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UNIVERSIDAD DE COLIMAFACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y,ZOOTECNIA
MAESTRÍA EN BIOQUÍMlCA Y CINETICA RUMINAL
EFECTO DEL AZUFRE SOBRE LA DIGESTIBILIDAD IN VITRO DECELULOSA POR HONGOS RUMINALES DE CAPRINOS
RAMÓN GOVEA CASARE2
TESIS
presentada como requisito para obtener el grado de
MAESTRO EN CIENCIAS
1998
ii
AGRADECIMIENTOS
A la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de Colima
por haberme dado la oportunidad de formarme como maestro en ciencias.
Con especial atención agradezco el gran apoyo económico que me brindó la
empresa del Consorcio Minero “Peña Colorada” en el desarrollo de mi formación.
Reconozco con apreciación extensiva el gran interés del cuerpo de asesores que
me condujeron con sus opiniones técnicas, tan importantes al desarrollo de mi trabajo y
la guía para la preparación de mi documento: ,
Dr. Miguel Arenas V.
Dr. Luis Felipe Bojalil Jaber
Dr. Fausto Sánchez y García Figueroa
Dr. Daniel Contreras Lara
Dr. Héctor González Cerezo,
Dr. Antonio Flores Díaz.
Dr. Judith Licea de Arenas.
Dr. Francisco Radillo Juárez
Además, a la Ingeniera Teresa Castillo Velasco, MC. Leonardo Gutiérrez
ChávezMC. Martha Vergara, MC. Joel López Pérez. BQ. Juan Manuel Miramontes,
Dra. Rocío Flores Bello, Dr. Sergio Aguilar Espinoza, MC. Ruben Ballardo y MC. J.
Trinidad Ramírez Carrillo por el apoyo fructífero en la revisión de mi trabajo.
i i i
Dedico a MIS PADRES J. Jesús Govea Terriquez y Ma. Soledad Casarez M. Quienes
me ofrecieron su apoyo incondicional en el proceso de formación para la obtención de
este grado.
A mi ESPOSA Alida Montejano Peregrino por su invaluable apoyo moral para la
realización de mi trabajo.
A mis HERMANOS Roberto, Pedro, Ana y Belén. A quienes admiro porque me
han brindado confianza y motivación en mi superación profesional.
A mis SUEGROS por tener el apoyo incondicional que me han mostradosiempre.
RESUMEN
Las paredes celulares de los forrajes en el Trópico Seco se caracterizan porposeer altos contenidos de celulosa hemicelulosa, lignina y pectina; compuestos que alser ingeridos por los rumiantes dificultan su digestibilidad. Los hongos anaerobiospresentes en el rumen, participan en la degradación de las paredes celulares, y el azufreinfluye en la proliferación de estos microorganismos. El conocer respuestas metabólicasde estos hongos en presencia de azufre puede permitir su manejo. Se evaluó in vitro lacapacidad de los hongos ruminales caprinos para digerir la celulosa pura (Sigmacell tipo10 1) en presencia de diferentes fuentes y concentraciones de azufre. y se determinaronlas concentraciones de glucosa y fluctuaciones del pH. Para reproducir las zoosporas delos hongos en cultivo axénico, se tomó una muestra de contenido ruminal de caprinos yse depositó en un medio de cultivo por 72 horas. Se inocularon en un medio de cultivocon celulosa pura como fuente de carbono. Se determinó la digestibilidad de los hongosutilizando diferentes fuentes y niveles de azufre. Las fuentes de azufre fueron: Sulfuro deSodio (Na2S), Metionina (C5 H11NO2S y ambos compuestos al 50% en proporción alazufre de su fórmula (considerando su peso molecular), y en los niveles de 0, 0.15, 0.25y 0.35%. La digestibilidad de celulosa se evaluó a los 2, 4, 6 y 8 días de incubación,donde se encontró una relación positiva en la digestibilidad con la concentración deSulfuro de Sodio y los períodos de incubación, con un coeficiente de coorelación der=0.94, r=0.96, r=0.94 y r=0.97, respectivamente. Destacó la concentración del Sulfurode Sodio en el nivel 0.15% a las 48, 96, 144 y 192 horas con digestibilidad de 35.26.40.82, 39.95 y 34.35% respectivamente; superando al testigo con valores de 28.86,29.44, 25.93 y 22.90%. La combinación de Metionina y Sulfuro de Sodio incrementó ladigestibilidad de la celulosa en el nivel 0.15% solo en las horas 144 y 192 (42.07 y42.45%). La concentración de glucosa se incrementó en la combinación de las dosfuentes, con valores 2.45 hasta 4.16 µmol/ml y con valores superiores en lasconcentraciones del 0.35%; en tanto que el testigo mostró valores que fluctuaron de 0.99a 2.78 µmol/ml, la metionina de 1.28 a 3.99 y sulfuro de sodio de 0.83 a 4.16 µmol/ml.El pH del medio de cultivo con Sulfuro de Sodio con el nivel de 0.25% para todos lostiempos, mostró variación desde 7.60 a 8.64, en tanto que los valores de los medios conMetionina y la combinación de ambos fueron más ácidos (7.20 a 7.61 y de 7.30 a 7.43).Mediante la adición de tientes de azufre, los hongos ruminales caprinos modifican ladigestibilidad i n vitro de la celulosa, concentración de glucosa y el pH.
Palabras Claves: Rumen, hongo anaerobio, digestibilidad, Sulfuro de Sodio,Metionina, Celulosa, Caprinos.
IX-DICE Pagina
AGRADECIMIENTOS. . .................. ..................... .................................. i i
RESUMEN ................................ ................................. ............... i v
INDICE . . . . . . . . .................... ............................... ................. \.
LISTA DE C’U>,U>ROS ................... .................................................. \:ii
LISTA DE FIGURAS.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . \?Il
1. INTRODCC‘CIÓY ........................ .................................. ..................... 1
-2. INFLUEKCI.4 DEL AZUFRE Es 14 DEGRADACIÓN DE L<\S
PAREDES CELULARES DE FORI?(.UES POR HONGOS DEL RGMEN.... 4
2 .1 El trópico seco y la producciitn mimal.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
2 1 I Caracterización de los forajes en el trópico seco ......... 5
2 3 Condiciones ambientales en el ri::~n. .......... .......... 6
2 3 1 Fisiología digestiva en el T;lmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2 2 2 Absorción de nutrientes a Través del rumen . . . . . . . ................. 9
2.3.3 Participación microbiana <n la digestión de las paredes celulares en
el rumen ....................... ................... ........ ..................9
2 3.4 Asociación de microorgar,ismos y alimento en el rumen ................... 1 0
? ? 5 Importancia de la adaptación a al dieta alimenticiah.d. ......................... 1 3
2 3.6 hqanipulación en la digestion del alimento ....................................... 13
2.3 Estructura de la pared celular de las plantas y su degradación por hongos
del turnen.. . . . . . . . . . . . _. _. . . . _. _._. ._... *,
2 3.1 Aspectos generales de los hongos del rumen .__. ___._.__. .__. 2 0
2.3.1.1 Taxonomía ..__.. .._......__....__._...., .._.._...__,._......_.... 2 1
2.3.1.2 Ciclo de vida ..,_.__.___,................._...._.,....____...._......_.... 21
2.3.1.3 F i s i o l o g í a y m e t a b o l i s m o . _. _. _. _. _. .._. 2 4
2.2.1.4 Características de los géneros de hongos más importantes.... 2 4
2 3.2 Colonización fungal de los tejidos de las plantas .._................__..._.__, 2 7
2 .;.3 Matabolismo de energía 1. caract&ísticas de fermentación _._. ,_ ____._. 2 8*-
2 3 4 Degradación de la pared celular por los hongos anaerobios del
1-1~ men .<.,...,___...............2 9
2.3.4.1 Degradación dc: celulosa., _. _. __, ._ ____.. _. _. _.
2.3.4.2 Degradazion dc lignina. .__.._..
2.4 Importancia del azufre 5-n la nutrición de rumiantes
3 4.1 Metabolismo y rquerimientos de azufre por microorganismos del
mmen.. _.
2.4.3 Síntesis de vitaminas. ._.__. ._____.._._... .._.
2.-l 3 Efecto del azufre sobre las poblaciones de hongos del wmcn. ..__..
3. MATERIALES Y MÉTODOS ..,_.........__,_.....
3 . 1 kluëstra... .._.._......,.. .,_.., ._.,,__..._,.. .¿. 67
3.2 Restricciones _...._.__.... ., ..,, _.____ 6 2
3.3 Localización del área de estudio _. ___. .._. . 6 3
3.4 Técnica de muestreo.. _. _. _. _. _. 6 3
3 .5 Procedimiento. _. 6 3
3 . 6 Descripcion d e l o s a n i m a l e s .._............ ._. 65
3.7 Mediciones.. ._ .___. ._ __ _. _. . . 6 6
3.8 Variables. _, . ._. ._. 6 7
3.9 Análisis estadístico _._. ,_, ..__. . ..___....... .._. 6 8
4. RESCLTADOS _..,.______.._.. .__,. ..__......_....... <. 70
4.1 Digestibilidad de celulosa ____. __ __. _. _.. . . .._._.
4.2 Concentración de glucosa........................................ ................ 7 6
4.3 Determinación de pH.. ................................................. ................. 8 0
5. DISCLWóN ....................................................................................... 8 4
5.1 Digestibilidad de celulosa..................... ,_. ........................ .................. 8 6
5.2 Concentración de glucosa. ............................................ .................. 8 9
5.3 Determinación de pH................................................... ................... 9 0
ANEXO.................................................................................. ................... 9 8
A). kletodo para la determinación de azíxares reductores propuesto por Jue
y Lipke ( 1985)....................................................................... .................. 98
B). Medio de cultivo para los hongos del rumen descrito por- Joblin 1198 1) 9 8C). Procedimiento para la determinación de proteína del formje utilizado
para la dieta de los caprinos:. ................................................................ 9 9
Cuadro 1. Val:jr nutritivo de la dieta utilizada en la alinicntación de los animales 60donadores de inoculo. . .._ ._. __.... .__. .._..
Cuadro 2. Porcentaje de digestibilidad de celulosa pura por hongos del Fumen,con diferentes fuentes. 3 niveles ]I’ 1 tiempos de incubación.. _. 71
Cuadro 3. Concentración de glucosa en el sobrenadante de los medios de cultivopara 10s hongos del turnen, con diferentes fuentes de azufre, 3 :i,rel,es 77v 1 tiempos de incubación itr r+/r’o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cuadro 4. Vaiores de pH del sobrenadante del medio de cultivo axénico de loshongos del rumen, con diferentes fuentes de azufre. 3 niveicj y 4t i e m p o s d e i n c u b a c i ó n . . _. ___. ., _. __. _. 8 I
. . .Vlll
LISTA DE FIbUK.4S
Figura 1. Di egrama que representa el tracio digestivo como un sistema para
COI;‘. er-bidn de la planta de forraic ti productos finales hasta productos
nurricios que puedan ser utilizado;; por el animal 1
.Figura 2. Cicin 32 \ida de los hongos del ruxn .._.._...., ?<
Figura 3 Inflciencia dei sustrato en el rumw sobre la actividad de la enzima p-g l u c o s i d a s a . . 34. . < . . . . . . . .
Figura 4. E\.oli::ón dc la digestibilidad al 0.15’!~, U: Lwdre.. ,,, 72
Figura 5. ET-olu~!;ln de la digestibilidad af .) _.’ 3-6 d‘ n7ufrc .._.. . . . < . . . 77
Figura 6. E\~olu:lon-de la digestibilidad al O.?i” o dc mifre. _. __. _. .._. 72
Figura 7. Evolu:~on de la glucosa al 0. l-i”,o dc ULI~JL’ _. _. __ _. __. _.. _. _. 78
Figura 8. E\olu~ton de la glucosa al 0.25%, de azufro ..___....._._.__........ .._._. 78
Figura 9. E~~oluaon de la glucosa al 0.35% de wuirc. .._._.._______..___.____...... <.. 75
Figura 10. E\.oluaón del pH al 0. i.í% de amfrc... _.., 8 2
Figura 11. E\.olwión del pH al 0.25% de azufre. _. ._._._. .______..... . ..__. _. ._.._ __ 82
Figura 12. Evoluckn del pH al 0.35?4 de amfrc. ..<............................... 82
INTRODUCCION
Entre los mamíferos con mayor distribución en la Tierra, se encuentran
los rumiantes; los cuales debido a la habilidad única de este grupo para digerir
un amplio rango de vegetación, están adaptados a los ambientes del Ártico,zonas templadas y tropicales. Su microflora presente en el rumen hace posible
la obtención de energía de una amplia variedad de alimentos fibrosos
(McAllister et al., 1994).
.
Para que un forraje sea útil como alimento, debe ser resistente al ataque
de patógenos y parásitos microbianos mientras crece en el campo, y ser
susceptible a la penetración, colonización y digestión por microorganismos
dentro del rumen (Cheng ef al., 1991). Las cutículas aceitosas o serosas, así
como los compuestos protectores (taninos condensados y ácidos fenólicos),
son necesarios para que los vegetales se defiendan y sobrevivan del ataque
microbiano en sus ambientes naturales (Forsberg y Cheng, 1992), pero éstos
impiden la digestión del material vegetal dentro del rumen principalmente a
través de la acción mecánico-enzimática de protozoarios, bacterias y hongos
(Jung y Allen, 1995; Sijtsma y Tan, 1996). Esta microflora es capaz de
degradar compuestos de las paredes celulares de plantas como celulosa y
hemicelulosa (Susmel y Stefanon, 1993).
Los hongos que habitan en el rumen son anaerobios estrictos y se
encuentran también en el tracto gastrointestinal de otros herbívoros (Phillips y
Gordon, 1995). Además, son capáces de degradar eficazmente a la celulosa y
otros polisacáridos estructurales como hemicelulosa, lignina y pectina, que son
base para la generación de energía utilizable por los hongos y bacterias. Asi
mismo forman la base para el metabolismo del herbívoro (Morgavi et al.,
1994).
2
La mayoría de las cepas de hongos del rumen, se han aislado de
rumiantes que viven en clima templado, generalmente alimentados con
pasturas suculentas o altamente digestibles de pajas y concentrados. La
producción de rumiantes en el trópico seco se caracteriza por ser de pastoreo
extensivo y por utilizar pasturas con alto contenido de paredes celulares y por
lo tanto poco digestibles. En este sentido se tienen pocos estudios
relacionados sobre la participación de los hongos en la digestibilidad de
paredes celulares que consumen los animales (Phillips y Gordon, 1995)
Entre los factores que modifican significativamente la población fungal
en el fumen se encuentra el contenido de azufre en las dietas o forrajes
ejerciendo una mayor degradación sobre las paredes celulares del forraje
(Gordon y Phillips, 1995).
Los hongos limitan su crecimiento en ausencia de los aminoácidos
azufrados como cisteína y metionina, lo que interfiere en la degradación de las
paredes celulares del forraje que consume el rumiante. Es muy posible que
los hongos ruminales puedan sintetizar sus proteínas a partir de fuentes de
azufre (Onoda et al., 1996), sin embargo, los requerimientos específicos de
este elemento no han sido suficientemente esclarecidos, por ello se pretende
evaluar la digestibilidad de celulosa in vitre, variando las fuentes y
concentraciones de azufre, y los periodos d e incubación. Así como
determinar la cantidad de glucosa generada en la fermentación de celulosa y
determinar los niveles de pH [H’] para cada uno de los tratamientos.
LITERATURA CITADA
Cheng, K.J., McAllister, T.A., Kudo, H., Forsberg and Costerton, J.W. 1991.Microbial strategy in feed digestion. In: Recent Advances on theNutrition of Herbivores (Y.W. Mo, H.K. Wong, N. Abdullah and Z.A.Tajuddin eds), pp 181-I 87. Vinlin Press, Kuala Lampur, Malaysia.
Forsberg, C.W. and Cheng, K.J. 1992. Molecular strategies to optimize forageand cereal digestión by ruminants, In: Biotechnology and Nutrition (D.Bilis and S.B. Kung eds.), pp. 109-147. Butterworth-Heinemann,Stoneham, MA.
Gordon, G.L.R and Phillips, M.W. 1995. New approach for the manip;lation ofanaerobic fungi in the rumen. In: Recent Advances in Animal Nutrition inAustralia, (J. B. Rowe and J.V. Nolan eds) 708-7 75
Jung H. G. and Allen M. S. 1995. Characteristics of plant cell walls affectingintake and digestibility of forages by ruminants. J. Anim. ScL- 73: 2774-2790.
McAllister T.A, Bae H. D.; Yanke, L.J.; Cheng: K. J. and Ha, J.K. 1994. A reviewof microbial digetion of feed particles in the rumen. AJAS 7 (3): 303-316.
Morgavi, D. P., Sakurada, M., Mizokami, M., Tomita, Y. and Onodera, R. 1994.Effects of Ruminal protozoa on cellulose degradation and the growth ofan anaerobic ruminal fungus, piromyces sp. strain OTSI, in vitre. Appl.Environ. Microbio/. 60: 3718-3723
Onoda, A.; Kobayashi Y; Hoshino S. 1996. Effects of anino acids on the growthof an anaerobic rumen fungus Neocallimasfix sp N 13. Reprod. Nufr.Dev. 36: 31 l-320
Philips, M. W. and Gordon, G.L.R. 1995. Carbohydrate fermentation by threespecies of polycentric ruminal fungi from cattle and water buffalo intropical Australia. Anaerobe 1: 41-47.
Sijtsma, L., Tan, B. 1996. Degradation of perennial ryegrass leaf and stem cellwalls by the anaerobic fungus Noecallimastix sp. Strain CS3b. Appl. andEnviron./ Microbio/, 62 (4): 1437-I 440.
Susmel P. and Stefanqn B. 1993. Aspects of lignin degradation by rumenmicroorganisms. J. of Biofechnol. 30: 141-I 48.
2. INFLUENCIA DEL AZUFRE EN LA DEGRADACION DE LAS PAREDES
CELULARES DE FORRAJES POR HONGOS DEL RUMEN.
2.1 El trópico seco y la producción animal.
Dentro de los animales, los rumiantes son los más ampliamente
distribuidos sobre la tierra, estos se adaptan a los ambientes tropicales y
templados. Su amplia distribución es debido a su capacidad para digerir una
amplia gama de vegetación (McAllister et al ., 1994; Fichney, 1996)
.
Entre los factores del medio ambiente que tienen reacciones diferentes
en los trópicos sobre los rumiantes se incluye al bajo contenido de nutrientes
en los forrajes que consume el animal, el cual esta asociado a la baja
digestibilidad, También se encuentra la variación en el contenido de nutrientes
de acuerdo su estado de madurez, asi mismo; la gran incidencia de
enfermedades parasitarias en rumiantes en pastoreo, asi como la imposición
que se tiene debido al estres calórico a través de la combinación de
temperatura alta con humedad elevada (Leng, 1988).
Los requerimientos de nutrientes para los rumiantes es complicada porque en LP@
el sistema digestivo fermentativo, lo cual se alteran los nutrientes en el 5iPbb
alimento a productos finales de la digestión microbiana en el rumen (Leng,\
1985).
Para la aplicación de principios nutricionales para la alimentación de
rumiantes. Se deben considerar ciertas imposibilidades por el medio ambiente
La primera es la baja cantidad de proteína en las plantas, la segunda que el ($@‘/
forraje es deficiente en nutrientes esenciales que son necesarios para Q/
eficientar la fermentación en el rumen (Leng, 1988).
5
2.1.1 Caracterización de los forrajes en el trópico seco.
Los forrajes tropicales son difíciles de cosechar por los múltlipes cambios
que se originan en relación a su calidad. El valor nutritivo de los forrajes es
bajo por la selección genética que se han dotado; formándose estructuras
protectoras en gran predación. La digestibilidad baja de una planta madura
bajo este ambiente es muy característico por su crecimiento y maduración
(Van Soest, 1982).
El producto de la fotosíntesis de estos forrajes se compqne de 4
carbonos (C,), mientras que los forrajes de clima templado están compuestos
de 3 carbonos (C,). Las plantas C4 son más eficientes en su fotosíntesis,
presentan una cantidad elevada de peso seco y bajo valor nutritivo. Además
tienen la particularidad de adaptarse a condiciones con altas temperaturas y
periodos de sequía prolongados (Van Soest, 1982).
El ambiente tiene influencia significativa sobre el contenido de la pared
celular y la digestibilidad en el forraje. La temperatura es el factor que más
influye, presentándose una lignificación elevada de la pared celular y una
maduración rápida de los tejidos. Este efecto se ha observado más en los
forrajes de clima templado y clima tropical, siendo mayor en forrajes que en
leguminosas y en tallos que en hojas. El desarrollo de los forrajes utilizados
como alimento para el ganado en las zonas tropicales y subtropicales son de
naturaleza fibrosa, tienen bajo contenido de nitrógeno y son menos digestibles
que las especies de las zonas templadas. A mayor cantidad de luz el contenido
de la pared celular se incrementa y la digestibilidad disminuye (Aagnes et al .,.1996).
Las características de la pared celular tiene influencía sobre la calidad
nutritiva en la baja digestibilidad y la dificultad para disminuír el tamaño de
partícula (Wilson, 1993)..
2.2 Condiciones ambientales del turnen.
El fumen es una porción del tracto @gestivo altamente especializado
que facilita el almacenamiento y prcesamiento microbiano de una gran
cantidad de forraje. La degradación y utilización del material ingerido por
rumiantes es regulado por la planta, animal y factores microbianos. De esta
manera el rumen aporta un ambiente adecuado para el crecimiento de
numerosos microbios estrictamente anaerobios, los cuales son los
responsables de la degradación del forraje que ingresa a él. El crecimiento de
estos microorganismos depende de las condiciones ambientales qel rumen
(Trinci ef al., 1994, Selinger et al., 1996)
Entre las condiciones ambientales se encuentran la temperatura que se
mantiene entre 38 a 41°C, potencial redox -250 y - 450 mV. reflejándose un
medio fuertemente reducido y la ausencia de oxígeno, mantiene pH entre 5.8
a 6.8. La composición del gas del rumen es variable pero contiene valores
comprendidos entre 65% de CO2 y un 35% de metano (Lin et al., 1985) (Fig.
1).
El rumen se mantiene estable, debido a la presencia de ácidos
orgánicos producidos durante la fermentación de los alimentos y el flujo de la
saliva en la cual existen bicarbonatos y fosfatos (Hobson y Wallace, 1982).
De la fermentación de polímeros de las plantas a compuestos simples
por los microorganismos del rumen resulta la producción de tres ácidos grasos
volátiles, normalmente encontrados en las proporciones de 56-70% de acetato,
17-29% de propionato y 9-19O/6 de butirato (Lìn et al., 1985)(Fig.l)
7
PARTES DEL SISTEMA CONDICIOIIES Y ACTIVIDADES DEL SISTEMA D I G E S T I V OD I G E S T I V O
B O C A
R u m e n -reticulo
Ornas0
AbomasoIn tes t ino de lgado
-wIn tes t ino g rueso
Recto y ano
Ftt. 1, Diagrama
ul Mastkacti ! humedec im ien to de l a l imen to de p lan tasl Sumin ins t r c !X ác ido carbón ico y agua (sa l iva y beb ida ,l fkracii y fermentac ión de gases (amoniaco y COZ
l CONDICICJ’tESpo tenc ia l 6x03 reducc ión = -250 a 450 mVpH 5.6 a 6 6Temperatun 39dCOsmolaridao 433 mOsmol<g’
l Organismz (concentracidn aproximada /g’ d e di-)Bac te r ias IO’O - 10”ProtozoaBcs 10” - 10’Hongos 1 d un idades fwmadoreas de t a l l os
l Productos ce la fermentación (concentracibn aproximroajAce ta to 60mMPropionarc MmfvlBut i ra to 10mMco2 6 5 %CH. 2 7 %
‘.’
Sekcción oe oarticulas pequenas de plantas
y celulas rncobianas para el resto det tracto =>diges t i vo . AQwción de l í qu idos
Digesti6n g&&-ice -Idrólisis ácida de biomasa Carbohtdratwrnicrobtana y algunvs te j i dos de p lan tas Amiînáci
3Ac. grasosVfinas
Ws farmentaciór; -microbiana
Forrnaci4n y elimrración de heces,
contentendo bactews viables y
hongc6 anaerob ios
u
Acetato
Prop ionatoBut i ra to
Usados por fos tejidosdel animal para reacciones
de biosfntasts y c rec imien to
que representa el tacto digestivo como un sistema para conversión de la planta de forra@ a
productos finales a productos nutricios que ouedan ser utiridos por el animal (Lin et al., 1935)
8
La fase gaseosa en el rumen se encuentra variando en su composición
pero contiene COn (65%), CH4 (27%), N (7%), 0 (0.6%), H (0.2%) y H2S
(0.1 Oh) (Trinci et al.,1 994). La presión osmótica puede estar entre 250 a 450
osmoles, una presión osmótica alta es detrímental a la función del rumen,
disminuyendo la absorción de ácidos grasos volátiles (Hoover y Miller, 1991).
2.2.1 Fisiología digestiva del rumen.
La mayor proporción de la dieta para rumiantes es a base de forraje, el
cual es fermentado en el rumen. El material alimenticio es fermentqdo hacia
azúcares, almidones, carbohidratos complejos de paredes celulares y proteína;
estos se convierten dentro de células microbianas y ácidos grasos volátiles,
aminoácidos y vitaminas, lo cual son la fuente principal de nutrientes para el
animal. El contenido de proteína de celulas microbianas es dependiente de
una fuente de nitrógeno adecuada (Leng, 1988; Mackie y White, 1990;
Selinger et al., 1996).
Los rumiantes se alimentan con dietas a base de materiales vegetales
compuestos principalmente de celulosa, hemicelulosa y lignina. Los herbívoros
no pueden sintetizar enzimas que degradan las paredes celulares de las
plantas, esta limitante la han superado por su propia evolución, en función de
la dependencia de los microorganismos que realizan estas funciones; y que
además, desarrollan cambios específicos en la fermentación en el rumen.
Además, pasan continuamente dentro del abomaso y son digeridos en el
intestino donde su producto del metabolismo es la fuente de energía para el
rumiante (Patterson, 1989).
El material ingerido por el rumiante es retenido en el rumen hasta que la
medida de las partículas son reducidas suficientemente por masticación y
acción microbiana permitiendo el tránsito hacia el intestino (Wilson, 1993).
Y
2.2.2 Absorción de nutrientes a través de la pared del rumen.
El estudio de la fisiología del rumen resulta interesante para entender la
nutrición en el rumiante (McAllister et al., 1994; Fichney, 1996). Como
participación en la fermentación del material vegetal, la población microbiana
aporta fuentes de carbono, energía y proteína microbiana al animal rumiante. En
su mecanismo de fermentación elaboran productos generados a partir de éste
como acetato y lactato que pueden ser absorbidos directamente pasando el
epitelio no glandular del rumen y ser utilizados como nutrientes (Teunissen et al.,
1991; Trinci et al.) 1994; Mukhopadhyay y Kurar, 1995). *
Los ácidos grasos volátiles son absorbidos lentamente a través de la pared
del rumen; la proporción de absorción depende de la longitud de la cadena de
estos ácidos, pH, concentración y osmolaridad. Entre un pH de 4.5 y 6.5, el grado
de absorción de los ácidos grasos volátiles es mayor el butirato que el propionato
y mayor que el acetato. Los microorganismos del rumen producen ambos lactato
levógiro y destrógiro en cantidades iguales y son facilmente absorbidos (Hoover y
Miller, 1991).
La glucosa, también puede ser absorbida a través de la pared del rumen,
pero está presente en cantidades insignificantes. El amoniaco es de facil
absorción, dependiente de la concentración y el pH. La absorción es rápida y alta
a un pH de 6.5 y declina a cero a un pH de 4.5. En este caso la absorción de
aminoácidos toman su lugar, pero las concentraciones de estos son muy bajas,
representando menos del 10% del total de nitrógeno absorbido del rumen (Hoover
y Miller, 1991)
2.2.3 Participación microbiana en la digestión de paredes celulares en el
rumen.
Los microorganismos del rumen se adhieren a la pared del rumen y están
presentes en el fluido -deI rumen y más del 75% se asocia a las partículas
parcialmente digeridas. El grado de colonización es dependiente de cada especie
microbiana (McAIIister et al., 1994). Algunas especies celulolíticas se adhieren
íntimamente a la pared celular de la planta (Fibrobacfer succinogenes), otros
desarrollan su papel digestivo en la superficie de la pared celular
(Ruminococcus). Los hongos ruminales producen hifas los cuales, atacan sus
substratos y penetran estructuras resistentes de las plantas ( Bonhomme, 199Oj.
La saliva, es considerada el vehículo adecuado para la transferencia de
microorganismos; es posible la ingestión inadvertida de éstos a par;tir de heces
frescas en animales jóvenes y estas heces contienen esporangias en la pastura
siendo un posible medio para la transferencia entre animales adultos del mismo
grupo (Lowe et al., 1987b; Munn ef al., 1988).
El grado en la cual los microorganismos penetran y digieren componentes
intracelulares ricos en nutrientes esta determinado por la composición química y
mecanismos protectores de la planta (McAllister ef al., 1994; Jung et al., 1995).
Engels y Brice (1985) mencionan que las paredes de células lignificadas de
rastrojos actúan como una barrera para los microorganismos del fumen, sin
embargo el modo de crecimiento rizoidal de los hongos puede vencer y penetrar
esa barrera.
2.2.4 Asociación de microorganismos y alimento en el rumen.
El rumen de animales recién nacidos está libre de microorganismos, las
bacterias predominan dos días después del nacimiento, siguendo los protozoarios
y los hongos, que aparecen después de 8 a 10 días ( Fonty et al., 1987).
La extrema asociación entre bacterias y enzimas que digieren las
partículas de alimento tiene especificidad para cada substratos (Pell y Schofield,
11
1993). Existen componentes naturales de la pared celular que impiden el proceso
de digestión microbiana de asociación y adhesión como son los taninos sílica o
terpenos (Bae et al.: 1993).
De los materiales alimenticios de planta utilizados por rumiantes. el forraje
es uno de los más importantes, éste puede permanecer en el rumen por 2 ó 3
días y posteriormente ser fermentado por los microorganismos albergados en este
lugar (Teunissen et al., 1991).
Los vertebrados son capaces de producir celulasas y hemicwlasas y
muchos herbívoros han evolucionado en asociaciones simbióticas con bacterias,
protozoarios y hongos, los cuales producen estas enzimas que son cagaces de
degradar polímeros de la plantas (Trinci et al., 1994; Mukhupadhyay I/ Kurar,
1995).
Existen interacciones entre estos microorganismos que son esenciales
para mantener el ecosistema del rumen, es por eso que cualquier trabajo donde
se pretenda incrementar la degradación de polímeros de la pared celular como la
celulosa es de mucho interés en la actualidad (Fonty et al., 1995).
Las interacciones entre hongos y bacterias no metanogénicas cel rumen
pueden establecer un mecanismo de competencia, sinergismo o simbiosis. Las
bacterias Selemonas ruminantium, consumen hidrógeno y compuestos similares
como succinato y lactato; además, digieren celulosa en presencia de
Neocallimastix sp y Caecomyces communis (Marvin-Sirkema et al., 1990). Sus
interacciones son poco conocidas y difíciles de determinar. Recientemente se
han encontrado mycoplasmas asociados con un gran número de hongos aislados
en bovinos (Kudo et al,, 1990).
12
La simbiosis entre hongos y bacterias metanogénìcas en el fumen es muy
común. Bauchop y Mountfort (1981) mostraron que los cultivos de Neocahnasfix
frontalis degradaron más extensamente el papel filtro en presencia que en
ausencia de bacterias metanogénicas.
Akin et aL(1983) demostraron que la presencia de hongos en el rumen
contribuyen significativamente en el consumo voluntario y la digestion del
alimento fibroso en ovinos.
Los hongos hacen más accesibles los fragmentos de las plantas a las
bacterias que se encuentran presentes en el rumen y fermentan algunos
monosacáridos como fructosa, glucosa y xylosa (Phillips y Gordon, 1992;
Theodorou et al., 1988 Gordon y Phillips, 1989).
Se ha demostrado que algunos hongos se incrementan con la defaunación
de los animales. -Rómulo et al. (1986, 1989) mostraron un incremento de entre 3 y
4 veces la concentración de zoosporas y esporangias de hongos en la
defaunación de ovinos. Se han reportado evidencias por Orpin (1989) que al
eliminar a los ciliados por defaunación también se incrementa la población fungal.
Los hongos del Turnen tienen acceso a los polisacáridos no disponibles
por bacterias celulolíticas, lo que significa que pueden penetrar las paredes
celulares de la planta por acción mecánica o enzimática o una combinación de
ambas (Kolattukudy, 1985), también se pueden detectar sobre fragmentos de
alimento a las 2 ó 3 horas después de haber sido ingeridos (Bauchop, 1986).
Akin y Rigsby (1987) encontraron que los hongos solos pueden degradar la
misma cantidad de fibra como hongos y bacterias a la vez.
1 3
2.2.5 Importancia de la adaptación a la dieta alimenticia.
En el fumen, la adaptación de los microorganismos se puede dar con
especies individuales o con una población microbiana completa. En verano, los
nutrientes son facilmente disponibles y la población microbiana asociada a la
pared del rumen es variada y compleja. Al contrario, durante el invierno cuando
el forraje es de baja calidad, el número de celulas bacterianas es limitada (Cheng
et al., 1993).
La dieta es el factor más importante que influye en el medio ambiente del
rumen, como el grado de procesamiento de alimento, la presencia de aditivos
alimenticios, la proporción de grano al forraje en la dieta que afecta el número,
proporción y actividad digestiva de los microorganismos ruminales. Los
microorganismos cultivados en el laboratorio sobre substratos artificiales tienen
poca invariabilidad sobre su capacidad digestiva (Cheng ef al 1991 c).
Los microorganismos que digieren componentes de la pared celular son
diferentes a los que digieren almidón, esto se ha experimentado en ganado
alimentado con granos de cereal comparado con alimento a base de forrajes
(McAllister ef al., 1993). La naturaleza estable de adaptación a la población
microbiana asegura que el hospedero animal recibe una continuidad, uniformidad,
suplencia de ácidos grasos volátiles y. proteína microbiana para mantenimiento,
crecimiento y reproducción (McAllister et al., 1994).
2.2.6 Manipulación en la digestión del alimento.
Una de las áreas más importantes de los estudios de la nutrición animal es
la de suplementación de alimentos, estos suplementos pueden disminuir el estrés
calórico, incrementan la conversión de la fibra, desarrollo en el animal, asi como
la producción de leche en rumiantes (Harper et al., 1996).
Los tejidos estructurales de las plantas dan lugar a grandes contenidos de
partículas en el rumen, éstas son resistentes a la reducción del tamaño de
partícula por la masticación y digestión Esta partícula debe ser reducida a 1 mm
antes de su ingreso al fumen y requiere un periodo de tiempo largo de retención
en el rumen para este propósito, teniendose como efecto que el alimento sea
consumido en bajas cantidades, resultando un rendimiento muy bajo en el animal
(Mackie y White, 1990).
Para que resulte un mejoramiento significativo en la prqducción de
rumiantes es esencial un entendimiento del proceso microbiano de penetración,
asociación, formación y adaptación asi como de de la manipulación química o
biológica del alimento a base de forraje de baja calidad como ejemplos primarios
de tratamientos (Mason et al., 1990; Eriksson, 1990).
Los forrajes con alto contenido de paredes celulares no son digeridos en el
intestino, por eso se considera necesario estimular la digestión microbiana en el
rumen. Se están evaluando gran cantidad de moléculas como aditivos
alimenticios en el rumiante, la mayoría de ellos son usados para un a función
específica, pero ellos intervienen a varios niveles para producir una variedad de
efectos sobre el animal (Jouany, 1994)
Es esencial una penetración y digestión microbiana del alimento y para
este fin es necesario el rompimiento de barreras que hacen resistencia utilizando
un procesamiento mecánico para utilizarlo como un medio de manipulación para
incrementar la digestibilidad del alimento en el turnen (Fahey et al., 1993; Wilson,
1994).
El valor nutricional de las plantas depende del estado físico de la planta a
la cosecha sobre madurez y contenido de paredes celulares y características que
son genéticamente caracterizadas (Waghorn, 1990).
Con la finalidad de evaluar la importancia de los hongos dentro del rumen
se han realizado pruebas para su eliminación en tratamientos in vivo alimentando
animales con un rastrojo de trigo, tratado con cloruro de sodio, pero este
mecanismo no ha funcionado (Ford ef al., 1987).
Los hongos del rumen ayudan al flujo del alimer;to dentro tracto digestivo e
incrementan su consumo; sin embargo, no está bién establecido una relación
directa en la degradación fungal de las paredes celulares con relación,al consumo
de alimento a base de forrajes con elevado contenido de paredes celulares y
requiere de más estudios (Akin y Borneman, 1990).
La colonización por hongos en forrajes (como determinación de cuentas
esporangiales sobre hojas blandas) fue substancialmente mayor cuando se
incluyeron antibióticos antibacterianos en el fluído del rumen de ovinos (Akin y
Windham, 1989).
Cuando se agregan grandes cantidades de harina a dietas ricas en granos
ofrecidas a intervalos de tiempo de dos o tres días, las zoosporas estan ausentes
de el rumen; lo que explica los efectos de una fermentación bacteriana de los
carbohidratos solubles evitando asi, la zoosporogenesis de los hongos y su
sobrevivencia en el rumen o bien, se atribuye a la depresión del pH ruminal con
un valor igual a 5.0 o menor (Gordon, 1985).
La disminución de pH del fluido del rumen a 5.5 por la adición de grandes
cantidades de azúcares solubles eliminaron a los hongos por un corto tiempo,
este tratamiento tiene efectos negativos sobre otros componentes del ecosistema
ruminal (Grenet et al., 1989).
16
La máxima estimulación para la produccióin de microorganismos fue dada
por glutamato, seguido por serina y metionina. La hemina es una proteína
necesaria para la formación de hemoproteínas en muchos microorganismos y
también es similar para los hongos del rumen. El papel principal de la hemina en
el metabolismo no se conoce, pero se ha comprobado que la hemina puede
inducir la zoosporogénesis en hongos del rumen (Orpin, 1989). Por el contrario la
falta de triptófano, tirosina y fenilalanina reduce el crecimiento de acuerdo al
medio que contenga una mezcla completa de aminoácidos, lo cual indica que los
hongos tienen dificultades para sintetizar aminoácidos aromáticos ,(Li y Heat,
1993).
Las hemicelulasas se han descrito por gran número de trabajos (Mountfort
y Asher, 1989) produciéndose en mayor cantidad cuando los hongos del rumen
crecen sobre celulosa, celobiosa, glucosa o xylosa (Lowe et aI., 19874).
El contenido de lignocelulosa en la dieta es un factor que determina la
presencia de poblaciones normales de hongos en el rumen. Las dietas a base de
ensilado de sorgo o de maíz reducen el número de hongos en el rumen por el
gran contenido de carbohidratos; asi como tambien los carbohidratos altamente
fermentados en la dieta como el almidón o granos, soportan bajas poblaciones de
hongos (Grenet et a/.,1989; Ho et al., 1991).
Además de la influencia de los nutrientes disponibles para la actividad
hemicelulolítica, las variaciones del pH atribuídas al tipo de alimento disponible
en el rumen pueden tener efectos significativos sobre el crecimiento y la
formación de enzimas que degradan los polisacáridos ( Williams y Orpin, 1987b).
Una cantidad de glucosa elevada es inhibidora de las enzimas
carboximetilcelulasa y P-glucosidasa (Wood ef al., 1988).
2.3. Estructura de la pared celular de las plantas y su degradación por
hongos del rumen.
La digestibilidad de la materia seca de un forraje es la clave que determina
la producción animal, este factor está influido por la proporción de paredes de
paredes celulares, la resistencia del forraje y estructuras fibrosas a la disminución
del tamaño durante la masticación (Wilson y Mertens, 1995, Wilson y hatfield,
1997). Es necesaria la digestión de la pared celular rápida por los microbios del
turnen y una trituración efectiva por la masticación para reducir el, tamaño de
partícula para que pase rápidamente y permita altos consumos de forraje,
(Deschamps et al., 1996).
La digestión ruminal de hemicelulosa, aunque extensa, resulta incompleta
alcanzando una digestión de 10 a 30% de la dieta (Wilson, 1993), algunas de las
causas que limitan su digestión son: a) la naturaleza física y química de la fibra
b) la cinética de digestión ruminal c) la naturaleza y densidad de población de las
especies de microorganismos que digieren la fibra d) la acción enzimática de
microorganismos sobre carbohidratos de la pared celular. Otros factores
principales que limitan la digestión de la pared celular del forraje en el rumen son:
características de los polisacáridos que dependen de las plantas, factores del
hospedero, componentes de la dieta y pH en el rumen (Wilson, 1994).
El contenido de la pared celular de un forraje es nutricionalmente
importante, ya que un alto contenido de estas paredes celulares ofrece una baja
digestibilidad (Stefanon et al., 1998). La dieta elevada en fibra tiene efecto
positivo sobre la población de hongos del rumen (Bauchop, 1989b).
La producción animal está determinada por el consumo y digestibilidad de
materia seca de un forraje. Ambos están influenciados por la proporción de las
paredes celulares y la resistencia y estructuras fibrosas a la disminución y tamaño
de partícula durante la digestión por los microorganismos del rumen (Wilson,
1994).
Las paredes celulares de las plantas aportan la principal fuente de energía
para más de 1.4 X 10’ unidades de ganado rumiante en el mundo (Wilson, 1994).
El contenido de la pared celular de un forraje se considera nutricionalmente
importante ya que un contenido elevado de ésta, disminuye su digestibilidad y
son consumidos en bajas cantidades por rumiantes. Las paredes celulares
representan un rango entre 30 y 60% del peso seco; también se encuentran en
menor cantidad en hojas que en tallos, en plantas leguminosas que en gramíneas
y en plantas jóvenes que en adultas (Minson, 1990; Stefanon ef al., 1996; Lewis
et al., 1996). Este bajo grado de digestión es variable y se inspira a mejorar las
características de la pared celular (Karunanandaa y Varga, 1996).
La digestión de los polisacáridos se dificulta debido a la estructura
molecular, degradación de enlaces, presencia de constituyentes esterificados,
lignificación y grado de enlaces cruzados, solubilidad y medida de partícula, entre
los factores dependientes de las plantas podemos mencionar la madurez, así
como la presencia de sílica y cutícula en la pared celular de la planta ( Stewart,
1986).
En relación a los factores del hospedero se tiene el coeficiente de medida
de partícula; retención de partícula, coeficiente de tránsito, anatomía intestinal, pH
del tracto intestinal y población microbiana y en los componentes de la dieta los
azúcares, almidón, grasas, cantidad del alimento consumido, procesamiento de
alimento y la presencia de manipulantes químicos o antibióticos (Stewart, 1986).
19
La celulosa y hemicelulosa unidos con pectina y parte de ácido
poligalacturónico se consideran componentes estructurales que se encuentran
en mayor cantidad en las paredes celulares de el forraje (Wilson, 1993).
La celulosa es uno de los compuestos orgánicos que se encuentra en
mayor proporción en el mundo y se producen 10” toneladas anuales sobre la
tierra, la mayoría se produce de los residuos de cosechas y terrenos madereros.
La celulosa es ampliamente disponible y además representa una fuente de mucho
valor renovable accesible en todas las naciones desarrolladas o e[l desarrollo
(Halliwell y Halliwel, 1995).
La celulosa es el más abundante de todos los polisacáridos, esta constituye
una fracción insoluble de la fibra ligada a una fracción lineal p-1,4 de varias
moléculas de glucosa. La celulosa es un polímero lineal con ligaduras
glucosídicas p-1,4 D-glucana. Las cadenas de p-1,4 glucana de celulosa se
encuentran agregadas a estructuras llamadas microfibrillas. El grado de
polimerización de la celulosa en la pared secundaria es muy alta con un valor de
14 000 moléculas de glucosa (Carpita y Gibeaut, 1993; Liyama et al ., 1994;
Denman ef a/., 1996).
La hemicelulosa está compuesta de una mezcla de polisacáridos que
incluyen xilanos, glucanos, mananos, galactanos y arabinanos. Los xilanos
constituyen la mayor proporción de Ilas fracciones de hemicelulosa, puede
comprender hasta el 40% del total de los carbohidratos encontrados en las
paredes celulares. Su importancia se debe a su unión tan estrecha con los ácidos
fenólicos (Besle et al., 1994).
20
Los forrajes presentan en su naturaleza física y química, una barrera para
su digestión completa en el rumen. La celulosa comprende de 40 a 50% de la
materia seca y la hemicelulosa de 20 a 30% de las plantas vasculares (Wilson,
1994).
2.3.1 Aspectos generales de los hongos del rumen.
Obispo y Dehority (1992) encontraron que al ofrecer una dieta compuesta
solo de paja o mayor de un 80% de granos de cereal con paja con frecuencia de
alimentación de una comida diaria, se mantuvo una cantidad S normal de
zoosporas en el rumen (1 O3 - 1 O4 /ml).
Los hongos del fumen están presentes en las especies más importantes de
los rumiantes domesticados (ovinos, cabras, bovinos y búfalos), también se
encuentran en otras especies de animales herbívoros, como antílopes, venados,
camélidos, canguros, caballos y elefantes (Fonty y Joblin, 1990, 1991). Además,
se han aislado de todas las porciones del tracto digestivo y la saliva, heces
frescas y secas de rumiantes adultos ( Munn et al .,1988; Trinci et al., 1994).
Los hongos saprófitos del rumen son capaces de crecer en medios
complejos y definidos (Lowe et al., 1985). Provocan un rompimiento substancial a
la planta fragmentándola y separando lignina de hemicelulosa (Akin et al., 1989;
Joblin, 1989; Gordon y Phillips 1989).
La morfología de la esporangia depende del ciclo de vida y condiciones de
crecimiento, esto a sido poco usado taxonómicamente, y ésta puede medir de 21
X 9 ym a 200 X 140 Pm y pueden ser ovales o cilindrìcas ( Orpin, 1975).
2.3.1.1 Taxonomía.
Las correcciones en su clasificación han sido confirmadas por comparaciones
recientes de secuencias genéticas de los hongos (Dore y Stahl, 1991; Bowman et
al., 1992; Li y Heath, 1993).
Su morfología y estructura es guiada para la identificación como la clase
de hongos Chitridiomycetes (Heath ef al., 1983).
Los hongos producen zoosporas y pertenecen a la clase Chitridiomycetes.
Existen muchas similitudes entre las familias y géneros. Los hongos del rumen
son clasificados taxonómicamente por: Barr (1988) y Barr et al. (1989) en:
División: Eumicotina
Subdivisión: Mastigomicotina
Clise: Chytridiomycetes
Orden: Spizellomycetales
Familia: Neocalimasticaceae
Género: Caecomyces (zoospora con uno o dos flagelos)
Neocallimastix (zoospora con 4 ó 20 flagelos)
Piromyces (zoospora con 1 ó 4 flagelos)
Orpinomyces (zoospora multiflagelada)
Anaeromyces (zoospora con un flagelo)
2.3.1.2 Ciclo de vida.
Los hongos del rumen son un grupo de microorganismos que tienen la
habilidad de producir zoosporas móviles wmo parte de su ciclo de vida. Después
de que se libera la esporangia, las zoosporas permanecen viables ahí por cierto
tiempo, formándose una vesícula la cual germina bajo condiciones apropiadas
produciendo uno o dos tubos germinativos, para luego desarrollarse dentro del
tallo vegetativo nuevamente, tienen movimientos amiboideos y permanecen
móviles por periodos que fluctuan entre minutos u horas. El ciclo completo se
realiza en 24 h in vitre. El espacio de tiempo de un ciclo de crecimiento fungal
típico in vivo no ha sido registrado, pero ésto no podría ser más de 15 a 18 h, esto
se basa en el tiempo de retención de partículas de alimento dentro del rumen.
(Lowe et al., 1987 a).
Su forma es esférica u oval y desarrollan esporangias, como micelio; se
reproducen de manera asexual mediante la liberación de zoosporas unicelulares
de partición citoplásmica en cada esporangia (Heath, 1988; Bauchop, 1989a).
Después de la desaparición de sus flagelos, las zoosporas se esparcen con los
cinetosomas, y posteriormente se lleva a cabo la eclosión (Li et al., 1990). Las
zoosporas de los hongos pueden ser poliflageladas o uniflageladas, dependiendo.
del género, en las especies poliflagelados, los flagelos toman una dirección
cerrada como si fuera un solo flagelo e impulsan zoosporas en forma de espiral
(Wubah et al., 1991a). (Fig. 2)
, \
Fig 2. Ciclo de vida de lcp hongos anaerobios (Marvin -Sikkema, 1994)
2.3.1.3 Fisiología y metabolismo.
Sus requerimientos nutricionales son similares a otros hongos saprófitos
considerando las fuentes de carbón y nitrógeno. Sin embargo, en relación a su
hábitat, los hongos desarrollan algún requerimiento especial para su crecimiento y
desarrollo (Lowe et al., 1985).
Los hongos tienen la característica de ser más resistentes a monómeros
fenólicos que las bacterias (Borneman ef al., 1990, Tanaka ef al., 1992)..
En los protozoarios y hongos el piruvato es convertido en acetil-CoA y
COZ por piruvato:ferredoxina oxidoreductasa; y los electrones producidos, son
canalizados a la formación de hidrógeno derivado por un proceso complejo donde
intervienen en acetil COA de la reducción de la ferredoxina por una hidrogenasa,
proceso que además forma acetato, donde toman lugar los hidrogenosomas,
siendo los organelos análogos a la mitocondria en algunos eucariotes
estrictamente anaerobios ( Finlay y Fenchel, 1989).
2.3.1.4 Características de los géneros de hongos más importantes.
El género de los hongos se determina en base a la forma de sus tallos
(monocéntrico y policéntrico), el tipo de rizoides (filamentos o bulbos) y el número
de flagelos por zoospora, las especies se definen en base en la estructura de la
zoospora ( Munn,1994; Nielsen et al.,1 995).
Los hongos monocéntricos presentan una zoospora que produce
solamente una esporangia, con toda la división del núcleo contenida en él.
También se reportan tres géneros de hongos monocéntricos, distinguiéndose de
otros por la producción de zoosporas uniflageladas o multiflageladas, además por
la posición de cada uno de los filamentos y rizoides que están altamente unidos.
Los nombres de estos géneros son: Neocallimastix, Piromyces, Caecomyces y
Sphaef-omonas (Li et al., 1993).
Neocallimastíx : Se han encontrado diferencias en la morfología micelial de los
hongos del rumen, las especies de Neocalimasfíx poseen muchos rizoides con
una longuitud de 35 x 2.5 Pm y se encuentran ampliamente unidos. Las zoosporas
de Neocallimastix frontalis, son de las especies con las dimensiones más largas
de 8 x 20 CLrn y además, son de estructura ovoide, sus organelos constan de un
núcleo, ribosomas e hidrogenosomas. No se observa retículo endoplásmico y
todas las zoosporas son mótiles (Barichievich y Calza, 1990a). Las zoosporas de
Neocallimasfix sp no germinan a menos de 25°C o arriba de 42°C (Lowe et al.,
1987c).
Pyromyces: Aunque se ha encontrado en Piromonas spp que existen rizoides
hasta de 734 Pm y se ha clasificado que tienen un sistema altamente
desarrollado ((Barichievich y Calza: 1990a). Las zoosporas de Piromonas ssp
poseen dimensiones de 7.1 x 14.6 prn su morfología es la misma cultivándola in
vibro o in vivo. Los organelos se encuentran dispersos y su contenido es de
apariencia granular. Presentan hidrogenosomas y todas las zoosporas son
mótiles. Las zoosporas flageladas de Piromonas communis en crecimiento in vitre
e in vivo es de morfología similar. Las zoosporas de Sphaeromonas ssp. son
esféricas con diámetro aproximado de 4 a 8 Pm. Los organelos son globulares
(0.2 - 0.5 Pm) y consisten de gránulos densos y algunas veces unidos con una
membrana. también se encuentran hidrogenosomas en ausencia de mitocondrias
(Barichievich y Calza, 1990a).
Caecomyces: Es característico por poseer especies con zoosporas uniflageladas
que tienen un estado vegetativo. La especie equi, de las heces de equino, es la
que se ha descrito ampliamente. Las colonias de Caecomyces equi crecen sobre
26
celobiosa in vitre, siendo de apariencia granular, tienen un crecimiento lento
comparado a Neocalhmastix spp y Piromyces spp. (Gold et al., 1988)
Sphaeromonas; Las Sphaeromonas no poseen rizoides. (Barichievich y Calza,
1990a). Las zosporas son esféricas a lipsoidales ó amivoidea, con un solo
flagelo. El nucleo es central con sus organelos distribuidos a través del
citoplasma e hidrogenosomas cerca de los cinetosomas, presenta agregados de
ribosoma. Poseen crecimiento vegetativo y desarrollo endógeno (Munn et al.,
1988). ,
Caecomyces: Las zoosporas de Caecoyces equi miden de 5 a 7 Pm con
organelos dispersos de núcleo: retículo endoplasmático e hidrogenosomas
Caecomyces egui también posee rizoides. El número de zoosporas varía de 2 a
78 y el máximo tiempo de maduración corresponde a 90 minutos después de la
alimentación (Orpin, 1977a)
En tanto sean descritas nuevas formas de hongos, el número de especies
se incrementará, específicamente para los géneros Piromyces y Neocallimasfix
(Barr ef al., 1988; Heat et al., 1988).
Se conoce la existencia de hongos policéntrícos en los Estados Unidos de
América, Canadá, Francia y Australia y se caracterizan por contener una extensa
unión de rizoides dentro de su núcleo y desarrollar esporangias a intervalos
largos. Se han encontrado dos nuevos géneros de hongos que son Orpinomyces2
Anaeromyces y Ruminomyces ( Ho et al., 1993, Ho et al., 1994).
Orpínomyces: Poseen rizomicelio policéntrico con un esporangióforo complejo y
uniones intercaladas o termínales. Las zoosporas son multiflageladas. Se
cuentan con especies bovis yjoyonii. Las colonias de Orpinomyces spp. crecen
sobre celobiosa en cultivps in vit/o (Breton et al., 1989)
Anaeromyces: Posee un tallo policéntrico extenso, con fuertes uniones,
rizomicelio polinucleado. Zoosporangia elíptica, 29x120 Pm. Los esporangióforos
miden 31 x 83 Pm. Las zoosporas son esféricas y miden 7.5-8.5 Pm. de diámetro,
con un solo flagelo mayor a 30 Pm (Breton et al., 1990)
Ruminomyces: Este género posee un rizomicelio complejo. Hifas muy unidas,
largas. Esporangióforo erecto, sin uniones. Esporangia elipsoidal a fusiforme.
Zoospora uniflagelada, esférica y variable en su forma. La especie para este
género es R. elegans ( Ho y Bauchop, 1990).
2.3.2 Colonización fungal de los tejidos de las plantas.
El alimento que ingresa al rumen; es rápidamente colonizado por una gran
población de hongos cuya frecuencia es mayor en dietas con tallos fibrosos que
con hojas blandas o suculentas (Bauchop, 1979 a, b, 1981).
Por otro lado Theodorou et al. (1988) sugieren que los hongos, por tener
acceso primario sobre las partículas de las plantas, desarrollan habilidades para
colonizar las partículas de plantas y asi facilitar su degradación.
Además, los tejidos de plantas fibrosas son retenidos en el rumen por un
periodo más largo de tiempo, lo que facilita su colonización extensiva por los
hongos (Bauchop, 1981, 1989a; Grenet et al., 1989).
Las esporangias fungales que se encuentran en el rumen, se adhirién a la
superficie de las hojas y posteriormente sobre los tallos de forrajes (Bauchop,
1979b; Gordon y Ashes, 1984).
La solubilización de la pared pelular de las plantas ha sido comprobada
en la mayoría de los trabajos desarrollados in vitre e in vivo con algúnos de los
2x
géneros de hongos del rumen incluyendo a Neocalimastix patriciarum,
Piromonas communis, Sphaeromonas communis y Caecomices egui, los
cuales tienen funciones específicas durante las reacciones de solubilización
de celulosa en rumiantes : - -., 1: (Elliot et al., 1987; Ho et al., 1988b;
Theodorou et al,, 1988).
2.3.3 Metabolismo de energía y características de fermentación.
Las componentes de las paredes celulares que digieren los hongos son
principalmente celulosa, B-glucanasa y la fermentación de carbohidratos como
glucosa y xylosa (Gordon y Phillips: 1989).
En comparación con los protozoarios y bacterias, los hongos emplean
mezclas de fermentación ácida; sus productos de fermentación son formato,
acetato, lactato, succinato, etanol, bióxido de carbono e hidrógeno;
conviertiendo la glucosa y esta en piruvato, siendo éste el producto
intermediario de la fermentación (Yarlett et al., 1981; Gottschalk, 1986; Yarlett
y Orpìn, 1986; O’Fallon et al., 1991).
Las celulasas extracelulares de orígen microbiano tienen gran
importancia para la conversión de componentes de celulosa y de componentes
lignocelulosos hacia azúcares fermentables. En el sistema celulolítico, la
enzima b-glucosidasa se considera un componente importante, ya que éste
aporta glucosa necesaria para el metabolismo y crecimiento de hongos.
Además, la actividad específica de las celulasas sobre celulosa puede dar
orígen a la producción de glucosa y fermentar a etanol (Calza, 1990; Wood y
Wilson, 1995; Dijkerman et al. 1996).
La fermentación de celulosa por hongos del rumen puede ser
determinada en medios de cultivo por m_ediciones gravimétricas o mediciones
de pérdida de materia seca o por la cuantificación de los productos finales de
la fermentación (Theodorou, 1995).
29
Mountfort y Asher (1985) determinaron que los hongos producen hasta
0.94 pmol de glucosa/minuto a partir de la fermentación de compuestos
celulósicas.
23.4 Degradación de la pared celular por los hongos anaerobios del Turnen.
Los trabajos ín vitre han demostrado que los hongos del rumen tienen la
particularidad de atacar, parcial o completamente tejidos de las plantas ( Gulati et
al., 1989).
.
El papel de los hongos en el papel de la degradación de las paredes
celulares ha sido ampliamente evaluado. Sus rizoides penetran los tejidos de
laplanta mejor que las bacterias y protozoarios. Estos hongos tiene más acceso al
material de la planta que otros microorganismos, ocupan un nicho ecológico en el
tracto digestivo de rumiantes y otros mamíferos herbivoros, participando en la
colonización primaria de las paredes celulares de las plantas (Wubah et al., 1993.
Zhu et al., 1996).
La digestión de las paredes celulares de plantas está influenciada por las
enzimas que degradan los polisacáridos elaboradas por los propios
microorganismos como bacterias, protozoarios y hongos (Fonty et al., 1995).
Los hongos producen enzímas hidrolíticas que actuan sobre disacáridos,
oligosacáridos y polisacáridos (Borneman et al., 1989: Gordon y Phillips, 1989;
Barichievich y Calza, 1990a).
Los hongos del rumen son capáces de solubilizar una elevada proporción
de paredes celulares de la planta, degradando fragmentos de las plantas durante
el pasaje de partículas en el tracto digestivo (Gordon y Ashes, 1984).
Williams y Orpin (1987a,b) reportaron que entre las enzimas de los hongos
del rumen que degradan polisacáridos se incluyen a la carboximetilcelulasa,
celobiosidasa y p-glucosidasa en estado vegetativo o zoospórico.
La contribucion de los hongos en la degradación de las paredes celulares
de plantas en el rumen no es claro; debido a la dificultad de medir la biomasa
fungal y la actividad en una mezcla de la población del ecosistema (Stewart ef
al., 1990). .
La actividad de estas enzimas se ha confirmado por diferentes grupos de
investigadores y solamente una especie del genero de Neocallimastix frontal&, ha
sido investigada en detalle relacionado con la especificidad de las enzimas que
degradan la pared celular de las plantas (Pearce y Bauchop, 1985).( Akin y
Rigsby, 1987; Lowe et al., 19874; Williams y Orpin, 1987 a, b; Gordon y Phillips
1989; Borneman ef al., 1989, 1990; Akin et al., 1990; Barichievich y Calza, 1990b;
Hebraud y Fevre, 1990; Calza, 1991).
Después de un período prolongado de fermentación (>72 h), los hongos
policéntricos y monocéntricos producen enzimas como feruloil y pcoumarol
esterasas desempeñando un papel importante en la neutralización de ácido
ferúlico y coumárico sobre lignocelulosa, considerado como una disolución de las
paredes celulares de la planta (Borneman et al.? 1990, 1991).
Williams y Orpin (1987a) reportan que la secreción de la enzima p-
glucosidasa se incrementa al adicionar ciertas fuentes de carbono. La actividad
carboximetilcelulasa de los hongos se localiza entre un pH de 5 a 7 y una
temperatura entre 4555OC.
La P-glucosidasa de los hongos del fumen tiene un pH óptimo de 5.5 a 6.0 y
una temperatura óptima de 45 a 55°C (Hebraud y Febre, 1988).
La celulasa, generalmente es inhibida por los productos finales de la
fermentación (Wood et al., 1988).
La celulosa y hemicelulosa son los componentes que se encuentran en
mayor proporción en las paredes celulares de las plantas; par2 su hidrólisis
completa a monosacáridos se requiere la presencia de dos enzimas complejas
como celulasas y xylanasas (Chahal, 1991).
La digestión de lignocelulosa se relaciona con la producción de esterasas
fungales que fraccionan la lignina de la hemicelulosa considerándose como los
responsables de la digestión arriba del 70% de lignocelulosa de forrajes (Akin et
al., 1990; Borneman et al., 1990, 1992).
Barichievich y Calza (1990 a, b) han definido las características físicas,
químicas y enzimáticas de las celulasas; caracterizándola como una enzima
compleja con múltiples componentes y peso molecuar de 1 a 2 millones de dalton.
Además, mencionan que el azufre tiene efecto positivo sobre la actividad de
carboximetilcelulasa.
La actividad de la enzima B-glucosidasa de Neocalimastk fronfalis se
incrementa 4 ó 5 veces más en cultivo con celulosa como fuente de carbono
(Calza, 1990).
Se ha mostrado que en mayor presencia de glucosa se detiene la
producción de la enzima celulasa (Mguntfort y Asher, 1983). Estudios a la fecha
indican que las enzimas de hongos qae degradan las paredes celulares de
forrajes son extracelulares; algunas de estas enzimas estan reguladas por la
presencia de azúcares solubles (Mountfort y Asher, 1989).
Se ha demostrado que los hongos pueden producir esterasas y liberan
ácido ferúlico y p-cumárico de la pared celular de la planta (Borneman et al.,
1989). Bajo esta característica, dichas enzimas desempeñan un papel significativo
en la degradación de las paredes celulares de las plantas aftas en compuestos
fenólicos (Hartley y Akin, 1989).
2.3.4.1 Degradación de celulosa.
Orpin y Letcher (1979) fueron los primeros en reportar que los hongos son
celulolíticos. Los hongos monocéntricos y policéntricos degradan y fermentan
celulosa (Borneman et al., 1989; Gordon y Phillips, 1989). Sin embargo, su
capacidad para degradar pectina no es significativa (Phillips, 1989).
La celulosa se considera el biopolímero más abundante en la naturaleza, y
son pocos los hongos que producen celulasas capaces de degradar la celulosa
cristalina; entre ellos se tiene al género Trichoderma spp y los hongos del rumen.
Las celulasas microbianas pueden ser utilizadas para generar glucosa. lo cual
pueden ser fermentadas hasta la producción de etanol. La celulasa de
Neocallimastix fronfalis es la de r&s interes en estudiar por el efecto considerable
sobre la hidrólisis de hidrógeno que se encuentra unido a la celulosa cristalina (
Wood, 1991; Wood y Wilson, 1995; Wood et al, 1995).
Los estudios sobre la formación de enzimas celulolíticas por hongos del
rumen (Mountfort y Asher, 1985) indican que el nivel de actividad p-glucosidasa
está influenciada por la naturaleza de los carbohidratos en el rumen. Estos
autores han dado importancia a mejorarar la digestibilidad del material de plantas
por rumiantes (Fig 3).
Esta enzima es común encontrarla en plantas, hongos y bacterias, su
estudio ha sido de mucho interes porque se involucra en la conversión biológica
de material celulosico (Chen et al., 1994)
Los hongos mejoran significativamente la digestión de rastrojo de trigo
(+28%) con efecto particularmente marcado sobre la celulosa (+50%) y
hemicelulosa (+33%) (Hillaire et al., 1990).
Se ha demostrado que la presencia de celulosa en el rumen induce la
secreción de celulasa pero los componentes que inducen la síntesis y secreción
no han sido determinados (Li, 1991).
La hidrólisis de la celulosa es fundamentalmente enzimática. Las enzimas
necesarias para la digestión de celulosa se asocian a la pared celular fungal y
estas tienen la capacidad de digerir celulosa cristalina y comprende las enzimas
endo-1,4- p- glucanasa, 1-4-p celobiohidrolasa y -p glucosidasas (Wilson y
Wood. 1992).
Se considera de 40°C la temperatura óptima de actividad contra celulosa
cristalina en incubaciones in vibro a 72 horas (Wood et a/., 1988).
31
SISTEMA CELULOLITICO
f3- GLUCOSIDASA
GLUCOSA
HONGO
,/’//í’ ‘1,._’ “\,/_’ _..\
YA ‘\\Metabolismo Crecimiento Degradacion de celobiosa
Fig. 3 Influencia del sustrato en el fumen sobre la actividad de la enzima J3-
glucosidasa (Dijkerman ef al., 1996).
2.3.4.2 Degradación de lignina.
Las plantas que contienen cantidades elevadas de lignina son pobres en
nutrientes y de difícil digestión por los microorganismos del ru-nen; aunque
algunas no son muy lignificadas y de baja digestibilidad debido al contenido de
compuestos fenólicos de bajo peso molecular que se encuentran unidos a estos
tejidos ( Harris y Hartley, 1976; Akin, 1986).
La asociación de lignina con polisacáridos de la pared céular limita la
digestión microbial con protección de 1 a 4 veces su propia #Tasa en los
carbohidratos de la pared célular (Van Soest, 1981).
Los hongos del rumen degradan la lignina que se encuentra contenida en
las paredes de las plantas y la habilidad para utilizar este componente
anaeróbicamente es una contribución importante por los microbios del rumen. Por
ello, muchos de los estudios se han enfocado a evaluar la habilidad de los
hongos para atacar los componentes de lignina de las paredes de las plantas
(Akin et al., 1983).
2.4 Importancia del azufre en la nutrición de rumiantes.
Para que la síntesis de aminoácidos se lleve a cabo dentro del rumen, el
azufre debe estar presente en la dieta. En adición, las vitaminas que contienen
azufre, semejantes a la tiamina y biotina son sintetizadas por los microbios del
rumen; más sin embargo, el sulfato de sodio y metionina han demostrado que
estimulan la síntesis de otras vitaminas como rivoflavina y vitamina BI2 en un
grado mayor que cuando la fuente de azufre fué cisteína o azufre elemental
(Phillips y Gordon, 1991).
En áreas del mundo deficientes en azufre, la fertilización ha sido utilizada
para promover la producción de forraje, y bajo estas condiciones la probabilidad
de una deficiencia de este elemento ocurrida en animales alimentados con
forrajes o granos es menor (Spears et al.: 1976).
La acción de la microflora del rumen altera completamente la dieta de
ambos elementos; la degradación de la dieta de proteína para producir amoniaco
y sulfuro o la síntesis de proteína microbiana de la dieta de urea y sulfato
inorgánico. La retención de nitrógeno y azufre está determinado por las
cantidades de nitrógeno y azufre depositados en los tejidos del cuerpo donde las
dietas suplementadas con más azufre tienen una mayor retención de,nitrógeno y
azufre (Kandylis, 1984).
McLenan et al. (1989) mostraron que mediante la adición de azufre a
suplementos con base en urea para rumiantes, consumiendo forrajes con alto
contenido de paredes celulares, se incrementó la retenck de nitrógeno y la
digestibilidad de los mismos. La razón en el incremento del consumo y
digestibilidad de materia seca y materia orgánica cuando el sulfato de sodio fue
adicionado a la dieta, puede ser explicado por la mejor utilización del nitrógeno
presente; sin embargo, el efecto de la suplementación de azufre solamente se
da si el nivel de nitrógeno es adecuado en la dieta.
Whanger, (1972) establecieron que para promover la máxima retención de
nitrógeno, es necesario una proporción adecuada de nitrógeno-azufre en la dieta.
La metionina es el primer aminoácido azufrado limitante en ganado lechero y su
deficiencia quizá origina cambios en el metabolismo de los lípidos (Bull y
Vandersall, 1972).
En los estudios que se han realizado en relación al efecto del azufre en
forrajes fertilizado y no fertilizados ha demostrado que la fertilización con azufre
incrementa el consumo voluntario y reduce los niveles de amonio en el rumen, lo
cual es indicador de una elevada actividad microbiana en el rumen, además se
37
encuentra un efecto marcado en la contribución de los hongos a la degradación de
celulosa cuando estos tienen una adecuada proporción de azufre (Akin ef al
1983).
El metabolismo del azufre y nitrógeno se encuentran estrechamente
asociados en rumiantes. La acción de la microflora del rumen quizá se altere
completamente la forma de la dieta para ambos de estos elementos (Kandylis,
1984). Se sugiere que para que el metabolismo sea óptimo por parte de la
microbiota y el animal hospedero, la cantidad y formas requerida? de azufre
necesaria en dietas a base de forraje, esto puede ser exitoso y aún no se ha
establecido (Weston et al., 1988).
Rees y Minson (1978) demostraron que el consumo voluntario y la
digestibilidad de materia seca de forraje fertilizado con azufre fue menor en
relación al control cuando las determinaciones se efectuaron con ovinos
suplementados con azufre. Además determinaron que la fertilización con azufre
reduce el tiempo de retención del forraje e incrementa el consumo voluntario y la
digestibilidad comparado con el forraje Digitaria decumbens que no se fertilizó.
Los autores sugieren que la baja actividad microbiana debido a la deficiencia de
azufre podría provocarle una respuesta negativa al animal.
La suplementación de azufre estimula la actividad bacteriana en el rumen.
Aunque algunos de los microorganismos tienen preferencia por ciertas formas de
azufre, debido a la relación simbiótica entre microorganismos del rumen, las
formas de azufre no parecen tener una influencia significativa sobre su actividad
(Whanger, 1972).
Los requerimientos de azufre para rumiantes productores de leche han
recibido un interés limitado y se ha establecido que los requerimientos para
ganado lechero no se eqcuentran establecidos, aunque se ha sugerido 0.20% de
38
azufre en la dieta en base seca, o se han definido los requerimientos para cabras
lecheras (Qi ef al., 1992).
Se ha demostrado que el sulfato inorgánico puede ser substituido por
fuentes de azufre orgánico como la metionina y viceversa. El azufre elemental ha
sido usado como fuente de azufre, pero ha mostrado que no puede ser realmente
disponible como sulfato o fuentes orgánicas, probablemente debido a la baja
solubilidad en el fluído del rumen (Spears et al., 1976).
Momont et al. (1993) no encontraron diferencias significativas en la
digestibilidad aparente de materia seca, fibra detergente neutro y fibra detergente
ácido entre corderos suplementados con sulfato de sodio o metionina. McCracken
et al. (1993) observaron que la suplementación de metionina no incrementa la
desaparición de fibra detergente neutro del forraje a 96 horas comparado con el
tratamiento controlado.
Lodman ef al. (1990) observaron solamente un aumento en la digestión de
materia seca y fibra detergente neutro como resultado de la suplementación de
metionina y urea. Hall et al, (1990) encontraron que ofreciendo metionina a
novillos alimentados con paja de bermuda grass y granos de maíz no se mostró
ningún efecto sobre el consumo y digestión de alimento, solamente tuvo un
incremento en la digestión de fibra detergente neutro.
Huisman et al. (1988) reportaron un incremento en la degradación de
materia seca de forraje con la suplementación de metionina en el líquido ruminal
en forma protegida.
2.4.1 Metabolismo y requerimientos de azufre por los microorganismos del
rumen.
La adición de componentes de azufre en una incubación in. vitre por
microorganismos del fumen han demostrado que estimulan la digestión de
celulosa. La metionina ha tenido una respuesta más alta que cualquier otra fuente
evaluada (Whanger, 1972).
El azufre total y el contenido de otros minerales en los forrajes no siempre
es un indicador confiable de disponibilidad para los microorganismos del rumen
(Spears et al., 1976).
Los microorganismos del rumen pueden reducir formas oxidadas de azufre
y ser incorporadas dentro de compuestos orgánicos; estos pueden producir
sulfuro de hidrógeno de sulfato e incorporar azufre dentro del material celular
(Whanger, 1972).
Los microorganismos del rumen pueden reducir formas oxidadas de azufre
a la forma en la cual la incorporan dentro de los compuestos orgánicos lo que
sígnifica que los rumiantes tienen la habilidad para obtener el azufre de las
fuentes inorgánicas de azufre (Kandylis, 1984).
Kahlon et al. (1975) indicaron que los microorganismos del rumen pueden
utilizar formas inorgánicas como formas orgánicas del azufre a la síntesis de
aminoácidos y cada una las fuentes de azufre difieren grandemente con respecto
a su disponibilidad. Ellos evaluaron las disponibilidades de varias fuentes de
azufre y encontraron que la concentración de azufre de 21.5 ug/ml de inóculo
(0.32% de azufre en la materia seca del substrato) resultó menor que la síntesis
óptima de proteína microbiana en un sistema in vitre donde se utilizó almidón
como substrato, mientras las concentraciones de 86.7 y 130.0 ug/ml (1.3 y 1.95%
en la materia seca del sybstrato) fue inhibitoria. Sin embargo, una concentración
de 43.3 ug/ml en la incubación del medio (0.65% en la materia seca del substrato)
resultó una mayor síntesis de proteína.
Komisarczuk-Bony ef al (1992) evaluaron los requerimientos de azufre para
los microbios del rumen y reportaron que la digestión de celulosa diaria fué de
45.3% suplementando diariamente 12 y 22 mg de azufre como sulfato de sodio en
un fermentador semicontinuo. A la adición de sulfuro de sodio se observó que
disminuye la incorporación de azufre dentro de la proteína bacteriana, más que la
adición de aminoácidos azufrados como metionina o cisteína.
Bull y Vandersall (1973) determinaron que el nivel óptimo de azufre fué de
0.16 a 0.25% como sulfato de sodio o sulfato de calcio y 0.32% como metionina,
en relación a las fuentes de azufre, el sulfato de sodio, sulfato de calcio y
metionina s$ comportaron iguales a las mismas concentraciones en relación a su
habilidad de las bacterias del rumen para promover la digestión de lignocelulosa
in vifro. Los mismos autores mencionan que las formas de azufre no parecen
tener influencia significativa sobre su actividad.
Spears et al. (1976) reportaron que con la suplementación de azufre se
incrementa el rompimiento de lignocelulosa por los microorganismos del rumen,
además observaron un incremento en la retención de nitrógeno y digestión de
fibra detergente neutro cuando el contenido de azufre se aumentó de 0.20 a
0.32% orgánica e inorgánicamente en la dieta.
Se ha encontrado que la digestibilidad in vivo, digestibilidad de materia
seca, materia orgánica, fibra detergente neutro y proteína cruda fué incrementada
por la adicíón de 0.6, 0.11, 0.28, y 0.36% de azufre como sulfato de calcio en la
dieta respectivamente (Qi et al., 1992).
Se ha indicado que el nivel óptimo de azufre en la dieta para una máxima
ganancia diaria en caprinos es aproximadamente 0.22% de materia seca de la
dieta con una relación de N:S de 1 O:? . Por eso, es posible que el nivel óptimo de
azufre en la dieta mejore el desarrollo por un incremento en la síntesis de proteína
bacteriana en el rumen y mejore el balance de aminoácidos, ya que se han
observado diferencias en el metabolismo de nitrógeno y azufre; estas
comparaciones se han realizado cuando la dieta aporta suficiente cantidad de N:S
para encontrar los requerimientos de los microbios del rumen (Qi et al., 1993,
Hegarty et al., 1954).
Numerosos estudios han indicado que la metionina es uno de los
aminoácidos limitantes en el crecimiento microbiano y la fermentación de
substrato en el rumien (Salter et al., 1979).
La población microbiana del rumen en animales alimentados con forrajes
de baja calidad y suplementados con 0.21% de azufre, contenia más del 10% de
bacterias, más dei 22% de protozoarios, y más del 69% de zoosporas fungales. El
incremento proporcional de hongos en el turnen se relacionó con un aumento del
16% en la digestión de la fibra (Millard et al., 1987).
Harrison y McAllan (1980) reportaron un valor medio de la relación 18.51
(N:S) en un rango de 8.6:1 y 30.8:1, para las bacterias del rumen. y un valor
medio de 21.6:1 en un rango entre 14:l y 38:l para protozoarios. De esto, ellos
concluyen que una relación de 2O:l de azufre y nitrógeno disponible debería ser
el adecuado para los requerimientos de los microbios del rumen.
Multani ef al. (1986) determinó la disponibilidad de varias fuentes de azufre
y encontró que una relación de N:S de 1O:l resultó una mayor síntesis de
proteína microbial in vitre cuando el azufre fue suplementado con sales de sulfato
de sodio, potasio, calcio, fierro (III) y amonio, as¡ como a través de metionina. Sin
embargo, el mejor nivel con sulfato de zinc y cisteína fue 40: 1.
Clark y Petersen (1988) observaron un incremento en relación a la
digestibilidad de materia seca i~ situ de forraje de baja calidad en bovinos
suplementados con urea más 15 g de metionina comparado con sulfato de
amonio. Se ha demostrado que la suplementación de aminoácidos en un medio
definido como sales de amonio, hemina, vitaminas y fuentes reducidas de azufre
estimulan considerablemente el crecimiento de los hongos del ru,men, estos
hongos pueden tomar sus aminoácidos e incorporar en ellos sus proteínas sin
que requieran ninguna modificación (Onoda et al., 1996).
Onwuaka y Akinsoyinu (1989) utilizando azufre elemental como fuente de
azufre en una relación de 151 en cabras y ovinos observaron una mejor
retención de nitrógeno y digestibilidad aparente de materia seca contra la relación
N:S 28:1, 7:l y6:l.
2. 4.2 Sintesis de vitaminas.
Las vitaminas que contienen azufre, semejantes a la tiamina y biotina son
sintetizadas por los microbios del rumen; sin embargo, el sulfato de sodio y
metionina han demostrado que estimulan la síntesis de rivoflavina y BI2 por los
microorganismos del rumen aun más que con cisteína o azufre elemental (Kahlon
et al., 1975; Whanger, 1972).
2.4.3 Efecto del azufre sobre las poblaciones de hongos del rumen.
A principios de 1980, el contenido de azufre en la dieta a base de forraje
con alto contenido de paredes celulares, fue reconocido como un factor
significante que gobierna la población fungal en el rumen (Akin et al., 1983; Akin y-THogan, 1983; Gordon, 1,985). En Australia la fertilización de forrajes con azufre
43
(Akin et a/., 1983) y dietas suplementadas con metionina (Gordon et al,, 1983)
mostró un incremento en la población fungal.
Akin et al. (1983); Akin y Hogan (1983) observaron que fertilizando la
pastura con azufre se mostró un efecto positivo sobre la población fungal. Los
hongos del rumen no fueron detectados en ovinos alimentados con paja de
Digitaria penfiii cosechadas de parcelas deficientes en azufre; además, la paja
colectada de la misma parcela después de una fertilización con azufre mantuvo
una población activa de los hongos del rumen, el número de zoospora$ por ml fue
de 4,000 a 6,000 y con suplementación de metionina (4.5 g/dia) la cantidad fue
4,100 por cada mililitro de líquido ruminal.
Orpin y Greenwood (1986) mencionan que una deficiencia de azufre en la
dieta podría limitar el crecimiento de los hongos en el rumen y esto limitaría el
crecimiento de los hongos en el rumen y se limitaría su contribución en la
digestibilidad de las paredes celulares de plantas.
Gulati ef al. (1989) sugirieron que en un incremento de la biomasa de los
hongos del rumen en ovinos resulta un incremento cuantitativo de azufre esencial
y aminoácidos que son absorbidos en el intestino. Esto se refleja en el
crecimiento de lana y tiene importantes aplicaciones para la producción de lana
en ovinos que pastorean en forrajes de baja calidad nutritiva.
En dieta con forraje tropical ( Heteropogon contorfus) que tenía un bajo
contenido de azufre, mostró una ausencia de población fungal en el rumen
(Morrison ef a/., 1990). Pero se reporta un incremento en el número de bacterias,
protozoarios y esporangias de hongos del rumen en ovinos suplementados con
sulfato de sodio, aunque este incremento no fue muy marcado en la cantidad de
esporangias, el contenido de azufre en paja de trigo afectó positivamente en los
hongos en el rumen.
En un sistema de alimentación en donde se ofreció forraje maduro
fertilizado con azufre, se estimuló la población fungal y se incrementó el consumo
de alimento, considerando que este efecto está influenciado por la habilidad de
los hongos para atacar y debilitar las paredes celulares de las plantas en
presencia de azufre (Akin et al., 1983).
El desarrollo de los hongos no solo depende del substrato sobre del cual
ellos degradan, sino también sobre el medio ruminal. Este hecho se explica en
base a los resultados obtenidos por Millard et al. (1987), donde el suministro de
azufre en el alimento no tuvo efecto significativo sobre el número de bacterias
viables, pero si se mostro un incremento en el número de hongos celulolíticos.
Con ei azufre inorgánico como suplemento en dietas de baja calidad, la
mayoría de la materia orgánica y fibra detergente ácido fueron digeridas en el
estómago y en el tracto alimentario, una gran cantidad de amoniaco fue digerido
en los intestinos por unidad de consumo de materia orgánica digestible y la
actividad fung,al en el rumen fue alta. Esto indicó que una inadecuada cantidad
de azufre en una dieta afecta el metabolismo de la microbiota del rumen y afecta
las variables relacionadas con la digestión y el metabolismo (Weston et al.,
1988).
Los hongos del rumen pueden usar sulfuro de sodio y cisteína y
metionina como fuentes de azufre (Li y Heath, 1993).
Gulati et al. (1985) y Weston et al. (1988) Evaluaron fuentes de azufre y
determinaron que suplementado rastrojo de cereal con metionina o sulfato de
sodio se mostró un incremento en el número de hongos del rumen. La fertilización
de la pastura mostró un incremento de 25% de consumo de alimento ad libifum.
En dietas con rastrojo de trigo con baja cantidad de azufre, mostró una
disminución en la población de hongos del rumen (Gordon, 1985).
El azufre puede ser utilizado por Neocalimastix pafríciarum cuando se
suplementa con cisteína, metionina o sulfuro de sodio. Phillips y Gordon (1991)
indicaron por el contrario que el azufre es un nutriente limitante para
Neocallimastix sp. porque varía la concentración de sulfuro solo y con cantidades
iguales de cisteína o metionina teniendo un incremento en su crecimiento de
arriba de 1 - 2 Pm del total de azufre, y el crecimiento sobre *sulfuro en
combinación con cisteína o metionina fué mejor que el crecimiento sobre sulfuro
solo.
Cuando se suplementó sulfato de sodio a los animales, se observó un
incremento en el número de hongos como también el consumo de alimento.
Además! se mostraron ligeros cambios en la población ruminal de bacterias y
protozoarios ciliados debido a la suplementación de la dieta. El Heteropogon sp;
suplementado con sulfato de sodio, manifestó una alta población fungal en el
rumen comparado la misma paja cuando no se suplementó. Los hongos requieren
formas reducidas de azufre como sulfuro de sodio y aminoácidos que contienen
azufre como cisteína y metionina para su crecimiento in vitre ( Marvin-Sirkema et
al., 1990: Phillips y Gordon, 1991)
Las dietas con un contenido inadecuado de azufre pueden tener un efecto
negativo sobre la población fungal en el rumen (Morrison et al., 1990).
Aunque Neocalkmastix pafrkiarum puede usar sulfato de amonio como una
sola fuente de nitrógeno para estimular su crecimiento, los aminoácidos
azufrados también lo estimulan (Li y Heat, 1993).
La ausencia de los aminoácidos azufrados limitan el crecimiento de los
hongos del rumen, interfiriendo en la degradación del sustrato presente en el
rumen.
Los requerimientos y fuentes de azufre para los microorganismos del
rumen no han sido esclarecidos, por lo que se proponeque la presencia de
fuentes de azufre en paredes celulares de forraje que consume el rumiante se
considera un factor significativo que modifica las poblaciones de hongos en el
rumen y este mejora la degrdación de los compuestos lignocelulosos de forraje.
Por ello se pretende evaluar la digestibilidad de celulosa in vitre bajo
diferentes fuentes y concentraciones de azufre, así como la concentración de
glucosa y pH.
LITERATURA CITADA
Aagnes, T. H., Blis A.S. and Mathiesen S.O. 1996. Digestibility and rumenfermentation in Reindeer feed baled timothy silage in summer and winter. J.of Agrie. Sc;. 127(4): 517-523.
Akin, D.E. 1982. Section to slide technique for the study of forage anatomyand digestion. Crep. Sc;. 22: 444-446.
Akin, D. E. 1986. lnteraction of ruminal bacteria and fungi with Southern forages,J. Anim. Sc;. 63:962.
Akin, D.E. and Benner R. 1988. Degradation of polysaccharides a?d lignin byruminal bacteria and fungi. Appl. Environ. Microb. 54: ll 17.
Akin, D.E. and Borneman W.S. 1990, Role of rumen fungi in fiber degradation. J.Dairy Sc;. 73:3023. Review
Akin, D.E. and Hogan J. P. 1983. Sulfur fertilization and rumen microbialdegradation of cell walls in Digitaria pentz;; (stent). Crep. Sc;. 23:851-858.
Akin, D. E. and Rigsby L.L. 1987. Mixed fungal populations and lignocellulosictissue degradation in the bovine rumen. Appl. Env. Microbio/. 53 (9), 1987-1995.
Akin, D.E., Borneman, W.S. and Lyon, C.E. 1990. Degradation de leaf blades andstems by monocentric and policentrìc isolates of ruminal fungi. Animal FeedScience and Technology. 31,20522 1
Akin, D.E.,Gordon G. L. R., and Hogan J.P. 1983. Rumen bacteria1 and fungaldegradation of Oigitatia pentzi grown with or without sulfur. Appl. Environ.Microbio¡. 461738-748.
Akin, D.E; Lyon C. E., Windham W. R., and Rigsby L.L. 1989. Physicaldegradation of lignified stem tissues by ruminal fungí. Appl. Environ.Microbio/, 55:611-616.
Barichievich, E.M. and Calza R.E. 1990a. Supernatant protein and cellulaseactivíties of the anaerobic ruminal fungus Neocallimastíx frontal& EB188.Appl. Environ. MicrobioI. 56:43.
Barichievich, E.M. and Calza R.E. 1990b. Media carbon inductión of extracellularcellulase activities in Neocallimastix frontalis EBI 88. Appl. Environ. Microbio/.56:43-48.
Barr, D. J. S. 1988. How modern systematics relates to the rumen fungi.BioSystems 21: 351-356.
48
Barr, D. J.S., Kudo, H., Jakober, K. D. and Cheng, H. J. 1989. Morphology anddevelopment of rumen fungi: Neocallimastix sp., Piromyces communis andOrpinomyces bovis gen. nov., sp. nov. Can. J. of Botany 67: 28152824.
Bae, H.D., McAllister, T.A., Yanke, L.J., Cheng, K.J. and Muir, A.D. 1993. Effectsof condensed tannins on cellulolytic activity and filter paper digestion byfibrobacter succinogenes S85. Appl. Environ. Microbio/. 59:2132-2138.
Bauchop T, 1989a. Colonization of plant fragments by protozoa and fungi In: TheRole of Protozoa and Funqj 111 Ruminant Diaestion (OECD/UNE InternationalSeminar) (ed. J. V. Nolan, R. A. Leng and D. 1. Demeyer), pp. 83-96.Penambul: Armidale, New South Wales, Australia.
Bauchop, T. 1979a. Rumen anaerobic fungi of cattle and sheep. Appl. andEnviron. microbio/. 38: 148-I 58.
‘
Bauchop, T. 1979b. The rumen anaerobic fungi: colonizers of plant fibre. Ann.Rech. Vef. 10:246-248.
Bauchop, T. 1981. Anaerobic fungi in rumen fiber digestion. Agtic. Environ. 6:339-348.
Bauchop, T. 1986. Rumen anaerobic fungi and the utilization of fibrous feeds.Rev. Rural Sc¡; 6. ll 8-23.
Bauchop, T. 1989b. Biology of anaerobic gut fungi. BioSysfems, 23: 53-64.J
Besle, J.M.! Cornu, A. and Jouany J.P. 1994. Roles of structural phenylpropanoidsin forage cell wall digestion. J. Sci. Food Agrie. 64: 171-l 90.
Bonhomme, A. 1990. Rumen ciliates: their metabolísm and relationships withbacteria and their hosts. Anim. Feed. Sc;. Technol. 30:203-266
Borneman, W.S., Hartley, R.D., Morrison, W.H., Akin, D.E., Ljungdahl, L.G. 1990.Feruloyl and p-cumaroyl esterase from anaerobic fungi in relation to plantcell wall degradation. Appl. Microbio/. biotechnol. 33: 345-351
Borneman, W. S., Ljungdahl, L. G., Hartley, R. D. and Akin, D. E. 1991. Isolationand characterization of p-coumaroyl esterase from the anaerobicNeocallimastix strain MC-2. Appl. and Environ. Microbio/. 57: 2337-2344.
Borneman, W.S., Ljungdahl L. G., Hartley R. D., and Akin D. E. 1992. Purificationand partial characterization of two feruloyl esterases from the anaerobicfungus Neocallimastix strain MC-2. Appl. Environ. Microbio/. 58:3762.
Bowrnan, B. H., Taylor, J. W., Brownlee, A. G., Lee, J., Lu, S. D. & White, T. J.1992. Molecular evolution of the fungi: Relationships of the Basidiomycetres,Ascomycetes, and Chytridiomycetes. Mo/. Biol. Evol. 9: 285-296
19
Breton, A., Bernalier, A., Bonnemoy, F. 1989. Morphology and metaboliccharacterization of a new species of strictty anaerobic rumen fungus:Neocailimastix joyonii. FEMS Microbio/. -58: 309-310
Breton, A., Bernalier, A., Dusser, M. 1990. Anaeromyces mucronatus nov. gen.,nov. sp. A new strictly anaerobic rumen fungus with polycentric thallus.FEMS. Microbiol. Lett. 70 : 177-182
Bull, L.S. and Vandersall J.H. 1973, Sulfur source for in vitre cellulose digestionand in vivo ratio utilization, nitrogen metabolism. and sulfur balance. J. Dairy.- -Sc;. 56: 106.
Calza. R. E. 1991. Nascent synthesis and secretion of cellobiase in Neocallimastixfrontalis EB188. Curr. Microbio/. Lett. 70: 177-182. .
Calza., R. E. 1990. Regulation of protein and cellulase excretion in the ruminalfungus Neocallimastix frontalis EBI 88. Curr. Microbio/, 21: 109-I 15.
Carpita, N.C. and Gibeaut, D.M. 1993. Structural models of primary cell walls inflowering plants: consistency 6f molecular structure with the physicalpropertes of the walls during growth. The Hant Journal3: I-30
Clark, C.K. and Petersen M.K. 1988. Influente of DL-methionine supplementationof growth, ruminal fermentation and dilution rates in heifers, J. Anim. Sci.66:743.
Coleman, G. S. 1985. The cellulasas content of 15 species of ontodinomorphidprotozoa. mixed bacteria and plant debris isolated from the ovine rumen. J.Agrie. Sci. 104:349-360.
Chahal, D.S. 1991. Production of Trichoderma reesei cellulase system with highhydrolytic potential by solid-state fermentation. In: Enzymes in BiomassConversion. by G.F. Leatham and M.E. Himmel.ed. ACS Symp. Ser. No. 480.pp. Il 1-122.
Chen, H., Li, X. and Ljungdahl, L.G. 1994. Isolation and properties of anextracellular p- glucosidasa from the polycentric rumen fungus Orpinomycessp. Strain PC-2. Appl. and Environ. Microbio/. 60 (1): 64-70.
Cheng, K.J., McAIIister, T.A., Kudo, H., Forsberg and Costerton, J.W. 1991.Microbial strategy in feed digestion. In: Recent Advances on the Nutrition ofHerbivores (Y.W. Ho, H.K. Wong, N. Abdullah and Z.A. Tajuddin eds), pp181-I 87. Vinlin Press, Kuala Lampur, Malaysia.
Cheng, K.J., McAIIister, T.A., Mathiesen, S.D., Blix, A.S., Orpin, C.G. andCosterton, J.W. 1993. Seasonal changes in the adherent microflora of therumen in high-arctic Svalbard reindeer. Can. J. Microbíol. 39: 101-l 08.
Denman, S., Xue, G.P. and Patel, B. 1996. Characterization of a Neocallimastixpatriciarum cellulase cDNA (celA) homologous to Trichoderma reeseicellobiohydrolase II. Appl. and Environ. Microbio/. 62(6): 1889-l 896.
Deschamps, F.C., Ramos, L.P. and Fontana, J.D. 1996. Pretreatment ofsugarcane bagasse for enhaced ruminal digestion. Appl. Bíoch. Biotechnol.16: 2-9.
Dijkerman, R. ; Vervuren, M.B.F, Op den camp H. J.M.; Drift Ch. V.D. 1996.Adsorption Characteristics of cellulolytic enzyme from the Anaerobic fungusfiromyces sp. Strain E2 on Microcristaline cellulose. Appl. and Environ.Micro6io/. 62( 1): 20-25.
Dore, J. & Stahl, D. A. 1991. Phylogeny of anaerobic Turnen chytridiomycetesinferred from small subunit ribosomal RNA sequence comparisohs. Can. J.Bot. 69: 1964-I 971.
Elliot, R., Ash A. J., Calderon-Cortes F., Norton B. W., and Bauchop T. 1987. Theinfluente of anaerobic fungi on rumen volatile fatty acid concentrations invivo. J. Agrie. Sc;. 109: 13-I 7.
Engels, F. M. and Brice, R. E. 1985. A barrier covering lignified cell walls of barleystraw that resists access by rumen microorganisms. Curr. Microbio/, 12, 217-224.
Er-iksson, K.L., 1990. Biological delignification for improved utilization. In: Microbialand Plant Opportunities to Improve Lignocellulose Utilization by Ruminants(D.E. Akin, L.G. Ljungdahl, J. R. Wilson and P. J. Han-is eds.), pp. 227-233.Elsevier Science Publishers, New York.
Fahey, G.C., Bourqin, L.D., Titgemer, E.C. and Atwell, D.G. 1993. Postharvesttreatment of fibrous feedstuffs to improve their nutritive value. In: Forage cellWall structure and digestibility (H.G. Jung, D.R. Buxton, D.R. Hatfield and J.Ralph eds.’ pp 515-766. Ameritan Society of Agronomy, Crop ScienceSociety of America, Soil Science Society of America, Madison, WI.
Faichney, G.J. 1996. Rumen physiology: the key to understending the conversionof plants into animal products. Aust. J. agrie. Res 47: 163-174. Revíew
Finlay, B. J; and Fenchel, T. 1989. Hydrogenosomes in some anaerobic protozoaresemble mitochondria. FEMS Microbio/. Lett. 65: 311-314.
Fonty, G. and Joblin K.N. 1990/1991. Rumen anaerobic fungi; theìr role andinteractions with other rumen microorganisms ín relatíon to fibre dígestion, In:Physiological Aspe& of Digestion and Metabolism in Ruminants (Tsuda T,Sazaki Y, Kawasshima R. ed.) Academic press, NY, 655-680.
Fonty, G; Gouet, P; Jouany, J. P; and _Senaud, J. 1987. Establishment of themicroflora and anaerobic fungi of the rumen of lambs. J. Gen. Microbio/. 133:1835-l 843. ‘.
Fonty, G; Williams, A.G; Bonnemoy, F; Withers, S.E; y Gouet, P. 1995. Effect ofanaerobic fungi on glycoside hydrolase and polysaccharide depolymeraseactivities, in sacco straw degradation and volatile fatty acid concentrations inthe rumen of gnotobiotically reared lambs. Reprod Nufr Dev 35: 329-337
Ford C.W., Eliiott R., Maynard P.J. 1987. The effect of chlorite delígnífication ondigestibility of some grass forage and on intake and rumen microbial activityin sheep fed barley straw. J Agrie Sci, Camb 108: 129-I 36.
Gilbert, H. J; Hazlewood, G. P; Laurie, J. 1; Orpin, C. G; and Xue. G. P. 1992.Homologous catalytic domaíns in a fumen fungal xylanasa: evidente forgene duplication and prokaryotic origin. Mo/. Microbio/. 6: 20652072.
Gold, J.J., Heath, LB., Bauchop, T. 1988. Ultrastructural description of a newchytrid genus of caecum anaerobe, Caecomyces equi gen. nov. BioSysfems.125: 31 l-323
Gordon, G.L.R. 1985. The potential for manipulation of rumen fungi. In. R.A. Leng,J:S:F: Barker, DB: Adams, and K:J: Hutchinson (Eds.) Reviews in RuralScience. Univ. New England, Publications Office, Armidale, Australia. 6: 124-128.
Gordon, G. L. R. & Phillips, M. W. 1991. Pectin degradation by some ruminalanaerobic fungi. In: Proceedinos of the Third International Svmoosium on the- - - - -Nutrition @ Herbivores . Zahari, M. W., Tajuddin, Z. A., Abdullah. N. & Wong,H. K. p. 27. Serdang: Malaysian Society for Animal Production.
Gordon, G.L.R. Gulati, S.K, and Ashes, J.R. 1983. Influente of low-sulphur strawon anaerobic fungal numbers in a sheep rumen. Pr-oc. Nufr. Soc. Aust. 8: 188
Gordon, G. L.R. and Ashes J.R. 1984. In vitre digestion of wheat straw by differentrumen anaerobic fungi. Can. J. Anim. Sci 64(suppl.): 156.
Gordon, G.L.R. and Phillips M.W. 1989. Degradation and utilization of celluloseand straw by three different anaerobic fungi from the ovine rumen. Appl.Environ. h4crobiol. 55: 1703.
Gottschalk, G. 1986. Bacteria1 metabolism. 2nd ed. Springer Verlag, New York.
Grenet, E., Breton, A., Barry, P. and Fonty, G. 1989. Rumen anaerobic fungi andplant substrate colonization as affected by diet composition. Anim. Feed Sci.Techo/. 26: 55-70.
Guardiola, C. M, Fahey, G.C., Spears, J.W. and Garrigus U.S. 1980. Effect ofsulphur suplementation on in vítro cellulose digestion and on nutrientutilizatión and nitrogen metabolísm of lambs fed low quality fescue hay. Can.J. Anim. ScL,- 60: 337-344.
Guardiola, C. M, Fahey, G.C., Spears, J.W. and Garrigus U.S. 1983. The effectsof sulphur supplementation on cellulose digestion and on nutrient digestion,
52
nitrogen metabolism and rumen characteristics of lambs fed on good qualityfescue and tropical star grass hays. Anim. Feed Sci. and Technol. 8: 129-138.
Gulati, S. K; Ashes J. R., Gordon J. L. R., and Rogers P.L. 1989. Batch culture ofrumen fungus Neocallimasfix and digestíbility of its amino acids. In: TheRoles of Protozoa and Fun@ jo Ruminant Diclestion. J. V. Nolan, R. A. LeEand D. 1. Demeyer, ed. Penambul Books, Armidale. NSW, Aust. Pag: 281
Gulati, S.K., Ashes J. R., Gordon J. L. R, and Phillips M.W. 1985. Possiblecontribution of rumen fungi to fiber digestion in sheep. Proc. NI.&. Soc.. Ausf,10:96.
Hall, K.L., Goetsch A. L., and Forster L.A., Jr. 1990 Effects of buffer or DL-methionine with different amounts of supplemental corn on feed intake andnutrient digestion by Holstein steers consuming bermudagrass hay. J. Anim.Sc;. 68: 1674.
Halliwell, N. and Halliwel, G. 1995. Biotechnological aspects of lignocellulose andbiomass degradation. Outlook on Agriculfure. 24(4) 219-225
Harper, E.G., Welch, R.P., Contreras, L.D., Chang, J.S Calza, R.E. 1996. Theeffect of Aspergillus oryzae fermentation extraci on the anaerobic fungiNeocallimastix frontalis EB 188, Piromyces c-ommunis DC 193 andOrpinomyces ssp. RW 206: generalized effects and component analysis.Appl. Microbio/. Biotechnol. 45: 8 17-82 1
Harris, P. J. and Hartley, R.D., 1976. Detection of bound ferulic acid in cell walls ofthe Gramineae by ultraviolet fluorescente microscopy. #afufe (London), 259:508-5 10.
Harrison, D.G., and McAllan A.B. 1980. Factors affecting microbial growth yieldsin the reticulo-rumen. In: Diaestive Phvsioloav @ Metabolism a Ruminants.Y. Ruckebush and P. Thivend (editors), MTP press. Lancaster, pp. 205-226.
Hartley, R. D; and Akin D.E. 1989. Effect of forage cell Wall phenolic acids andderivates on rumen microflora. J. Scí. Food Agrie. 49:405.
Heath, I.B., Bauchop T., and Skipp R.A. 1983. Assignment of the rumen anaerobeNeocallimastix frontalis to the Spizellomycetales iChvtrid¡omvcetes) on thebasis of its polyflagellate zoospore ultrastucture. Can. J. Bot. 61:295-307.
Heath, I.B. 1988. Gut fungi. Trends Eco/. Evol. 3: 167.
Hebraud, M; and Fevre M. 1988. Characterization of glycoside and polysacharidehydrolases secreted by the rumen anaerobic fungi NeocaIímastíx fronfalis,Sphaeromonas communis and Piromonas communis. J. Gen. Microbiol~134: 1123-l 129.
Hebraud, M. and Fevre M. 1990. Purification and characterization of a specificglycaside hydrolase from the anaerobic ruminal fungus Neocallimastixffontalis. Appl. Environ. Microbio/, 56:3164.
Hegarty, R-S; Nolan, J.V. and Leng R.A. 1994. The effects of protozoa and ofsupplementation with nitrogen and sulfur on digestion and microbialmetabolism in the rumen of sheep. Aust, J. Agrie. Res.45: 1215-1227
Hillaire M.C, Jouany J.P, Fonty G. 1990. Wheat straw degradation in Rusitec, inthe presente or absence of rumen anaerobic fungi. Proc. Nutr. Soc. 49:127A.
Ho, Y.W., Bauchop. T. Ruminomyces elegans gen. et sp. nov. A polycentricanaerobic rumen fungus from cattle. Mycotaxon. 38:397-405 .
Ho, Y. W. & Bauchop, T. 1991. Morphology of three polycentric rumen fungi anddescription of a procedure for the induction of zoosporogenesis and releasefor the induction of zoosporogenesís and release of zoospores in cultures. J.Gen. Microbio! 137: 213-217.
Ho, Y. W., Abdullah. N, & Jalaludin, S. 1991. Fungal colonization of rice strawand palm press fibre in the rumen of cattle and buffalo. An. Feed Sc;. andTechnol. 34: 3 ll -32 1.
Ho, Y. W., Abdullah. N. ¿i Jalaludin, S. 1994. Orpinomyces intercalafis, a newspecies of polycentric anaerobic rumen fungus from cattle. Mycotaxon 47:283-284.
Ho, Y.W., Barr D. J. S., Abdullah N., Jalaludin S., and Kudo M. 1993.Anaeromyces, an earlier name for Ruminomyces. Mycotaxon. 47:283.
Ho, Y.W., Abdullah N., and Jalaludin S. 1988a. Colonization of guinea grass byanaerobic rumen fungi in svvamp buffalo and cattle. Anim. Feed Sci.Technol. 22: 16 1.
Ho, Y.W., Abdullah N., and Jalaludin S. 1988b. Penetrating structures ofanaerobic rumen fungi in cattle and swamp buffalo. J. Gen. Microbio/,134:177-181.
Hobson, P. N; and Wallace, R. J. 1982. Microbial ecology an,d activities in therumen. Part 1. CRC Crit. Rev. Microbio/. 9: 165-225.
Hoover W.H. and Miller T.K. 1991. Rumen digestive physiology and microbialecology. Dairy Nutrition Management Vol 7 (2)
Huisman, J., Van Weerden E. J., Van Leeuwen P., and Koch F. 1988. Effect ofmethionine compounds on rumen activity of cows. Neth. J. Agr. Sci. 36:l ll.
Hume, I.D., and Bit-d. P.R. 1970. Synthesis of microbial protein in the rumen. IV.The influente of lev@ and form of dietary sulphur. Aust. J. Agr. Res. 21: 315.
Hungate, R. E. 1969. A roll tube method for cultivation of strict anaerobes. In:Norris J. R. Ribbons D. W. , eds. Methods in Microbiology. Vol. 3B. London:Academic Press. 117-l 32.
Joblin, K. N. 1989. Physical disruption of plant fibre by rumen fungi of theSphaeromonas group. In: The Roles of Protozoa and Fun@ b RuminantDiaestion. J. V. Nolan, R. A. Leng, and D. 1. Demeyer. ed. Penambul Books,Armidale, Australia. pp. 259-260.
Jouany, J.P. 1994. Methods of manipulation the microbial metabolim in the rumen.Ann Zootech. 43: 49-62
Jung H. G. and Allen M. S. 1995. Characteristics of plant cell walls affectingintake and digestibility of forages by ruminants. J. Anim. Sc;.- 73: 2774-2790..
Karunanandaa, K., and Varga, G.A. 1996. Colonization of rice straw by white-rotfungi (cyathus stercoreus). Effect on ruminal fermentation pattern, nitrogenmetabolism and fiber utilization during continuous culture. Anim. leed. SciTechnol. 61 (l-4) 1-16.
Kandylis, K. 1984. The role of sulphur in ruminant nutrition. Livestock Prod. Sc;,ll :611. A review
Kolattukudy, P. E. 1985. Enzymatic penetration of the plant cuticle by fungalpathogens Ann. Rev. Phytopath. 23: 223-250
Komisar&uk-Bony, S.: S. Toillon, C. Huc, and M. Carcelen. 1992. Estimation ofthe sulfur requirements of Turnen microbes in a semi-continuous fermentorRusitec. Proc. Aust. Soc. Anim. Prod. 19:300.
Kudo, H., Jakober K. D., Phìllippe, R. C., Cheng, K. J., Barr, D. J. S. & Costerton,J. W. 1990. lsolation and characterisation of cellulolytic anaerobic fungi andassociated mycoplasmas from the rumen of a steer fed a roughage diet.Canadian Journal of Microbiology 36: 513-517.
Leng, R.A. 1985. Muscle metabolism and nutrition in working ruminants. In:Draught Animal Power for Production. ACIAR Proceedings Series No. 10
Leng, R.A. 1988. Ruminant nutrition in the tropics. Livestock production p- 221-228.
Lewis, L.A., Hunt, C.W., Sanchez, W.K., Treacher, R., Pritchard, G.T. and Feng,P. 1996. Effect of direct-fed fibrolytic enzymes on the digestivecharacteristics of a forage based diet fed to beef steers. J. of Anim. Sc¡. 74(12). 3020-3028.
Li, J. & Heath, 1. B. 1992. The phylogenetic relationships of the anaerobícChvtridiomvcetous gut fungi (Neocallimasticaceae) and the Chvtrídiomvcota.1. Cladistic analysis of rRNA seque‘nces. Canadian Journal of Botany 70:1738-l 746. -.
55
Li, J., Heath, 1. B. & Packer, L. 1993. The phylogenetic relationships of theanaerobic Chvtridiomvcetous gut fungi (Neocallimasticaceae) and theChvtridiomvcota. II. Cladistic analysis of structural data and description ofNeocallimasticales ord. nov. Canacfian Journa/ of Botany 71: 393-407.
Li; J; Heath, 1.8; and Cheng, K. J. 1994. The development and zoosporeultrastructure of a polycentric chytridiomycete gut fungus, Orpinomycesjoyoni comb.nov. Can. J. Bof. 69: 580-589.
Li. J. & Heath, 1. B. 1993. Chytridiomycetous gut fungi, oft overlooked contributorsto herbivore digestion. Can. J. Microbio/. 39: 1003-l 013. Review
Lin, K. W; Patterson, J.A. and Ladisch, M.R. 1985. Anaerobic fermentations:Microbes from ruminants. Enzymes and Microbial Technology 7: 98-107.
Lodman, D.W., Petersen M. K., Clark C. K., Wiley J. S., Haustad K. M., andMclnerney M. J. 1990. Substitution of DL-methionine for soybean meai as awinter supplement for gestating cows grazing native range. J. Anim. Sc;,68:4361.
Lowe, S. E; Theodorou, M. K; Trinci, A.P.J; and Hespell, R. 6. 1985. Growt ofanaerobic rumen fungi on defined and semidefined media lacking rumenfluid. J. Gen. Microbio/. 131: 2225-2229.
Lowe, S.E; Griffith, G. G; Milne, A; Theodorou, M. K; and Trinci, A. P. J. 1987a.The life cycle and growth kinetics of an anaerobic rumen fungus. J. gen.Microbio/. 133: 1815-l 827.
Lowe, S.E., Theodorou, M.K. and Trinci, A.P.J. 1987b. Isolation of anaerobic fungifrom saliva and faeces of sheep. J. of Gen. Microbio/. 133: 1829-I 834.
Lowe, S.E., Theodorou, M.K. and Trinci A.P. J. 1987c. Growth and fermentation ofan anaerobic rumen fungus on various carbon .sources and effect oftemperature on development. Appl. and Environ. Microbio/. 53: 1216-1215
Lowe, S.E., Theodorou M. K., and Trinci A.P. J. 19874 Cellulases and xylanase ofan anaerobic rumen fungus grown on wheat s t raw, wheat s t rawhemicellulose, cellulose, and xylan. Appl. Environ. Microbio/. 53: 1216-1223.
Mackie, R.I. and White, 6. A. 1990. Recent advances in rumen ecology andmetabolim: potential impact on nutrient cutput. J. Dairy Sc¡. 73: 2971-2995.
Marvin-Sirkema, F.D; Richardson, A. J; Stewart, C. S; Gottschalk, J. C; and Prins,R. A. 1990. Influente of hydrogen consuming bacteria on cellulosedegradation by anaerobic fungi. Appl. Environ. Microbio/. 56: 3793-3797.
56
Mason, V.C., Cook, J.E., Keene, A.S. and Hartley, R.D. 1990. The use of mixturesof ammonium salts tith lime for upgrading cereal straws. Anim. Feed. Sc;.Technol. 28:169-181.
McAlIister T.A, Bae H.D.; Yanke, L.J.; Cheng, K.J. and Ha, J.K. 1994. A review ofmicrobial digetion of feed particles in the rumen. AJAS 7 (3): 303-316.
McCracken, B.A.! Judkins M. B., Krysl L. J., Holcombe D. W., and Park K.K.1993. Supplemental methionine and time of supplementation effects onruminal ferrnentation, digesta kinetics, and in situ dry matter and neutraldetergent fiber disappearance in cattle. J. Anim. Sci. 71: 1932.
Minson, D. J. 1990. Foraie in Ruminant Nutrition. New York. Academic Press. pp.20-22.
Momont, P.A., Pruitt R. J., and Johnson P.S. 1993. Effect of methionine additionto a urea-grain supplement on intake and digestibility of mature, dormantgrasses and performance of cows grazing winter range. J. Anim. Sci. 71:515.
Morgavi, D. P., Sakurada, M., Mizokami, M., Tomita, Y. and Onodera, R. 1994.Effects of Ruminal protozoa on cellulose degradation and the growth of ananaerobic ruminal fungus, piromyces sp. strain OTSI, in vitre. Appl. Environ.Microbio/. 60: 37 18-3723
Morrison, M., Murray, R. M. & Boniface, A. N. 1990. Nutrient metabolism andrumen microorganisms in sheep fed a poor-quality tropical grass haysupplemented with sulfate. J. Agrie. Sc;. 115: 269-275.
Mounfort, D.O. and Asher, R.A. 1989. Production and regulation of cellulase bythe ruminal anaerobic fungus Neocahmastix frontal&. Appl. and Environ.Mícrobiol. 55: 1016-I 022.
Mounfort, D.O., Asher, R.A. 1985. Production and regulation of cellulase by twostrains of the rumen anaerobic fungus Neocallimasfix frontahs. Appl, andEnviron. Microbio/, 49: 1314-l 322.
Mountfort, D. 0; and Asher R.A. 1983. Role of catabolite regulatory mechanismsin control of carbohydrate utilization by the rumen anaerobic fungusNeocallimastix frontalis. Appl. Environ. Microbio/, 46: 1331.
Mukhopadhyay and Kurar, C. 1995. Role of rumen bacteria, protozoa and fungi onthe digestion of dry matter and cell-wall components of certain feedstuffs.lndian J. of Anim. Sc¡. 65 (1): 117-I 19.
Multan¡, A.S., Makkar G. S, and Ahuja A.K. 1986. In vitre utilization of a sulfursalts by the rumen microorganisms. Indian J. Anim. Sci. 56:461.
Muller, M. 1988. Energy metabolism of protozoa without mitochondria. Ann. Rev.Microbio1 42: 465-488.
57
Munn, E. A. 1994. The ultrastructure of anaerobic fungi. In: j& anaerobic fun@(ed. C. G. Orpin & D. 0. Mountfort). Marcel Dekker: New York. In press.
Munn, E. A., Orpin, C. G. & Greenwood, C. A. 1988. The uitrastructure andpossible relationships of four obligate anaerobic chyfricfiomycete fungi fromthe fumen of sheep. BioSysfems 21: 67-82.
Nielsen, B.B., Zhu, W.Y., Trinci, A.P. J., Theodorou, M.K. 1995 Demostration ofzoosporangia of anaerobic fungi on plant residues recovered from faeces ofcattle. Mycol. Res. 99 (4): 471-474.
Obispo, N. E. & Dehority, B. A. 1992. A most probable number method forenumeration of rumen fungi with studies on factors affecting theirconcentration in the rumen. J. Microbio/. Meth. 16: 259-270.
O’Fallon, J.V., Wright, R. W and Calza, R. E. 1991. Glucose metabolic patways inthe anaerobic rumen fungus Neocallimastix frontak EB 188. J.Biochem-.274: 595599.
Onoda, A.; Kobayashi Y; Hoshino S. 1996. Effects of anino acids on the growth ofan anaerobic rumen fungus Neocallimastix sp N 13. Reprod, Nutr. Dev. 36:31 l-320
Orpin, C.G. 1975. Studies on the rumen flagellate Neocallimastix frontalis. J. Gen,Microbiol. 91:249-262.
Orpin, C.G. 1976. Studies on the rumen flagellate Sphaeromonas communis. J.Gen. Microbio/. 94:270.
Orpin, C. G. 1977a. The ocurrence of chitin in the cell walls of the rumenorganisms Nocallimastix frontal&, Piromonas communis and Sphaeromonascommunis. J. Gen. Microbio/. 99: 215-218.
Orpin, C. G. 1977b. On The induction of zoosporogenesis in the rumenphycomycetes Neocallimastix frontal&, Piromonas communis. J. Gen.Microbio/. 101: 181-I 89.
Orpin, C. G. 1983/1984. The role ciliate protozoa and fungi in the rumen digestionof plant cell walls. Anim. Feed Sc¡. Technol; 10, 121-l 43.
Orpin, C. G. 1989. Ecology of rumen anaerobic fungi in relation to the nutrition ofthe host animal. Page 29 in The Roles of Protozoa and Funai in Ruminant- - - -Diaestion. J. V. Nolan, R. A. Leng, and D. 1. Demeyer, ed. Penambul Books,Armidale, NSW, Aust.
Orpin, C.G., and A.J. Letcher. 1979. Utilization of cellulose, starch, xylan andother hemicelluloses for growth by the rumen Phycomycete Neocallimastixfrontalis. Curr. Microbio/. 3: 121-I 24.
Patterson J. A. 1989.-. Prospects for establisment of genetically enginermicroorganisms in the rumen. Enzíme Microb. Technol, vol ll _
Pearce, P.D., and Bauchop T. 1985. Glycosidases of the rumen anaerobic fungusNeocallimastix fronaths grown on ce l lu los ic subst ra tes. Appl. Environ.Microbio/. 49: 1265-l 269.
Phillips, M. W. & Gordon, G. L. R. 1992. Fungistatic and fungicida1 effects of theionophores monensin and tetronasin on the rumen fungus Neocallimastix sp.Lm?. Lett. Appl. Microbio/. 15: 116-I 19.
Phillips, M. W. and Gordon, G.L.R. 1995. Carbohydrate fermentation by threespecies of polycentric ruminal fungi from cattle and water buffalo in tropicalAustralia. Anaerobe 1: 41-47.
Philips, M.W. 1989. Unusual rumen fungi isolated from northern Australian cattleand water buffalo. In: Nolan, J.V., R.A. Leng and D.I. Demeyer. (eds.). TheRole of Protozoa and Funai 111 Ruminant Diaestion. pp. 247-249. Peambul- -Books, Armidale, AGralia.
. Phillips, M.W. and Gordon G.L. R. 1991. Growth responses to reduced sulphurcompounds of a ruminal fungus, Neocalhmastix sp. LMI. Proc. Third Int.Symp. on Nutr. Herbivores. (Malaysia. p. 26.
Qi, K., Lu C. D. and Owens F.N. 1992. Sulfate supplementation of Alpine goats:effects on milk yield and composition, metabolites, nutrient digestibilities, andacid-base balance. J. Anim. Sci. 70:3541-3550.
Qi, K., Lu C. D. and Owens F. N. 1993. Sulfate supplementation of growing goats:effects on performance, acid-base balance, and nutrient digestibilities. J.Anim. Sc¡. 71: 1579.
Rees, M.C. , Davis P. and Hogan J.P. 1982. The effect of fertilizer andsupplementary sulphur on the digestion of Digitatia pentzi in sheep. Proc.Aust. Soc. Anim. Prod. í4:681
Romulo, B. H., Bird, S. H. & Leng, R. A. 1986. The effects of defaunation ondigestibility and rumen fungi counts in sheep fed high-fibre diets. Proc. Aust.Soc. Anim. Prod. 16:327-330.
Romulo, B. H., Bird, S. H. & Leng, R. A. 1989. Combined effects of defaunationand protein supplementation on intake, digestibility, N retention and fungicounts in sheep fed straw based diet. In The Role of Protozoa and Funcli inRuminant Diaestion (OECD/UNE Intemational Seminar) (ed. J. V. Nolan, R.A. Leng & D. 1. Demeyer), pp. 285-288. Penambul: Armidale, New SouthWales, Australia.
Salter, D.N., Daneshvar K. and Smith R. H. 1979. The origin of nitrogenincorporated into compounds in the rumen bacteria of steers given proteinand urea containing diets. Br. J. Nutr, 41:197.
Selinger, L. B., Forsberg, C. W and Cheng: K. J. 1996. The rumen: A unique sourceof enzymes for enhácing livestock production. Anaerobe 2, 263-284.
Sijtsma, L., Tan, B. 1996. Degradation of perennial ryegrass leaf and stem cellwalls by the anaerobic fungus Noecallimasfix sp. Straìn CS3b. Appl. andEnwiron. Microbio/. 62 (4): 1437-l 440.
Spears, J. W., Ely D. G., Bush L. P. and Buckner R. C. 1976. Sulfursupplementation and in vitre digestion of forage cellulose by rumenmicroorganisms. J. Anim. Sc;. 43:513.
Spears, J.W., Ely, D.G. and Bush, L. P. 1978. Influente of supplemental sulphuron in wifro and in vivo microbial fermentation of Kentuky 31 tall fescue. J.Anim. Sc;. 47: 552.
Spears, J.W., Bush, L.P. and Ely, D.G. 1977. Influente of nitrate andmolybdenum on sulphur utilization by rumen microorganisms. J. Dairy Sci.60: 1889.
‘
SPP. 1991. Síntesis geográfica del Estado de Colima, Col. México. Pag. 22-23.
Stefanon, B., Pell: A.N. and Schofield, P. 1996. Effect of maturity on digestionkinetics of water soluble and water-insoluble fractions of alfalfa and bromehay. J. ofAnim. Sc;. 74 (5). ll 04-I 115.
Stewart, C. S., Akoyo, J. A. and Zadrazil, F. V., 1990. Enhan’ced degradability ofwheat straw following fermentation by Pleurotis ostreatus and thecontribution of rumen fungi and bacteria to straw degradation in vitro. In: M.T. Collaco and M. Coughlan (Editors), Advances in the Biolo~ical Treatment- -g Liclnocellulosic Materials, Elsevier Sciences, Barking, pp. 269-280.
Stewart, C. S. 1986. Rumen function with special referente to fibre digestion. Soc.Appl. Bactetiol. Symp. Ser, 13: 263-286.
Susmel P. and Stefanon B. 1993. Aspects of lignin degradation by rumenmicroorganisms. J. of Biotechnol. 30: 141-l 48.
Tanaka, H; Ushida, K; and Kojima, Y. 1992. Effect of p-coumaric acid on celluloseutilization by rumen fungi with or without methanogen. Anim. Sc;. Technol.63: 917-923.
Teunissen, M.J., Op den Camp, H. J. M., Orpin, C. G., Huis, J. H. J. & Vogels G.D. 1991. Comparison of growth characteristics of anaerobic fungi isolatedfrom ruminant and non -ruminant herbivores during cultívation in a noveldefined medium. Joumal of General Microbiology 137: 1401-l 408.
Theodorou, M.K., Lowe, S.E. and Trinci, A.P.J. 1988. The fermentativecharacteristics of anaerobic rumen fungi. Biosystems 21: 371-376.
Theodorou, M.K., Davies, D.R., Nielsen, B.B., Lawrence, M.I. and Trinci, P.J.1995. Determination of growth of anaerobic fungi on soluble and ce\\u\osicsubstrates using a pressure transdüiir. Microbiology-141: 671-678.
Trinci, A. P. J., Davies, D. R., Gull, K., Lawrence, M. I., Nielsen, B. B., Rickers, A.& Thepdorou, M. K. 1994. Anaerobic fungi in herbivorous animals. Mycol.Res. 98: 129-152. Review.
Van Soest, P. J. 1981. Limiting factors in plant residues of low biodegradability.Agrie. Environ. 6: 135.
Van Soest, P.J. 1982. Environment and forage. In: Nutritional Ecology of theRuminant. Edit. 0 and B Books Corvallis, Oregon p: 58-74
Waghorn, G.C. 1990. Beneficial effects of low concentrations of condensedtannins in forages fed to ruminants. In: Microbial and Plant Opportunities toImprove Lignocellulose Utilization by Ruminants (D.E. Akin, L.G. Ljungdahl,J.R. Wilson and P.J. Harris eds.), pp. 137-147. Elsevier Science, Publishers,New York.
Weston, R.H., Lindsay J. R, Purser D. B., Gordon G. L. R. and Davis P. 1988.Feed intake and digestion responses in sheep to the addition of inorganicsulfur to a herbage diet of low sulfur content. Aust. J. Agrie. Res. 39:1107-1119.
Whanger, P.D. 1972. Sulfur in ruminant nutrition. World Rev. Nutr. Dietect. 15:225A Review
Wilson, C.A., and Wood T.M. 1992. Studies on the cellulase of the rumenanaerobic f u n g u s Neocallimastix fronatlis, with special referente t o t h ecapacity of the enzyme to degrade crystalline cellulose. Enzyme Microb.Technol. 14: 258.
Wilson, J. R. 1993. Organization of forage plant tissues. In Foracle Cell WallStructure and Dinestibility (Eds H. G. Jung, D. R. Buxton, R. D. Hatfield & J.Ralph), pp. l-32. Madison: Ameritan Society of Agronomy.
Wilson, J.R. 1994. Cell wall characteristics in relation to forage digestion byruminants. J. Agrie. Sc;. (Camb.). 122:173- 182.
Wiliiams, A.G., and Orpin C.G. 1987a. Polysaccharide-degrading enzymes formedby three species of anaerobic rumen fungi growt on a range of carbohydratesubstrates. Can. J. Microbio/.- 33: 418-426
Wìlliams, A.G., and Orpin C.G. 1987b. Glycoside hydrolase enzymes present inthe zoospore and vegetative growth stages of the rumen fungi Neocallimastixpatticiarum, Piromonas communis, and an unidentified isolate, grown on arange of carbohydrates. Can. J. Microbio/. 33:427-434.
Windham, W.R. and Akin, D.E. 1984. Rumen fungi and forage fiber degradation.Appl. and Environ. Microbio/. 48: 473-476.
61
Wood, T. M. 1991. Fungal cellulasas. In Biosynthesis and Biodegradation ofCellulose (ed. C. H. Haigler & P. J. Weimer). 499-53. Marcel Dekker: NewYork.3
Wood, T. M., and Wilson C.A. 1995. Studies on capacity of cellulase of theanaerobic rumen fungus Piromonas communis to degrade hydrogen bond-ordered cellulose. Appl. Microbio/ Biotechno/-. 43: 572-578
Wood, T. M., McCrea S. I., Wilson C. A., Bhat K. M. and Gow L. A. 1988.Aerobic and anaerobic fungal cellulases, with special referente to their modeof attack on crystalline cellulose, In Biochemistry -and Genetics of CelluloseDeat-adation. ed. J. P. Aubert, P. Begin and J. Millet, AcademPresq pp.31-52
Wood, T.M., Wilson, C.A., McCrae, S.I. 1995. The cellulase sys’tem of theanaerobic rumen fungus Neocallimasfix frontalis : studies on the properties offractions rich in endo- (1-4)-p-D-glucanase activity. Appl. Microbiol.Biotechnol 44: 177-l 84
Wubah, D.A; Fuller, M.S; and Akin, D. E. 1991. Studies on Caecomycescommunis: morphology and development. Mycologia, 83: 303-310.
Wubah, D.A., Akin, D.E. and Borneman, W.S. Biology, fiber-degradation, andenzymology of anaerobic zoosporic fungi. Ctitical Reviews in Microbiology.19 (2): 99-115
Xue, G. P; Gobius, K. S; and Orpin, C. G. 1992a. A novel polysaccharidehydrolase cDNA (ceID) from Neocallimasfix patriciarum encoding three multi-functional catalytic domains with high endoglucanase, cellobiohydrolase andxylanase activities. J. gen. Microbio/. 138: 2397-2403.
Xue, G. P; Orpin, C. G; Gobius, K. S; Aylward, J. H; and Simpson, G. D. 1992b.Cloning and expression of multiple cellulase cDNAs from the anaerobicrumen fungus Neocallimastix patriciarum in Escherichia col¡. J. Gen.Microbio/. 138: 1413-l 420.
Yarlett, N. & Orpin, C.A. 1986. Hydrogenosomes in the rumen fungusNeocallimastix pattíciarum. Biochem. J. 236: 729-739.
Yarlett, N; Hann, A.C; Lloyd, D., and Williams, A. 1981. Hydrogenosomes in therumen protozoon Dasyfricha rumínanfium. Biochem. J. 200: 365-372.
Zhu, W., Theodorou, M.K., Longland, A. C., Nielsen, B.B., Dijkstra, J. and Trinci, A.P.J.1996. Growth and survival of anaerobic fungi in batch and continuous-flowcultures. Anaembe. 2: 29-37
62
3. MATERIALES Y MÉTODOS
El experimento se realizó con la finalidad de evaluar la particularidad de
degradar celulcsa pura por los hongos del rumen de caprinos alimentados con
sustratos fibrGsOS característicos del tr8pico seco. Se evalu8 su efecto sobre
la digestión de celulosa, asi como la concentración de glucosa como producto
de la fermentación y cambios en el pH al adicionar fuentes de azufre para
promover el crecimiento de estos hongos. .
3.1 Muestra
Para el experimento se utilizaron 2 X IO3 Iml zoosporas de hongos del
rumen, estas Leron obtenidas de un medio de cultivo axénico; las cuales se
cultivaron bajo condiciones específicas para su crecimiento en un medio de
cultivo descrito por Joblin (1981).
3.2. Restricciones
Se adicionaron antibióticos al medio de cultivo para evitar
contaminación bacteriana y se comprobó que el cultivo era axénico mediante
la observación al microscópio óptico.
En este experimento se tuvieron ciertas limitantes en relación con la
obtención de cultivos puros de hongos para llegar hasta su clasificación
taxonómica una vez que se contaba con una cepa local y esto debido a la falta
de equipo y condiciones adecuadas para este fin. Además no se contó con los
recursos necesarios para poder implementar las técnicas ya establecidas,
teniendo que adoptar materiales y reactivos existentes en nuestro laboratorio.
3.3 Localización del área de estudio
El trabajo se realizó en el Laboratorio de Posgrado del Area
Agropecuaria de la Universidad de Colima, el cual se ubica en la carretera
Jiquilpan- Manzanillo Km 260.
A los 18O 55’ latitud norte y !O3O 52’ longitud oeste, con una altura de 33
msnm. Su temperatura promedio anual es de 25OC y la precipitación media
anual de 710 mm (Anuario Estadíwco, 1994).
3.4 Técnica de muestreo
Los hongos se obtuvieron directamente de una fístula de un caprino,
recolectando digesta después de 2 horas de haber aliementado los animales.
La muestra se colocó en una bolsa de polietileno previamente esterilizada y
colocada en el medio de cultivo descrito por Joblin (1981) Después de 72
horas se obtuvieron las zoosporas para ser usadas para el experimento.
3.5 Procedimiento
Para la determinación dl contenido de paredes celulares del rastrojo de
maíz que se adicionó a la dieta para los animales se utilizó el método de
Goering y Van Soest (1970).
El contenido de azufre en la dieta se determinó de acuerdo a la técnica
de Mottershead (197 1)
En la preparación del cultivo axénico los hongos se aislaron y
multiplicaron en el medio propuesto por Joblin (1981), se adicionó celobiosa
(100 mg), almidón (1 OO mg) y glucosa (200 mg) como fuentes de carbono, los
componentes del medio se aforaron a 200 ml de agua destilada,
posteriormente se calentó hasta ebullición, se insertó una cánula conteniendo
COn comercial libre de 02, y el burbujeo se mantuvo hasta equilibrar la
anaerobios& en el medio. Además, se añadieron sulfuro de sodio (0.12%) y
cisteína (0.12 g) como agentes reductores, posteriormente se esterilizó en una
olla de presion a ll 5OC (1.5 libras/ kg de presión) por 15 minutos, Se adicionó
al medio una mezcla de antibióticos para evitar la contaminación bacteriana la
que consistió de 100 mg de cloranfenicol (diluídos en 1 ml de etanol), 2 g de
penicilina- G ( penicilina benzatínica yl procaínica, Cls Hj8 N2 Oq S CI3 H20 NZ
02, peso molecular 570.7, 1000 unidadesimg, Sigma, Pen-P) y 800 mg de
sulfato de estreptomicina (Sigma, S- 6501, peso molecular 1457.4, 765.
unidades de estreptomycina base/ mg, 5.5 mol/mol de agua ) lo anterior se
diluyó en 9 ml de agua destilada (Akin y Benner, 1988).
Los hongos se cultivaron en un medio de cultivo descrito por Joblin
(1981) bajo condiciones anaerobias según metodología como propone
Hungate, (1969) y con ciertas modificaciones por Obispo y Dehority (1992).
Se comprobó que el medio era axénico por observación al microscopio óptico
con un objetivo 10X y una vez que se preparó el medio de cultivo, este se
mantuvo en un matraz de fondo plano de capacidad de un litro. sellado con
tapón de goma No 5, posteriormente se esterilizó a una temperatura de
ll 5OC por un tiempo de 15 minutos. Se agregaron 20 g. de digesta ruminal
contenida en un filtro de polietileno (poro de 50 um), previamente esterilizada
con 1600 poroslcm’, misma que se colocó en 180 ml de la preparación del
medio. Se incubó a una temperatura de 39OC durante 72 h.
Se realizó el conteo de zoosporas con una cámara hemocitométrica de
Newbauer en microscópio óptico con el objetivo de 40 X. como describe
Morgavi et al., 1994. Se adicionaron 9 ml de medio basal en cada uno de los
3 tubos de ensayo (16cm/l.5 mm) utilizados en cada tratamiento, incluyendose
la misma cantidad de tubos no inoculados para considerarlos como control y
en la condición anaerobia. Las zoosporas que se encontraban en el medio de
cultivo donde se llevó a cabo la multiplicación de los hongos, fueron
transferidas a cada uno de los tubos tomando un mililitro que contenía una
cantidad aproximada de 2 X lo3 zoosporas del medio de crecimiento y estos
se colocaron en cada uno de los tubos de ensayo (16cmH.5 mm) para su
posterior evaluación en las incubaciones in vifro.
Después se adicionó a cada uno de los tubos 100 mg de celulosa pura,
tubos sin celulosa y sin fuente de azufre también fueron utilizados para
tomarlos como control. Aunque se comprobó que el medio era axénico se
agregaron 10 ~1 de antibióticos a cada uno de los tubos (16cmU.5 mm) para
evitar la contaminación bacteriana.,
3.6 Descripción de los animales
En el cuadro 1 se describe el valor nutritivo de la dieta utilizada para la
alimentación de los animales. El análisis bromatológico se realizó con la
técnica de macro Kjendhal (Tejada, 1985) para la determinación de proteína.
SE: utilizaron como donadores de inóculo para el experimento 2 caprinos
machos criollos castrados de aproximádamente 4 años de edad, 25 kg de
peso vivo, con fístula y cánula ruminal; con un tiempo de 3 años de fistulados.
La ración diaria para los animales consistió de 700 g de rastrojo de maíz (en
base seca), 200 g de melaza, 15 g de urea y 10 g de una mezcla de
minerales de casa comercial exento de azufre.
Con un consumo diario promedio de 800 g por día. El agua se
suministró a libre acceso.
66
Cuadro 1. Valor nutritivo de la dieta utilizada para la alimentación de los animales donadores
d e inóculo.
Dieta MS PC FDN FDA Hemi L i g Cel Azufre
% % % % % % % (w-N
Rastrojo de maíz 92.32 6.57 70.54 50.20 21.86 ll .53 36.30 9.6
Melaza 5.99 77.9
MS = Mater ia seca FDN = Fibra detergente neutro Llg = L ign ina Gel = Celulosa C = Proteína cruda,
Hemi = Hemwlulosa FDA = Fibra detergente ácido ppm = par tes por m i l l ó n
3.7 Mediciones
El medio de cultivo para el experimento fue el que describe Kudo et a/.
(1990) modificado por Barichievich y Calza (1990a). El sustrato utilizado en el
experimento fue celulosa pura comercial (Sigma chemical Co, No. Cat: S-
6790). El pH del medio se ajustó a 6.8 con ácido fosfórico (dilución 2O:l con
agua destilada, J.T. Baker, M-32736, 85.3% de pureza), posteriormente se
calentó hasta ebullición a flama directa con un mechero bunsen, este se
burbujeo con una canula de bióxido de carbono (COZ) comercial libre de
oxígeno (02 ) para su posterior vaciado a tubos de ensayo (16cm/?.5mm) y
sellados con tapón de goma No. 0.
Para el desarrollo del experimento se utilizaron como fuentes de azufre
al sulfuro de sodio, metionina y una mezcla de ambas fuentes comerciales
(Sigma), en estas dos últimas; dicha mezcla se realizó considerando la
proporción de azufre de cada fuente en cantidades de 50% del peso fórmula
gramo en relación al contenido de azufre;
3.8 Variables
Las variables evaluadas que se midieron fueron: digestibilidad de
celulosa (%) niveles de glucosa (~mollml) y valor de pH.
Se manejaron 4 periodos de incubación (2, 4, 6 y 8 días), al término de
cada periodo el contenido de cada uno de los tubos se filtró usando papel
filtro Whatman No 40. El mismo papel junto con el residuo de celulosa se
deshidrató en un horno (UL, K-5030-01) por un tiempo 12 h a una temperatura
de 80°C, se colocaron en un desecador (K-6514-1 0) por 15 *minutos.
Posteriormente se pesaron en una balanza analítica (Sigma, modelo AS120S,
capacidad 122 g) y por diferencia de peso se estimó la cantidad de celulosa
digerida, además se consideró la fracción fluída que contenia cada uno de los
medios de cultivo para determinar la cantidad de materia seca encontrada en
ellos y así corregir esta determinación como propone Obispo y Dehority
(1992).
Se tomó el sobrenadante de cada uno de los tubos que se encontraba a
una temperatura de 20° C para la determinación del pH mediante un
potenciómetro digital, calibrado con solución buffer de pH 4 y 7 (modelo S-
220, Electrodo 476140,Corning Mexicana, S.A México D.F.).
Se guardaron 2 ml de sobrenadante en camara de refrigeración a 4OC
para posteriormente determinar la concentración de glucosa por el método de
azúcares reductores propuesto (Jue y Lipke, 1985).
ox
3.9 Análisis estadístico
Los datos fueron analizados de acuerdo al procedimiento de SAS. El
modelo incluye los efectos de las fuentes de azufre x niveles de azufre x
interacción entre fuentes y niveles x error.
Se evaluaron 12 tratamientos para cada uno de los tiempos de
incubación.
El diseño utiliza& en el presente experimento fue completamente ai
azar con arreglo factorial. Para el experimento se utilizaron un total de 4
niveles de azufre ( 0, 0.15, 0.25 y 0.35%) de la fracción molecular de la fórmula
para las fuentes de metionina, sulfuro de sodio y la mezcla de sulfuro de sodio
y metionina con 3 repeticiones cada uno, mismos que fueron evaluados en 4
periodos de incubación a los 2, 4, 6 y 8 dias. El grupo testigo se consideró sin
ninguna fuente.
El modelo estadístico utilizado fue Y = M + A + B + AxB + Error
donde:
M = Media de cada uno de los tratamientos
A = Variable de fuentes
B = Variable de niveles
AxB = Interacción de fuentes con niveles
Error = Error experimental
Los resultados obtenidos fueron analizados estadísticamente mediante
un análisis de varianza. Para la comparación múltiple de medias de los
tratamientos se utilizó la prueba de Tukey (PC O.OS)(Steel y Torrie, 1980)
69
LITERATURA CITADA
Akin, D.E. and Benner R. 1988. Degradation of polysaccharides and lignin byruminal bacteria and fungi. Appl. Environ. Microb. 54: 1117.
Anuario Estadístico del Estado de Colima. 1994. México. Pag. 4-6
Barichievich, E.M. and Calza R.E. 1990a. Supernatant protein and cellulaseactivities of the anaerobic ruminal fungus Neocahmastix frontalis EB188.Appl. Environ. Nlicrobiol. 56:43.
Goering, H.K. and Van Soest P. J. 1970. Forage Fiber Analyses (apparatus,reagents, procedures and some applications). USDA AgricultureHandbook 379. \
Hungate, R. E. 1969. A roll tube method for cultivation of strict anaerobes. In:Norris J. R. Ribbons D. W. , eds. Methods in Microbiology. Vol. 38.London: Academic Press. 117-I 32.
Joblin, K. N. 1981. isolation, enumeration and maintenance of rumen anaerobicfungi in roo1 tubes. Appl. Environ. Microbio/. 42: ll 19-l 122
Jue, C. K. and P. N. Lipke. 1985. Determination of reducing sugars in thenanomole range with tetrazolium blue. J. Biochem. Biophys. Metho&ll: 109.
Kudo, H., Jakober K. D., Phillippe, R. C., Cheng, K. J., Barr, D. J. S. &Costerton, J. W. 1990. Isolatíon and characterisation of cellulolyticanaerobic fungi and associated mycoplasmas from the rumen of a steerfed a roughage diet. Can. J. of Microbio/. 36: 513-517.
Mottershead, B.E. 1971. Estimation of sulphur in biological materials using thetechnicon autoanalyser. Lab. pract. 20: 483
Obispo, N. E. & Dehority, B. A. 1992. A most probable number method forenumeration of rumen fungi with studies on factors affecting theirconcentration in the rumen. J. Microbio/. Meth. í6: 259-270.
Steel, R.G.D. and Torne, J.H. 1980. Principles and procedures of statistics(2nd edn). McGraw Hill International, London, UK.
Tejada, H. 1. 1985. Determinación de proteína cruda por el método de Kjeldahl
“Manual de laboratorio para anátisis de ingredientes utilizados en la
alimentación aniti-ial” Patronato de apoyo a la investigación y
experimentación pecuaria en México, A.C. Pag. 23
70
4. RESULTADOS
Los resultados encontrados para la digestibilidad de celulosa,
concentración de glucosa y cambios en el pH en el medio de cultivo por efecto
de las fuentes de azufre se describen en los cuadros 2, 3 y 4 y en las figuras 4,
5,6,7>8 S lo;11 y 12
4.1 Digestibilidad de celulosa <
LGS resultados de digestibilidad de celulosa por los hongos del rumen
estimulando su crecimiento con fuentes de azufre se muestran en el cuadro
No. 2 y en las figuras 4. 5 y 6
LGS resultados muestran que la digestibilidad de celulosa se ve afectada
por los niveles de azufre en el medio de cultivo, ya que se obtuvieron
diferencias significativas para los 3 niveles de azufre utilizados en los
tratamientos de metionina y sulfuro de sodio a los 2,4,6 y 8 dias de incubación,
en el tratamiento de sulfuro de sodio hubo diferencias significativas entre los 3
niveles de azufre a los 2 y 4 dias de incubación, mientras que a los 6 días no
hubo diferencias significativas entre los niveles 0.15 y 0.25%. ni entre los
niveles de 0.25 y 0.35%, no habiendo diferencia solo entre los niveles de 0.15
y 0.35%.
Como se observa en las figuras 4 y 5, al utilizar la mezcla de metionina
más sulfuro de sodio se obtuvieron los resultados de digestibilidad más
sobresalientes solo para los niveles de 0.15 y 0.25% de azufre, no siendo así
el efecto para el nivel 0.35% de azufre. Los resultados más bajos se
registraron al utilizar la metionina como fuente de azufre a los 6 y 8 dias de
incubación para el nivel de 0.25% de azufre.
CUADRO 2. Digestibilidad de ceiulosa pura por hongos del rum?n bajo la suplementación dediferentes fuentes de azufre con 3 niveles y L :‘empos de incubación en elmedio de cultivo In vitre.
Tiempo de
incubación NIVELES DIGESTIE -iDAU Yo .
(DIAS)
TESTIGO METIONINA SULFURO 3E SODIO S + M EEM
2 0.1 5%
0.25%
0.35%
4 0.1 5%
0.25%
0.35%
6 0.15%
0.25
0.35%
8 0.15%
0.25%
0.35%
28.86abc
23.79bcd
22.4Ocd
29.44cd
29.06cd
24.60def
25.93cde
33.99abc
26.99cd
22.90def
32.63bcd
30.76cd
29.54ab
26.72bc
17.31de
36.03ab
26.54cde
19.88f
36.47ab
22.50de
18.65e
35.06abc
22.80ef
19.55f
35.26a
25.59br
15.24f
40.82a
30.27~
23.43e’
39.95a
34.45ar-:
27.690:.:
34.35ac :d
35.31 ah:
34.13akd
30.10ab 1tll.3
34.39a
17.65de
31.07bc +8.3
35.54b
24.60def
42.07a *14.3
37.02a
25.08de
42.45a k8.2
39.67ab
28.89cde
Medias con la misma letra para cada tiempo de incubación no drfieren significativamente
(PC 0.01)
M + S = Mezcla de sulfuro de sodio y metionina como fuentes de azufre
EEM = Error estándar de la media para cada tiempo de incubaclon
_:: 32 36
202 4 6 a
Dias de mcubacih
Figura 4. Evo:.ción de la digestibilidad al 0.15 % de Azufre (ver cuadro 2)
44
2 36.z.Z2 32E
iY 28ae
24 / <.............;
20 i4 6 8
Dias de incubación
Figura 5. Evoxión de la digestibilidad al 0.25 % de Azufre (ver cuadro 2)
36 /l ..o32 1 :’iri Jk3l / .:.’0 20.
,,/,...” &.
.s .; _ _- . ..__..._.. -.--- -3-: -.: :
1 6
-Es
-;
TESTIGO
METIONINA
SULFURO DE
S + M
.
SCOIO
-o- TESTIGO
.? MET IONINA
--)- SULFURO DE SODIO-:i- s+M
-e- TESTIGO
7 MET IONINA
---‘3-- SULFURO DE SODIO12 L
1 4 6 8 ~-:- S+M
Dias de incuoación
Figura 6. Evoxión de la digestibilidad al 0.35 % de Azufre (ver cuadro 2)
A los 8 días de incubación, erpleando sulfuro de sodio como fuente de
azufre, no se encontraron diferer:-ias significativas en los resultados de
digestibilidad de la celulosa para nin+no de los 3 niveles de azufre utilizados
Cuando se utilizó la mezcla :e sulfuro de sodio mis metionina como
fuentes de azufre a los 2 días de irrubación no hubo diferer,:ia significativa
con el nivel de 0.35%. Lo mismo oc¿-re a los 4 y 8 dias de incubación. En los
tratamientx con 0.15 y 0.25% arro,?n resultados estadística-riente iguales.
mientras que el tratamiento co7 0.35% de azufre resultó diferente
estadísticamente en todos los tiemp-rs de incubación en relaciin a los niveles
de 0.15 y 2.25%
Los valores cle digestibilidad ~5 ceiuiosa obtenidos en 5 testigo fueron
estadisticamente iguales para los 3 r- veles a los 2! 4. 6 y 8 dias de incubación.
Los resultados indícan que z los dos dias de incuba: ón los valores
para las tres fuentes de azufre evalsadas no se obtuvo difere-via estadística.
obteniéndose los valores más altos erl el nivel de 0.15% con @ores de 29.54,
35.26 y 30.10 % de digestibilidad para las fuentes de metio?ina, sulfuro de
sodio y la mezcla de metionina y sulfxo de sodio respectivamente. Asi mismo
para el nivel de 0.25% para la mezcla de metionina y sulfuro ce sodio con un
valor de 34.39% de digestibilidad. El testigo resultó más alto a’ utilizar el nivel
de 0.15% con una digestibilidad de 28.86%.
Al cuarto dia de incubacióg se presentaron los resultados más
sobresalientes para el nivel con 0 15% para la mezcla de metionina con
36.03% de digestibilidad y sulfuro de sdio con 40.82% de digestibilidad. En
este tiempo de incubación el testigo mostró los resultados más bajos de
digestibilidad, siendo de 29.44, 29.06 y 24.60.
74
A los 6 días de incubación los datos más sobresalientes son para ei
nivel 0.15% con 36.47% de digestibilidad para la metionina, 39.95% para e;
sulfuro de sodio y 42.07% gara la mezcla de metionina rrlás sulfuro de sodio.
Al igual para el nivel de 0.25% para la fuente oe sulfuro de sodio cor
34.45% de digestibilidad y la mezcla de sulfuro de sodio más metionina con
37.02%. Para este nive; el testigo también mostk un valor mayor de.3igestibilidad con un valor de 33.99.
Los resultados más sobresalientes a los 8 dias de incubación, se
--egistran con el nivel 0.15Y de azufre siendo de 35.06üL de digestibilidad par-2
.a metionina, 34.35% pars el sulfuro de sodio y 42.45% para la mezcla de
cr7etionina más sulfuro de sodio. También sobresalió ei Gel de 0.25% para la
‘uente de sulfuro de sodio con 35.31% de digestibilidac y la mezcla de sulfure
de sodio más metionina co? 39.67%. Solo en este per ado sobresalió el nive:
de 0.35% de azufre al utilizar el sulfuro de sodio con 34 Í3% de digestibilidad
Como se observa en el cuadro 2, los valores encontrados para el nivei
de 0.15% de azufre superó a los demás niveles, excepto cuando se evaluó la
mezcla de sulfuro de sodic y metionina a los 4 dias de incubación al presntar
un valor de 31.07% de digestibilidad.
El análisis estadístlco nos indíca que existe una diferencia altamente
significativa (PC 0.01) para los tratamientos a los 2,4.6 y 8 dias de incubación
evaluados durante el estudio. El mismo análisis nos presenta una diferencia
altamente significativa (PC 0.01) por efezto del uso de las fuentes de azufre
utilizadas a los 4, 6 y 8 dias de incubación de los hongos, sobresaliendo la
fuente de sulfuro de sodio y la mezcla de metionina más sulfuro de sodio. En
75
relación a los niveles de azufre utilizados en cada uno de las fuentes de
azufre, también nos señala una diferencia altamente significativa (P =C 0.01) a
los 2.4,6 y 8 dias de incubación, sobresaliendo, el nivel de 0.15% de azufre.
4.2 Concentración de glucosa
Los valores que se muestran en el cuadro 3 y figuras 7, 8 y 9
corresponden a la -concentración de glucosa que se produjo probablemente a
partir de la celulolisis por ios hongos del Turnen mediante el proceso
fisicoquímico de la degradación de celulosa.
El análisis de varianza de estos datos nos indica que existe una
diferencia altamente significa?;va (P 0.01) con respecto a las fuentes de
azufre. Sobresaliendo con los valores más altos a los 6 días de Incubación los
niveles de 0.25 y 0.35% de azufre para las 3 fuentes de azufre.
Al analizar la interacción entre las fuentes y niveles de azufre. se
encontró una diferencia altamente significativa (PC 0.01) para los 2, 4 y 8 días
de incubación y una diferencia significativa (PC 0.05,! a los 6 días de
incubación. Se observa que a los 2 días de incubación se obtuvo una mayor
concentración de glucosa de 3.94 ~moles/mI al utilizar el nivel de 0.35% de
azufre al adicionar la mezcla de sulfuro de sodio más metionina. A los 4 días
de incubación, los resultados más altos de glucosa se obtuvieron al adicionar
la mezcla de sulfuro de sodio más metionina 3.92 ~moleslml y el sulfuro de
sodio con 3.83 ~moles/mI al utilizar el nivel de 0.35% de azufre. A los 6 días
de incubación, los resultados más altos de glucosa se registraron al adicionar
la metionina con 3.05 ~moles/ml, sulfuro de sodio con 3.16 ~moles/ml, y la
mezcla sulfuro de sodio y metionina con 3.33 ~moles/ml. para el nivel de
0.25%; al igual que al que cuando se utilizó el nivel de 0.35% con valores de
3.99 ~moles/ml para fuente de metionina 4.16 ~moles/ml para el sulfuro de
sodio y 4.10 ~moles/ml para la mezcla de sulfuro de sodio más metionina.
Las figuras 7?8 Y 9 muestran que a[utilizar la mezcla de metionina y sulfuro
de sodio se obtuvieron los valores más sobresalientes, siendo el efecto más
77
CUADRO 3
Tiempo de
incubación
(DIAS)
Concentración de glucosa (~Lmoliml) en el sobrenadante en los medios decultivo para los hongos del rumen utilizando 2 fuentes de azufre y lacombinación de las dos con 3 niveles WI 4 tiempos de incubación in vitre.
NIVELES CONCENTRAClON DE GLUCOSA.
TESTIGO METIONINA SULFURO DE SODIO S + M EEM
4 0.15% 2.78~
0.25% 1.39d
0.35% 1.27d
6 0.15%
0.25%
0.35%
8 0.15%
0.25%
0.35%
2 0.15%
0.25%
0.35%
0.99g
1.39fg
1.66ef
0.99d
1.89cd
1.05d
1.17de
1.33de
1.44de
1.83e
2.33cd
2.66c
2.78~
3.11b
1.44d
1.50d
3.05ab
3.99ab
1.28de
1.50cde
3.16bcd
1.33fg
1.94de
1.94de
l . l l d
1.61d
3.83a
2.66bc
3.16ab
4.16a
1.66cde
1.94cde
0.83e
3.33b
3.44b
3.94a
-0.1
2.45~ I 0.5
3.07bc
3.92a
2.78bc
3.33ab
4.10a
ro.3
2.99abc
3.82ab
4.16a
10.1
Medias con la misma letra para cada tiempo de incubación no difieren significativamente
(P¿ 0.01)
M + S = Mezcla de sulfuro de sodio y metionina como fuentes de azufre
EEM = Error estándar de la media para cada tiempo de incubación
3.2
: 2.0:;cj 1.6.1
1 . 2
0.8 L
4.0
3.4=E2 2.8
j 2.2
3(3 1.6
1.0
-- - TESTIGO
7 MET IONINA
--- SULFURO DE 50DIO
--:- S+M
Dias de inwbación
Figura 7 Evolución de la glucosa al 0.15 % de Azufre ‘$er cuadro 3)..
2 4 6 8
Dias de incubación
Figura 8 Evoluckm de la glucosa al 0.25 % de Azufre ter cuadro 3).
--r TESTIGO
:-- METIONINA
--)-- SULFURO DE SODIO--2- S+M
2.5 -. _:’
s 2.0.; ‘.
8 3’ ,.
< 1.5~-+- TESTIGO
1.0 :‘0
METIONINA
->--.0.5
SULFURO DE SODIO2 4 6 8 --:- S+M
Dias de incubación
Figura 5 Evolución de la glucosa al 0.35 % de Azufro ‘ier cuadro 3).
79
marcado z los 2 y 8 dias de incubación para los niveles de 0.15 0 25 y 0.35%
d e azufre Los resultados más bajos se reportaron con eI testigo al
compararlos con los 3 niveles de azufre.
A ìos 8 dias de incubación se registraron los valores miás altos en la
concentración de glucosa los cuales se presentaron al utilizar ia mezcla de
metionina y sulfuro de sodio, dichos valores fueron de 2.92. 3.8% y 4.16
~moles/~I para las concentraciones de 0.15. 0.25 y 0.35% de azuirg
Los valores más bajos que se obtuvieron a los 2 días de incubación al
utilizar ei sulfuro de sodio y el nivel de 0.15%, fueron de 1.33 ,moles/ml. Un
comportamiento similar se observó en el testigo cuando se utilizó el nivel de
kl5% de azufre obteniendose valores de 0.99 vmoles/ml.
A los 4 días de incubación los resultados más bajos de concentración de
glucosa se reportaron para las fuentes de sulfuro de sodio con el nivel de 0.15
y 0.25% de azufre con valores de 1.11 y 1.61 ~~moles/ml respectivamente.
Resultó un comportamiento similar con el testigo para los niveles de 0.25%
con valor de 1.39 pmoles/ml y 0.35% con 1.27 ~moleslml
A los 6 días, los valores más bajos de glucosa se reportaron al adicionar
metionina al utilizar el nivel de 0.15% de azufre, encontrando 1.50 ~moles/ml.
De la misma manera en el testigo a una concentración de 0.99 ;Imoles/ml.
4.3 Determinación de pH
Los resultados para los valores de pH del sobrenadante de cada uno de
los tratamientos por el efecto ca las fuentes y niveles de azufre y el tiempo de
incubación se exponen en el cLadro 4 y en las figuras 10. ll y 12.
El análisis de varianza TOS indíca que existe una diferencia altamente
significativa (PC 0.01) en los 5 4) 6 y 8 días de incubación por efecto del uso
de las fuentes evaluadas.
En relación a los niveies de azufre evaiuados para cada una de las
fuentes, el mismo análisis ncs indíca una diferencia altamente significativa
(PcO 01) para los 2: 6 y 8 días de incubación, sobresaliendo el nivel de 0.35%
de azufre al presentarse los mayores valores con este tratamiento.
Para las interacciones entre las fuentes y niveles de azufre el análisis
estadístico nos indíca una diferencia altamente significativa (P~0.01) para los
2, 6 y 8 días de incubación y diferencia significativa (P ~0.05) para los 4 días
de incubación.
Las figuras 10, 11 y 12 muestran que el pH se incrementó al adicionar
sulfuro de sodio como fuente de azufre a las concentraciones de 0.15! 0.25 y
0.35% de azufre, siendo más altos para los 2 y 4 dias de incubación. Los
valores más bajos se expresan al utilizar la metionina como fuente de azufre
para todos los niveles, con el efecto más marcado a los 4 y 6 días de .
inm ~harifín
X1
CUADRG 4. Valores de pF del sobrenadante del medio c? cultivo de los hongos del fumenutilizando 2 fuentes de azufre y la combinacin de las dos con 3 niveles en 4tiempos de iwgbación in vitr-o.
Tiempo de
incubación NIVELES PH .
(DIAS)
TES’IGO METIONINA SULFURC 3E SODIO S+M ,.EE”
2 0.15% 7.952
0.25% 7.7?2
0.35% 7.35’
4 0 . 1 5 % 7.58~
0.25% 7.71 abc
0 . 3 5 % 7.45c
6 0 . 1 5 % 7.59bcd 6.9Og
0.25% 7.55Me 7.20f
0.35% 7.47ors 7.lf
8 0.15% 7.58bcde
0.25% 7.84ab
0.35% 7.32de
i.cxg7.61de
7.750
6.931
7.28e
7.37de
8.:2,:
8.2:3b
8.4:~
7 7Eabc
8.663
8.4-ab
7.46cde
7.6t;bc
7.8:a
7.6Cxd
7.7iaoc
7.93a
7.60de
7.30fg
7.43ef
to. L
7.52bc
7.32~
7.51 bc
kl 3
7.42cde
7.43de
7.68ab
10.2
7.38de
7.36de
7.47cde
kO.5
Medias con la misma letra para cada tiempo de incubackn no difieren significativamen:e(P< 0.01)
M + S = Mezcla de sulfuro d+ sodio y metionina como fuentes de azufre
EEM = Error estándar de la qedia para cada tiempo de incuoación
82
8.4 r
8.2
:;: L -._,, î ,;
x --Lt---~a 7.4 -4L---.
7 . 2
7.0 + TESTIGO-.6.8 _
.: METIONINA
6.6--+--- SULFURO DE SODIO
2 4 6 8 --2- S+M
Dias de incubación .
Figura 10. Evolución del pH al 0 .15 % de Azufre (ver cuadro 4).
8.8
8.6 0.
..,.
8.4
8.2
8.0IQ 7.8 ^
3
7.6 :
7.4 ‘.---LL.=- -------
- -o- TESTIGO
7.2 --- ..~.... ‘y-- METIONINA
7.0 --o-- SULFURO DE S O D I O-2 4 6
0-z- S+M
Dias de incubación
Figura l l . Evolución del pH a l 0 .25 % de Azufre (ver cuadro 4) .
8.2‘.
8.0. . 3
7.8 ‘+5 7.
7.6 -i_//- ‘.
7.4+ TESTIGO
7 . 2 -- . ---:-- METIONINA
7.0---o-.- SULFURO DE SODIO
2 4 6 8 -x- S+M
Dias de incubación
Ffgura 12. Evolución del pH al 0 .35 % de Azufre (ver cuadro 4) .
83
A los 2 días de incubación, los valores más altos de pH se registraron al
utilizar sulfuro de sodio como fuente de azufre para los niveles de 0.25 y
0.35Ok de azufre siendo estos de 8.25 y 8.45 respectivamerx
A los 4 días de incubación, los valores más altos ;3~ pH se obtuvieron
al utilizar el sulfuro de sodio para las 3 concentraciones US azufre con valor
de 7.73. para el 0.15%: con pH 8.64 para 0.25% y pH E 47 para el nivel de
0.35O/c de azufre..
En el tratamiento de incubación por 6 dias, los resJkados de pH más
altos se obtuvieron al utilizar el tratamiento de sulfuro de scdio y la mezcla de
metionina y sulfuro de sodio con el nivel de 0.35% de azufre para ambos
tratamentos; los valores de pH obtenidos fueron de 7.83 p;--a sulfuro de sodio
y 7.68 para la mezcla de las dos fuentes.
A los 8 días de incubación1 los valores más altos 23 pH se obtuvieron
cuando se utilizó sulfuro de sodio en los niveles de 0.25 :, 0.35% de azufre,
con valores de 7.77 y 7.93 respectivamente.
Solo se presentaron valores de pH más elevados para el testigo con el
nivel 0.25% de azufre con un valor de 7.84.
No se encuentró diferencia significativa (P> 0.05) para los 4 días de
incubación en relación a los niveles de azufre evaluados.
El pH más bajo se obtuvo al utilizar la el nivel de 0.15% de azufre con
la metionina como fuente- de azufre a los 2, 6 y 8 dias de incubación con un
valor de 7.07, 6.90 y 6.93 respectivamente.
5. DISCUSION
Para promover la máxima retención de nitrógeno, es necesario una
proporción adecuada de nitrógeno-azufre en la dieta (Whanger, 1972). La
metionina es el,primer aminoácido azufrado limitante en ganado lechero y s,
deficiencia quizá origina cambios en el metabolismo de los lípidos (Bull !
Vandersall, 1972).
En los estudios que se han realizado en relación al efecto del azufre FI
forrajes fertilizado y no fertilizados ha demostrado que la fertilización còn azufre
incrementa el consumo voluntario y reduce los niveles de amoniaco en el
rumen. lo cual es indicador de una elevada actividad microbiana en el rumeq.
además se encuentra un efecto marcado en la contribución de los hongos a a
degradación de celulosa cuando estos tienen una adecuada proporción ee
azufre (Akin et al., 1983).
Orpin y Greenwood (1986) mencionan que una deficiencia de azufre e?
la dieta podría limitar el crecimiento de los hongos en el fumen asi como s;1
contribución en la digestibilidad de las paredes celulares de plantas.
El metabolismo del azufre y nitrógeno se encuentran estrechamente
asociados en rumiantes. La acción de la microflora del rumen quizá se altere
completamente la forma de la dieta para ambos de estos elementos (Kandylis.
1984). Se sugiere que para que el metabolismo sea óptimo por parte de la
microbiota y el animal hospedero, la cantidad y formas requeridas de azufre
necesaria en dietas a base de forraje: esto puede ser exitoso y aún no se ha
establecido (Weston et al., 1988).
La capacidad de digestión celulolítica por los hongos, la cual es
superior a 45% del peso seco de los tejidos de las plantas en cultivos in vitre
sugiere que ellos tienen-.un potencial por contribuir significativamente en la
digestión de lignocelulosa en el hospedero animal (Orpin, 1988).
La habilidad para utilizar diferentes carbohidratos para el crecimiento de
los hongos del rumen y para producir diferentes productos finales de la
fermentación en cultivos puros explicaria la variación en las propiedades de
los diferentes aislamientos fungales en el rumen en el rumen. La información
sobre los sustratos y productos finaies podría aportar una comparación
funcional a las diferentes especies de yongos del rumen, siendo aislados del
rumen de ovinos y bovinos en diversas zonas geográficas y regiones
climáticas (Phillips y Gordon, 1988).
La importancia de encontrar los requerimientos nutricios de azufre para
los microorganismos del rumen en dietas bajas en azufre ayudaría al
incremento ce la digestibilidad de lignocelulosa en 7.3 y 18.3 % (Weston et al.,
1988).
Al supiementar las dietas de baja zalidad nutritiva con fuentes de azufre
se ha mostrado que la degradación de: sustrato presente en el wmen podría
ser mejorado (Morrison et al.. 1990).
El incremento en la proporción de la producción microb!ana por
suplementación de aminoácidos debe ser benéfico para el mejoramiento del
desarrollo animal, particularmente para animales alimentados con forrajes de
mala calidaci y suplementados con nitrógeno no proteico. Se ha demostrado
que el sulfuro de sodio, asi como la metionina, tienen efecto sobre los
microorganismos. Reflejándose este en una mayor síntesis microbiana
(Fujimaki et al., 1992).
En la actualidad se conoce que los hongos del rumen se consideran
importantes en los rumiantes, ya que por su modo de crecimiento como una
extensión hiial engloban una poderosc actividad celulolítica y debido a su
actividad fibrolítica se ha considerado su uso en digestores anaerobios.
Actualmente se estan aplicando técnicas biotecnológicas potenciales para
86
clonar genes de enzimas celulasas de estos hongos con expresión en otros
microorganismos como las bacterias con el propósito de mejorar el
funcionamiento del turnen (Teunissen et al., 1993)
Las dietas para rumiantes a base de fuentes de azufre quizá alteran el
equilbrio ácido - base y en esto SE; considera que los requerimientos
específicos para su crecimiento está reiacionada con la cantidad de materia
seca ingerida y digestibilidad de la misma (Qi et al., 1993)
Evaluar la relación nitrógeno-azufre en suplementos de baja calidad
quizá tenga un impacto considerable sobre el desarrolio de ios animales
rumiantes (Morrison et al., 1994)
Es muy probable que los hongos del rumen ptiedan sintetizar su
proteina celular a partir de aminoácidos y ser aprovechados por la céiula y
utilizarla para su rápido crecimiento (Onoda et al., 1996).
5.1 Digestibilidad de celulosa
En los cuatro periodos de incubación que se evaluaron en el presente
experimento, se obtuvieron los mayores resultados en ia digestibilidad de
celulosa al evaluar el sulfuro de sodio y la metionina con ia concentración de
0.15% de azufre. Para ambas fuentes se encontró que la concentración de
azufre es importante en el crecimiento o proliferación de los microorganismos
presentes en el medio ya que al adicionar el nivel de 0.35% de azufre se
obtuvo un decremento en la digestibilidad de la celulosa, pudiendo ser
indicativos de que a niveles crecientes de azufre se afecta el desarrollo de los
microorganismos obteniendose respuesta negativa en la digestibilidad de la
celulosa.
87
Como no se encontró diferencia significativa entre fuentes y niveles a
los dos dias de incubación, se supondría que el efecto de ambos tratamientos
se manifiestan después de este tiempo de incubación. Además se pudo
observar que en el tiempo de incubación por 8 días al utilizar 0.35% de azufre
se incrementa la digestibilidad de celulosa solamente con el sulfuro de sodio
como fuente de azufre, lo que indicaría la reducción de esta fuente al
transcurso de este tiempo, difiere de la metionina y la mezcla de sulfuro de
sodio más metionina, logrando identificar que el tiempo que se exponga el
sustrato en un medio donde se tengan microorganismos que lo degraden, asi
como la fuente de azufre podría influir sobre la actividad microbiana.
Los resultados encontrados muestran que la digestibilidad se mejoró de
22 a 42% en comparación con el grupo testigo, efectos similares han sido
mostrados por Akln (1982), Akin et al. (19831, Guardiola et al. (1983). Otros
trabajos in vivo realizados por Barton et al. (1971), Spears (1976, 1977: 1978)
han mostrado que con la suplementación de azufre se incrementa la
digestibilidad de la celulosa contenida en los forrajes, estos estudios indican
que el azufre es esencial para el crecimiento óptimo de los microorganismos
del rumen.
También Bird (1972) encontró que la digestibilidad aparente de la
materia seca se incrementó de 43.8 a 65.7% cuando se adicionó sulfato de
sodio a raciones deficientes en azufre. Como se observa en el presente
trabajo, las fuentes de azufre tienen efecto positivo (P < 0.05) respecto al
grupo testigo sobre la digestibilidad de celulosa, aunado a los cambios de pH y
concentración de glucosa que se produce después de la fermentación por los
hongos como lo menciona Williams y Withers (1985).
Entre los tratamientos de los niv_eles de azufre, sobresalió el 0.15%
respecto al testigo: concordando con los resultados encontrados por Guardiola
et a/. (1980, 1983) quienes encontraron que adicionando fuentes de azufre a
88
un medio de cultivo con microorganismos del rumen se incrementó la
digestibilidad de celulosa in vitre significativamente (P < 0.05) para todos los
niveles evaluados con 0.05, 0.10 y 0.15% de azufre, al utilizar una fuente de
azufre inorgánica y orgánica de sulfato de sodio y metionina: no encontrando
diferencia significativa (P i 0.05) entre ambas fuentes de azufre y la mayor
digestibilidad se presentó cuando la metionina fue adicionada como donadora
de azufre: no coincidiendo estos resultados con los obtenidos por Hume y Bird
(1970): quienes encontraron un incremento en la digestibilidad de materia seca
después del incremento en los niveles de azufre de 0.231 y 0.432% de azufre.
Con respecto a la utilización de la mezcla de sulfato de sodio y
metionina, los resultados del presente trabajo y los obtenidos por Guardiola et
al. (1983) no concuerdan ya que ellos no encuentran diferencia entre las 2
fuentes evaluadas, solamente que ellos evalúan el sulfato de sodio y en el
presente estudio se utilizó sulfuro de sodio como fuente de azufre inorgánica.
Los resultados encontrados wgiere que las fuentes de azufre orgánica
e inorgánica tuvieron efectos sobre los hongos del Turnen, lo que concuerda
con reportes obtenidos por Fujimakl et al (1992), quienes al evaluar diferentes
fuentes de azufre incluyendo los aminoácidos azufrados como nutrientes
encuentraron un efecto muy marcado sobre la producción microbiana del
rumen de caprinos.
Los resultados encontrados en este trabajo en lo que respecta a la
digestibilidad de la celulosa concuerda con los reportados por Bull y Vandersal
(1972) quienes al utilizar diferentes fuentes de azufre orgánico e inorgánico
evaluaron la digestibilidad de celulosa in vifro y encontraron una mayor
degradación con la fuente inorgánica de azufre para los tiempos 4, 6, 12, 24 y
48 h siendo menor con metionina como fuente orgánica de azufre. Además
otros autores como Mur-y ef al (1991) mencionan el azufre inorgánico puede
ser utilizado por los microbios del rumen para sintetizar la proteína microbiana.
8 9
El efecto observado en el presente experimento sugiere que mediante la
utilización de una mezcla Ge hongos obte.nidos del fumen de cabras estos son
capáces de usar compuestos de azufre para incorporarlos dentro de
compuestos orgánicos y con ello contribuír a mejorar la digestìbìlìdad del
sustrato presente en el tracto digestivo; además, los resultados nos sugieren
que la determinación del nivel. más que la fuente de azufre es determinante
para desarrollar un medio adecuado para una proliferación de los hongos y de
esta manera obtener una mayor degradación fisico-química de los compuestos
celulósicas de una manera mecánica - enzimática en los rumiantes. lo que se
reflejaria en la mayor eficiencia en el aprovechamiento del alimento ingerido
por el animal, mejorando de esta manera los parámetros productivos.
4.2 Concentración de glucosa
En el presente estudio se demostró la presencia de glucosa generada
dentro del medio de cult!vo a partir de la degradación de celulosa por los
hongos del rumen in vibro. Las concentraciones de glucosa encontradas en e!
oresente experimento! mostraron una diferencia altamente significativa para
íos cuatro periodos de incubación (P < 0.01) en relación a los niveles de
azufre utilizados, sobresaliendo el nivel con 0.35% con el cual se obtuvieron
valores hasta de 4.16 ~lmoleslml a los 6 y 8 dias de incubación para las
fuentes sulfuro de sodio y la mezcla de metionina ,y sulfuro de sodio. En
relación con el testigo que presentó valores de 0.99~tmoVml. Estos resultados
no concuerdan con los encontrados por Mor-van et al. (1996) quienes
encontraron una cantidad mayor de azúcares reductores al cuarto dia de
incubación en un cultivo en asociación de hongos con bacterias del rumen y
monocultivo de hongos.
Este efecto podría explicar la c@idad de celulosa digerida por los
hongos del rumen, de donde se deduce que a niveles crecientes de azufre
ocurre un efecto negativo para los microorganismos y por lo tanto se reprime el
crecimiento de los hongos esto se podría deducir por la relación que se tlene
con la digestibilidad y la concentración de glucosa como se observa en los
cuadros 2 y 3, lo que sugeriría que la menor cantidad de glucosa encontrada
en el medio de cultivo se podria deber a su utilización por los microorganismos
para su metabolismo y crecimiento
En la mayoría de los tratamientos se encontró que al incrementar el
tiempo de incubación se incrementan los valores de glucosa, no concordando
con los resultados obtenidos por Morgavi et al. (1994), quienes encontraroh
una cantidad menor de glucosa al incrementar el tiempo de incubación, hecho
que explican como una represión en la producción de celulasa fungal.
unicamente que en este caso no se evaluó ningún suplemento para los
hongos.
4.3 Determinación de pH
En relación al pH se encontraron los valores más bajos al utilizar la
metionina como fuente de azufre, siendo más marcado para los 2, 6 y 8 dias
de incubación con valores de 7.07, 6.90 y 6.93 repectivamente. Los resultados
encontrados muestran que mediante la adición de azufre como sulfuro de
sodio se incrementó el pH y el efecto fue más marcado cuando se utilizó la
concentración de 9.25 y 0.35% de azufre para los 2, 4: 6 y 8 dias de
incubación.
Al relacionar el pH con la digestibitidad se observa que la degradación
de celulosa fue mayor cuando se adicionó el nivel de 0.15% de azufre,
considerandose los valores óptimos similares a los que se encuentran en el
rumen que son desde 5.8 a 6.8 como óptimo lo cual concuerda con lo
argumentado por Kudo (1990) quieq establece que para asegurar un
desarrollo microbiano óptimo in vitre, se requiere que se mantenga un pH igual
0 cercano a 6.8.
En este experimento se muestra que a mayor concentración de azufre
como sulfti-o de sodio el pH se e!wa considerablemente, considerandose
como un fsctor que influye sobre la digestibilidad por los microorganismos
sobre la digestibilidad de celulosa.
Los cesultados encontrados nc concuerda con los resultados obtenidos
por Qi et a: 1992, quienes al evaluar el efecto de la suplementación de fuentes
de azufre on cabras sobre el balance ácido base no encuentran diferencia
significativo (P> 0.05) sobre el pH pw 0-fecto de la suplementación de fuentes
de azufre.
Al u: iizar metionina y sulfuro ce sodio con el nivel de 0.15% de azufre
se registra-:,n valores de 6.83 y 7.73 para los 4 dias de incubación, lo cual se
relaciona czn la digestibilidad obtenida en este mismo trabajo, encontrandose
una mayor digestibilidad en pH cercanos a 6.8. Esto concuerda con los
resultados 3btenidos por Whanger I 1972) quien encontró que el pH óptimo
para la rec’xción de compuestos de azufre.presentes en la dieta es de 6.5 a
6.8, el misyo autor menciona que el.grado de reducción no muestra diferencia
a los camhs en el pH, no siendo muy sensitivo a este efecto.
El pH inicial disminuyó a los 4 dias de incubación y se incrementó a los
6 y 8 dias lo que concuerda con los resultados obtenidos por Morgavi ef al.
(1994), ellcs encontraron que el pH decrece a la mitad de la incubación con un
tiempo de :O dias y se vuelve a incrementar en tiempo posterior, este cambio
sugiere que la solución buffer que se adicionó al medio previene que este
disminuya o aumente y mantenga un medio propicio para el desarrollo de los
microorganlismos.
Las condiciones de anaerobios%, temperatura, asepsia, tiempo de
incubació? y componentes del medio de cultivo son muy específicas y se
requiere uYlformidad en estas variables y su modificación provocó inseguridad
92
en la viabilidad de los microot-gantsmos. Debido a esto fue necesario realizar
demasiados ensayos para lograr los objetivos.
Ei efecto del azufre sobre ia digestibilidad de celulosa sugiere que se
pueden encontrar los requerimientos específicos para cualquier tipo de
microorganismo presente en el rurnen y que existe la posibilidad de evaluar
otros sustratos que puedan ser aprovechados por los rumiaws. Lo cual podría
contribuir positivamente sobre la producción de leche, carne c lana.
Al mismo tiempo deberán tomarse otras mediciones en relacl’ón a los
productos finales después de la fe:mentación del sustrato Fara poder explicar
lo que sucede dentro del animal.
Gordon y Ashes (1984) incitaron que la respuesta a a digestibilidad de
la dieta con metionina por los hongos en el rumen sugerir!? que estos quizá
requieren metionina o metabolitos de metionina para su crecimiento, ellos
consideran necesario determinar las fuentes de azufre qde prefieren estos
hongos y su posible incremento en la digestión en las paredes celulares in vitre
para ser explotado en rumiantes.
Mountfort y Kaspar (1986) wsualizaron que la producción de hidrógeno
por los hongos puede ser de utilidad para la hidrogenación de hidrocarburos
insaturados para producir combustible como alcano en presencia de paladio.
Esto puede establecer un nuevo campo en el uso de los hongos para la
producción de ácidos grasos volátiles como alimento para ganado en cocultivo
con bacterias metanogénicas que utilizan hidrógeno o a través de la
eliminación de hidrógeno catalítico
El papel de los hongos en la degradación de la lignwpermanece sin
esclarecerse. Además, existe la necesidad de desarrollar trabajos con la
finalidad de evaluar su átributo en la degradación de las paredes celulares en
:elación a la dieta y sus posibles interacciones en el medio ambiente
:Mountfort, 1994).
Los mayores problemas que se tienen con estos microorganismos se
-elacionan con la determinación de su biomasa dent:o del rumen, pero para
3sto se deberán emplear pruebas orientadas a técnicas de biologia molecular
Theodorou et al., 1990).
Se requiere de investigaciones que vayan encaminadas hacia el
Intendimiento de las bases bioquímicas de traduccikni de energía hacia otros
-7icroorganelos de esta clase de hongos anaerobios para el establecimiento
:e la producción de ATP.
A la fecha no se tienen estudios sobre la L!ilidad de cultivar estos
-ongos en la producción de bioactivos, antibióticos f farmaceuticos. además,
sn la síntesis de compuestos poco utilizados como esreroles y una variedad de
:erpenos,
Asi como la modificación de la fermentaciór para la producción de
combustibles u otros metabolitos.
Los estudios sobre estos hongos en otros campos aportarán cambios y
sportunidades en el futuro. pero para esto es necesario continuar hacia un
-mejor entendimiento del verdadero papel de los hongos en la digestión de las
Daredes celulares contenidas en la dieta de los rumiantes, asi como los daños
sn el medio ambiente (Mountfort, 1994).
Aunque se han tenido logros considerables e importantes sobre el papel
3e los hongos dentro del rumen! existe mucha especulación sobre la
significancia de las paredes celulares y su fermentación.
Todavia se tiene poca información sobre su contribución en el
-metabolismo del rumen sobre diferentes fuentes alimenticias (Mounffort, 1994).
94
El aislamierk de nuevas especies y generos de hongos contribuiGn al
esclarecimiento de wevas ideas sobre la distribución, especialización, r,-ígen
y función de estos microorganismos en medios anaerobios. Sus es:ddios
deben aportar un *eta exitoso para especialistas en microbiología yc: que
muchos aspectos bioquímicos, ecofisiológicos y moleculares de estos
organismos permar?cen poco entendidos (Theodorou ef al., 1994).
El efecto de cada uno de los tratamientos abordados en el presente
trabajo indica que ;s cantidad de celulosa digerida por los hongos del r,-nen,
asi como la concer::.*ación de glucosa en el medio y los cambios de pH i 3nen
una relación intrínseca con los niveles. Los cuales tienen un efecto negai Jo al
incrementarse en sa concentración y niveles de oxidación sobre los hs-gos,
reprimiendo su cre::miento. Esto conduce a que halla una menor cantIrad y
cualidad de nutrier:?s disponibles en el medio en que se desarrollan, ~2 que
los hongos tiene- requerimientos específicos para su crecimier:o y
reproducción.
Los efectos zue se obtuvieron en este experimento, sugieren aue la
presencia y concew-aciones diferentes de compuestos de azufre, constwyen
un factor que modifica la población fungal; esto al registrarse un efecto positivo
sobre la digestibilidad de celulosa por los hongos del rumen con el efec:o de
los tratamientos e: Auados con sulfuro de sodio, metionina y la mezc 3 de
sulfuro de sodio m2c metionina.
95
LITERATURA (DISCI-XON)
Akin. D.E. 1982. Section to slide technique for the study of forage anatomy anddigestion. (i.ql. Sci. 22: 444-446.
Akin. D.E.,Gordon G. L. R., and Hogan J.P. 1983. Rumen bacteria! and fungaldegradation of Digitaria pentzlr grown with or vithout sulfur. Appl.Environ. Microbiol. 461738-748.
Bartcn, J.S., Bull, L.S. and Hemken, R.W. 1971. Effects of various levels ofsulfur upon cellulose digestion in purified diets and lign&ellulosedigestion in pur-ified diets and lignoceliulose digestion in corn fodderpellets in vifro J. Anim. Sc¡. 33: 682
Bird. P.R. 1972. Sulphur metabolism and excretion studles in ruminants. IX.Sulphur, nitrogen and energy utilization by sheep fed a sulphur-deficientand a sulphate-suplemented roughage-based diet. Aust. J. Biol. Sc;. 25:1073-I 085
Bretcn, A. Bernalier, A., Dusser. M. 1990. Anaeromyces mucronatus nov. gen.,nov. sp. A new strictly anaerobic rumep fungus with polycentric thallus.FEMS microbio1 /et?-70: 177-q 82
Bull. L.S. and Vandersall J.H. 1972. Sulfur source for in vitre cellulosedigestion and in vivo ratio utilization, nitrogen metabolism, and sulfurbalance. J. Dairy. Sci. 56: 106
Fujimaki, T., Kobayashi, Y., Wakita M. and Hoshino, S. 1992. Amino acidsupplements: a least combination that increases microbial yields ofwashed cell suspension from goat rumen. J. Anim. Physiol. a. Anim. Nutr.67.41-50
Guardiola, C. M, Fahey, G.C., Spears, J. W. and Garrigus U.S. 1980. Effect ofsulphur suplementation on in vitre cellulose digestion and on nutrientutilizatión and nitrogen metabolism of lambs fed low quality fescue hay.Can. J. Anim. ScL,- 60: 337-344.
Guardiola, C. M, Fahey, G.C.. Spears, J.W. and Garrigus U.S. 1983. Theeffects of sulphur supplementation on cellulose digestion and on nutrientdigestion, nitrogen metabolism and rumen characteristics of lambs fed ongood quality fescue and tropical Star grass hays. Anim. Feed Sc;. andTechnol. 8: 129-l 38.
Gordon, G.L.R. and Ashes, J.R. 1984. In vitro digestion of wheat straw bydifferent rumen anaerobic fungi. Can. J. Anim. Sci. 64: 156-157
Hume, I.D., and Bird, P R. 1970. Synthesis of microbial protein in the rumenIV. The influente cf level and form of dietary sulphur. Ausf. J. Agr. Res21: 315.
Kandylis, K. 1984. The role of sulphur in ruminant nutrition. tivesfock Prod. SCLll:61 1. A review
Morgavi, D. P., Sakurada. M., Mizokami, M., Tomita. Y. and Onodera, R. 1994Effects of Rumina’ Lirotozoa on cellulose degradation and the growth of ananaerob ic ruminal fungus, piromyces sp. s!rain OTSI, in vitre. AppiEnviron. Microbio/ 60: 3718-3723
Morvan, B., Rieu-Lesmf F., Fonty, G. and Gouet. P. 1996. In vitre interactionsbetween rumen Hz- producing cellulolytic microorganisms and HZ: utilizingacetogenic and sulfate-reducing bacteria. Anarrobe.-2: 175-l 80
Mountfort, D.O. 1994. Anaerobic Fungi: Future perspectives In: The anaeroblcfungi (de. C. G. OrUin and D.O. Mountfort). Marcel Dekker: New York. Ii!press.
Mountfort, D.O. an Kaspar, H.F. 1986. Paladium-nediated’ hydrogenation ofunsaturated hydrccarbons with hydrogen gas released during anaerobiccellulose degradatlon. Appl. Environ. Microbioi 52: 744-750.
Morrison, M., Murray M. and Boniface, A.N. 1990. Metabolism and rumenmicroorganisms iri sheep fed a poor- cuality tropical grass haysupplemented with sulphate. J. of Agrc. Sci. Cambrigde ll 5: 269- 275
Morrison, M., Boniface A.N. and Murray M. 1994. Alteration of supplementnitrogen:sulphur râtio by increasing sulphate supplementation affects theratte rather than the extent of fibre degradation in catle feed a maturedtropical grass hay. J. Sc;. Food Agrie. 65: 449-455
Murray, P. J.: Rowe, P. J. and Speijers, E. J. 1991. Sulfur suplementation and theuse fluvomycin wit!~ lupin grain for sheep. Ausf. J. Agrie. Res. 42: 1323-1333
Onoda, A.; Kobayashi Y. Hoshino S. 1996. Effects of anino acids on the growthof an anaerobic rumen fungus Neocallimasfix sp N 13. Reprod. Nutr, Dev.36: 311-320
Orpin. C.G. and Greenwood, Y. 1986. Nutritional and germinationrequerements of the rumen chytridiomycete Neocallimastix patriciarum.Trans. Br. Mycol, Soc. 86:( 1) 103-l 09.
Orpin, C.G. 1988. Nutrition and biochemistri of anaerobic chytridiomycetes.BioSistems 21: 365-370.
Phillips, M.W. and Gordon, G. L. R. - 1988. Sugar and polysaccharidefermentation by rumen anaerobic fungi from Australia, Britain and newzealand. Biosystems. 21: 377-383
37
Qi, K., Lu C. D. and Owens F. N. 1993. Sulfate supplementation of growinggoats: effects on pefformance, acid-base balance. and nutrientdigestibilities. J. Anim. Sci. 71.! 579.
Spears, J.W., Ely D. G., Bush L. P. and Buclcner R. C. 1976. Sulfursupplementation and in vifrc; digestion of forage cellulose by rumenmicroorganisms. J. Anim. Sc;. 43:513.
Spears. J.W., Bush, L.P. and Eiy. D.G. 1977. Influente of nitrate andmo!ybdenum on sulphur utilization by fumen microorganisms. J. Dairy Sc;.60.-l 889.
Spears. J. W., Ely, D.G. and Busfi: L. P. 1978 Influente of supplementalsulphur on /n vitre and in iv.5 microbial fermentation oí Kentuky 31 tallfessue. J. Anim. Sc¡ 47: 552.
-.
Teunissen, M.J., Hermans, J.M.H. Huis in t Veld Veld, J.H J.! Vogels, G. D.1953 Purification and charac:?rization of a complex boclnd and free p-encoxylanase from the culture fluid of the anaerobic !Gngus Pkomycessp strain E2. Arch. Microbiol. 159: 265-271
Theodor,zu, M.K.. Gill. M. King-Spconer C. Breever, D. 1992 Enumeration ofanaerobic chytridiomycetes as thallus-forming units: ?avel method forquantification of fibrolytic fucgal populations from the digestive tractecosistem. Appl. Environ. MicrrJbiol. 56: 1073-I 078.
Whange-. P.D. 1972. Sulfur in rumirant nutrition. World Rev. hutr. Dietect:15.225. A Review.
Webb, J Theodorou, M.K. 1991 Neocallimasfix hurleyensis, a new species ofanaerobic fungus from the ovine rumen. Can. J. Bof. 69: 1220-I 224
Weston. R.H., Lindsay J. R, Purser D. B., Gordon G. L. R. and Davis P. 1988.Feed intake and digestion responses in sheep to the addition of inorganicsulfur to a herbage diet of low sulfur content. Aust. J . Agric. Res .39.7 107-I 119.
98
ANEXO
.-\). Método para la determinac:ón de azúcares reductores propuesto por Jue y Lipkeí 1985).
Se adicionó 1 g azul C? tetrazoliorn (sigma) a 500 ;7:\ de hidróxido de sodio 0 1Yl La mezcla fué calentads. a 60°C‘ con movimientos rigurosos. La preparaciónpermaneció en material de \-iirio color- ambar. El reacti1.c %e dispònible para su usodespués de una semana. El rrtrato doble de sodio y pi?iasio (Fisher Scientific) fuejisuelto en agua destilada a 12 :.3ncentración de 1 .O M.
Se colocaron 40 1~1 de zxestra en tubos de 13 x 100 mm y se adicionaron 4 ml de.d mezcla del reactivo que cc%--.r:nia tetrazolium azul 0. 1qe. ?dróxido de sodio 0.05 hl.x-trato doble de sodio y pote<.,> 0.5 hl. Esta mezcla se cai=ntó en agua hirviendo por 3minutos, los tubos se enfria:-,:,? en corriente de agua, se secaron y la absorhancia fileieterminada a 664 i nm en espe;:: :~fotómetro ( Modelo: 001838.3. \:rra: Bausch Lnntb :i i).
B). Medio de cultivo para los ~‘ot-tSos del rumen descrito Po: Joblin (198
<olución A”’ 17 mllolución B”’ 17 mlFluido del rumen clarificado 15 mlCellobiosa’ 200 mgExtracto de levadura 50 mgTripticasa 100 mggemina O.O5?/ó 0.2 mi!0.05% en 1: 1 etanol con hidrìxido de sodioL.05 M)Rezarzurina, 0. l?,ó (peso/volu:xen) 0.3 mlCarbonato de sodio (NaHCO.; 500 mgL-cisteina.HCl.H20 30 mgIgua destilada 50.5 ml
a ) Solución A (Hungate, 196~ ! KH2P04, 3 g; NaCl, 6 g; !\H4)2S04, 3 g; CaCL2, 0 3
3. MgS04, 0.3 g (0.6 g si es -H20); aforado a 1000 ml con agua destilada,21
b) Solución B (Hungate, 196~ 1K2HP04, 3 g. para aforar a 1000 ml de agua destilada
c) Si es necesario se puede wr::plazar por glucosa (100 rns\
C). Procedimiento para la detcrminacion de proteina del forraje utilizado para ia dirta delos caprinos (Método de Kjendhal)
1 Se colocó 1 g de muestra en un matraz, Kjendhal que contenía 20 mi de acidosulfYnic0 al 98% y 6 y de seknio para acelerar la reacción, colocando además 5 Feriasde vidrio para controlar la ebullición.2. La mezcla se calentó a ebuliicibn hasta su clarificación JI una \.ez fria la solu~ion sedepositaron 200 ml de agua destilada. a esta misma se colocaron 100 ml de hidroydo desodio al 15% y 7 granallas de zinc para su posterior destilación.3. Para lc recuperacion del hid:-oxido de amonio se se colocaron 75 rnl de ácido bc~r:co al4% en UII matraz er:enmeyer de 500 ml y 3 gotas Qe rojo de metilo como indicador4. El desrilado se aiL:sró a un \oiumen de 200 rnl\. jubsecuenmente se tituló para rl%enerla cantidad de nitrógeno de la muestra5. La carxidad de nkroyeno obtenido t%e multipli:aJo por factor 6.25 para ca:.:..iar elporcentaje de protek (Tejada. 1985).
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