sanos y pacientes con cáncer de mama en etapa II, las
condiciones para procesar las muestras de suero para la obtención de proteínas fueron las
mismas, se utilizó el kit de sigma y las proteínas obtenidas se concentraron con acetona, los
procesos de rehidratación de las muestras, el isoelectroenfoque y la separación en SDS-PAGE
se realizaron como se ha descrito anteriormente.
Una vez separadas las proteína séricas de individuos sanos en los geles bidimensionales, se
transfirieron las proteínas a las membranas de nitrocelulosa, se realizaron los ensayos de
inmuno-blot utilizando sueros de individuos sanos y de pacientes con cáncer de mama (como
anticuerpos primarios), estos ensayos nos revelaron que existen anticuerpos en el suero de los
pacientes con cáncer contra varias proteínas séricas, se observan 6 puntos en la membrana de
nitrocelulosa de los cuales 1,2 y 3 pertenecen a A1AT; 4 a Haptoglobina y 5 y 6 Albumina de
suero, se observó además que los sueros de personas sanas no presentan anticuerpos (Fig. 19).
Fig. 16. A Vista tridimensional de una fracción de los mapas proteómicos de un individuo sano y B de un paciente con cáncer de mama.
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67
4 pI 7
188
62 49 38
28
18
6
PMP
Durante los ensayos iniciales se encontraron varias proteínas de alto y mediano peso
molecular (Fig. 20), mencionadas en el párrafo anterior y se encuentran marcadas como 1, 2 y
3, tienen un peso alrededor de los 49 KDa con PI aproximado de 4.5 a 5.5, el punto 4 con peso
de 40 KDa aproximadamente y pI de 6; los puntos 5 y 6 con un peso de 50 KDa y PI de 6.5
aproximadamente. Al realizar las réplicas de los mismos solo se encontraron proteínas de
mediano peso molecular algunas fueron las mismas ya observadas en los ensayos anteriores
(1, 2 y 3), las otras observadas durante los ensayos iniciales ya no aparecieron (Fig. 17)
A
B
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68
4 pI 7
188
62 49 38
28
18
6
1 2 3
4 5
6
PMP
A B
Fig. 17. Inmuno-blot en 2-DE en el cual se utilizó un suero de individuo sano. Se puede observar arriba (A) el gel bidimensional del cual fueron transferidas las proteínas a la membrana; abajo (B) se observa el inmuno-blot con suero de un individuo sano como primer anticuerpo, en el cual se puede ver claramente que no se encontraron anticuerpos.
Fig. 18. Inmuno-blot en 2-DE en el cual se utilizó el suero (108) de un paciente con cáncer de mama en etapa II. Se puede observar arriba (A) el gel bidimensional del cual se transfirieron las proteínas a la membrana; abajo (B) se observa el inmuno-blot en el cual es claramente visible la presencia de varios anticuerpos presentes en los sueros con cáncer de mama en etapa II (marcados con flechas).
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69
188 62 49 38
28
18
6
1 2 3 P
MP 4 pI 7
A
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70
1 2 3
4
5
B
7.4.1. ANALISIS POR ESPECTROMETRIA DE MASAS
Las proteínas observadas correspondientes a las del WB fueron cortadas del gel de
poliacrilamida, con la ayuda de una punta estéril de micropipeta, una vez tomadas del gel se
pusieron en un microtubo estéril, se etiqueto cada tubo con el numero consecutivo conforme
fueron tomadas del gel P-Hs-1 (proteína de suero humano 1, 2 etc.) y se enviaron para su
análisis mediante espectrometría de masas, el resultado de este análisis fue el siguiente:
Tabla 6. Resultado del analisis por espectrometria de masas de las proteinas identificadas.
Puntos1 Proteinas Identificadas
2 NCBI Acceso #
3
P-Hs-1 alpha-1-antitrypsin P01009
P-Hs-2 alpha-1-antitrypsin P01009
P-Hs-3 alpha-1-antitrypsin P01009
P-Hs-4 CD5 like 5174411
P-Hs-5 serum albumin P27169
Fig. 19. Inmuno-blot en 2-DE en el cual se utilizó el suero (109) de un paciente con cáncer de mama en etapa II. Se puede observar arriba (A) el gel bidimensional del cual se transfirieron las proteínas a la membrana; abajo (B) se observa el inmuno-blot en el cual es visible la presencia de anticuerpos en menor número provenientes de los sueros con cáncer de mama en etapa II (marcados con flechas).
Fig. 20. Gel bidimensional de poliacrilamida teñido con azul de Coomassie, del cual se cortaron las proteínas para ser sometidas al análisis por MS. Puntas de flecha.
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1.- Puntos referenciados que fueron identificados y cortados del gel 2.-Proteina identificada 3.-No de acceso en NCBI de donde se identifico la proteina
7.5. ENSAYOS DE INMUNO-BLOT 1-D Debido a estos resultados se decidió trabajar con la proteína que estuvo presente en todos los
ensayos (fig.17) de inmuno-blot en 2-DE, y que fue identificada como alfa-1 Antitripsina. Las
tres manchas proteicas identificadas como A1AT se cortaron de 8 geles bidimensionales de
poliacrilamida teñidos con azul de Coomassie, la proteína fue recuperada de los fragmentos
del gel mediante el proceso de electroelución, y la proteína obtenida fue sometida nuevamente
a SDS-PAGE y electrotransferida a membranas de nitrocelulosa (a partir de un gel
preparativo de poliacrilamida) para el análisis individual de los sueros.
Antes de transferir a la membrana se cortó una pieza del gel para teñirlo con plata y comprobar
la presencia de la proteína (Fig. 21).
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Para comprobar en estos resultados y que efectivamente este reconocimiento de anticuerpos es
para A1AT se probó con el anticuerpo monoclonal comercial anti-A1AT (Fig. 22)
Una vez que fue transferida a la membrana se bloqueó con leche al 5% y PSTwen-20 al 0.1%,
se realizó el corte de la membrana en pequeñas piezas (tiras) para probar de manera individual
los sueros de los pacientes con cáncer de mama, así como los de individuos sanos, se
obtuvieron un total de cuarenta y seis tiras las cuales fueron incubadas en mini bandejas de
incubación durante 18h a 4ºC; se utilizaron 20 tiras para incubar sueros controles de pacientes
sanos, 25 para incubar sueros con cáncer de mama (todos a una dilución 1:100 con este
anticuerpo primario), y una más con el anticuerpo comercial A1AT monoclonal de Sigma (se
muestra en la fig 23. Para el anticuerpo secundario se utilizó conjugado biotin-labeled goat
Fig. 21. Electroforesis unidimensional, se muestra en el gel de poliacrilamida (carril 2) la proteína identificada, aislada de los geles bidimensionales, y caracterizada por MS como A1AT. Presenta un peso molecular aproximado de 50 KDa. MPM carril 1.
Fig. 22. Inmuno-blot 1-D (panel B), se muestra la membrana con la proteína A1AT (carril 2) identificada, aislada de los geles bidimensionales y caracterizada por MS que fue reconocida por mAb-A1AT. Panel A comparación de la electroforesis unidimensional (fig. 19) con el inmuno-blot 1-D.
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anti-human IgG (H+L) a dilución 1:5000 (KPL) durante 3h en el caso de los sueros y para el
anticuerpo comercial fue goat anti-mouse IgG (BioRad). Se lavaron 5 veces con PBS Tween-
20 al 0.1% y fue revelado con HRP-streptavidin peroxidase (KPL).
En el caso de los pacientes con cáncer de mama se examinaron 25 sueros (fig. 23A carril 1-25)
en este resultado se puede observar la presencia de anticuerpos que reconocen A1AT para la
mayoría de los casos, solamente en un caso, un suero con cáncer de mama (fig. 23A carril 15)
no dio resultado positivo. Mientras tanto se puede observar que para el caso de los controles
Fig. 23A. Inmuno-blot en 1-D en donde el análisis se realizó con sueros de individuos sanos en la membrana de nitrocelulosa que contenía solamente la proteína A1AT aislada de geles de 2-DE. 23B. Inmuno-blot en 1-D en donde el análisis se realizó con sueros de pacientes con cáncer de mama en etapaII en la membrana de nitrocelulosa que contiene solamente la proteína A1AT aislada de geles de 2-DE
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solo en los carriles 6 y 12 (fig. 23B) se reconoce la presencia del anticuerpo, mientras que en
los demás carriles no existe reconocimiento contra A1AT. Por lo que la probabilidad de éxito
para detectar anticuerpos en personas sanas es muy baja.
Así mismo se realizó un análisis densitométrico en las tiras el cual se muestra que el suero de
los pacientes con cáncer de mama se podrían clasificar en tres grupos con relación a la
intensidad de la banda: un primer grupo presenta alta intensidad (Fig. 23A, carriles 2, 5, y 6);
un segundo grupo muestra intensidad media ( carriles 1, 3, 4, 7, 8, 16, 19, y 20), y un tercer
grupo muestra baja intensidad (carriles 9-14, 17, 18, y 21-25). La intensidad de la banda se
normalizó a porcentajes, en el que la banda más intensa fue considerada como 100%. Se
encontró que el grupo, dos y tres tenían porcentajes promedio de 97, 80, y 72%,
respectivamente. En la fig. 23B, carriles 6 y 12 bandas de reactividad con presentes
intensidades de 52 y 51%, respectivamente, que son alrededor de 47% menor con respecto del
primer grupo y 20% menor que la del tercer grupo. Las diferencias observadas en la intensidad
de las bandas en las tiras de membrana de nitrocelulosa fueron las esperadas, debido a que la
concentración de los anticuerpos es variable, el estado inmunológico y nutricional de los
sujetos comparados es diferente, y por qué el tamaño o el tiempo de evolución del tumor son
diferentes también, aun considerando una etapa temprana de la enfermedad.
7.5.1. ANALISIS ESTADISTICO DE LOS RESULTADOS POR INMUNO-BLOT
El análisis estadístico utilizado para determinar las diferencias significativas entre las edades
de los grupos fue por t-Test, donde se compararon las edades del grupo de individuos sanos
con las de los pacientes con cáncer de mama que fueron utilizados para este estudio.
Tabla 7. Resumen estadistico de las edades de individuios sanos y con cancer de mama.
Cáncer Control
Conteo 25 20
Promedio 48.725 44.85
Desviación estándar 6.5861 8.32419
Coeficiente de variación 13.5183% 18.5601%
Mínimo 38.0 30.0
Máximo 61.0 60.0
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Rango 23.0 30.0
Skewness estándar 0.1275506 0.1591
Kurtosis estándar -0.797189 -0.633538
En donde:
Ho: La media 1 = a la media 2 Ha: La media 1 ≠ a la media 2
Asumiendo igualdad de varianzas t = 1.74217 P-value = 0.0886287
Se concluye que no existe diferencia estadísticamente significativa entre las dos medias de las
muestras, con un 95% de confiabilidad. La edad de los pacientes no es un factor que afecte las
variables de los análisis comparativos en la búsqueda de AATs.
Grafica 3. Grafica de medias de las edades de individuos sanos y pacientes con cáncer de mama
PRUEBA X2
La comparación para la presencia de anticuerpos entre el grupo de individuos sanos y los
pacientes con cáncer de mama se realizó por medio de una prueba de X2 para probar la
influencia del estado de salud en la presencia de AATs.
Tabla 8. Resultado de AAT positivos y negativos para ambos grupos encontrados en los ensayos inmunoproteomicos.
AAT
Positivo Negativo Total
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Control 2 18 2
Cáncer 24 1 25
Total 26 19 45
En donde:
Ho: Datos independientes (no existe asociación). No influye el estado de salud de los
pacientes con cáncer de mama para la presencia de AATs.
Ha: Dados no independientes (existe asociación) influye el estado de salud de los pacientes
con cáncer de mama para la presencia de AATs.
Tabla 9. Resultados para X2 con los positivos y negativos de ambos grupos.
AAT
Positivo Negativo Total
Control 11.56 8.44 20
Cáncer 14.44 10.56 25
Total 26 19 45
Tabla 10. Resumen estadisticos para X2
X2 (0) = 33.68
X2 (1, 0.95) = 3.841
(p Value) X2 = 6.47573E-09
De acuerdo a X2 (p < 0.0000) se rechaza Ho, por lo que se demuestra que si influye el estado
de salud de los pacientes con cáncer de mama en la presencia de antígenos asociados a tumor
teniendo un 95% de confiabilidad, por lo que en este estudio prueba que los individuos sanos
no presentan AATs y que es preciso el estado de cáncer de mama para poder encontrar AATs;
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77
evidenciando así que por medio de la búsqueda de AATs podemos determinar el estado
canceroso de un individuo y es factible su uso como indicadores del estadio canceroso.
MODELO BINOMIAL BERNOULLI
Y el modelo binomial de Bernoulli se usó para determinar la probabilidad de éxito de
encontrar AATs en los pacientes con cáncer de mama.
Tabla 11. Resultado de AAT positivos y negativos para ambos grupos encontrados en los ensayos inmunoproteomicos.
AAT
Positivo Negativo Total
Control 2 18 20
Cáncer 24 1 25
Total 26 19 45
En donde p(Exito) por lo tanto p(Exito) = probabilidad de encontrar AAT
Tabla 12. Porcentaje de deteccion de AATs para ambos grupos
AAT
Positivo Negativo
Control 10% 90%
Cáncer p(E) = 96% 4%
Se tiene que p = probabilidad de éxito de encontrar AAT, por lo tanto encontramos que en los
pacientes con cáncer de mama esta probabilidad es p = 0.96, estos resultados expresados en
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78
datos porcentuales son del 96% de probabilidad de encontrar anticuerpos contra A1AT en
sueros de pacientes con cáncer de mama, comparado con los individuos sanos en donde solo
se encontró el 10% de probabilidad.
8. DISCUSIÓN
Los recientes avances en la comprensión de las tecnologías moleculares han llevado a los
análisis globales de perfiles de proteínas, se han realizado varios estudios de proteoma
comparando sueros cancerosos vs normales. El proteoma de suero es una fuente ideal para la
identificación de biomarcadores de diagnóstico y dianas terapéuticas, en el cáncer si un
biomarcador es sensible puede ser detectado en el suero y ser utilizado para la detección o
diagnóstico temprano. En este estudio se utilizaron métodos proteómicos 2-DE, e inmuno-
proteómicos, WB) para análisis diferenciales en la búsqueda de marcadores tumorales, así
como AATs en pacientes con cáncer de mama en segunda etapa. A través del análisis de las
proteínas menos abundantes en el suero de las pacientes.
La resolución de 2-DE de proteínas nos permite analizar el proteoma de sueros humanos,
Wulfkuhle y colaboradores (2002), han reportado 170 puntos de proteínas que surgen
diferencialmente en tejidos de carcinoma ductal, e identificado 51 de ellos; en estudios
subsecuentes en carcinoma de mama ductal se identificaron 57 proteínas diferencialmente
expresadas, 10 de las cuales se validaron por inmuno-histoquimica (Wulfkuhle et. al. 2002).
Sin embargo en esta investigación proteómica, mediante análisis in sillico se detectaron 69
proteínas diferenciales (cáncer vs control) de las cuales observamos sobre expresadas en
pacientes con cáncer, algunas de bajo peso molecular (alrededor de 11), como es el caso de la
cadena α2 haptoglobina, que es una glicoproteína secretada en células de hígado cuya función
principal es captar hemoglobina libre y reciclarla (Liao et. al. 2008). En estudios previos se ha
demostrado que cuerpos de hierro promueven el crecimiento celular neoplásico y la
acumulación en células cancerosas más que en células normales. Adicionalmente otros
estudios han indicado un alto riesgo en pacientes con grandes depósitos de hierro que en los
que cuentan con menores reservas de hierro; así mismo el incremento relacionado con la
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79
hemoglobina resulta en una reducción de las concentraciones de haptoglobina, sin embargo
también ha sido identificada como un fuerte agente antioncogénico, activador del crecimiento
celular endotelial y la diferenciación. se ha reportado la subexpresion de haptoglobulina en
sueros de algunos tipos de cáncer como por ejemplo ovario y pulmón (Liao et. al. 2008,
Awadallah et. al. 2004, Huang et. al. 2006). Este último autor reporta una disminución en la
expresión de la cadena α2 haptoglobina en muestras de suero de pacientes con cáncer; en
nuestro caso encontramos esa diferencia observando una disminución de esta proteína en
relación con los sueros de pacientes sanos.
Otras proteínas observadas por sus diferencias en los mapas proteómicos y referenciadas
fueron apoliproteinas AI, AII, C-II y III (Hannah et.al. 2004). Cabe mencionar que estas
proteínas no pudieron ser identificadas como tales por medio de espectrometría de masas.
De manera alternativa se realizaron ensayos de inmunoblot en 2-DE, que consiste en la
combinación de las técnicas de electroforesis de proteínas y “Western blot”. Esta combinación
metodológica nos permitió obtener resultados interesantes y prometedores. Existen algunos
estudios en los que se ha demostrado la presencia de autoanticuerpos en personas con cáncer
incluso hasta 4 años anteriores a la detección por mastografía; de la misma manera también se
ha reportado autoantígenos estos son candidatos prometedores para el diagnóstico y pronostico
del cáncer de mama (Fernández 2005, Chapman et.al. 2007, Cho 2007, Desmetz et.al.2009,
Tamesa et. al. 2009).
Los resultados de nuestros ensayos nos permitieron observar la presencia de algunos AATs en
pacientes con cáncer de mama específicamente con carcinoma ductal infiltrante en etapa II,
por inmunoblot se visualizaron 6 manchas principales en algunos ensayos de las cuales se
identificaron como Alpha 1-antitripsina (A1AT), Hs-4 Haptoglobina y por ultimo P-Hs-5 y 6
como Albumina de suero (tabla 4).
La albumina sérica humana es una proteína con actividad antioxidante, una propiedad que
puede ser anticancerígena; algunos estudios han reportado el aumento de riesgo de mortalidad
por cáncer asociado a bajas concentraciones de albumina (Phillip et. al. 1980, Law et. al.
1994), así mismo una fuerte asociación positiva entre niveles de albumina y la aparición del
cáncer de colon; el riesgo se asocia con altos niveles de albumina sérica (Knekt et. al. 2000).
Otros estudios reportan la utilidad de la albumina como un factor de predicción en la
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80
sobrevivencia del cáncer, ya se le ha relacionado con la alimentación y su presencia en bajos
niveles es indicativo de desnutrición y por lo tanto a un alto riesgo de muerte por cáncer
(Gupta et. al. 2010).
A1AT se ha encontrado en suero y en tejido de pacientes con carcinoma ductal infiltrante y de
cáncer colorrectal; la cual ha sido reportada como una proteína que incrementa su expresión,
durante la presencia de tumores malignos (Hamrita et. al. 2009, Xie et. al. 2010). A1AT
pertenece a la superfamilia de proteínas llamadas serpinas (Inhibidores de la proteinasa
serina), es una glicoproteína sintetizada principalmente por células de hepatocitos, monocitos,
macrófagos, así como por células tumorales; también juega un papel central en la protección
de los tejidos; de actividad proteolítica extracelular en la regulación de los procesos
proteolíticos y tiene un papel clave para la coagulación de la sangre, la activación del
complemento y la apoptosis. Diversos estudios demostraron que el 90% de la capacidad
inhibidora de la tripsina sérica circulante se atribuye a A1AT y que esta actividad es
importante para el mantenimiento de la homeostasis de proteasa-antiproteasa y la prevención
de daños en los tejidos así como para la migración celular (Wewer et. al.1987, Marcus et.al.
2010). Otros estudios sugieren que la deficiencia de A1AT se asocia con un mayor riesgo de
varios tipos de cáncer y la disminución de los niveles de A1AT induce las actividades de la
serina proteasa contribuyendo al desprendimiento de las células malignas de su lugar de origen
(Yang et. al. 1999).
El reconocimiento auto inmune se está convirtiendo en un importante tema en la biología del
cáncer, múltiples antígenos identificados y asociados con el cáncer de
mama hasta la fecha poseen profundas implicaciones más allá de la búsqueda de nuevos
biomarcadores de diagnóstico de cáncer. Aunque no está claro por qué algunos de los
pacientes desarrollan inmunogenicidad a un antígeno particular, la mayoría de AATs no son
productos del gen mutado, sino más bien proteínas o antígenos que se encuentran
sobreexpresados y que están relacionados con el proceso de diferenciación celular (Menart et
al. 2000, Yi et al. 2009).
En el presente manuscrito, se presenta, la identificación de A1AT como potencial y especifico
AATs importante e interesante y que ha de seguirse estudiando. Este AATs se encontró en
población de mujeres jóvenes mexicanas (menores a 50 años de edad) con etapa temprana del
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81
cáncer de mama. Debido a la sensibilidad de la mamografía la probabilidad de detección es
menor en pacientes con tejido mamario denso, con lesiones de poco tamaño, y en mujeres
premenopáusicas, sin embargo la identificación del estado de los AATs puede llevar a la
detección en las primeras etapas del cáncer de mama en mujeres menores de 50 años de edad.
Se ha establecido que la eficacia del tratamiento en pacientes con cáncer de mama depende de
la detección precoz de la neoplasia. En este sentido, la relevancia de la identificación de este
AATs es prometedora en términos de su uso potencial como biomarcador de pronostico
durante las primeras etapas en el desarrollo del cáncer.
Las ventajas en la validación de este tipo de biomarcador es que se podría ser utilizado para la
detección en personas asintomáticas y en etapas tempranas del cáncer de mama y que los
autoanticuerpos pueden ser encontrados en muestras de suero, las que son fácilmente
accesibles para la investigación, son además muy estables, y permanecen en el suero durante
un largo período de tiempo. La persistencia y estabilidad de los anticuerpos les da una ventaja
sobre otros biomarcadores. Por otra parte, la variedad de técnicas y reactivos para realizar el
análisis de la presencia de anticuerpos facilita el desarrollo de estos ensayos de detección.
Es importante destacar que estos resultados son preliminares y que requieren de una mayor
verificación y validación de estudios caso-control. En estos resultados, se observó que algunos
individuos sanos contienen anticuerpos que reaccionan con la proteína A1AT, pero esta
reactividad fue mucho menor que en los pacientes con cáncer de mama. Con estos resultados
preliminares, no sería posible todavía determinar si la baja reactividad de estos sueros
normales debería ser tomada como negativa o positiva en términos de la presencia de cáncer
de mama. Aunque tomando en cuenta que la generación de autoanticuerpos puede ocurrir
durante el proceso de tumorigénesis, es probable que estos anticuerpos en los sueros
correspondan a una etapa muy temprana, que aún no ha sido detectado por el análisis de
mamografía; sería interesante mantener a estos individuos controles que reaccionaron como
positivos bajo observación y darles seguimiento.
Por otro lado, un método cuantitativo como ELISA podría ayudar a establecer y definir las
muestras positivas y negativas. El plan a futuro es construir una plataforma de microarreglos
con la proteína recombinante y utilizar esta plataforma para corroborar los resultados de
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82
estudios caso-control utilizando muestras de 200 o más individuos. Además, también se planea
analizar los pacientes con enfermedades autoinmunes, como artritis o lupus y con otros tipos
de cáncer, para determinar la especificidad de este biomarcador. Del mismo modo, más
estudios con muestras de pacientes con carcinoma ductal in situ y cáncer de mama en estadios
III y IV ayudaría a confirmar la especificidad de los autoanticuerpos de A1AT en este
subconjunto de pacientes con cáncer de mama. En resumen, nuestros resultados confirman que
los niveles de proteína A1AT son elevados en el suero de los pacientes con cáncer de mama y
que se encuentran sobreexpresados.
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83
9. CONCLUSIONES
En conclusión se encontraron mediante técnicas proteómicas de 2-DE, algunas proteínas
asociadas al cáncer de mama en etapa II, las cuales no fueron confirmadas por espectrometría
de masas, pero si identificadas en algunos mapas proteómicos ya reportados; el análisis de la
técnica in sillico es algo complejo, requiere mayor experiencia en conocimiento y tiempo de
análisis. Por otro lado aplicando la técnica de inmunoblot 2-DE se detectaron AATs, de los
cuales A1AT fue la proteína sérica encontrada como más prometedora en sus primeros
estudios, para confirmar si en el suero de pacientes con cáncer vs controles existía este AATs
se analizaron 25 sueros diagnosticados con carcinoma ductal infiltrante en Etapa II, en 24 se
detectó respuesta ante A1AT resultando de esta manera con una alta frecuencia en cuanto a los
casos positivos contra los casos controles, de los cuales solamente 2 de 20 muestras se
pudieron detectar; indicando de esta manera, que los sueros de pacientes con cáncer de mama
contienen autoanticuerpos contra A1AT, motivo por el cual se propone como preliminar y
potencial biomarcador útil para el diagnóstico de pacientes con cáncer de mama en etapas
tempranas.
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10. PERSPECTIVAS
En el caso de la búsqueda de marcadores tumorales de cáncer de mama mediante técnicas
proteómicas en 2-DE se sugiere realizar nuevamente el análisis de las proteínas estudiadas por
espectrometría de masas para su identificación, de igual manera se propone un análisis más
detallado de los datos estadísticos de la zona de mediano y alto peso molecular, la cual se
muestra interesante, llevando estos estudios al encuentro de diferencias que sean establecidas
como significativas y que de alguna manera lograrían arrojar mayor número de datos sobre
posibles biomarcadores .
Por otro lado mediante los estudios realizados por inmuno-proteomica es importante enfatizar
que es un estudio preliminar y se sugiere realizar nuevos ensayos con otros tipos de cáncer,
así como en alguna otra etapa en cáncer de mama y de igual manera con mayor número de
muestras que complementen los resultados obtenidos.
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85
11. BIBLIOGRAFÍA
1. Abbas Abul k., Lichtman Andrew H., Pillai Shiv. 2008. Immunology cellular and
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12. APÉNDICE
12.1. Carta de consentimiento informado.
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92
12.2. Tabla del total de sueros obtenidos.
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Muestras
de suero Edad Diagnóstico Fecha de toma Diagnostico
1 38 control 21/05/2008
2 32 control 22/05/2008
3 53 control 21/05/2008
4 60 control 21/05/2008
5 36 control 21/05/2008
6 _
control 21/05/2008
7 _ control 21/05/2008
8 38 control 26/05/2008
9 41 control 26/05/2008
10 47 control 29/05/2008
11 35 control 29/05/2008
12 47 control 29/05/2008
13 46 control 05/06/2008
14 26 control 09/06/2008
15 28 control 09/06/2008
16 50 control 09/06/2008
17 38 control 09/06/2008
18 25 control 10/06/2008
19 - control 10/06/2008
20 - control 10/06/2008
21 25 control 11/06/2008
22 25 control 11/06/2008
23 30 control 11/06/2008
24 38 control 11/06/2008
25 24 control 12/06/2008
26 26 control 12/06/2008
27 60 control 13/06/2008
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94
28 42 control 16/06/2008
29 54 control 16/06/2008
30 49 control 17/06/2008
31 51 control 17/06/2008
32 - control 17/06/2008
33 - control 17/06/2008
34 27 control 23/06/2008
35 40 control 25/06/2008
36 34 control 30/06/1008
37 46 control 12/08/2008
38 27 control 12/08/2008
39 23 control 12/08/2008
40 24 control 12/08/2008
41 29 control 18/08/2008
42 33 control 14/10/2008
43 24 control 14/10/2008
44 49 control 25/09/2008
45 26 control 25/09/2008
46 45 control 05/11/2008
47 59 Control
48 54 control
49 24 control
50 36 control
51 36 control
52 49 control
53 43 control
54 40 control
55 24 control
56 20 control
57 23 control
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58 46 BIRADS 0 ACRIII 11/06/2008
59 45 BIRADS 0 ACR IV 11/06/2008
60 51
BIRADS 0 ACRIII
cirugia 4 años 13/06/2008
61 61 BIRADS 0 12/11/2008
2831/09 Carcinoma de
conductos mamarios invasor
sin patron especifico,grado II
62 43 BIRADS I ACR II 11/06/2008
63 53 BIRADS II ACR III 11/06/2008
64 34 BIRADS II ACR II 11/06/2008
65 51 BIRADS II ACR II 12/06/2008
66 60 BIRADS 2 13/06/2008
67 47 BIRADS 2 ACRII 16/06/2008
68 56 BIRADS II ACR III 17/06/2008
69 57 BIRADS II ACR II 23/06/2008
70 57 BIRADS II 18/12/2008
71 52 BIRADS II 07/01/2009
72 49 BIRADS II 07/01/2009
73 64 BIRADS II 08/01/2009
74 58 BIRADS II 09/01/2009
75 47 BIRADS II 09/01/2009
76 55 BIRADS II 13/01/2009
77 44 BIRADS II 13/01/2009
78 48 BIRADS II 13/01/2009
79 61 BIRADS II 14/01/2009
80 52 BIRADS II 14/01/2009
81 48 BIRADS II 14/01/2009
82 52 BIRADS II 16/01/2009
83 41 BIRADS II 16/01/2009
Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco
96
84 68 BIRADS IV ACRI 27/06/2008
EHP: 9799/08 Características
histologicas normales, se
sugiere nueva Biopsia.
85 66 BIRADS IV ACRI 30/06/2008 Papilomatosis intraductal
86 49 BIRADS IV ACR II 20/08/2008
Carcinoma ductal in situ con
extensión lobulillar e invasión
multifocal grado II etapaI
87 48 BIRADS IV ACR II 20/08/2008
88 78 BIRADS IV ACR I 20/08/2008
89 43 BIRADS IV ACR III 16/10/2008
90 35 BIRADS IV 22/10/2008
91 54 BIRADS IV 05/11/2008
92 41 BIRADS IV 06/11/2008
93 68 BIRADS IV 06/11/2008
94 57 BIRADS IV 21/11/2008
95 44 BIRADS IV 24/11/2008
96 68 BIRADS IV 24/11/2008
97 58 BIRADS IV 02/12/2008
98 67 BIRADS IV 02/12/2008
99 53 BIRADS IV 02/12/2008
100 63 BIRADS IV B 02/12/2008
18428/08 Carcinoma ductal
infiltrante sin patron
especifico. etapaII
101 58 BIRADS IV 05/12/2008
ETO 18075/08 Ca ductal
infiltrante etapa II
102 45 BIRADS IV A 08/12/2008
103 40 BIRADS IV 08/12/2008
Carcinoma ductal infiltrante
moderadamente
diferenciado
104 58 BIRADS IV 09/12/2008
105 54 BIRADS IV 10/12/2008
106 47 BIRADS IV 10/12/2008
Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco
97
107 36 BIRADS IV 11/12/2008
108 55 BIRADS IV 11/12/2008
109 50 BIRADS IV 11/12/2008
110 46 BIRADS IV 12/12/2008
Carcinoma ductal infiltrante
moderadamente
diferenciado etapa II
111 36 BIRADS IV 12/12/2008
112 61 BIRADS IV 16/12/2008 Negativo a malignidad
113 52 BIRADS IV 16/12/2008
114 51 BIRADS IV C 18/12/2008
19048/08 Carcinoma ductal
infiltrante. etapa II
115 43 BIRADS IV 18/12/2008
116 57 BIRADS IV A 19/12/2008
117 62 BIRADS IV 21/01/2009
Adenocarcinoma de los
ductos mamarios etapa II
118 43 BIRADS IV ACR II 21/01/2009 Carcinoma ductal infiltrante
119 53 BIRADS IV A 05/02/2009
120 56 BIRADS V ACR III 18/06/2008
EHP: 36/09 : Adenocarcinoma
de los ductos mamarios
Grado II.
121 79 BIRADS V 01/07/2008
EHP: 9970/08 Ca ductal bien
diferenciado invasor grado I
con permeacion linfatica
122 43 BIRADS V 20/11/2008
123 45 BIRADS V 02/12/2008 2641/09 Positivo Her 2
124 40 BIRADS V 08/12/2008
EHP 16872/08 :
Adenocarcinoma papilar
invasor con areas quisticas
ductales pobre a moderada
diferenciación
125 64 BIRADS V 15/12/2008 Carcinoma ductal infiltrante etapa II
126 40 BIRADS V ACR III 27/01/2009 Carcinoma ductal infiltrante etapa II
127 44 BIRADS V ACR II 27/01/2009
Carcinoma ductal con
microinvasión etapa II
128 65 BIRADS V ACR II 03/02/2009
Adenocarcinoma de los
ductos mamarios etapa II
129 54 BIRADS V 03/02/2009
Carcinoma de ductos
mamarios infiltrante
moderadamente
diferenciado etapa II
Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco
98
130 38 BIRADS V ACR II 10/03/2009
Carcinoma de los ductos
mamarios infiltrante etapa II
131 51 BIRADS V ACR III 19/03/2009 Carcinoma ductal invasor etapaIII
132 54 BIRADS VI 12/09/2008
Carcinoma lobulillar mama
derecha etapaIII
133 53 BIRADS VI 26/11/2008
EHP: 2759/09Carcinoma
ductal infiltrante
moderadamente
diferenciado con permeacion
linfatica Grado II etapaIII
134 49 09/12/2008
135 BIRADS IV
Carcinoma de los ductos
mamarios infiltrante etapa II
136 46 BIRADS IV
Carcinoma ductal infiltrante
moderadamente
diferenciado etapa II
137 45 BIRADS V Carcinoma ductal infiltrante etapa II
138 45 BIRADS IV
Carcinoma de ductos
mamarios infiltrante
moderadamente
diferenciado etapa II
139 45 BIRADS V Carcinoma ductal infiltrante etapa II
140 41 BIRADS IV
Carcinoma ductal infiltrante
moderadamente
diferenciado etapa II
141 40 BIRADS IV
Adenocarcinoma de los
ductos mamarios
142 50 BIRADS IV
Carcinoma de los ductos
mamarios infiltrante
143 37 BIRADS V Carcinoma ductal infiltrante
144 59 BIRADS V
145 39
146 39
147 44
148 59
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99
12.3. PROTOCOLO PARA DEPLESIÓN DE SUEROS
Kit proteoprep 20 plasma Sgma-Aldrich.
1. Diluir el buffer de equilibrio y de elución del kit 9:1(para que quede 1X).
2. Diluir el suero 9:1 en el buffer de equilibrio del kit (anteriormente diluido).
3. Sonicar durante 20 min.
4. Pasar el suero por los filtros corning spin-x del kit y centrifugar a 4,500 rpm 1min.
5. Llevar a concentrar la muestra en speed vac durante 1h (o a un volumen no menor
de 100µl).
6. Equilibrar la columna de deplesión del kit de la siguiente manera:
a) Con la jeringa del kit tomar 4ml de buffer de equilibrio y pasarlos por la
columna.
b) Colocar la columna en un eppendorff y centrifugar a 4,500 rpm 1min.
c) Desechar el centrifugado del eppendorff.
7. Colocar el suero filtrado y concentrado en la columna e incubar durante 15 min.
8. Colocar la columna de deplesión en un eppendorff y centrifugar el suero a 4,500
rpm 1min, (guardar el suero centrifugado)
9. Eluir la columna de la siguiente manera.
a) Con la jeringa del kit tomar 2ml de buffer de elucion y pasarlos por la
columna.
b) Colocar la columna en un eppendorff y centrifugar a 4,500 rpm 1min.
c) Desechar el centrifugado, si es que no se desea analizar.
10. Equilibrar nuevamente la colunma como en el paso 6.
11. Colocar el suero filtrado y concentrado en la columna e incubar durante 15 min.
12. Colocar la columna de deplesión en un eppendorff y centrifugar el suero a 4,500
rpm 1min, (guardar el suero centrifugado por segunda vez).
13. Repetir los pasos 9 y 10.
Nota: La columna se guarda una vez equilibrada y son buffer de equilibrio ya que
puede ser utilizada hasta 100 depleciones.
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100
12.4. PROTOCOLO PARA TINCIÓN CON PLATA (SIGMA-ALDRICH)
Reactivo Volumen Tiempo Solución Agua desionizada
Metanol Ácido acético
20 ml 25 ml 5 ml
20 min
Fijadora
Etanol Agua desionizada
15 ml 35 ml
10 min
Lavado (Etanol 30%)
Agua desionizada
50 ml 10 min Lavado
Agua desionizada Sensibilizador
50 ml 500 µl
10 min
Sensibilizador
Agua desionizada
50 ml 10 min Lavados (2)
Agua desionizada Proteo silver silver
50 ml 500 µl
10 min
Plata
Agua desionizada
50 ml 1-1.5 min Lavado
Agua desionizada Proteo silver developer1 Proteo silver developer2
46 ml 2.5 ml 50 µl
3-7 min
Revelado
Proteo silver Stop
2.5 ml 5 min Parado
Agua desionizada
50 ml 30 seg Lavado
12.5. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PARA GELES DE ACRILAMIDA
Buffer de corrida 5X
Agitar en poco agua desionizada y aforar al final
Trisma base 15.1 g
Glicina 72 g
SDS 5 g
Agua desionizada 1000 ml
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101
Buffer de muestra stock 2X (SDS)
Solución stock de la cual se prepara el buffer de muestra 1X y 2X
50ml 100ml
Trisma base 12M 0.76 g 1.52 g
SDS 0.12M 1.0 g 2.0 g
Ajustar pH a 6.8
Glicerol 2M 10 ml 20 ml
Buffer de muestra 2X
500 µl
Buffer de corrida 2X 400 µl
B-mercaptoetanol 50 µl
Azul de bromofenol 50 µl
Buffer de muestra 1X
1000 µl
Buffer de corrida 2X 500 µl
B-mercaptoetanol 50 µl
Azul de bromofenol 50 µl
Agua bidestilada 500 µl
Marcador de peso molecular
Hervir por 5 min, cargar de 3 a 6 µl por carril; almacenar a 4°C
20 µl 40 µl
Buffer de muestra 1X 19 µl 38 µl
Marcador de peso molecular 1 µl 2 µl
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102
Persulfato de amonio 10%
Preparar al momento (almacenar a 4°C no más de 1 semana)
Persulfato de amonio 40 mg (0.040 g)
Agua bidestilada 400 µl
4X Tris Cl/SDS, pH 6.8
Ajustar el pH a 6.8 antes de aforar
50 ml 100ml
Trisma base 3.02 g 6.55 g
SDS 0.2 g 0.4 g
Agua bidestilada 50 ml 100 ml
4X Tris Cl/SDS, pH 8.8
Ajustar el pH a 6.8 antes de aforar
50 ml 100ml
Trisma base 9.08 g 18.17 g
SDS 0.2 g 0.4 g
Agua bidestilada 50 ml 100 ml
Acrilamida 30%
Disolver la acrilamida en 40 ml de agua agregar al bis acrilamida y aforar, protegiendo de la luz. Filtrar por poro de 0.45 y almacenar a 4°C
50 ml 100ml
Trisma base 9.08 g 18.17 g
SDS 0.2 g 0.4 g
Agua bidestilada 50 ml 100 ml
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103
Azul de coomassie
Agitar el metanol y azul de coomassie por 24h, posteriormente agregar el ácido acético y al final aforar con agua adicionándola por las paredes.
1000 ml Concentrado 500 ml
Metanol 50% 500 ml 250 ml
Azul de coomassie 0.05% 0.500 g 1g
Ácido acético glacial 10% 100 ml 50 ml
Agua bidestilada 400 ml 200 ml
Solución decolorante
1000 ml Concentrado 1000 ml Ácido acético 50 ml 100 ml
Metanol 65 ml 400 ml
Agua bidestilada 785 ml 500 ml
PARA DOBLE DIMENSION
Solución de rehidratación
Preparar al momento Solución de rehidratación 94.5 %
DTT 1M 5 %
IPG 4-7 0.5 %
Buffer de equilibrio 2-DE
Concentración final Cantidad Urea (PM 60.06) 6M 72.1 g
Tris-HCl pH 8.8 75mM 10.0 ml
Glicerol (87% w/w) 29.3% (v/v) 69 ml (84.2 g)
SDS 2% (v/v) 4.0 g
1% azul de bromofenol 0.002% (w/v) 400 µl
Agua bidestilada a 200 ml
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104
PARA ELECTROTRANSFERENCIA Y W.B.
Protocolo de electrotransferencia
1. En una charola verter el buffer de transferencia, mojar las esponjas, el papel filtro
y la membrana de nitrocelulosa.
2. Colocar la placa de transferencia con la parte negra hacia abajo y dentro acomodar
de la siguiente manera:
a) Esponja.
b) Papel filtro
c) Gel de poliacrilamida (MPM hacia la izquierda)
d) Membrana
e) Papel filtro
f) Esponja
3. Se cierra la placa y se coloca dentro de la cámara de electrotranferencia
coincidiendo los polos.
4. Se coloca el refrigerante y se llena con el buffer de transferencia.
5. Se corre al 100v 1h
Buffer de transferencia
Disolver el tris y la glicina en poco agua, adicionar metanol y aforar 1000 ml 2000 ml
Trizma base 3.025 g 6.05 g
Glicina 14.45 g 28.9 g
Metanol 200 ml 400 ml
Agua bidestilada a 1000 ml a 2000 ml
PBS pH 7.0
500 ml 1000 ml 10X NaCl 4 g 8 g 80 g
KCl 0.1 g 0.2 g 2 g
NaH2PO4 0.325 g 0.650 g 6.5 g
Kh2PO4 0.1 g 0.2 g 0.2 g
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PBS/Tween
400 ml 800 ml PBS 400 ml 800 ml
Tween 20 400 µl 800 µl
Solución de revelado con HRP Se preparan la solución A y la solución B por separado, se mezclan al momento de revelar
Solución A Solución B
HRP Metanol PBS H2O2 Volumen final
60 mg 20 ml 100 ml 60µl 120 ml
30 mg 10 ml 50 ml 30 µl 60 ml
15 mg 5 ml 25 ml 15 µl 30 ml
7.5 mg 2.5 ml 12.5 ml 7.5 µl 15 ml
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13. ANEXOS
13.1. Cursos,
� Seminario de información: manejo de presentación oral y escrita.
Realizado el 31 de Octubre de 2010. CIATEJ. Guadalajara Jalisco
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13.2. Congresos
� Simposio Mexicano de Espectrometría de Masas y Proteómica Celular y Molecular.
Realizado del 8-12 de Noviembre de 2009. San Luis Potosí.
� Simposio de cáncer de mama.
Realizado el 25 y 26 de Octubre de 2010. Mexico DF.
� México Bio 2010. 2do. Foro internacional de negocios en biotecnología. Con el cartel
de investigación científica: Identificación de antígenos y autoanticuerpos en sueros de
pacientes con cáncer de mama en etapas tempranas.
Realizado del 20 al 22 de Octubre de 2010. CINVESTAV Irapuato.
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13.3. Artículo
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