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CROMATINA
Estructura y función
Cromatina: estructura y función
• Primera clase- "Cromosomas" virales,
bacterianos y eucariotas- Cromatina:
Niveles de compactado:Nucleosoma,Fibras,
Cromosomas en interfase y mitosis
• Segunda clase- Procesos celulares en
el contexto de la cromatina:
ReplicaciónRegulación de la
expresión génica
En eucariotas, procariotas y virus:
ADN asociado a proteínas
Organismo Dimensiones ARN/ADN Longitud
VTM 0.008x 0.3 µm
ARN (simple) 2µm=6.4kb
Fago T4 0.065x0.1 µm ADN (doble) 55 µm=170 kb
E. coli 1.7x0.65 µm 1 ADN doble 1.3 mm = 4.2 x103 kb
H. sapiens (nucleo)
6µm diam. 46 cromosomas
ADN doble
1.8 m = 6 x106 kb
* EL ADN CABE DENTRO DE LA CÉLULA
* ADN PROTEGIDO DE LESIONES; MÁS ESTABLE
* ADN ORGANIZADO CONTROL DE LAS DIFERENTES FUNCIONES CELULARES (expresión génica, replicación, recombinación, separación de cromosomas en la división celular,...)
ADN de ØX174 Cromosomas eucarióticos en mitosis
Bacteria lisada – ADN “compacto”
EUCARIOTAS, PROCARIOTAS, VIRUS – ADN CONDENSADO POR ASOCIACIÓN CON PROTEÍNAS
EN VIRUS: ADN o ARN condensado dentro de las partículas virales por interacciones inespecíficas con proteínas de la cápside
VMT: ARN en hélice dentro de la cápside
CROMOSOMA PROCARIÓTICO
Lisis: fibras en forma de bucles unidas a la envoltura rota de la célula
LISIS
E.coli
•Cromosomas circulares
•Cromosomas lineales
•Ambos (ej. Agrobacterium tumefaciens)
CROMOSOMA PROCARIÓTICO
HLP1.
• Dominios en bucles de 40 kb aprox. de ADN superenrrollado; asociado a proteínas básicas
• No se sabe cómo se mantienen unidos en su base
• Cada dominio es independiente de los otros
PROTEÍNAS BÁSICAS DETECTADAS EN BACTERIAS
Proteína ComposiciónContenido por
célulasSemejanza con
eucariontes
HUDímero
subunidades a y b de 9.000 d.
40.000 dímeros Histona H2A
H
Dímero subunidades idénticas de
28.000 d.
30.000 dímero Histona H2B
IHF
Subunidad a de 10.500 d.
Subunidad b de 9.500 d.
Desconocido Desconocida
H1Subunidad de
15.000 d.10.000 copias Desconocida
HLP1Monómero de
15.000 d.20.000 copias Desconocida
PSububnidad de
3.000 d.Desconocido Protaminas
CROMOSOMA EUCARIÓTICO - CROMATINADIFERENTES NIVELES DE
COMPACTADO
6 veces compactado
40 veces compactado
> 1000 veces compactado
> 10000 veces compactado
CROMATINA - NUCLEOSOMAS
FIBRA DE 30 nm
FIBRA DE 10 nm
« collar de perlas »
Suspension de nucleos a baja fuerza ionica: lisis y liberación de fibras de cromatina de 30 nm
Nucleasa microcóccica
fuerza iónica
205
405
805605
Digestión suave con nucleasa microcóccica: se obtienen múltiplos de una determinada unidad de longitud: Repetición nucleosomal
Tratamiento más drástico con nucleasa
microcóccica:
3) Se liberan mononucleosomas
4) Se liberan nucleosomas recortados
5) Se liberan cores de histonas
PARTÍCULA NUCLEOSÓMICA CENTRAL
- 146 pb de ADN enrollados alrededor de la PARTÍCULA NUCLEOSÓMICA CENTRAL o CORE de histonas (2 vueltas)
-Tetrámero de H3 y H4
-2 dímeros de H2A y H2B
6 nm
OCTÁMERO
NUCLEOSOMA
-146 pb ADN enrollados en el core
-ADN ligador de largo variable
- Histona H1
Especie Repetición nucleosomal
Longitud del ligador
S. cerevisiae 160-165 13-18
Erizo de mar (espermatozoide)
260 110
D. melanogaster 180 33
Humano 185-200 38-53
EN PROMEDIO
EN LA CROMATINA HAY OTRAS PROTEINAS:
HMGs, protaminas, y todas las enzimas necesarias para la duplicación, transcripción,
etc. del ADN.
HISTONAS DEL CENTRALES o del CORE
- Proteínas pequeñas (11- 15 Kda)- Muy conservadas - RELEVANCIA- Alta carga + (ricas en Lys y Arg)- Dominio “pliegue histónico” - 3 hélices-α separadas por asas cortas no estructuradas- Colas N-terminales ¡¡IMPORTANTES!!
Histona Nº residuos PmContenido en moles % de
ModificaciónLys Arg
H1 213 21.000 27,7 1,4 Fosforilación
H2A 129 13.900 10,9 9,3Fosforilación,
acetilación
H2B 125 13.774 15,2 6,1Fosforilación,
acetilación
H3 135 15.273 9,6 13,3Acetilación, metilación
fosforilación
H4 102 11.236 10,8 13,7Acetilación, metilación
fosforilación
2) Se forman heterodímeros H3-H4
3) Se forma tetrámero H3 - H4
4) Unión al ADN
5) Dos dímeros H2A-H2B son reclutados
¿Cómo se arma un nucleosoma?: Las histonas se asocian de manera ORDENADA para formar un nucleosoma
-Tetrámero se une a 60 pb centrales de los 146
-Dímeros H2A-H2B a 30 pb a cada lado de esos 60 pb
-Hélice N-ter de cada H3 contactan 13 pb en cada extremo del ADN
ESTRUCTURA ATÓMICA DEL NUCLEOSOMA A ALTA RESOLUCIÓN
EJE DIÁDICO
INTERACCIONES ADN-histonas
- 14 sitios de contacto diferentes, uno por cada vez que el surco menor del ADN está frente al octámero de histonas
- 142 puentes de hidrógeno (entre a.a. y O del enlace fosfodiéster cerca del surco menor)
- enlaces por cargas + de histonas y – del ADN
(INTERACCIONES INESPECÍFICAS)
Colas N-terminales de histonas del core dirigen el enroscado del ADN en sentido levógiro:
¿Cómo se disponen los nucleosomas en la fibra de 10 nm?
2 factores favorecen la ubicación de un nucleosoma:
• Facilidad para que se curve la doble hélice: secuencias ricas en AT en surco menor
• Presencia de proteínas no histonas unidas al ADN con gran afinidad
- Longitud variable en el genoma
- Posicionamiento dinámico
Fibra de 30 nm:
Una vez que se forman los nucleosomas, la fibra de 10 nm se condensa en el siguiente nivel de compactado
2 modelos para la fibra de 30 nm:
SOLENOIDEZIGZAG
ADN ligador
ADN ligador
INTERVIENEN:
- H1
- Colas N-terminales de las histonas del core
Histona H1 o ligadora- Proteína pequeña; un poco más grande que las del core
- Secuencia menos conservada
- Estructura típica
¿Dónde se ubica en el nucleosoma?
Modelos:
Protección de 20 pb adicionales de ADN de digestión con nucleasa
microcóccica
Al aumentar la concentración salina en presencia de histona H1 se forma una fibra de 30 nm:
Las colas N-terminales de las histonas intervienen en la formación de la fibra de 30 nm
Recordar : Las colas de las histonas son blanco de modificaciones
post-traduccionales
Compactado en la fibra de 30 nm, un cromosoma humano aún mediría 0.1 cm = 10 veces más
grande que el núcleo celular!!
Niveles de mayor compactado (?) que varían en el ciclo celular en respuesta a señales del ciclo celular
Cromatina saliendo de un núcleo lisado
en interfase Cromosoma mitótico
CROMATINA EN INTERFASE
* La cromatina es una estructura fluida y dinámica en la que se deben
"exponer" las secuencias de ADN para que se den los diferentes procesos celulares.
* Estructura de cromosomas en interfase: cromosomas plumosos, cromosomas politénicos
* 2 «formas» de cromatina en interfase: EUCROMATINA y HETEROCROMATINA
CROMOSOMAS “ESPECIALES” EN INTERFASECROMOSOMAS PLUMOSOS («lampbrush»)
Cromosomas apareados en premeiosis en oocitos inmaduros de anfibios – CROMOSOMAS GIGANTES
BUCLES: genes que se expresan
EJE: cromatina condensada (ANDAMIAJE
CROMOSÓMICO)
CROMOSOMAS POLITENICOS
Cromosomas de larvas de insectos; múltiples ciclos de síntesis de ADN sin división celular
Los cromosomas homólogos se mantienen unidos, paralelos
D. melanogaster
BANDA
INTERBANDA
-5000 bandas e interbandas
-3 a 30 kb = 0.005 a 0.0005 µm
- Interbandas: 5 % genoma
- Bandas: > condensación cromatina y/o > contenido de proteínas
- Patrón reconocible
-Genes en interbandas se expresan más
CROMOSOMAS POLITENICOSECDISONA
CAMBIOS EN LA EXPRESION GENICA
APARICIÓN DE «PUFFS»: la cromatina se descomprime y
hay transcripción
MAS ADELANTE VEREMOS LOS MECANISMOS IMPLICADOS EN ESTA «APERTURA» DE LA CROMATINA
Tiempo
ANILLOS DE BALBIANI (Chironomus tentans):
LO QUE OCURRE EN CROMOSOMAS PLUMOSOS Y POLITENICOS EN CUANTO A PODRIA SER LO QUE OCURRE EN TODOS LOS CROMOSOMAS EN INTERFASE
EUCROMATINA Y HETEROCROMATINA
En la cromatina se distinguen zonas más y menos densas
EUCROMATINA
Estructura menos condensada, compuesta mayormente de fibra de 30 nm
HETEROCROMATINA
- Forma altamente condensada
- Incluye proteínas adicionales
- Genes no expresados (silenciados) en la mayoría de los casos; repetidos (tandems) de secuencias cortas
- Mantenimiento de telómeros y centrómeros de cromosomas
TELÓMERO
-Secuencias cortas repetidas
Ej. 5´TTAGGG 3’ (humano)
- Gran parte monocatenario (3’) formando una estructura especial, resistente a nucleasas
Estructura especial de la cromatina:
- Desacetilada
- Asociada a proteínas especiales
CENTRÓMERO
- Resistencia en la mitosis; unión a huso durante la mitosis a través del cinetocoro
- Diferente largo en los diferentes organismos
Ej. levadura: 125 pb
humano: varios miles de Kb
- Secuencias repetidas no características- satélites α
-Histonas desacetiladas, metiladas
Histonas especiales ej CENP-A, variante de H3
(N-terminal con extensión; unión a cinetocoro?)
-Docenas de proteínas asociadas
CROMOSOMAS EN MITOSIS
- Nivel máximo de compactado; los cromosomas se observan como cuerpos bien definidos
- Asociados a diferentes complejos de proteínas. si se extraen las histonas, se observa en microscopio electrónico bucles de ADN unidos a un andamiaje nuclear (40-90 kb = 10-30 nm)
Proteínas de andamiaje nuclear:
- topoisomerasa II en base de los lazos : control en replicacion y transcripción?
- SMCs “Structural maintenance of chromosomes”
SMCs
- COHESINAS
- CONDENSINAS (+ ATP : formación de bucles)
Formación de complejos en forma de anillos
ORGANIZACIÓN DE LOS CROMOSOMAS:
BANDEADO DE PROTEÍNAS G
Bandas G: bajo contenido de GC
Bandas R: alto contenido de GC –genes + transcriptos
Organización mantenida en la evolución:: IMPORTANTE
La cromatina es una estructura dinámica:porciones de ésta se descompactan para que tengan lugar los distintos procesos celulares
- Replicación
- Regulación de la expresión génica
REPLICACIÓN En el sitio de replicación la fibra de 30 nm se desorganiza.Inmediatamente después de la replicación el ADN se asocia a nucleosomas.
Nuevos nucleosomas : 2 posibilidades
2) los nucleosomas viejos se desarman y sus histonas + nuevas histonas forman nuevos nucleosomas
3) Los cores “viejos” se mantienen
Experimento: Sobrecruzamiento de histonas
Células crecen en presencia de a. a. PESADOS
• Replicación en presencia de a.a. livianos:: histonas nuevas son livianas
• Se forman octámeros
• Purificación de nucleosomas y fraccionamiento en gradiente de densidad
nucleosoma parentalhistonas sintetizadas de novo (livianas)
A) Se conservan los octámeros
B) Se forman octámeros nuevos (mezcla de histonas)
A) dos densidadesB) gradiente de densidades
B) parece ser la correcta
In vivo el ensamblaje de los nucleosomas no es un proceso espontáneo.
Se requieren chaperonas histónicas (ej. CAF-I, RCAF)
POSICIONAMIENTO DE NUCLEOSOMAS:
A veces es un estorbo, a veces una ventaja: depende de dónde queden los sitios de unión de factores transcripcionales
Si quedan escondidos, la cromatina deberá ser modificada para que los factores de transcripción puedan actuar.
CROMATINA Y TRANSCRIPCIÓN
POSICIONAMIENTO DE LOS NUCLEOSOMASPOSICIONAMIENTO EXTRÍNSECO:
El primer nucleosoma se posiciona en un determinado lugar, por secuencia o por proteína unida al ADN. El resto determinado por el primero
200 pb
PROMOTORES “PREPOSICIONADOS”
- Sitios de unión de factores de transcripción expuestos sobre el nucleosoma o en ADN ligador
- Genes constitutivos suelen ser de este tipo
Ej.: Promotor del gen hsp26 de D. melanogaster (respuesta al shock térmico)
GAGA GAGAHSE HSE TATA
pol II
pol II
(A)
(B)
HSTFTFIID
transcripción
interacción
- Modificaciones de la estructura de la cromatina asociados a transcripción se han observado in vitro e in vivo
- Esas modificaciones, ¿son necesarias para la transcripción o son consecuencia de la misma?
Se ha demostrado que en algunos promotores el “remodelado” de la cromatina puede tener lugar aún en ausencia de transcripción
¿Qué pasa si los sitios de unión de factores de transcripción en un promotor NO están accesibles?
EJEMPLO: Promotor de PHO5 de S. cerevisiae
TATAPHO2
PHO4
carencia de fosfato
TATAPHO2
PHO2
pol IITBP
-1-2
a b
transcripción
PERO....
¿Cómo se remodela la cromatina?
1) COMPLEJOS REMODELADORES DE LA CROMATINA ATP-dependientes
2) MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES DE LAS HISTONAS
A)
TATA
TATA
TBP
SWI/SNF
SWI/SNF
TATA
transcripción
TBP
TATA
TBPSWI/SNF
TATA
SWI/SNF
B)
TBP
transcripción
Swi-Snf
MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES DE LAS HISTONAS DEL CORE
-Lisinas y Serinas de histonas del core sufren acetilación, metilación, fosforilación, ubiquitinación....
- Mutaciones causan alteraciones de la expresión:
Ej. H4: *dominio R (aa 17 a 29) : implicado en represión
*dominio A (aa 1 a 16) : implicado en activación
-Modo de acción:
1) modificación de la interacción con ADN (carga)
2) Lugares de unión para proteínas
“Código de histonas”
SWI/SNF
DESACETILACIÓN DE HISTONAS
- Grandes complejos proteicos
- Reclutados a determinados promotores por represores específicos
1) Ume6 se una a promotor; interacción con Sin3
2) Sin3 es parte de complejo con RPD3 (HDAC)
COMPLEJOS DE ACCIÓN REPRESIVA - SILENCIAMIENTO
Complejos de proteínas que establecen estructuras muy organizadas de la cromatina (de tipo de heterocromatina)
Ej. telómeros de S. cerevisiae
• Rap1 se une a telómeros
• Rap1 recluta Sirs
•Interacción con histonas hipoacetiladas
• Sirs se agregan
Las figuras de esta presentación han sido extraídas de:
- Lewin, B. 2004. Genes VIII. Pearson Prentice-Hall.
-Watson, J.D. et al. 2004. Molecular Biology of the Gene. 5ª ed. Pearson Benjamin-Cummings.
-Lodish, H. et al. 1999. Molecular Cell Biology. 4a ed. W.H. Freeman & Co.
- Alberts, B. et. al. 2002. Molecular Biology of the Cell. 4a ed. Garland Publishers
-Travers, A. (1999) “The location of linker histone in the nucleosome”;
TIBS 24: 4.
- Thoma, F.; Koller. T.H. and Klug A. (1979) “Involvement of the histone H1 in the organization of the nucleosome and of the salt-dependent superstructures of chromatin”.
J. Cell. Biol. 83; 403
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