Unidad 5 Tecnicas de Análisis y Manipulacion del ADN adn

5. Técnicas de Análisis y Manipulación

de Ácidos Nucleicos.

OBTENCION Y PREPARACIÓN PRELIMINAR DE LAS MUESTRAS.

La muestra celular se obtiene y prepara a partir de:

Órganos

tejidos

fluidos biológicos

En función del objetivo perseguido:

Clínico

Identificación de individuos

Tipo de célula: Somática

Germinal

Tipo de genoma:

Nuclear

Mitocondrial

Tipo de estudio a realizar:

Secuencia del genoma

Genes

Productos génicos

En cualquiera de los caso, deben emplearse condiciones

que garanticen Ia calidad de Ia muestra frente a las

diversas variables que afectan a Ia fase preanalitica

Recolección

Anticoagulante empleado

Manipulaciones para Ia conservación

Transporte, etc.

En general, la preparación preliminar se hace rápidamente

tras la obtención (dentro de 1 hora, como máximo 24 h), o la

muestra se mantiene congelada hasta que llega al

laboratorio.

Muestras de tejidos sólidos.

Normalmente se obtienen mediante biopsia (método

invasivo de recogida, bajo condiciones quirúrgicas, de

células o porciones de tejido de un organismo vivo, con

fines diagnósticos).

Se liberan de restos de sangre, grasa o tejidos

acompañantes por lavados con disolución salina

fisiológica fría y se envían al laboratorio, según los

casos, refrigeradas o congeladas, protegidas con hielo,

nieve carbónica o nitrógeno líquido.

Muestras de suspensiones celulares.

Células embrionarias (diagnóstico pre-implantación).

EI óvulo fertilizado origina en el útero por sucesivas

mitosis estructuras de 2, 4 y 8 células totipotentes (8

blastómeros, que forman la mérula) y luego de 16, 32 y

64 células pluripotentes; esta última estructura se llama

blastocisto o blastodermo, y a partir de ella se inicia el

desarrollo.

Para observar si el embrión es portador de un trastorno

genético se puede obtener DNA extrayendo 1 ó 2

blastómeros (que no afecta al desarrollo de las otras

células de la mórula).

Líquido o fluido amniótico

A partir de la primera semana de gestación, el embrión

queda protegido al estar inmerso en el líquido amniótico,

contenido dentro de una membrana llamada saco amniótico

o amnios. La composición del líquido amniótico, cuyo

volumen llega hasta 1.100 ml a término, depende de un

equilibrio dinámico de intercambios con el feto y la madre, y

contiene células epiteliales que aportan unos 65 ng DNA/ml.

La obtención de una muestra, mediante punción abdominal

a través de la pared del útero, se denomina amniocentesis.

Células de tejidos o sangre fetales

Como alternativa al líquido amniótico se utilizan

muestras de vellosidades coriónicas, tejido fetal

procedente del corion (membrana más externa

del embrión, que contacta con la placenta). Estas

constituyen la mejor fuente de DNA fetal.

Células de sangre o médula ósea adultas

Las muestras de sangre periférica son las más

empleadas, comúnmente de sangre venosa

(unos 40 ug DNA/ml) recogida sobre

anticoagulante.

Se utilizan también manchas de sangre, que se

obtienen de sangre fisiológica (talón, dedo...)

secada sobre un papel o cartón, o bien de

origen accidental (prendas, vehículos,

utensilios...). La mancha se raspa y extrae por

lavado con disolución salina.

Muestras bucales

Los raspados y enjuagues bucales, obtenidos por

métodos no invasivos, con cepillo suave o algodón y

disolución salina, contienen células epiteliales de

descamación con suficiente DNA genómico para su

detección, previa amplificación por PCR.

La saliva es de uso creciente por su facilidad de obtención

(toma directa o presencia sobre la piel, sellos, colilla de

cigarrillo, etc.)

Semen

Contiene millones de espermatozoides (5-7% del

volumen total, con 1,3 pg DNA por célula)

formados en los testículos, en suspensión en una

fracción liquida de secreciones de las vesículas

seminales (50% en volumen), la próstata (20% en

volumen), las glándulas bulborrectales y el

epidídimo.

Se recoge de varias maneras:

a) En preservativo, para estudios de funcionamiento del

tracto genital masculino, marcadores de fertilidad, etc.

b) Por aspiración directa de la vagina, para investigación

criminal por agresión sexual

c) Por lavado salino de manchas secas en ropa, piel,

pelo, etc.

Las muestras frescas se deben analizar antes de 1h de

su recogida, manteniéndolas a temperatura corporal

durante su transporte.

Los espermatozoides se pueden separar del resto de

células (que incluyen las de la víctima, en casos de

asalto sexual) mediante lisis diferencial de éstas con

SDS (dodecilsulfato sódico) y proteinasa K.

Células en cultivo

Las células aisladas o procedentes de tejidos u

órganos disgregados se pueden cultivar en

medios especiales.

El cultivo celular constituye per se un área de

estudio independiente, con requerimientos

especializados en cuanto a equipo,

procedimientos, sustratos, nutrientes y factores

de crecimiento, etc.

Muestras celulares de líquidos biológicos

extravasculares.

Líquido cefalorraquídeo

Es un fluido resultante de Ia ultrafiltración del

plasma (de ahí su analogía en composición) y

que recoge los productos de desecho del

metabolismo cerebral. Se encuentra en dos

compartimentos que recubren el cerebro y la

medula espinal, comunicados entre sí: el

sistema ventricular (30 ml) y el espacio

subaracnoideo.

Líquidos o derrames serosos

Se localizan en las cavidades del cuerpo que

rodean los órganos, delimitadas por dos

membranas, la parietal (externa) y Ia visceral

(interna, superficie del órgano).

Liquido articular o sinovial

Es un ultrafiltrado del plasma, viscoso, con un

alto contenido en proteínas y ácido hialurónico,

localizado en la cavidad articular para conferir un

carácter lubricante frente a la fricción propia de

las articulaciones durante el movimiento.

Muestras biológicas menos habituales

Pueden contener células y, por tanto, DNA, una serie de

muestras de interés en casos concretos:

Humor acuoso (cámara anterior del ojo)

Humor vítreo (detrás del iris)

Lagrimas

Endolinfa (tubo espiral del oído interno)

Perilinfa (canales del equilibrio)

Moco cervical

Líquidos folicular, oviductal y vaginal

Heces

Secreciones nasales

Uñas, etc.

DISOCIACION DE LA MUESTRA TISULAR

En los tejidos, las células se encuentran

atrapadas en una organización tridimensional,

con interacciones o adhesiones tanto entre ellas

como con la matriz extracelular (gel hidratado

formado por fibras proteicas, como colágeno, y

cadenas glucídicas complejas).

El mejor rendimiento en cuanto a disociación de

células pueden señalarse tres estrategias:

Fragmentación mecánica: Mediante corte, troceado o triturado de la

muestra.

Disgregación química: La rotura de la matriz extracelular y de las uniones

intercelulares se suele realizar por homogeneización isotónica o por

sonicación (exposición a ultrasonidos, ondas sonoras o acústicas no

percibidas por el oído humano por poseer una frecuencia superior a 20

kHz), generalmente en presencia de detergentes (iónicos, como el

dodecilsulfato sódico o SDS, o no iónicos, como Tween-20 y Triton X-100).

La eliminación de cationes divalentes, en especial el Ca2+ (con agentes

quelantes como EDTA).

Digestión enzimática: Las proteínas de la matriz se digieren con proteasas

como colagenasa, proteinasa K, pepsina o tripsina. Dependiendo del tipo de

muestra, esta digestión puede requerir largos tiempos de incubación (por

ejemplo, células en cultivo o raíces de pelo).

EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS POR

SOLUBILIDAD EN FASES INMISCIBLES

En general, dada su complejidad macromolecular, los ácidos

nucleicos son difíciles de separar de los componentes de

membrana, proteína residual o añadida (tales como las

enzimas de restricción) y otras moléculas solubles (por

ejemplo, polisacáridos),

Los métodos drásticos alteran sus estructuras y sus

características. De ahí que sean muchos los métodos

suaves elaborados para eliminar la impureza de las

preparaciones, todos ellos basados en las propiedades

físico-químicas del ácido nucleico. Para la eliminación de

proteínas asociadas se utilizan enzimas proteolíticas, como

la proteinasa K.

Los métodos drásticos alteran sus estructuras y sus

características. De ahí que sean muchos los métodos

suaves elaborados para eliminar la impureza de las

preparaciones, todos ellos basados en las propiedades

físico-químicas del ácido nucleico. Para la eliminación de

proteínas asociadas se utilizan enzimas proteolíticas, como

la proteinasa K.

Extracción del DNA

El protocolo básico consiste en el tratamiento del

homogenado con disolventes orgánicos (fenol,

cloroformo o ambos).

ANALISIS DIRECTOS DEL DNA

Electroforesis

Esta técnica se basa en la capacidad de las

macromoléculas cargadas para desplazarse en un

campo eléctrico, con velocidad proporcional a su

carga e inversamente proporcional a su tamaño.

Las moléculas de DNA poseen, al pH alcalino

habitual, una carga negativa uniforme por unidad de

masa, lo que hace que su movilidad hacia el ánodo

(+) solo venga determinada por el tamaño de la

molécula (número de pares de bases, si es lineal).

Detección del DNA tras su separación (“revelado”)

Una vez separadas, las moléculas de DNA se

visualizan normalmente por la fluorescencia de

distintos compuestos que se unen a ellas.

Aunque el más utilizado es el bromuro de etidio,

va siendo sustituido por otros fluorocromos con

mayor poder de detección o menor toxicidad.

Tecnología del DNA recombinante

(Clonación celular)

El método clásico de clonación de ácidos nucleicos es

el que aprovecha la capacidad de las células para

replicar el DNA.

Surge gracias a la aparición de una serie de técnicas

que permiten el aislamiento del DNA y al

descubrimiento en los años 70 de las enzimas de

restricción, que hace posible en el laboratorio clonar el

DNA e incorporar los fragmentos a vectores, que a su

vez se introducen en células anfitrionas, donde tiene

lugar su replicación.

ENZIMAS DE RESTRICCION

Aunque estas enzimas desempeñan una función

propia en las células procariotas en las que se

descubrieron, son particularmente importantes por su

empleo experimental en varias áreas de la Biología

Molecular, de interés tanto básico como aplicado al

diagnóstico clínico.

En especial, se utilizan en el proceso de la clonación

molecular del DNA, Además, tienen aplicación en otras

técnicas, como la secuenciación del genoma y el

estudio de los polimorfismos.

Se inicia el estudio de estas enzimas con un breve

recordatorio de las nucleasas en general.

Nucleasas

Se denomina de forma genérica nucleasa a cualquier

enzima con capacidad de escindir los enlaces

fosfodiéster de Ia cadena polinucleotidica de los ácidos

nucleicos; son, por tanto, fosfodiesterasas. Su

especificidad puede analizarse con respecto a tres

criterios:

1. Escisión en posiciones internas o terminales en la

estructura primaria (endonucleasas y exonucleasas,

respectivamente):

1. Escisión en posiciones internas o terminales en la

estructura primaria (endonucleasas y exonucleasas,

respectivamente):

2. Actuación sobre uno de los dos tipos de enlace

fosfoéster:

3. Reconocimiento de nucleósidos, bien por Ia pentosa o

bien por Ia base nitrogenada (solo en algunas nucleasas)

desoxirribonucleasas o DNasas, que actúan solo sobre

DNA; ribonucleasas o RNasas, que hidrolizan RNA

finalmente, algunas nucleasas distinguen entre

nucleósidos purinicos y pirimidinicos:

Enzimas de restricción.

Las enzimas de restricción se Ilaman también nucleasas

de restricción, endonucleasas de restricción y, en

ocasiones, enzimas restrictivas o restrictasas.

Se nombran con tres letras tomadas del género

y especie de la bacteria de la que se aislaron

originalmente, seguidas a veces por una letra

más, que identifica el serotipo (variante

antigénica de la bacteria), y finalmente por un

número romano que las identifican en el caso de

que en una misma variante se hayan encontrado

varias enzimas con distinta especificidad:

La importancia de las enzimas de restricción

radica en su gran especificidad de

reconocimiento de una secuencia corta de DNA

dúplex y la consiguiente hidrólisis de un enlace

fosfodiéster en cada hebra, justamente en

secuencias concretas del DNA llamadas sitios

de reconocimiento o de restricción.

Los fragmentos de DNA originados son útiles

para iniciar la clonación celular o acelular, para

el análisis de DNA, para elaborar mapas físicos

de restricción, para la detección de

polimorfismos, etc.

Las diversas enzimas de restricción se agrupan normalmente en tres

familias, de acuerdo con sus propiedades:

Acción de las enzimas de restricción de tipo II

Las enzimas de tipo II, son las mas usadas

pues, al clonar en secuencias muy definidas,

son las utilizadas como herramientas en

ingeniería genética.

Son éstas las restrictasas estructuralmente más

simples y las mejor estudiadas por su utilidad

en Ingeniería Genética, a modo de “tijeras” para

el corte del DNA.

EI sitio de restricción es a Ia vez Iugar de

reconocimiento y de hidrolisis.

Se hidrolizan de forma muy específica enlaces

fosfoéster del DNA, uno en cada hebra, generándose

dos fragmentos de restricción.

EI enlace hidrolizado es siempre el 3'-P, por lo que el

fosfato queda unido a 5’, dejando en ambos

fragmentos extremes 3'-OH y 5’-P.

La reacción no necesita ATP, lo que la diferencia de la

catalizada por las enzimas de tipo I y III.

CLONACION CELULAR DE MOLECULAS

DE DNA

EI objetivo central de esta clonación es la

producción de un gran número de copias de una

región de DNA.

Se trata, por tanto, de un proceso de clonación de

tipo celular (pues se consigue gracias al empleo

de células) que, por contraposición a la clonación

acelular por PCR, in vitro, se puede considerar que

se realiza in vivo (estrictamente hablando, en

cultivo).

Se basa esta clonación, al igual que Ia PCR, en Ia

realización de múltiples rondas de replicación,

pero en este caso catalizadas por la DNA

polimerasa propia de la célula en la que se lleva a

cabo el proceso, célula “anfitriona”.

Para ello, el fragmento de DNA a clonar (llamado

inserto) se une a otro DNA (vector de clonación), y

la molécula de DNA recombinante formada se

incorpora a Ia célula anfitriona donde tiene lugar la

amplificación por replicación.

Una vez detectada la presencia del DNA de

interés y seleccionados los clones que lo

han amplificado, se aísla el gen o

fragmento de DNA, que se emplea con

distintos fines, esencialmente el estudio de

características físicas, secuencia,

estructura, propiedades funcionales,

expresión génica a proteínas, etc. (muchos

de estos objetivos pueden ser aplicables

también a la PCR o clonación acelular).

Tipos de vectores.

Plásmidos.

Son moléculas de DNA de doble hebra, de

pequeño tamaño (2-5 kb) y forma circular,

presentes en forma libre en el citosol de

muchas bacterias (de 1 a 3.000

plásmidos/célula) y de algunos eucariotas

unicelulares.

Bacteriófagos.

Los bacteriófagos (también llamados fagos) son virus que infectan

exclusivamente a bacterias.

Los virus en general se replican mediante la introducción de su

genoma en células procariotas o eucariotas (infección).

Esta propiedad resulta útil para conseguir una alta eficiencia de

clonación, empleando como vectores virus mordicados.

Cada tipo de virus infecta a células específicas y, dependiendo del

tamaño del genoma vírico, admite insertos más o menos grandes,

pero en general mayores que los que se pueden insertar en

plásmidos.

Así, para clonar en bacterias se usan bacteriófagos.

Cósmidos

Son vectores sintéticos, quimeras que combinan

características de plásmidos y fagos para combinar las

ventajas de ambos tipos de vectores.

EI fragmento plasmídico proporciona las características

de tamaño pequeño (5-7 kb).

Del fago se toman las secuencias “cos” (del inglés

cohesive sites), que proporcionan al cósmido la

capacidad, propia del DNA del fago, de ser

empaquetado en cápsidas víricas in vitro.

Cromosomas artificiales

Este tipo de vectores se han diseñado en especial para

adaptarse al gran tamaño de insertos requeridos en el

caso del genoma humano y de otros mamíferos, y para la

clonación en células eucariotas.

a) Cromosomas artificiales bacterianos:

Se les llama comúnmente BACS (bacteriaI artificial

chromosomes). Se trata de vectores sintéticos derivados

del plásmido F o el fago P1. Se caracterizan, en primer

lugar, por aceptar grandes insertos de DNA, entre 100 y

300 kb.

b) Cromosomas artificiales de levadura:

Los YACs (yeast artificial chromosomes) son vectores

sintéticos que contienen las tres regiones relacionadas

con la funcionalidad de un cromosoma; secuencias

constituyentes de un centrómero, de dos telómeros y

de un origen de replicación.

GENOTECAS Se llama genéricamente genoteca o biblioteca de DNA a una colección de clones formados a partir de todos los fragmentos de DNA obtenidos previamente por escisión del genoma de una especie o de un tejido.

PCR (REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA)

• KARY MULLIS,1985.

• ESTA TÉCNICA PERMITE AMPLIFICAR, A GRAN ESCALA,

REGIONES ESPECIFICAS DEL ADN.

• SE BASA EN EL USO DE OLIGONUCLEÓTIDOS SINTÉTICOS QUE

SON COMPLEMENTARIOS A SECUENCIAS QUE FLANQUEAN

UNA REGIÓN ESPECIFICA DEL ADN MOLDE

• POR MEDIO DE CICLOS DE AMPLIFICACIÓN REPETIDOS, ES

POSIBLE OBTENER REGIONES DISCRETAS DEL ADN.

PASOS FUNDAMENTALES DE LA

PCR

• DESNATURALIZACIÓN: 94° C.

• APAREAMIENTO: INICIADOR O PRIMER Y ES UN

OLIGONUCLEÓTIDO DE 15 A 30 BASES NUCLEOTÍDICAS. 45-

65°C.

• EXTENSIÓN: POLIMERIZACIÓN, EN DIRECCIÓN 5’ A 3’ POR

MEDIO DE UNA ADN POLIMERASA Y

DESOXIRRIBONUCLEÓSIDOS TRIFOSFATADOS (dNTPs). 72° C.

COMPONENTES DE LA PCR

• ADN BLANCO (MOLDE, OBJETIVO O PLANTILLA).

• INICIADORES (PRIMERS): SON FRAGMENTOS DE ADN

SINTÉTICOS (OLIGONUCLEÓTIDOS) QUE SON HOMÓLOGOS

COMPLEMENTARIOS A UNA REGIÓN DEL ADN MOLDE.

• ENZIMAS POLIMERASAS TERMOESTABLES: THERMUS

AQUATICUS (TAQ) Y T. TERMOPHYLLUS (TTH).

COMPONENTES DE LA PCR

• DESOXIRRIBONUCLEÓTIDOS DE TRIFOSFATO (dNTPs): LA ADN POLIMERASA INCORPORA DESOXIRRIBONUCLEÓTIDOS AL FORMAR UN ENLACE FOSFODIÉSTER ENTRE EL GRUPO –OH LIBRE EN EL EXTREMO 3’ DE LA CADENA NACIENTE Y EL

GRUPO FOSFATO 5’ DEL dNTP.

• EL AMORTIGUADOR: LA SOLUCIÓN AMORTIGUADORA ESTÁNDAR PARA LA PCR CONTIENE KCl 50 mM, TRIS-HCL 10 mM, PH 8.4, MgCl2 1.5 mM Y GELATINA EN CONCENTRACIÓN DE 100 g/ml.