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UNIDAD 3: Endonucleasas o Enzimas de Restricción
Elaboró: Dra. Kadiya del C. Calderón Alvarado
UNIVERSIDAD DE SONORA
POSGRADO EN BIOCIENCIAS
MICROBIOLOGÍA MOLECULAR (2442)
Introducción:
Endonucleasas de restricción (restrictasas)
Descubiertas simultáneamente entre 1968 y 1970 por Werner Arber y Hamilton Smith.
W. Arber
H. Smith
Las endonucleasas de restricción son un mecanismo de defensa de las bacterias frente a la entrada de ADN foráneo.
• Degradan el ADN extraño• No degradan el ADN propio de la bacteria
Arber&Linn,1969
Tipo I: Cortan en sitios cercanos al de reconocimiento.Tipo II: Cortan justo en el sitio de reconocimiento.
Las endonucleasas de restricción supusieron un enorme avance en el campo de la ingeniería genética. El uso de las enzimas restrictasas con estos fines fue propuesto y desarrollado por Nathans y Danna en 1971.
D. Nathans
K. Danna
Las endonucleasas de restricción cortan dentro de la secuenciade ADN, dejando extremos que pueden ser:
1. Cohesivos (protuberantes)En 5’
En 3’
ATCGGTGGTACCTGC KpnI ATCGGTGGTAC CTGC||||||||||||||| ||||||| ||||TAGCCACCATGGACG TAGCCAC CATGGACG
ATCGGTGAATTCTGC EcoRI ATCGGTG AATTCTGC||||||||||||||| ||||||| ||||TAGCCACTTAAGACG TAGCCACTTAA GACG
5’
3’
3’
5’3’
5’3’
5’
3’
5’5’
3’
5’
3’
3’
5’3’
5’
5’
3’ 5’5’
3’
3’
Las endonucleasas de restricción cortan dentro de la secuenciade ADN, dejando extremos que pueden ser:
2. Romos
ATCGGTGATATCTGC EcoRV ATCGGTGAT ATCTGC||||||||||||||| ||||||||| ||||||TAGCCACTATAGACG TAGCCACTA TAGACG
5’
3’
3’
5’3’
5’
3’
5’
5’
3’
Roberts,1976
Nucleasas
Endonucleasas Exonucleasas
Modificado deRoberts,1976
Cortesinternos Cortesexternos
ADN ADN
TipoI Mg2+
EcoKIModificado dePray,2008
cofactor
Sitiodereconocimiento,diferente alsitiodecorte
Endonucleasas de tipo II: Son enzimas endonucleasas, que cortan internamente el ADN de doble cadena, en sitios de reconocimiento específico (dianas de restricción).
La mayoría de las secuencias diana son simétricas en ambas
hebras del ADN(dianas palindrómicas)
LewinB.GenesIX(2009)
TipoIIMg2+
93%detodas lasenzimasconocidas
EcoRI BamHI HindIII
Modificado dePray,2008
Sitiodereconocimiento,en elmismo sitiodecorte
Las metilasas (o metil-transferasas) modifican el ADN bacteriano, añadiendo un grupo metilo a las bases A ó C del ADN recién sintetizado
La metilación en los sitios diana de las enzimas endonucleasas de restricción bloquean la acción de las mismas sobre el ADN propio
Permite a las bacterias defenderse contra el ataque de los bacteriófagos y hacen de barrera frente al ADN foráneo.
Metilasas
citosina 5-metil-citosina
grupo metilo
TipoIII
EcoPIModdePray,2008
Sitiodereconocimiento,diferente alsitiodecorte
• Isoesquizomeros:tienen lamisma secuencia dereconocimiento yelmismo sitio decorte.
SphI ->CGTA/CBbul ->CGTA/C
• Neoesquizomeros:tienen elmismo sitio dereconocmiento,perocortan elADNen diferente lugar.
SmaI ->CCC/GGGXmaI ->C/CCGGG
Chandrasegaran,2001
Tiposdecortes
• Cortes“pegajosos”
Tiposdecortes
• Cortes“romos”
Mecanismo deacción
• Unsolocorte en cada una delascadenas deazucar-fosfato deladoble helice,hidrolizando elenlacefosfodiester
Chandrasegaran,S.2001
Enzima Fuente Sitio de restricción
BamHI Bacillus amyloliquefaciens G G A T C C C C T A G G
EcoRI Escherichia coli G A A T T CC T T A A G
HindIII Haemophilus influenzaeA A G C T TT T C G A A
PstI Providencia stuartiiC T G C A GG A C G T C
BalI Brevibacterium albidumT G G C C AA C C G G T
SmaI Serratia marcescensC C C G G GG G G C C C
Ejemplos de endonucleasas de restricción comerciales y sus secuencias de reconocimiento
Extr
emos
coh
esiv
osE.
rom
os
LewinB.GenesIX(2009)
Usoenellaboratorio
• Estudiarlasdiferenciasentrelalongituddelosfragmentosdediferentesindividuos(RFLP)
• Clonacióndegenes• ConstruccióndelibreríasdeADNc• Secuenciación
RFLP• Distinguir individuos homocigotos yheterocigotos• Deteccion deenfermedades• Estudios dediversidad
Pray, L. (2008)
Clonación
Chandrasegaran,S.2001
Librerías genómicas
Pray, L. (2008)
Actividaddelasenzimasderestricción
• Seexpresaentérminosdeunidades• Unidad:cantidaddeenzimaqueseuniráatodossitiosespecíficosen1microgramsdeADNmuestraen1ha37ºC
Stephenson,2016
Stephenson,2016
CantidaddeHindIII
Stephenson,2016
DigestioninsilicoSepretende digerirvirtualmente elplasmidopGEM – 3Z
Sepuede buscar elvectoren NEBcutter,conelcodigo deGenBank
Obtenemos unmapa delasenzimas conlasquepodemos abrir elvector
Incluso podemos realizar unaelectroforesis insilicoyvercomo severia elvectordigeridoconlasenzimas elegidas
Digestión invitro
• Leerespecificaciones delaenzima
Digestióninvitro
Recetadedigestión
Incubar:37◦Cx1-16horas
Actividad ”estrella”
• Laenzima seune asitios similares pero noidenticos alsitio dereconocimiento correspondiente.
• Bajo condiciones extremas• Temperatura incorrecta• pHelevado• Bajafuerza ionica• Altas concentraciones deglicerol (>5%)
Ligación
• SielADNdeinterés yelvectorsoncortados conlamisma enzima,yesta crea cortes “pegajosos”,sepuede incubar conuna ADNligasa.
• Molécula deADNrecombinante.
Pray, L. (2008)
Resumen
• Conforman un“sistema inmune”primitivo en procariotas
• Clasificacion• Sitios deanclaje• Sitio decorte• Tipos decorte
• Importancia biotecnologica
• Es imprescindible conocer lasespecificaciones delaenzima queseesta utilizando
Bibliografía recomendada
• ArberW,LinnS(1969)."DNAmodificationandrestriction". AnnualReviewofBiochemistry. 38:467–500.
• RobertsRJ(Nov1976)."Restrictionendonucleases". CRCCriticalReviewsinBiochemistry. 4(2):123–64.
• Pray, L. (2008) Restrictionenzymes. NatureEducation• Chandrasegaran,S.2001.RestrictionEnzymes.eLS..• JohnW.Pelley,18- RecombinantDNAandBiotechnology,InElsevier'sIntegratedBiochemistry,Mosby,Philadelphia,2007,Pages159-167,ISBN9780323034104
• FrankH.Stephenson,Chapter10- RecombinantDNA,InCalculationsforMolecularBiologyandBiotechnology(ThirdEdition),AcademicPress,Boston,2016,Pages321-373,ISBN9780128022115
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