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INTRODUCCIÓN
En el presente laboratorio abordaremos dos temas fundamentales para el curso de
Microbiología: MICROSCOPIO COMPUESTO Y TINCION GRAM o
COLORACIÓN DE BACTERIAS.
El uso adecuado de un microscopio es una de las destrezas más importantes que debe
aprender un estudiante microbiología. Los microscopios se desarrollaron a finales del siglo
XVII y hoy en día, continúan siendo importantes para la identificación de hongos y algunos
otros microorganismos. Es por eso que los estudiantes debemos aprender como utilizarlos y
cuidarlos adecuadamente.Y en cuanto al tema de Tinción de Bacterias, definiremos el uso
de colorantes, del método Gram, y utilizando las muestras hechas en la semana anterior con
los medios de cultivo, hallaremos los tipos de Bacteria y que Bacterias son específicamente.
OBJETIVOS
MICROSCOPIO COMPUESTO
Manejar correctamente el microscopio conociendo la función de cada parte del
microscopio.
Conocer, mediante la observación de las muestras, cual es el objetivo apropiado
para observarlas (1Ox; 43x; 97x).
Enseñar el cuidado y mantenimiento apropiado de los microscopios. Aprender los pasos de un adecuado manejo del enfoque y observación de muestras
con el microscopio.
TINCIÓN DE LAS BACTERIAS (Método Gram)
Mediante este método podemos teñir las bacterias, para su mejor descripción
Determinación de bacterias Gram (+) ó Gram (-)
El método de tinción de bacterias sirve para diferenciar entre distintas
formas de microorganismos.
Podemos usar amplificaciones mayores.
FUNDAMENTO TEORICO
MICROSCOPIO COMPUESTO
Un microscopio compuesto tiene más de un lente objetivo. Los microscopios compuestos
se utilizan especialmente para examinar objetos transparentes, o cortados en láminas tan
finas que se transparentan. Se emplea para aumentar o ampliar las imágenes de objetos y
organismos no visibles a simple vista. El microscopio óptico común está conformado por
tres sistemas:
* El sistema mecánico está constituido por una palanca que sirve para sostener, elevar y
detener los instrumentos a observar.
* El sistema de iluminación comprende un conjunto de instrumentos, dispuestas de tal
manera que producen las ranuras de luz.
* El sistema óptico comprende las partes del microscopio que permiten un aumento de
los objetos que se pretenden observar mediante filtros llamados "de antigel subsecuente".
Sabemos que existen dos tipos de microscópicos: Simple y Compuesto.
MICROSCOPIO SIMPLE
Consiste en una lente o cristal de aumento montado en una armazón graduable provisto de
un soporte para la conveniente colocación del objeto y de un espejo que refleja la luz.
MICROSCOPIO COMPUESTO
Se diferencia del simple por que consta de dos juegos de lentes, uno conocido como
objetivo, y el otro por ocular; montado en un tubo (como observaremos a continuación en la
figura siguiente). Podemos conseguir un enfoque preciso con la ayuda de un tornillo
micrométrico. Los microscopios compuestos dan un aumento mayor que los simples; y son
necesarios para ver y examinar objetos tan minúsculos como las bacterias.
Un microscopio compuesto se divide en dos partes: Mecánica y óptica. A continuación
veremos cada una de las partes.
PARTE MECÁNICA
Principales componentes de los microscopios, descripción general y usos
Componente Descripción
BaseParte de metal o plástico sobre la cual descansa el resto de las partes del microscopio.
BrazoColumna en forma de “C” que se proyecta de la base y que sostiene a la platina y a los componentes ópticos.
PlatinaPlataforma plana unida a la parte inferior del brazo sobre la cual se colocan los portaobjetos o muestras a observar.
Cierre del Diafragma o Condensador
Manija debajo de la abertura de la platina que consiste de un grupo de piezas de metal a manera de obturador que regula la cantidad de luz que atraviesa al portaobjetos colocado en la platina.
CondensadorNo está presente en todos los microscopios – colecta los rayos de luz del iluminador y los enfoca – incrementa la resolución, aumenta el contraste de la muestra.
Botón de ajuste del condensador knob
Sube y baja el condensador.
CabezalParte cilíndrica/vertical unida en la parte superior del brazo que sostiene el sistema óptico.
RevólverPlato giratorio que sostiene los objetivos (lentes), unido a la parte inferior del cabezal, puede dársele la vuelta para cambiar los lentes (objetivos).
Principales componentes de los microscopios, descripción general y usos
Componente Descripción
Ajuste del macrométrico
Botón grande que mueve el cabezal hacia arriba y abajo para observar la muestra en el enfoque macrométrico.
Ajuste del micrométrico
Botón pequeño que mueve el cabezal a distancias más cortas, de manera más lenta y es usado para observar a la muestra con un enfoque más nítido.
Iluminador, Fuente lumínica
Controla la cantidad de luz que se transfiere a la muestra.
OcularesTubo de metal corto, removible que contiene lentes ubicados en la parte superior del tubo, generalmente de 10X, 43X, 97X de aumento.
Ajuste de DioptríaAjuste usado para compensar la diferencia de observación de los ojos.
Objetivos (lentes)Tubos de metales pequeños, atornillados dentro del revólver que incrementa el aumento de la muestra (a menudo se refieren sólo como objetivos).
Espejo Usado para reflejar la luz a través de la muestra.
Eje giratorio del espejo
Usado para ajustar el espejo para que refleje la luz a través de la muestra.
Lentes auxiliaresTambién se les refiere como lentes suplementarios, pueden ser encontrados en microscopios de disección en la base de la cubierta de los objetivos o cabezal.
TINCIÓN DE BACTERIAS
DEFINICIÓN DE COLORANTES O TINTES
Un tinte se define como una sustancia o compuesto orgánico que tienen los grupos
cromóforo y auxocromo ligados al núcleo bencénico.
Existen varios métodos de tinción pero estos están agrupados en tres tipos de tinción
específicos, los cuales pasaremos a mencionar.
Los tipos de tinción son:
A. Tinción simple: 1. Colorantes básicos
2. Colorantes ácidos
3. Colorantes indiferentes
B. Tinción compuesta: 1. Tinción de Gram
2. Tinción de ácidos resistentes
C. Tinción de estructuras: 1. Feulgen (para material nuclear)
2. Tinción de endósporas
3. Tinción de pared celular
4. Tinción de flágelos
5. Tinción de cápsulas
El método que usaremos para estudiar para la descripción de bacterias es el método de
Tinción de Gram.
TINCIÓN DE GRAM
La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en
microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su
nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza
tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una
primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram
positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las
que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.
Bacterias Clostridium perfringens (Gram positivas).
Bacterias Escherichia coli (Gram negativas) vistas al microscopio tras ser teñidas con la tinción de Gram.
Bacterias Gram positivas de Bacillus anthracis (bacilos morados) que producen una enfermedad llamada Carbunco, encontrados en una muestra liquido cerebroespinal. Si hubiera una especia de bacteria Gram negativa apareceria de color rosa. El resto son leucocitos atacando la infección.
PARTE EXPERIMENTAL
Materiales de vidrio:
- Portaobjetos
- Tubo de ensayo
Medios de cultivo:
- Agar nutritivo
- Caldo nutritivo
Colorantes:
- Cristal violeta (azul o morado)
- Lugol
- Safranina (rojo)
- Alcohol – Acetona
Equipo:
- Mechero
- Inoculador
- Microscopio
PROCEDIMIENTO
1. Secamos el portaobjetos pasando por el fuego
2. Preparamos el frotis de Agar nutritivo y Caldo nutritivo.
3. Dejamos secar al ambiente.
4. Fijamos al calor ( 3 veces)
5. Teñimos con cristal violeta por 20 segundos.
6. Lavamos con agua por 2 segundos.
7. Cubrimos el frotis con lugol durante 1 minuto.
8. Decoloramos con agua por 2 segundos.
9. Contracolorear con safranina y dejar que se tiña por 20 segundos.
10. Lavamos con agua y lo secamos con papel filtro.
11. Examinamos en el Microscopio con objetivo de 97X luego de secarse.
MICROSCOPIO COMPUESTO
CONCLUSIONES
- Pudimos determinar el
tipo de Bacteria presente en las muestras que preparamos.
- Los resultados que se obtuvimos en su mayoria de la coloración Gram fueron
Streptococos.
- Conluimos que es necesario seguir el procedimiento con el debido cuidado pues al
inicio no logramos los resultados esperados.
RECOMENDACIONES
- Es necesario realizar correcta y minuciosamente los procedimientos del frotis y la
fijación para obtener los resultados correctos.
- Es recomendable tener en cuenta saber el manejo del microscopio correctamente
para no dañar el microscopio.
- Se recomienda seguir el procedimiento minuciosamente, pues si no se corre el
riesgo de no obtener ningún resultado.
CUESTIONARIO
1. Establecer la diferencia entre poder de resolución y abertura numérica.
- Resulta evidente que el poder de resolución de un Microscopio óptico está
restringido por los valores limitados de la abertura numérica y la longitud de onda
de la luz visible.
2. Completar:
-
3. Hacer una tabla en relación a enfermedades microbianas que son transmitidas por el
aire, agua y alimento.
-
4. Responder
Partes del Microscopio Funcion(es)Ocular lFunción del ocular es presentar al ojo dicha imagen de la
forma más legible posible, agrandándola lo que sea necesario
Objetivo Función principal de un cualquier objetivo es obtener una imagen del objeto observado lo más nítida y luminosa posible
Condensador Es la de concentrar la luz generada por la fuente de iluminación hacia la preparación
Diafragma de Iris Es limitar el haz de rayos que atraviesa el sistema de lentes eliminando los rayos demasiado desviados
Tornillo Macrometrico Sirve para alejar o acercar el tubo y la platina. Se obtiene la imagen de la muestra (enfoque o ajuste grueso).
Tornillo Micrometrico Sirve para dar claridad a la imagen. Se logra el ajuste fino
ENFERMEDAD SÍNTOMAS PRINCIPALES
ALIMENTOS TÍPICOS
MODO DE TRANSMISIÓN
Salmonelosis Diarrea, dolor
abdominal, dolor de
cabeza, fiebre y
náuseas
Huevos, carnes y
productos lácteos sin
pasteurizar.
Comienzan entre las 8 y 48 horas
después de comer el alimento
contaminado y dura entre 1 y 8 días.
Escherichia coli Dolor de cabeza,
diarrea y dolor
abdominal severo.
Leche sin pasteurizar,
vegetales crecidos con
estiércol, etc.
Comienzan entre 3 y 9 días después de
ingerir el alimento contaminado, dura
de 2 a 9 días si no hay complicaciones.
Listeria
monocytogenes
Leche sin pasteurizar y
quesos blandos, carnes
de ave, paté de carne,
ensaladas, etc.
Fiebre repentina,
escalofríos, dolor de
espalda, dolor
abdominal y diarrea.
Comienza dentro de las 24 horas
después de comer el alimento
contaminado. Dura entre 2 y 7 días.
a) ¿Existen diferencias químicas entre las paredes celulares de las Bacterias gram
positivas y gram negativas?
- Las bacterias gram negativas contienen un porcentaje más alto de lípidos que las
bacterias gram positivas. Las paredes celulares de las bacterias gram negativas son
también más delgadas que las de las gram positivas; las paredes de las bacterias
gram negativas tienen una cantidad mucho menor de peptido-glucano con ligaduras
cruzadas menos extensas que en las paredes de las bacterias gram positivas.
b) Afecta la edad del cultivo a la reacción de Tinción de Gram.
- La edad del cultivo afecta a la reacción de tinción Gram pues cultivos viejos de
algunas bacterias gram positivas pierden la facultad de retener el cristal violeta y se
tiñen con la safranina.
5. Hacer una lista de Bacterias Gram positivas y Gram negativas con las enfermedades
que provocan.
GRAM POSITIVAS GRAM NEGATIVAS
Bacillus subtilis Achromobacter
Clostridium tetani Brucella ovis
Corynebacterium diphtheriae Klebsiella pneumoniae
Lactobacillus acidophilus Escherichia coli
Streptococcus pyogenes Salmonella typhi
-
BIBLIOGRAFÍA
1. Wesley A. Volk Microbiología Basica
Ed. Harlon – Año 1996
México (sexta edición)
2. A. J. Salle Bacteriología
Ed. Gustavo Gili – Año 1960
Barcelona (cuarta edición)
3. Harry Seeley Microbiología en Acción
Ed. Blume – Año 1973
ANEXOS
Estafilococos
Muestra Nº 01
Muestra Nº 02
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