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Identificación y cuantificación de bacterias
filamentosas del género Thiothrix con la técnica
FISH en EDAR de la Comunidad Valenciana y
estudio de sus relaciones con parámetros
físico-químicos y operacionales.
TRABAJO FINAL DE MÁSTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL
Realizado por:
Verónica Romera Lozano
Dirigido por:
Dr. José Luis Alonso Molina
Dr. Gonzalo Cuesta Amat
VALENCIA, Septiembre 2013
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
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Agradecimientos
Lo primero dar las gracias a mis tutores Gonzalo Cuesta Amat y José Luis Alonso durante este
periodo a pesar de las dificultades que hayan tenido, muchas gracias por vuestra dedicación,
correcciones y apoyo. También destacar el ambiente de trabajo en el Instituto Universitario
del Agua y Medio Ambiente (IIAMA) donde he podido trabajar con Yolanda, Irene, Paula,
Mariela, Andrés e Inma, además de numerosas personas que han pasado y han coincidido
conmigo; como Marta, Alba, Paula y Laura entre otros, aportándome su experiencia,
consejos y sus amenas charlas en ratos difíciles.
A Andrés Zornoza por su ayuda y su disposición siempre que lo he necesitado, por su
paciencia en los ratos de trabajo y su aportación.
A la Entidad Pública de Saneamiento de Aguas Residuales de la Comunidad Valenciana
(EPSAR) por facilitar los datos para la realización de este estudio.
A mi familia por sus esfuerzos, sus ánimos y su incondicional ayuda sin la cual este trabajo no
estaría terminado.
También agradecer a Iván los momentos de apoyo mutuos, las largas charlas sobre este
tema y todo lo relacionado con él, además de sus horas acompañándome.
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Índice
1. Introducción ........................................................................................................................ 17
1.1 Las aguas residuales y su composición ................................................................................. 17
1.2 Tratamiento de aguas residuales .......................................................................................... 21
1.2.1 Fases del tratamiento .................................................................................................... 21
1.2.1.1 Tratamiento biológico ............................................................................................... 22
1.2.2 Fangos activos: .............................................................................................................. 23
1.2.3 Microbiología de los Fangos activos.............................................................................. 24
1.2.4 Problemas en sistemas de Fangos activos .................................................................... 26
1.3 Importancia de las bacterias filamentosas ............................................................................ 27
1.3.1 Género Thiothrix ........................................................................................................... 27
1.3.1.1 Descripción taxonómica de Thiothrix eikelboomii. ................................................... 31
1.3.1.2 Descripción taxonómica de Thiothrix disciformis ...................................................... 32
1.3.1.3 Descripción taxonómica de Thiothrix defluvii ........................................................... 32
1.3.1.4 Descripción taxonómica de Thiothrix fructosivorans ................................................ 32
1.3.1.5 Descripción taxonómica de Thiothrix nivea. ............................................................. 33
1.4 Identificación de morfotipos filamentosos ........................................................................... 33
1.4.1 Microscopía convencional ............................................................................................. 33
1.4.2 Técnica FISH para la identificación de bacterias filamentosas ...................................... 34
2. Objetivos ............................................................................................................................. 40
3. Material y Métodos ............................................................................................................. 42
3.1 Toma de muestras ................................................................................................................. 42
3.1.1 EDAR CARRAIXET ........................................................................................................... 42
3.1.2 EDAR CASTELLÓN DE LA PLANA .................................................................................... 43
3.1.3 EDAR DENIA-ONDARA ................................................................................................... 43
3.1.4 EDAR QUART-BENÁGER................................................................................................. 44
3.2 Muestreo ............................................................................................................................... 44
3.3 Parámetros físico-químicos y variables operacionales ......................................................... 45
3.4 Método clásico de identificación de bacterias filamentosas ................................................ 45
3.5 Técnica FISH........................................................................................................................... 45
3.5.1 Fijación y permeabilización de las muestras ................................................................. 45
3.5.2 Hibridación in situ con sondas fluorescentes marcadas con fluoróforos (FISH) ........... 48
3.5.2.1 Tratamiento de los portaobjetos cubiertos con Teflón ............................................ 48
3.5.2.2 Aplicación de las muestras a los portaobjetos .......................................................... 48
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3.5.2.3 Sondas utilizadas ....................................................................................................... 48
3.5.2.4 Hibridación “in situ” .................................................................................................. 49
3.5.2.5 Observación al microscopio ....................................................................................... 50
3.6 Análisis estadístico ................................................................................................................. 52
3.6.1 Coeficiente de correlación de Spearman. ..................................................................... 53
3.6.2 Análisis de Componentes Principales (ACP) .................................................................. 54
3.6.3 Tratamiento por ordenador .......................................................................................... 57
4. Resultados ........................................................................................................................... 59
4.1 Características morfológicas y estructurales de las bacterias filamentosas del género
Thiothrix ............................................................................................................................................. 59
4.2 Cuantificación e identificación de bacterias filamentosas del género Thiothrix ................... 62
4.2.1 Microscopia convencional ............................................................................................. 62
4.2.2 Técnica molecular FISH .................................................................................................. 63
4.3 Comparación microscopía convencional-FISH ...................................................................... 65
4.4 Análisis estadísticos entre las bacterias filamentosas del género Thiothrix y los parámetros
operacionales y físico-químicos ......................................................................................................... 72
4.4.1 Análisis Bivariante. Coeficiente de Spearman. .............................................................. 72
4.4.2 Análisis de Componentes Principales (ACP) .................................................................. 76
5. Discusión .............................................................................................................................. 82
5.1 Técnica convencional versus FISH ......................................................................................... 82
5.2 Correlaciones de Spearman ................................................................................................... 82
5.3 Análisis componentes principales ......................................................................................... 85
5.3.1 Parámetros físico-químicos del afluente ....................................................................... 85
5.3.2 Parámetros físico-químicos del Licor Mezcla ................................................................ 85
5.3.3 Parámetros físico-químicos del efluente ....................................................................... 86
5.3.4 Parámetros operacionales ............................................................................................. 86
6. Conclusiones ........................................................................................................................ 88
7. Bibliografía ........................................................................................................................... 90
8. Anexos ................................................................................................................................. 96
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Índice de Figuras
Figura 1: Esquema de las etapas de tratamiento de una EDAR con el sistema de fangos activos ....... 22
Figura 2: Fases del tratamiento. Línea de fangos (EPSAR) .................................................................... 22
Figura 3: El ciclo del azufre. (Sawyer y McCarty, 1967) ........................................................................ 27
Figura 4: Árbol filogenético del género Thiothrix. (Aruga et al., 2002) ................................................. 29
Figura 5. Árbol filogenético del género Thiothrix (Chernousova, 2009) ............................................... 31
Figura 6: Preparación del portaobjetos para visualización en microscopio de FISH ............................ 36
Figura 7: Técnica FISH con sondas 16SrDNA marcadas con fluoróforos ............................................... 37
Figura 8: Depuradora de Carraixet ........................................................................................................ 42
Figura 9: Depuradora de Castellón ........................................................................................................ 43
Figura 10: Depuradora de Denia ........................................................................................................... 43
Figura 11: Depuradora de Quart ........................................................................................................... 44
Figura 12: Protocolo de Fijación ............................................................................................................ 47
Figura 13: Recuento de Índice Filamentoso .......................................................................................... 51
Figura 14: Ejemplo de matriz ................................................................................................................ 52
Figura 15: Matrices análisis de Componentes Principales .................................................................... 56
Figura 16 A, B: A) Vista convencional, B) Vista con FISH sonda G123T, 1000X ..................................... 59
Figura 17 A, B: A) Vista convencional, B) Vista FISH sonda G2M, 1000X .............................................. 60
Figura 18 A, B y C: A) Vista convencional, B) Vista FISH y C) Superposición capas vistas a y b sonda
TFR, 1000X ............................................................................................................................................. 60
Figura 19 A, B: A) Vista Convencional, B) Vista FISH sonda TFR, 1000X ................................................ 61
Figura 20 A, B: A) Vista convencional, B) Vista FISH sonda TNI, 1000X ................................................ 61
Figura 21 A y B: A) Vista Convencional G2M, y B) FISH sonda G2M (Quart), 1000X............................. 62
Figura 22 A y B: A) Vista Convencional, B) FISH sonda TFR (Denia), 1000X .......................................... 62
Figura 23 A y B: A) Vista Convencional Thiothrix Eikelboomii, B) FISH sonda G2M (Quart) ................. 63
Figura 24 A y B: A) Vista Convencional y B) FISH sonda TNI (Castellón), 1000X ................................... 63
Figura 25 A, B y C: A) Vista Convencional, B) FISH y C) superposición de imagen FISH y Convencional
Sonda TFR. (Denia) ................................................................................................................................ 64
Figura 26: Valores IF Thiothrix, EDAR Quart. ......................................................................................... 66
Figura 27: Valores IF Thiothrix, EDAR Denia .......................................................................................... 67
Figura 28: Valores IF Thiothrix, EDAR Castellón Línea 1 ........................................................................ 67
Figura 29: Valores IF Thiothrix, EDAR Castellón; Línea 2. ...................................................................... 68
Figura 30: Valores IF Thiothrix, EDAR Carraixet, Línea 1. ...................................................................... 68
Figura 31: Valores IF Thiothrix, EDAR Carraixet; Línea 2 ....................................................................... 69
Figura 32: Valores IF Thiothrix, EDAR Quart. ......................................................................................... 69
Figura 33: Valores IF Thiothrix, EDAR Denia .......................................................................................... 70
Figura 34: Valores IF Thiothrix, EDAR Castellón Línea 1 ........................................................................ 70
Figura 35: Valores IF Thiothrix, EDAR Castellón Línea 2 ........................................................................ 70
Figura 36: Valores IF Thiothrix, EDAR Carraixet, Línea 1 ....................................................................... 71
Figura 37: Valores IF Thiothrix, EDAR Carraixet; Línea 2 ....................................................................... 71
Figura 38: ACP de las variables físico-químicas del afluente con las sondas G2M, TNI y TFR .............. 77
Figura 39: ACP de las variables físico-químicas del licor mezcla con las sondas G2M, TNI y TFR ......... 78
Figura 40: ACP de las variables físico-químicas del efluente con las sondas G2M, TNI y TFR .............. 79
Figura 41: ACP de las variables operacionales con las sondas G2M, TNI y TFR .................................... 80
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Figura 42: Vista aérea EDAR Carraixet ................................................................................................... 96
Figura 43: Vista aérea EDAR DENIA ....................................................................................................... 96
Figura 44: Vista aérea EDAR QUART ...................................................................................................... 97
Figura 45: Vista aérea EDAR CASTELLÓN ............................................................................................... 97
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Índice de Tablas
Tabla 1: Ejemplo composición de aguas residuales domésticas (% DQO) ............................................ 18
Tabla 2: Composición típica de agua residual doméstica ..................................................................... 18
Tabla 3: Límites de vertido zonas normales (MAGRAMA 2012) ........................................................... 20
Tabla 4: Límites adicionales de vertido en zonas sensibles (MAGRAMA 2012) .................................... 20
Tabla 5: Problemas en estaciones depuradoras de fangos activos: Causas y Efectos .......................... 26
Tabla 6: Sondas empleadas en la identificación de las bacterias filamentosas .................................... 49
Tabla 7: Solución de hibridación según porcentaje de formamida ...................................................... 49
Tabla 8: Solución de lavado según porcentaje de formamida .............................................................. 50
Tabla 9: Escala de valoración de organismos filamentosos .................................................................. 51
Tabla 10: Interpretación de Coeficiente de Spearman ......................................................................... 54
Tabla 11: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Carraixet
L1 ........................................................................................................................................................... 64
Tabla 12: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Carraixet
L2 ........................................................................................................................................................... 64
Tabla 13: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Castellón
L1 ........................................................................................................................................................... 65
Tabla 14: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Castellón
L2 ........................................................................................................................................................... 65
Tabla 15: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Denia . 65
Tabla 16: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Quart. 65
Tabla 17: Variables mínimos, máximos, media y desviación estándar de todas las sondas ................. 65
Tabla 18: Correlaciones Spearman de las sondas con los parámetros físico-químicos del afluente .... 73
Tabla 19: Correlaciones Spearman de las sondas con los parámetros físico-químicos del afluente
continuación .......................................................................................................................................... 73
Tabla 20: Correlaciones Spearman de las sondas con los parámetros físico-químico Licor mezcla .... 74
Tabla 21: Correlaciones Spearman de las sondas con los parámetros físico-químico Efluente .......... 75
Tabla 22: Correlaciones Spearman de las sondas con las Variables operacionales ............................. 75
Tabla 23: Matriz de componentes rotados con porcentajes de las varianzas ...................................... 76
Tabla 24: Matriz de componentes rotados con el porcentaje de la varianza, licor mezcla. ................. 78
Tabla 25: Matriz de componentes rotados del efluente con el porcentaje de la varianza .................. 79
Tabla 26: Matriz de componentes rotados de las variables operacionales, con el porcentaje de la
varianza ................................................................................................................................................. 80
Tabla 27: Relación de muestras estudiadas. L.1: Línea 1; L.2: Línea 2; L(A+B): Línea A+B; L(C+D): Línea
(C+D) ...................................................................................................................................................... 98
Tabla 28: Listado completo de los parámetros físico-químicos y las variables operacionales,
nomenclatura y ubicación en el tratamiento ........................................................................................ 99
Tabla 29: Media, desviación estándar e intervalos de las variables físico-químicas del afluente por
depuradora .......................................................................................................................................... 101
Tabla 30: Media, desviación estándar e intervalos del afluente continuación ................................... 102
Tabla 31: Media, desviación estándar e intervalos de las variables físico-químicas del licor mezcla por
depuradora .......................................................................................................................................... 103
Tabla 32: Media, desviación estándar e intervalos de las variables físico-químicas del efluente por
depuradora .......................................................................................................................................... 104
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Tabla 33: Media, desviación estándar e intervalos de las variables operacionales por depuradora . 104
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ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS
%SSVLM: Porcentaje de Sólidos suspendidos volátiles del Licor Mezcla
AGV: Ácidos Grasos Volátiles
CAGV: Carga Másica de Ácidos Grasos Volátiles
CARBO: Carbohidratos
CCARBO: Carga Másica de Carbohidratos
CM: Carga Másica
CMDBO: Carga Másica de la Demanda Biológica de Oxígeno
CMDQOs: Carga Másica de la Demanda Química de Oxígeno soluble
CNT: Carga Másica del Nitrógeno Total
CNTs: Carga Másica del Nitrógeno Total soluble
CN-NH4: Carga Másica del Nitrógeno Amoniacal
Cond: Conductividad del licor mezcla
CPT: Carga Másica del Fósforo Total
CPTs: Carga Másica del Fósforo Total Soluble
CP_PO4: Carga Másica del Fósforo como ortofosfato
CPROT: Carga Másica de Proteínas
CS: Carga Másica del sulfuro
CSO4: Carga Másica de Sulfatos
CTA: Carga Másica de Tensoactivos
DBO5: Demanda Bioquímica de Oxígeno total a los 5 días
DBOT: Demanda Bioquímica de Oxigeno total del efluente
DBOs: Demanda Bioquímica de Oxígeno soluble del efluente
DBO5/NKT: Relación Demanda Biológica de Oxígeno relacionado con el Nitrógeno Kjeldahl
DBO5/PT: Relación Demanda Biológica de Oxígeno relacionado con el Fósforo Total
DQOt: Demanda química de Oxígeno total efluente
DQOtLM: Demanda química de Oxígeno total Licor mezcla
DQOs: Demanda química de oxígeno soluble efluente
DQOs/NKTs: Relación Demanda Química de Oxígeno soluble/ Nitrógeno Kjeldahl soluble
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DQOs/PTs: Relación Demanda Química de Oxígeno soluble/ Fósforo Total soluble
DQOLM: Demandad química de oxígeno del Licor Mezcla
EDAR: Estación Depuradora de Aguas Residuales
EF: Edad del fango
EPS: Sustancias poliméricas extracelulares
EPSAR: Entidad Pública de Saneamiento de Aguas Residuales de la Comunidad Valenciana
FISH: Hibridación in situ con sondas fluorescentes
H2S: Ácido sulfhídrico
he: Habitantes equivalentes
IF: Índice de filamentos
IVF: Índice volumétrico de Fango
LM: Licor Mezcla
NKTs: Nitrógeno amoniacal Kjeldahl soluble
N_orgs: Nitrógeno Orgánico Soluble
N_orgp: Nitrógeno Orgánico Particulado
N_org: Nitrógeno Orgánico Total
NT: Nitrógeno Total
NTs: Nitrógeno Total Soluble
NTLM: Nitrógeno total del licor mezcla
NT SSVLM: Nitrógeno total de los Sólidos suspendidos volátiles del Licor Mezcla
ODb: Oxígeno disuelto en el reactor biológico bajo <0,8 ppm
ODm: Oxígeno disuelto en el reactor biológico medio 0,8-2 ppm
ODa: Oxígeno disuelto en el reactor biológico alto >2 ppm
PDQOs: Porcentaje de la Demanda Química de Oxígeno soluble en el afluente
PROT: Porteínas
P_org: Fósforo Orgánico
P_orgs: Fósforo Orgánico Soluble
P_orgp: Fósforo Orgánico Particulado
P_PO4: Fósforo relativo al ortofosfato
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PT: Fósforo total
PTs: Fósforo Total Soluble
PTLM: Fósforo total del Licor Mezcla
PT SSVLM: Fósforo total de los Sólidos suspendidos Volátiles del Licor Mezcla
rDBOf: Rendimiento de la Demanda Biológica de Oxígeno filtrada del efluente
rDBOT: Rendimiento de la Demanda Biológica de Oxígeno Total del efluente
rDQOt: Rendimiento de la Demanda Química de Oxígeno Total del efluente
rDQOs: Rendimiento de la Demanda Química de Oxígeno soluble del efluente
rSST: Rendimiento de eliminación de los Sólidos suspendidos totales
SO2: Dióxido de azufre
SO32-
: Sulfito
SO42-
: Sulfato
SSLM: Sólidos en Suspensión del Licor Mezcla
SSTefl: Sólidos Suspendidos Totales del efluente
SSVLM: Sólidos en suspensión volátiles del Licor Mezcla
Sulfu: Sulfuros
Tªr: Temperatura reactor biológico
Tensan: Tensoactivos
TRHr: Tiempo de retención hidráulico en el reactor biológico
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Resumen
Las bacterias que pertenecen al género Thiothrix se caracterizan por rasgos morfológicos
distintivos, como el crecimiento filamentoso y la acumulación de gránulos de azufre cuando
se incubaron en presencia de sulfuro o tiosulfato. Los morfotipos Thiothrix se producen en
plantas depuradoras municipales e industriales con y sin eliminación de nutrientes.
Tradicionalmente, los problemas de “Bulking” filamentoso han sido controlados por
microscopía clásica, como la observación morfológica y tinción policromática. Pocos trabajos
se han llevado a cabo para la detección de Thiothrix en muestras de EDAR con
procedimientos moleculares, tales como la hibridación in situ fluorescente (FISH). En este
estudio, se investigó varias EDAR de la Comunidad Valenciana con la técnica de FISH para
analizar la composición de las especies y sus relaciones del género Thiothrix con parámetros
físico-químicos y operativos. Las muestras de lodos activos se obtuvieron de cuatro EDAR de
la Comunidad Valenciana y se analizaron por microscopía óptica cuantitativa y FISH. En el
análisis de FISH se utilizó un conjunto de 10 sondas FISH ácidos nucleicos rRNA específicos
que cubren el género y la especie Thiothrix. La abundancia de bacterias filamentosas en las
139 muestras de lodos activados se midió de acuerdo con el método de puntuación
subjetiva de Eikelboom (2000), donde las observaciones se calificaron en una escala de 0
(ninguna) a 5 (crecimiento extensivo). Los filamentos de Thiothrix estaban presentes en los
cuatro EDAR analizadas. En 92 (66,2%) de las muestras, los filamentos de Thiothrix se
observaron con la sonda G123T. Era evidente que las poblaciones mixtas de Thiothrix sp.
estaban presentes en las muestras de lodos activos investigados, las diferencias observadas
estaban en la abundancia relativa de los diversos grupos. Estos resultados fueron apoyados
por los resultados obtenidos mediante microscopía convencional. T. eikelboomii, T. nivea y T.
fructosivorans eran comunes (IF> 3) en dos de los cuatro EDAR analizadas. No se detectó
señal de fluorescencia con las sondas G1B (T. disciformis), G3M (T. defluvii) y Meg1028 +
Meg 983 (Meganema perideroedes). El análisis de correlación de Spearman y el análisis de
componentes principales (ACP) sugirió un comportamiento diferente entre las especies
dentro del género Thiothrix. Thiothrix eikelboomii mostró una relación positiva con la
temperatura del reactor (Tªr). Por el contrario, T. fructosivorans se relacionó negativamente
con la temperatura del reactor, (Tªr). Las bacterias filamentosas T. nivea y T. fructosivorans
se asociaron con altos valores de edad del fango (EF) y valores bajos de tasa de carga másica
(CM). T. nivea mostró una relación positiva con el tiempo de retención hidráulico (TRHr) y
negativa con los carbohidratos y las proteínas del afluente. Thiothrix eikelboomii y T. nivea se
asociaron con déficit de nitrógeno y fósforo (DBO5/NT/PT).
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1. Introducción
1.1 Las aguas residuales y su composición
Las aguas residuales contienen materias sólidas o líquidas evacuadas como desechos
tras un proceso industrial, es lo que comúnmente conocemos como residuos. Estos
residuos son la consecuencia de los diversos usos del agua.
o Residuo de uso doméstico: se producen estos en la utilización de baños, cocina
y lavado, los cuales contienen detergentes, restos de alimentos y restos
sintéticos.
o Residuos por el uso humano y animal: consisten en desechos fecales y orina,
los cuales pueden transportar organismos patógenos que afectan a la salud
humana.
o Residuos Industriales Líquidos (Riles): elementos que las industrias vierten en
las redes de alcantarillado tales como; metales, productos químicos y
elementos sólidos, todos con serios efectos nocivos.
o Agua de lluvia: al derivar hacia los alcantarillados las aguas de lluvias, estás
arrastran gran cantidad de arena, hojas y ramas de árboles, pasto y otros
elementos que se combinan con los otros residuos líquidos.
Según la composición de estas aguas residuales pueden estar formadas por:
o Agua Potable: las aguas residuales se componen mayoritariamente de agua
potable. Esto es, agua convenientemente tratada para el consumo humano.
o Sólidos: en las aguas residuales se encuentran todo tipo de sólidos
distinguiéndose entre ellos los orgánicos y los inorgánicos:
o Los sólidos orgánicos son sustancias que contienen carbón, hidrógeno y
oxígeno, pudiendo alguno de estos elementos combinarse con
nitrógeno, azufre o fósforo.
o Los sólidos inorgánicos son sustancias inertes y no susceptibles de ser
degradados, designándoseles comúnmente como minerales. Dentro de
estos se incluyen arenas, aceites y sales minerales disueltas en el agua
potable y sin propiedades combustibles.
o Gases disueltos: las aguas residuales contienen pequeñas y variadas
concentraciones de gases disueltos como el oxígeno, el cual está presente en el
agua en su estado original, así como también disuelto en el aire que está en
contacto con la superficie del líquido, el anhídrido carbónico, resultante de la
descomposición de materia orgánica, el nitrógeno disuelto de la atmósfera, y el
sulfuro de hidrógeno de compuestos de azufre tanto orgánicos como
inorgánicos.
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Tabla 1: Ejemplo composición de aguas residuales domésticas (% DQO)
Componentes Henze, 1982 Tamaka et
al.; 1991 ** Narkis et al.;
1980* ***
DQO Total (g/m3) 530 259 394 (350-443) 813 (600-1180)
DQO soluble 40
Carbohidratos 12 6 57 (50-70) 36 (33-38)
Proteínas 8 12 9 (2-20) 6 (2-9)
Lípidos 10 19 27 (18-36) 14 (7-22)
Surfactantes 5 6 8
Ácidos Grasos 19 3 10 (7-10) 4 (3-5)
Ácidos húmicos 2
(6-12) 14 (8-18)
Otros orgánicos 46 49
*Cantidades y rangos de 3 ejemplo por cada tipo de agua
** Agua residual nueva (10-60 minutos), *** Agua residual antigua (6-12 horas)
Tabla 2: Composición típica de agua residual doméstica
Concentración (mg/l)
Fuerte Media Débil
Sólidos totales 1200 700 350
Sólidos disueltos totales 850 500 250
Fijos 525 300 145
Volátiles 325 200 105
Suspendidos totales 350 200 100
Fijos 75 50 30
Volátiles 275 150 70
Sólidos Sedimentables (ml/l) 20 10 5
Demanda Bioquímica de Oxígeno, 5 días 20ºC (DBO5, 20º)
400 220 110
Carbono Orgánico Total (CCT) 290 160 80
D.Q.O. (Demanda Química de Oxígeno) 1000 500 250
Nitrógeno total como N2 85 40 20
Nitrógeno Orgánico 35 15 8
Amoniaco Libre 50 25 12
Nitritos 0 0 0
Nitratos 0 0 0
Fósforo (total como P) 15 8 4
Orgánico 5 3 1
Inorgánico 10 5 3
Cianuros (*) 100 50 30
Alcalinidad (como CaCO3) (*) 200 100 50
Aceites y grasas 150 100 50
Detergentes 15 10 5
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o Microorganismos: destacan como componentes biológicos,
o Bacterias: pueden tener dos comportamientos totalmente distintos.
Beneficiosas para el sistema porque participan en la depuración, o
dañinas porque alteran los procesos de depuración y pueden ser
patógenas.
o Organismos microscópicos y macroscópicos: metazoos, protozoos; que
juegan un papel en el control de la población de bacterias libres y unidas
al flóculo.
o Virus: patógenos para los humanos.
Una EDAR es una Estación Depuradora de Aguas Residuales, que recoge el agua
residual de una población o de una industria y, después de una serie de tratamientos y
procesos la, devuelve a un cauce receptor (río, embalse, mar…).
Se distinguen dos tipos de EDAR principales: las urbanas y las industriales. Las EDAR
urbanas reciben aguas residuales mayoritariamente de una aglomeración humana.
Mientras que las industriales reciben las aguas residuales de una o varias industrias.
El agua residual urbana en la mayor parte de España está formada por la reunión de las
aguas residuales procedentes del alcantarillado municipal, de las industrias asentadas
en el casco urbano y en la mayor parte de los casos de las aguas de lluvia que son
recogidas por el alcantarillado.
La mezcla de las aguas fecales con las aguas de lluvia suelen producir problemas en
una EDAR, sobre todo en caso de tormentas, por lo que en las actuaciones urbanas
recientes se están separando las redes de aguas fecales de las redes de aguas de lluvia.
Habitualmente las autoridades que tiene encomendadas competencias
medioambientales definen primero los usos que van a tener los cauces para así
establecer las necesidades o situaciones críticas de los vertidos. Debemos distinguir,
por lo general, dos grandes líneas maestras para empezar (en España):
o La Directiva 217/ 91/CEE de la Unión Europea que establece los plazo para
construir depuradoras y los tamaños de la población de que deben contar con
una. Así mismo establece mecanismos y frecuencias de muestreo y análisis de
las aguas residuales. El control se basa en los siguientes parámetros: sólidos en
suspensión, DBO5, DQO, fósforo y nitrógeno. La transposición de la Directiva
91/271/CEE al derecho español, está contenida en el Real Decreto-Ley 11/1995,
de 28 de Diciembre (BOE núm. 312, de 30 de Diciembre), por el que se
establecen las normas aplicables al tratamiento de las aguas residuales
urbanas. Por su parte, el Real Decreto 509/1996, de 15 de Marzo (BOE núm. 77,
de 29 de Marzo) desarrolló el contenido anteriormente citado, mediante la
incorporación de los Anexos contenidos en la Directiva 91/271/CEE, que no
había sido incorporado inicialmente.
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o Los programas de aplicación de la Directiva 91/271/CEE, en España, se han
introducido mediante la aprobación del Plan Nacional de Saneamiento y
Depuración de Aguas Residuales (1995-2005) (resolución de 28 de Abril de
1995 de la Secretaría de Estado de Medio Ambiente y Vivienda, por la que se
publica el Acuerdo de Consejo de Ministros de 17 de Febrero de 1995). Existe la
trasposición a la legislación española de esta Directiva y un Plan Nacional de
Saneamiento y Depuración de Aguas Residuales.
La comisaría de Aguas correspondiente a la cuenca donde se vierte las aguas tras su
depuración, emite una autorización de vertido en la que se puede reflejar valores
límite de vertido.
La depuración consiste en la eliminación de la contaminación e impurezas contenidas
en el agua a tratar. Los procesos utilizables para depuración depende del tipo de
afluente pudiéndose estructurar en tres grandes bloques atendiendo a la naturaleza:
físicos, químicos y biológicos. Los tres se basan en la separación del agua residual en
dos fases: una contiene el agua limpia ya tratada y otra los sólidos sedimentables.
En la Comunidad Valenciana, se depuró en el año 2011 un volumen de 474 hm3/año,
que la sitúa entre las primeras regiones españolas en el cumplimiento de la Directiva
Comunitaria 271/91 sobre depuración. Al igual que en otras regiones como Cataluña se
ha implantado un Canon de Depuración (Ley 2/1992), que se factura junto al recibo del
agua potable, y se ha permitido financiar parte de las actuaciones previstas en el Plan
Director de Saneamiento (1992). El número de estaciones depuradoras de aguas
residuales (EDAR) existen en la región ascendía en el año 2011 a 460 unidades, que
ofrecían cobertura a más de 5.962.911 Habitantes Equivalente (he). Se ha
incrementado la capacidad de reducción de la carga media contaminante tratada por
las EDAR en 2011 lo que supone una reducción del 1,71% respecto a la tratada en
2010, superando la carga máxima semanal los 11.652.951 he, la cual aumenta en un
5,7 % respecto a los registrados en el año 2010. Se ha favorecido que en 2011 las
depuradoras eliminasen del agua 120.000 Tm de sólidos en suspensión y 122.000 Tm
Tabla 3: Límites de vertido zonas normales (MAGRAMA 2012)
Concentración Porcentajes de Reducción
DBO5 25 mg/l de O2 70-90 %
DQO 125 mg/l de O2 75 %
Sólidos en suspensión 35 mg/l de O2 90 %
Tabla 4: Límites adicionales de vertido en zonas sensibles (MAGRAMA 2012)
Concentración Porcentajes de Reducción
h-e<100.000 P total 2 mg/l 80 %
N Total 15 mg/l 70-80 %
h-e>100.000 P Total 1 mg/l 80 %
N Total 10 mg/l 70-80 %
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de DBO5 (materia orgánica biodegradable). Actualmente, la Comunidad Valenciana, es
una de las más avanzadas en materia de infraestructuras de reutilización, disponiendo
de 41 EDAR con tratamiento terciario o avanzado con una capacidad total de 330,9
hm3/año. Desglosando por provincias Valencia sería la de mayor aprovechamiento de
aguas depuradas con el 65% seguida de Alicante con 28% y Castellón con 7%.
1.2 Tratamiento de aguas residuales
Una EDAR comprende varias etapas de tratamiento colocadas en serie. Paralelamente
a este tratamiento, un laboratorio de análisis, se encarga de controlar la calidad del
afluente y efluente de la EDAR, así como de los parámetros de funcionamiento del
procedimiento. El grado de tratamiento requerido para un agua residual dependerá
fundamentalmente de los límites de vertido para el efluente en un determinado lecho
receptor.
1.2.1 Fases del tratamiento
En general en la bibliografía los distintos tratamientos de aguas residuales se dividen
en pretratamientos, primarios, secundarios y avanzados o terciarios (figura 1 y 2). En el
pretratamiento se eliminan los sólidos de mayor tamaño que pueden atascar o dañar
la instalación posterior así como las gravas y arenas. En el primario se elimina parte de
los sólidos suspendidos y la materia orgánica asociada a ellos, normalmente mediante
operaciones físicas como la sedimentación. El efluente del tratamiento primario
frecuentemente contiene una DBO relativamente elevada. El tratamiento de este
efluente para eliminar la materia orgánica residual y la materia suspendida se conoce
como tratamiento secundario. Este tratamiento se realiza normalmente mediante
procesos biológicos con utilización de microorganismos. El efluente del tratamiento
secundario tiene, generalmente baja DBO5 y sólidos suspendidos y puede contener
varios mg/l de O2 disuelto. Para la reutilización del agua o para el control de la
eutrofización de las aguas receptoras es necesario el tratamiento terciario, con el fin
de eliminar los sólidos suspendidos, materia orgánica y nutrientes que quedan después
del tratamiento secundario. Actualmente la distinción entre tratamiento primario,
secundario y terciario resulta bastante arbitraria dado que muchos métodos modernos
de tratamiento incluyen procesos físicos, químicos y biológicos en la misma operación.
Así mismo, cuando la eliminación de nutrientes se realiza por vía biológica, estos
procesos se suelen incluir en el tratamiento secundario, realizándose simultáneamente
la eliminación de materia orgánica y nutrientes. (Ferrer y Seco; 2010)
En el apartado 1.2.1.1 hablaremos más detenidamente del tratamiento biológico.
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Figura 1: Esquema de las etapas de tratamiento de una EDAR con el sistema de fangos activos
Figura 2: Fases del tratamiento. Línea de fangos (EPSAR)
1.2.1.1 Tratamiento biológico
En la etapa biológica de la depuración se ponen en contacto las aguas residuales con
unos microorganismos (bacterias, protozoos y metazoos). Estos crecen utilizando los
contaminantes del agua como fuente de carbono y/o como fuente de energía,
convirtiéndolos en nueva biomasa, dióxido de carbono y otros compuestos inertes
(Ferrer y Seco, 2007) que eliminan de ellas la mayor parte de la materia orgánica que
puedan contener. De la acción sobre los compuestos biodegradables los
microorganismos obtienen la energía para sus procesos vitales, como ya se ha
mencionado anteriormente y dejan como productos finales unos fangos fácilmente
sedimentables en depósitos diseñados a tal efecto y un agua depurada limpia que
puede verterse sin prejuicio para el medio ambiente.
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Además en las EDAR se han desarrollado esquemas de procesos orientados a la
nitrificación, desnitrificación y eliminación de fósforo, incluyendo el citado
anteriormente; de eliminación de materia orgánica.
1.2.2 Fangos activos:
Existen varios métodos para el tratamiento de aguas residuales sin embargo el proceso
de fangos activos se utiliza desde hace más de medio siglo y es el más extendido en la
actualidad; a partir de la observación de que cualquier agua residual, doméstica o
industrial, aireada durante cierto tiempo, reducía su contenido en materia orgánica, al
mismo tiempo que se formaba un fluido con flóculos de bacterias. La observación en el
microscopio del fluido muestra que se encuentra formado por una población
heterogénea de microorganismos, que cambia continuamente con el tiempo como
respuesta a la variación de la composición del agua residual y a las condiciones
ambientales (Soddell y Seviour, 1990)
Es imprescindible, para el buen rendimiento del proceso, que en los tanques de
aireación se produzca una buena agitación persiguiéndose dos fines. En primer lugar
que se obtenga una buena homogenización entre el agua residual y el fango activado
de tal forma que todos los microorganismos del fango obtengan alimento. En segundo
lugar mantener unas concentraciones de oxígeno disuelto lo suficientemente altas,
que permitan el metabolismo de los microorganismos que conforman el fango
activado. Para conseguir ambos fines, las cubas de aireación están dotadas de sistemas
de aireación y/o homogenización. Con este proceso conseguimos un tratamiento
aerobio que oxida la materia orgánica hasta dióxido de carbono (CO2), amoniaco (NH3),
agua (H2O) y nueva biomasa celular.
La etapa biológica de un proceso por fangos activos podemos dividirla en tres fases: los
tanques de aireación, los decantadores secundarios y la línea de recirculación. En los
tanques de aireación se realiza la mezcla entre el agua a tratar y el cultivo de
microrganismos o fango activo, por medio de difusores o aireación mecánica. Esta
mezcla, que se obtiene tras un período de agitación y oxigenación, se envía a los
decantadores secundarios en los que se produce una separación en dos fases: por un
lado la biomasa celular obtenida forma flóculos o también llamados fangos activos,
que sedimentan en el fondo de los decantadores, por el otro el agua limpia. Es un
proceso utilizado a escala mundial como tratamiento biológico secundario para aguas
residuales domésticas (Bitton et al., 1999).
Una parte de los fangos activos que quedan en la parte baja de los decantadores son
enviados de nuevo a los tanques de aireación mediante la línea de recirculación para
mantener una concentración adecuada de microorganismos, el resto de fangos se
extrae del sistema evitando una acumulación excesiva de biomasa y controlando el
tiempo de retención celular. (Knobelsdorf et al, 2005).
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1.2.3 Microbiología de los Fangos activos
El proceso de separación de los fangos activos del agua tratada es uno de los pasos
más importantes en la depuración biológica del agua residual, es por ello que tiene
especial importancia en la formación del flóculo. Éste debe tener un tamaño que le
permita soportar las turbulencias del agua y poder sedimentar posteriormente, para
obtener un sobrenadante fluido y claro.
Los microorganismos del flóculo se mantienen unidos gracias a una matriz extracelular
de naturaleza variable, que contiene material polisacárido, altos niveles de proteínas,
DNA y sustancias húmicas y fúlmicas (Kerley y Foster, 1995; Frölund et al; 1995), es lo
que se suele llamar biofloculación. Estos polímeros extracelulares (EPS); son
segregados por las denominadas bacterias formadoras de flóculos.
Centrándonos en la estructura del flóculo, está formado por microorganismos
(bacterias, hongos, protozoos y algún metazoo), materia inorgánica y orgánica (≈ 60-
90% de la misma es volátil) y su tamaño oscila entre 1 y 1000 µm. Los flóculos se unen
para formar el fango y se depositan en el fondo del tanque por sedimentación (Soddell
y Seviour, 1990). A continuación describiremos cada uno de los microorganismos que
forman la estructura del flóculo.
o En los fangos activos los microorganismos más abundantes son las bacterias
que forman el 95% de la biomasa. Principalmente intervienen en la eliminación
de materia orgánica por distintas vías y en la eliminación de nutrientes.
Además, sin las bacterias formadoras de flóculo y las bacterias filamentosas
sería imposible la sedimentación y la obtención de un efluente clarificado y de
calidad.
o El segundo grupo más numeroso son los protozoos, que componen el 5% de la
biomasa. Eliminan microorganismos patógenos de las aguas tratadas, ayudando
a clarificar el efluente y favoreciendo la biofloculación.
o Además podemos encontrar en raras ocasiones, hongos que pueden proliferar
pero que no suelen competir con las bacterias por la utilización de materia
orgánica disuelta, por tanto no los consideraremos relevantes para el proceso
de depuración.
o En los sistemas de depuración se suele atribuir a las algas el papel principal de
proporcionar oxígeno a las bacterias, para que éstas puedan participar
activamente en la eliminación de materia orgánica del agua residual (Ferrer, y
Seco 2007). Por el contrario su excesivo crecimiento puede provocar graves
problemas de atascos en las conducciones, aunque no son frecuentes en los
procesos de fangos activos.
o El último grupo son los rotíferos, que junto con los nematodos constituyen la
cima de la cadena trófica, en el sistema de fangos activos. Principalmente son
depredadores de organismos inferiores. Además los rotíferos eliminan
bacterias dispersas y contribuyen a la formación del flóculo por la secreción de
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mucus. Son indicadores del buen funcionamiento de la depuración de las aguas
tratadas. Cuando existen elevadas cantidades de rotíferos y nematodos en
nuestro sistema, será un indicador de altas edades de fango y por lo tanto de
cambios en la capacidad de depuración del fango activo.
Basándose en la observación visual y en algunas medidas físicas, se ha sugerido que
existen dos niveles de estructura en los flóculos del fango activo (Sezgin et al., 1978):
o Microestructura: la confieren procesos de agregación microbiana y
biofloculación.
o Macroestructura: la proporcionan microorganismos filamentosos. Estos
organismos forman una red o una espina dorsal dentro del flóculo en la que las
bacterias floculadoras se adhieren.
Cuando las bacterias formadoras del flóculo y las filamentosas crecen en equilibrio se
forma el flóculo ideal, que es compacto, denso, grande y que sedimenta bien,
permitiendo obtener un sobrenadante claro. Si este equilibrio no se da, aparecen
problemas de separación de los sólidos del fango activo, relacionados con la naturaleza
del flóculo; lo que se conoce comúnmente como hinchazón de fangos o “Bulking”. Un
crecimiento masivo de filamentosas que impide el acercamiento de los flóculos y
dificulta la compactación y sedimentación de los flóculos. Al contrario de lo que
pasaría sí la proporción de filamentosas fuera baja, a lo que conllevaría la aparición de
pequeños y débiles flóculos que pueden aparecer en el clarificado de las aguas “flóculo
punta de alfiler”.
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1.2.4 Problemas en sistemas de Fangos activos
El proceso de fangos activos lleva asociado una serie de fallos en la formación de la
microestructura o de la macroestructura del flóculo (Ferrer y Seco, 2007). Estos
problemas ejercen un efecto negativo sobre la calidad del efluente, que impide
alcanzar los objetivos de calidad en muchas circunstancias. A continuación en la tabla 5
podemos ver algunos de los problemas que se suelen dar con más frecuencia en las
EDAR:
Tabla 5: Problemas en estaciones depuradoras de fangos activos: Causas y Efectos
PROBLEMA CAUSA EFECTO
Crecimiento
disperso.
Los microorganismos no forman flóculos,
sino que están dispersos, formando sólo
pequeños grupos o en células aisladas.
Efluente turbio. No hay zona de sedimentación
del fango.
Limo (Gelatina)
“Bulking” viscoso
(también se ha
denominado
“bulking” no
filamentoso).
Los microorganismos aparecen entre
grandes cantidades de limo exocelular. En
casos severos este limo confiere al fango
activo una consistencia gelatinosa.
Reducción de los porcentajes de sedimentación y
compactación. En casos severos no hay
separación de sólidos y se pierde fango con el
efluente del clarificador secundario. En casos más
leves suele aparecer una espuma viscosa.
Flóculo-alfiler “Pin-
floc” o “Pinpoint
floc”.
Se forman flóculos pequeños, compactos,
tenues, toscamente esféricos. Los
mayores decantan rápidamente. Los
menores decantan lentamente.
Índice volumétrico del Fango (I.V.F.) bajo, y
efluente turbio.
Esponjamiento
“Bulking”.
Organismos filamentosos se extienden
fuera de los flóculos por la solución,
interfiriendo en la compactación y
decantación del fango activo.
I.V.F. alto, sobrenadante muy claro.
Concentración del Fango Activo Recirculado
(F.A.R.) y del Fango Activo en Exceso (F.A.E) baja.
En casos severos hay pérdidas de fango con el
efluente. El proceso de manejo de los sólidos
resulta sobrecargado hidráulicamente.
Manto
ascendente.
La desnitrificación en el clarificador
secundario libera N2 gaseoso poco soluble
que se adhiere a los flóculos de fango
activo subiéndolos a la superficie del
clarificador.
Se forma una espuma de fango activo en la
superficie del clarificador secundario.
Formación de
espumas y/o
natas.
Causado por:
Sobrenadantes no degradables
Presencia de GALO y en ocasiones de
Microthrix parvicella.
Grandes cantidades de sólidos del fango activo
flotan formando espuma en la superficie de los
elementos del tratamiento. Las espumas de
Gordonia y Microthrix son persistentes y difíciles
de eliminar mecánicamente. Se acumulan y
pueden pudrirse. Los sólidos pueden pasar al
clarificador y al efluente o derramarse de las
cubas de aireación.
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1.3 Importancia de las bacterias filamentosas
Las bacterias filamentosas aparecen en todos los tipos de EDAR con procesos de
fangos activos, siendo responsables de la mayoría de los problemas de “bulking” y
“foaming” (Jenkins et al., 2004). Más de 30 morfotipos filamentosos han sido
identificados en plantas de tratamiento de aguas residuales urbanas (Eikelboom, 2000)
y muchos más han sido detectados en plantas que reciben agua de origen industrial
(Eikelboom y Geurkink, 2002; Eikelboom, 2006).
Las bacterias filamentosas deben ser consideradas como un miembro más de la
comunidad biológica de los fangos activos que están involucradas en la degradación de
la materia orgánica.
1.3.1 Género Thiothrix
Este género pertenece a la familia Thiothrichaceae, clase Gammaproteobacteria,
acomoda un grupo importante de bacterias filamentosas relacionadas con el ciclo del
azufre (figura 3), (Eikelboom y van Buijsen, 1981; Jenkins et al., 1993; Seviour et al.,
1999). Se encuentran a menudo como grupos de bacterias filamentosas dominantes en
el fango activo, y su proliferación puede llevar a una sedimentabilidad pobre de los
flóculos (bulking).
Alimento animal
Alimento vegetal
Mat
eria
co
loid
al
Mu
erte
Bacteria anaerobia
Sulfatos
SO42-
S elemental
Proteínas vegetales.
S orgánico
Urea
So42-
Sulfitos
S02, So32-
Sulfuro
H2S
Materia orgánica
residual.
S orgánico.
Proteína animal
S orgánico
Descomposición bacteriana Anaerobia Bacteria aerobia
Oxi
dac
ión
qu
ímic
a p
arci
al
Bac
teri
a d
el a
zufr
e
Bac
teri
a A
nae
rob
ia
Oxí
gen
o
Figura 3: El ciclo del azufre. (Sawyer y McCarty, 1967)
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Los miembros del género Thiothrix, suelen ser filamentos de 0,7 – 2,6 µm de diámetro
y 0,7– 5,0 µm de longitud, son filamentos multicelulares. Producen gonidios
deslizantes al final de los filamentos. Son Gram negativo o Gram variable. No
presentan flagelos pero si pueden contener un mechón o penacho fímbrico al final de
los gonidios, pueden formar rosetas y tienen la capacidad intracelular de almacenar
gránulos de azufre (Larkin y Strohl, 1983, Williams et al., 1987). Son bacterias aeróbicas
o microaerofílicas. El rango óptimo de temperatura es de 15 - 30º; llegando a un
máximo de 32 o 37ºC; y un mínimo entre 4 - 10ºC, además presenta un rango de pH
óptimo para crecimiento entre 6,0 - 8,5. Se han aislado especies autótrofas
facultativas, mixotróficas y heterotróficas. Utilizan compuestos orgánicos simples
como sustrato para el crecimiento tanto en especies autotróficas facultativas como
mixotróficas. Algunas cepas pueden contener biopolímeros de azufre dentro de
invaginaciones de la membrana citoplasmática cuando las células están creciendo en
presencia de compuestos de azufre inorgánico reducido (Williams et al., 1987)
creciendo autotróficamente y pudiéndose comparar con las proporciones cinéticas en
aquellos organismos con crecimiento heterotrófico. En condiciones aerobias oxidan el
S2- a S0.
⁄
Esta información, combinado con el hecho de que hay otros organismos que compiten
por este sustrato, verifica que el “bulking” causado por Thiothrix, es muy común
cuando el agua residual es de origen séptico. Algunas, pero no todas las especies
necesitan este almacenamiento para después reducirlo a azufre. (Winogradsky 1888).
Las distintas especies de Thiothrix han sido encontradas en innumerables hábitat,
desde las aguas naturales que contienen sulfuros (Jones et al., 1982; McGlannan y
Makemson, 1990; Brigmon et al., 1994), sistemas de irrigación (Ford y Tucker, 1975)
hasta sistemas de fangos activos de plantas de tratamiento de aguas residuales, donde
su presencia en gran número contribuye directamente al problema de “bulking”
(Eikelboom, 1975; Williams y Unz, 1985; Williams y Unz, 1989; Brigmon et al 1994;
Tandoi et al., 1994; Wagner et al., 1994;). La implicación del género Thiothrix podría
ser la causa del “bulking” en el fango activo en las plantas de tratamiento de aguas
residuales, esta característica ha dado lugar a distintos estudios de su fisiología
(Richard et al., 1985; Williams y Unz, 1985 a, b; Tandoi et al., 1994), ultra estructura
(Williams et al., 1987; Brigmon et al., 1994b), características de crecimiento (Unz y
Williams, 1989; Williams y Unz, 1989) e interacciones con metales pesados
(Shuttleworth y Unz, 1991, 1993). (Howarth et al.; 1999)
Desde la primera descripción de Thiothrix por Winogradsky (1888), se han validado
cinco especies (Skerman et al., 1980; Howarth et al., 1999); los miembros de cada
taxón forman un grupo filogenético distinto (Howarth et al., 1999; Kanagawa et al.,
2000).
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Una de las cualidades para definir los rasgos del género Thiothrix es la capacidad de
formar rosetas. Sin embargo, algunas bacterias filamentosas como Leucothrix murcor
también pueden forman rosetas y gonidios (Williams y Unz, 1985a; Brock, 1992).
Los géneros Thiothrix y Leucothrix se han agrupado alternativamente juntos en la
familia Leucotrichaceae en base a su fisiología (Reichenbach y Dworkin, 1981; Howarth
et al., 1999). Posteriormente, Aruga et al.; 2002, (figura 4); publicaron una nueva
clasificación y corrección del árbol filogenético de Thiothrix propuesto anteriormente
por Winogradsky y Howarth.
Figura 4: Árbol filogenético del género Thiothrix. (Aruga et al., 2002)
En este estudio se encontraron diferencias filogenéticas entre el grupo T. nivea y el
tipo 021N de Eikelboom. Todas las cepas tipo 021N utilizaron varios tipos de azucares,
incluyendo glucosa, manosa, maltosa y trehalosa, mientras que los miembros del
grupo de T. nivea utilizaron pocos o ningunos de estos azucares. Los filamentos de
Eikelboom tipo 021N son muy largos (varios milímetros en longitud), mientras que los
filamentos del grupo T. nivea son de menor longitud. (Eikelboom, 1975; Williams y
Unz, 1985a; Kanagawa et al., 2000). Estas diferencias han dado lugar a la separación
del tipo 021N y T. nivea.
Además el grupo Eikelboom tipo 021N pude dividirse en tres distintos subgrupos (I al
III) en base a los datos filogenéticos. Se observó que la secuencia de 16S era similar
entre cepas del grupo III y otros dos grupos entre el 89,7 y el 91%.
Las cepas del grupo III están claramente diferenciadas del grupo I y II por su gran
longitud y la capacidad de oxidar compuestos de azufre (Kohno, 1988; Kanagawa et al.,
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30
2000).Esta diferencia entre los grupos también se aprecia en la habilidad para utilizar
glicerol y butirato que tienen las cepas del grupo III.
A parte de todo lo anterior, el grupo III se ha separado de los grupos I y II; y se ha
designado como una nueva especie del genero Thiothrix. Las cepas del grupo III son
filogenéticamente más cercanas a T. defluvii Ben 57T, designándolas con el nombre de
T. flexilis.
Las diferencias en las secuencias del gen 16S entre el grupo I y II, sugiere que las cepas
del I y las cepas del II no son miembros de la misma especie. Diferentes autores
(Stackebrandt y Goebel, 1994; Hiraishi y Ueda, 1994; Kanagawa et al., 2000),
encuentran diferencias en la utilización del lactato y el carácter del poli-β-
hidroxibutarato y la actividad catalasa. Para esta diferenciación se propone el nombre
de una nueva especie para el grupo I llamado T. disciformis.
Cinco de las cepas del grupo II, incluida T. eikelboomii AP3T, poseen la capacidad de
reducir nitrato y utilizar algunas fuentes de carbono diferentes. Las secuencias del gen
16 S rDNA mostraron similitudes del 98,5 – 98,7% entre T. eikelboomii AP3T y las otras
cuatro cepas. Estos resultados sugieren que las cinco cepas no pertenecen a una sola
especie. Sin embargo, estas diferencias filogenéticas y fenotípicas podrían no ser
definitivas en la división de las cepas en una nueva especie. Por tanto se propone la
inclusión de todas ella en el grupo II (Aruga, 2002).
En el último estudio publicado de relaciones filogenéticas (Chernousova, 2009), se
estudian la secuencias de dos cepas comparadas con las secuencias depositadas en el
banco de datos del NCBI. El análisis de estas secuencias ha revelado la elevada
similitud entre el gen hsp 60 y el de T. fructosivorans QT (91,2 y 91,5% respectivamente
para las cepas BLT y G1T). Las características genotípicas y fenotípicas descritas en ese
estudio sugieren la diferencia a nivel de especie previamente y al nivel de genero de
Thiothrix para cada una de las cepas BLT y G1T. Se propone el nombre de Thiothrix
caldifontis para la cepa G1T, G2, K2 y P y Thiothrix lacustris para la cepa BLT.
Con lo cual el árbol filogenético del género Thiothrix quedaría de la siguiente manera
(figura 5):
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Figura 5. Árbol filogenético del género Thiothrix (Chernousova, 2009)
Actualmente las sondas FISH disponibles para los diferentes grupos y especies del
género Thiothrix son: 021N y TNI (Wagner et al., 1994), y G1B, G2M, G3M y G123T
(Kanagawa et al., 2000). Sin embargo, la sonda 021N, diseñada para detectar
miembros del tipo 021N, ha hibridado con un número limitado de filamentos tipo
021N (Nielsen et al., 1998; Pernelle et al., 1998, van der Waarde et al., 1998;
Kanagawa et al., 2000).
1.3.1.1 Descripción taxonómica de Thiothrix eikelboomii.
Thiothrix eikelboomii: (ei.kel.boom’i.i. M.L. gen. n. eikelboomii de Eikelboom;
Denominada así en honor de D.H. Eikelboom, pionero en las claves de identificación
morfológicas para bacterias filamentosas del agua residual). Las células forman
filamentos multicelulares. La morfología celular en los filamentos no es constante, es
pleomórfica. Las células discoidales en la base de los filamentos puede medir 1.0 - 3.0
µm de diámetro y 0.4 - 0.7 µm de longitud. Pueden observarse nudos en los
filamentos. Gram–negativo o Gram-variable. Sin presencia de vaina. Forman rosetas en
algunas pero no en todas las cadenas de filamentos. (Howarth et al., 1999)
Se pueden observar inclusiones intracelulares de gránulos sudanofílicos y poli-β-
hidroxibutirato. El crecimiento se produce en un rango de temperatura entre 10-33ºC,
pero no suele presentar crecimiento a 37ºC. El rango de pH está comprendido entre
los 6.5 - 8.5. Reacción oxidasa positiva. No hay ningún requisito de azufre inorgánico
reducido para su crecimiento y es heterótrofa. Los gránulos de azufre se depositan en
invaginaciones de la membrana citoplasmática cuando las células crecen en presencia
de algún compuesto de azufre inorgánico reducido. Hidrolizan la gelatina. No
hidrolizan el almidón, caseína y urea. Utilizan la glucosa, fructosa, maltosa, sacarosa,
manitol, piruvato, succinato, malato, acetato, lactato y propinato como fuente de
carbón. Reducen el nitrato a nitrito.
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1.3.1.2 Descripción taxonómica de Thiothrix disciformis
Las células son filamentos celulares suavemente curvados. Los filamentos son de más
de 0,5 mm de longitud. Las colonias son como huellas dactilares. La morfología celular
en los filamentos es variable, particularmente por la longitud y en las células presentan
formas de disco u ovales. El tamaño de las células mayores va de 1,2 - 3,0 µm de
diámetro y 0,5 - 3,0 µm de longitud.
La elongación y el hinchamiento celular están siempre presentes. Los septos son
claramente visibles entre células individuales. Gram negativa. Con ausencia de vaina.
No se observan inclusiones de volutina. Los gránulos sudanófilos (PHB) son observados
en el interior celular. El crecimiento ocurre en los rangos de temperatura de 14 – 32ºC
y un rango de pH 7,0 - 7,9. La temperatura optima esta entre 25 - 30ºC. Con reacción
positiva a la oxidasa. También catalasa positivos con presencia de burbujas violetas
generadas cuando las células son expuestas a peróxido de hidrogeno. Cuando las
células están creciendo en presencia de un compuesto inorgánico de azufre reducido,
los glóbulos de azufre son depositados en invaginaciones de la membrana
citoplasmática. El azufre inorgánico reducido no es requerido para el crecimiento. La
glucosa, fructosa, manosa, sacarosa, maltosa, trehalosa, manitol, succinato, piruvato,
acetato, malato, butirato, hidroxibutirato, glutamato, glicerol y aspartato son
utilizados como fuentes de carbono. La mayoría de las cepas utilizan citrato y alanina.
No crecen con lactato, benzoato, xylosa, erititol, galactosa, lactosa, melobiosa,
rafinosa, arabinosa, ramnosa, etanol, l-propanol, sorbitol, formato, gelatina o almidón.
El crecimiento es inhibido por el 0,5 % (w/V) de cloruro sódico. No reducen el nitrato.
El contenido de DNA en G+C es de 44-45 mol%. (Aruga; 2002)
1.3.1.3 Descripción taxonómica de Thiothrix defluvii
Las células son filamentos multicelulares muy finos, similares a varillas. Las células
presentan distintos diámetros desde la base del filamento, donde miden 2,0 – 4,0 pm
de diámetro y 0,5 - 2,0 µm de longitud, mientras que las demás células del filamento
miden 1,0 - 2,0 µm de diámetro y 5,0-10 µm longitud. Las células presentan formas
irregulares, pueden ser cilíndricas u ovales (forma de barril). Generalmente son Gram-
negativas. No presentan vaina. Pueden forman rosetas y gonidios aunque estas
características no están presentes en todas las cepas. Las células pueden depositar
intracelularmente azufre elemental en presencia de compuestos reducidos de azufre
inorgánico. No presenta gránulos de volutina, pero sí gránulos de poli-β-
hidroxibutirato. El crecimiento óptimo lo presenta en el rango de temperaturas 10 - 30
ºC. Esta bacteria es de crecimiento muy lento y no ha sido posible determinar las
propiedades bioquímicas de este organismo. La cepa tipo es Thiothrix defluvii Ben57 '.
1.3.1.4 Descripción taxonómica de Thiothrix fructosivorans
Las células son varas de 1.2 – 2.5 µm y 1.2 - 2.5 µm de longitud, y forman filamentos
multicelulares. Gram negativa. No presenta flagelo pero presentan un mechón
fímbrico al final del gonidio. Presencia de vaina. Suelen forman rosetas. Las inclusiones
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volátiles, gránulos sudanofílicos y los gránulos de poli-β–hidroxibutirato se observan
en el interior de las células. El crecimiento ocurre en el rango de temperatura de 4 –
28º C y un pH de 6.5 – 8.5, pero no hay crecimiento a 33ºC. Son positivos a la oxidasa y
a la catalasa, pero a esta última débilmente. No hay ningún requisito de azufre
inorgánico reducido para su crecimiento y es heterótrofa. Se depositan los glóbulos de
azufre dentro de las invaginaciones de la membrana citoplasmática cuando las células
crecen en presencia de algún compuesto de azufre inorgánico reducido. Hidroliza la
gelatina pero no el almidón, la caseína, ni la urea. La fructosa, sacarosa, piruvato,
succinato, malato, acetato, lactato, son utilizados, como fuente de carbono. El nitrato
es reducido a nitrito. (Howarth et al., 1999)
1.3.1.5 Descripción taxonómica de Thiothrix nivea.
El análisis filogenético (Kanagawa et al., 2002) mostró claramente las diferencias entre
el grupo T. nivea y Eikelboom tipo 021N, con menos del 92.0 % de similitud en las
secuencias del gen 16S rDNA entre ellos. Todos los Eikelboom Tipo 021N utilizan varios
tipos de azúcares, incluyendo glucosa, manosa y maltosa como fuente de carbono,
mientras que los miembros del grupo T. nivea no utilizaron estos azúcares. Los
filamentos de Eikelboom Tipo 021N son muy largos y pueden alcanzar varios
milímetros de longitud, mientras los miembros de T. nivea son más cortos, alrededor
de 1 mm de longitud (Eikelboom, 1975; Williams y Unz 1985 a; Kanagawa et al., 2000;).
El grupo Eikelboom Tipo 021N forma colonias que son como huellas digitales en su
identificación, característica distinta respecto de los miembros del grupo T. nivea
(Williams y Unz, 1985 a; Kanagawa et al., 2000). El grupo Eikelboom Tipo 021N
presenta metabolismo heterótrofo, sin el requerimiento de azufre reducido, mientras
que T. nivea y T. unzii requiere azufre reducido para su crecimiento.
1.4 Identificación de morfotipos filamentosos
1.4.1 Microscopía convencional
Los métodos clásicos se basan en la observación microscópica de las muestras para
determinar las características morfológicas. Eikelboom (1975), estableció una
nomenclatura basada en la observación microscópica de las características
morfológicas, que actualizaron posteriormente otros autores (Jenkins et al., 2004)
Los caracteres morfológicos en los que se basa la clasificación de Eikelboom (1975), y
de Jenkins et al., (2004) son: presencia o ausencia de ramificaciones, movilidad, forma
del filamento (curvo, irregular, enrollado, etc.), ubicación respecto al flóculo, existencia
de crecimiento epifítico, vaina, septos, constricciones celulares, dimensiones celulares,
dimensiones del filamento, forma celular (cuadrada, rectangular, ovalada, etc.),
presencia de biopolímeros de azufre y gránulos de polifosfato, reacciones de tinción
(Gram y Neisser) y formación de rosetas y gonidios.
Los métodos convencionales son de gran ayuda para la observación de
microorganismos en plantas de tratamiento de aguas residuales, sin embargo no dan
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información fiable sobe la identidad exacta de los filamentos observados, por este
motivo, los filamentos son designados con los términos “tipo” o “morfotipo” en vez de
especie. Hoy en día se sabe que un morfotipo específico puede incluir varias especies y
también puede ocurrir lo contrario, que varios morfotipos puedan representar una
sola especie.
La identificación y cuantificación mediante las técnicas convencionales puede resultar
difícil:
o Los filamentos que se encuentran en el interior de los flóculos son difíciles de
identificar y cuantificar.
o El método convencional es subjetivo y depende del nivel de entrenamiento y
de la experiencia del que realiza la cuantificación e identificación.
o Estructura abierta de los flóculos.
o Elevada población de filamentos.
o Una misma especie puede mostrar polimorfismos o diferentes especies parecer
iguales.
Los métodos clásicos complementan a las técnicas moleculares ya que proporcionan
información de interés sobre las características del flóculo y la presencia de protozoos
y otros microorganismos asociados. La microscopía convencional es considerada una
herramienta indispensable para el control del proceso de depuración pero a nivel
microbiológico realmente solo unas pocas bacterias filamentosas han podido ser
identificadas según sus características morfológicas, por ello actualmente se sabe que
la identificación de las bacterias del fango activo no puede llevarse a cabo utilizando
sólo el método convencional (Nielsen et al., 2009).
1.4.2 Técnica FISH para la identificación de bacterias filamentosas
Los métodos moleculares han sido utilizados para la identificación y cuantificación de
microorganismos filamentosos (Blackall, 1994; Wagner et al., 1994; Bradford et al.,
1996; Erhart et al., 1997; Kanagawa et al., 2000;), en particular la técnica de
hibridación in situ con sondas 16S DNA marcadas con fluoróforos (FISH) es considerada
como la más apropiada para una correcta identificación de las bacterias filamentosas
en las muestras de fangos activos (Nielsen et al., 2009).
La mayoría de los morfotipos filamentosos de Eikelboom no han sido nombrados
siguiendo las reglas del Código Internacional de Nomenclatura de Procariotas y
muchos reciben una identificación alfanumérica. Ello se debe principalmente a que
muchos de estos microorganismos muestran una morfología celular diferente a la que
presentan en los fangos activos. Esta situación está cambiando gracias al empleo de
técnicas moleculares de caracterización y secuenciación del gen 16S rDNA, que
empiezan a clarificar la posición taxonómica de los morfotipos de bacterias
filamentosas.
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La técnica FISH ha sido una técnica común para la detección e identificación de
microorganismos en diferentes ambientes microbianos, en los que se incluyen
comunidades de bacterias como las presentes en los sistemas biológicos de
depuración con fangos activos (Amann et al., 1995).
Las técnicas de identificación moleculares se basan en nuevas herramientas
moleculares, que hacen posible tanto la determinación de la composición de
comunidades microbianas, como la detección y cuantificación de especies dentro de
las comunidades microbianas. Las técnicas moleculares más utilizadas en estos
estudios de diversidad microbiana a nivel genético, son aquellas basadas en la
amplificación y secuenciación del gen 16S, que codifica para la subunidad ribosómica
bacteriana (y su equivalente en eucariotas, 18S rRNA).
El ARN ribosómico 16S (o el gen que lo codifica) es la macromolécula más ampliamente
utilizada en estudios de filogenia y taxonomía bacterianas. Su aplicación como
cronómetro molecular fue propuesta por Carl Woese (Universidad de Illinois) a
principios de la década de 1970.
Aunque existen cronómetros moleculares alternativos al rRNA 16S, hasta el momento
ninguno ha conseguido sustituirle. De hecho, esta macromolécula presenta una serie
de características, en base a las cuales fue considerado como cronómetro molecular
definitivo (Woese, 1987):
1- Se trata de una molécula presente en todas las bacterias actuales. Constituye,
por tanto una diana universal para su identificación.
2- Su estructura y función han permanecido constantes durante un tiempo muy
prolongado, de modo que las alteraciones en la secuencia reflejan
probablemente cambios aleatorios.
3- Los cambios ocurren de manera suficientemente lenta, como para aportar
información acerca de todos los procariotas y, junto con las variaciones en los
rRNA 16S, a lo largo de toda la escala evolutiva. Los rRNA de la subunidad
pequeña contiene, sin embargo, suficiente variabilidad para diferenciar no sólo
los organismo más alejados, sino también los más próximos.
4- El tamaño relativamente largo de los rRNA 16S (1.500 nucleótidos) minimiza las
fluctuaciones estadísticas (tamaño adecuado como para proporcionar
información suficiente, con un coste asumible).
5- La conservación en estructura secundaria puede servir de ayuda en las
comparaciones, aportando una base para el alineamiento preciso.
6- Dado que resulta relativamente fácil secuenciar los rDNA 16S existen bases de
datos amplias, en continuo crecimiento.
Esta técnica se basa en preparar cortas secuencias de DNA de una sola hebra, llamadas
sondas, que son complementarias de las secuencias de RNA que se quieren identificar.
Estas sondas pueden unirse con una secuencia de RNA complementaria (16S rRNA o 23
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rRNA y se produce un híbrido DNA: RNA. La sonda está marcada con moléculas
fluorescente (por ejemplo fluoresceína o rodamina) de forma que los híbridos
formados sean fácilmente detectables con un microscopio de epifluorescencia. La
especificidad de las sondas puede ser ajustada a diferentes niveles, taxonómicos como
son dominio, phylum, clase, familia, género y especie, para la identificación de las
bacterias en sus diferentes comunidades naturales (Amann et al.; 1995) la hibridación
directa de la bacteria diana con una sonda complementaria de una región del gen 16S
o 23S rRNA. El elevado número de moléculas de rRNA (103 – 105) es una ventaja en la
aplicación de la técnica de hibridación al aumentar su sensibilidad (Amann, 1994). Una
secuencia de DNA (sonda) puede unirse con una secuencia de RNA complementaria
(16SrRNA o 23SrRNA) y se produce un híbrido DNA: RNA. La sonda está marcada con
una molécula fluorescente de tal forma que los híbridos formados se pueden detectar
fácilmente con un microscopio de epifluorescencia.
Las sondas deben ser lo suficientemente específicas para unirse únicamente a la
bacteria que se quiere identificar. Para asegurar la especificidad, los dos parámetros
determinantes son la temperatura y la concentración de formamida en el tampón de
hibridación (Alonso et al., 2009). La formamida hace que disminuya la temperatura de
unión de las sondas mediante el debilitamiento de los puentes de hidrógeno, es decir,
disminuye la temperatura de fusión de los híbridos DNA: RNA en 0,72 º C por cada 1%
de formamida utilizada y permite realizar la hibridación a 46 º C (Alonso et al., 2009).
La sonda que se utiliza en la técnica FISH está formada por una pequeña secuencia de
nucleótidos de cadena sencilla, en cuyo extremo, normalmente 5’, se marca con un
fluoróforo, como puede ser rodamina o fluoresceína.
En las figuras 6 y 7 se muestran esquemas simplificados del proceso de hibridación in
situ con sondas 16SrDNA con fluoróforos.
Figura 6: Preparación del portaobjetos para visualización en microscopio de FISH
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Figura 7: Técnica FISH con sondas 16SrDNA marcadas con fluoróforos
La técnica de hibridación con sondas marcadas con fluoróforos in situ (FISH), presenta
una serie de ventajas frente a otras técnicas de detección e identificación. Las cuales se
comentan a continuación:
o No parecen existir sustancias inhibidoras que interfieren en la reacción de
hibridación.
o Puede determinar directamente la abundancia de los microorganismos
detectados.
o No necesita cultivo previo de la bacteria ni la extracción de los ácidos nucleicos
(Nielsen et al., 2009).
o Las preparaciones pueden conservarse durante mucho tiempo (años).
o Se mantiene la morfología de la célula (Nielsen et al., 2009).
o La hibridación inespecífica con otros microorganismos presentes en la muestra
no es habitual, por lo que no se dan resultados falsos positivos.
o La especificidad de las sondas permite detectar varias especies o genes en una
misma muestra, utilizando una sonda para cada especie, género o grupo,
marcada con fluoróforos distintos, para la identificación de las bacterias en sus
diferentes comunidades naturales.
o Puede utilizarse junto con la tinción DAPI para determinar si las células
estudiadas están vivas o no, muy útil para la monitorización del estado de la
microbiota durante la adicción de tóxicos para el control del “bulking” y del
“foaming”.
Además de todas las ventajas de la técnica molecular FISH anteriormente citadas, se
aprecian ciertas limitaciones:
o La identificación a través de FISH es solo posible si la sonda requerida está
disponible.
o Se han desarrollado sondas para varias especies filamentosas importantes,
pero aún no para todas las especies que puedan aparecer en el fango activo.
o Podría afectar las características morfológicas de las especies filamentosas.
o Su mayor limitación reside en la sensibilidad de la penetración de la propia
sonda y de la matriz donde estemos hibridando, que depende del contenido de
ribosomas existente en las bacterias filamentosas, si este contenido es bajo no
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darán una señal fluorescente clara con la sonda; en muchos casos es necesario
un tratamiento previo.
o Puede ocurrir que una sonda específica para una especie de una señal
fluorescente con otras especies, si sus secuencias de rRNA son muy parecidas.
Tales resultados positivos falsos pueden ser prevenidos mediante la aplicación
de sondas competidoras.
o La accesibilidad de la sonda rRNA es distinta según la molécula de rRNA de que
se trate y la zona del mismo de la que sea complementaria, lo que hay que
tener en cuenta para el diseño de la sonda.
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2. Objetivos
El control efectivo de muchos de los problemas en el proceso de depuración se basa en
la identificación de los microrganismos que lo causan y en la eliminación de las
condiciones que favorecen su crecimiento. El crecimiento excesivo de las bacterias
filamentosas puede interferir en el correcto funcionamiento del sistema de fangos
activos produciendo problemas como la deficiente sedimentación del fango o la
formación de espumas.
El principal objetivo de este trabajo es la identificación y cuantificación de
determinados morfotipos filamentosos del género Thiothrix, presentes en los fangos
activos de varias EDAR de la Comunidad Valenciana y, estudiar las posibles relaciones
con parámetros físico-químicos y operacionales.
Para todo ello, en el presente trabajo se plantean los siguientes objetivos específicos:
o Aplicar la técnica FISH a muestras procedentes de 4 plantas depuradoras de
aguas residuales urbanas con sistemas de fangos activos de la Comunidad
Valenciana (Carraixet, Castellón, Denia y Quart Benàger) para detectar la
presencia de los morfotipos filamentosos Thiothrix disciformis, T. eikelboomii,
T. defluvii, T. nivea, T. fructosivorans y Candidataus “Meganema perideroedes”
morfotipo 021N
o Determinar la abundancia de siguientes especies del género Thiothrix: T.
disciformis, T. eikelboomii, T. defluvii, T. nivea, T. fructosivorans y Candidataus
“Meganema perideroedes” morfotipo 021N mediante el criterio subjetivo de
Eikelboom 2000, 2006.
o Comparar la abundancia de los morfotipos Thiothrix disciformis, T. eikelboomii,
T. defluvii, T. nivea, T. fructosivorans y Candidataus “Meganema perideroedes”
morfotipo 021N obtenida con dos técnicas de detección diferentes:
microscopía convencional y la técnica molecular FISH.
o Estudiar las características morfológicas y estructurales de las bacterias
filamentosas detectadas.
o Estudiar las relaciones existentes entre los parámetros operacionales y físico-
químicos de las EDAR y la abundancia de las diferentes especies de Thiothrix
causadores de “bulking”.
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3. Material y Métodos
3.1 Toma de muestras
Se tomaron las muestras del licor mezcla de cuatro EDAR de la Comunidad Valenciana
con una frecuencia quincenal durante un año. En el Anexo I podemos encontrar
imágenes aéreas de las 4 EDAR de estudio. A continuación se muestran los esquemas
de funcionamiento y algunos datos de interés de las depuradoras elegidas para el
presente estudio.
3.1.1 EDAR CARRAIXET
La planta de depuración Cuenca del Carraixet se ubica en la comarca de La Ribera Alta,
en el municipio de Alzira, en la Comunidad Valenciana, es capaz de tratar agua
procedente de 4 municipios consiguiendo unos rendimientos del 98 % para sólidos en
suspensión (SS), 95 % de DBO5 y del 91 % para DQO, según la información publicada
por la EPSAR en el año 2012.
Cuenta con dos líneas aerobias de tratamiento biológico, línea A+B y línea C+D, ambas
con una zona anaerobia (figura 8.). El caudal tratado es de 33.584 m3/d abasteciendo a
una población de 96.230 habitantes equivalentes (he).
Figura 8: Depuradora de Carraixet
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3.1.2 EDAR CASTELLÓN DE LA PLANA
La EDAR de Castellón de la Plana se encuentra localizada en la comarca de la Plana Alta
en la provincia de Castellón. Para el año 2012 el caudal tratado era de 43.220 m3/d,
prestando servicio a 193.773 habitantes equivalentes (he). Los rendimientos de
eliminación son los siguientes: 95 % para SS, 95% para DBO5 y 91 % para DQO (Figura
9)
3.1.3 EDAR DENIA-ONDARA
La EDAR Denia-Ondara-Pedreguer se ubica en la comarca de La Marina Alta, en la
provincia de Alicante. Da servicio a los municipios de Denia, Ondara y Pedreguer. Trata
un caudal de 17.089 m3/d y abastece a una población de 45.152 según datos del año
2012 publicados por la EPSAR. El tratamiento consta; (figura 10) de una sola línea con
proceso de oxidación total y tiene un rendimiento de eliminación del 97% para sólidos
en suspensión, 95% de DBO5 y 93% de DQO.
Figura 10: Depuradora de Denia
Figura 9: Depuradora de Castellón
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3.1.4 EDAR QUART-BENÁGER
La depuradora de Quart-Benàger se ubica en la comarca valenciana de L’Horta Oest.
Da servicio a los municipios de Alaquás, Aldaia, Manises, Mislata, Quart de Poblet,
Valencia y Xirivella. El tratamiento biológico tiene lugar en cuatro reactores paralelos
anóxico-aerobio de geometría rectangular (figura 11). Según datos de 2012, trata un
caudal de 35.903 m3/d, abastece a una población de 166.942 y tiene unos
rendimientos de eliminación del 98% para SS, 98% para DBO5 y 95% para DQO.
Figura 11: Depuradora de Quart
3.2 Muestreo
El muestreo se realizó siempre en el mismo punto, generalmente a la salida del reactor
biológico. Se tomaron 1,5 l de licor mezcla con un recipiente de plástico, de estas
muestras se tomaron unas alícuotas para su fijación que se realizó antes de las 24
horas.
Los muestreos se realizaron cada quince días durante el año 2009. El muestreo
comenzó en Diciembre de 2008 y finalizó en Diciembre de 2009. Las muestras fueron
simples realizadas de forma puntual.
Para el transporte y conservación de las muestras fue necesario mantener las
condiciones aerobias de la muestra, lo cual se logró con la cámara de aire que queda
sobre el licor mezcla en el recipiente de recogida.
Las EDAR estudiadas tratan aguas de origen doméstico, aunque la planta de
tratamiento de Quart-Benàger recibe además aguas industriales.
El número de líneas de tratamiento independientes se distribuye de la siguiente
manera Quart-Benàger y Denia con una línea cada una, total de muestras a analizar 24.
Las depuradoras de Carraixet y Castellón contaban con dos líneas independientes cada
una; por lo tanto se tomaron 46 muestras en cada una de las EDAR con dos líneas. El
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cómputo total de muestras fue de 140 muestras. En el Anexo II encontramos la
relación de fechas de muestreo por depuradora estudiada.
3.3 Parámetros físico-químicos y variables operacionales
En las tablas expuestas en el anexo III se encuentran los parámetros físico-químicos
analizados, su nomenclatura y unidades en los que se han utilizado y en el anexo IV las
tablas con todos los parámetros donde aparecen los rangos, media y desviación
estándar en cada depuradora. Estos parámetros se determinaron siguiendo los
procedimientos normalizados (APHA, 2005) en las muestras de las distintas EDAR. El
Índice Volumétrico de Fango (IVF) se calculó según el procedimiento descrito por
Jenkins et al., 2004.
En el presente trabajo los valores de oxígeno disuelto (OD) en el reactor fueron
distribuidos en tres intervalos: < 0,8 oxígeno disuelto bajo (ODb), 0,8 – 2 oxígeno
disuelto medio (ODm) y > 2 ppm oxígeno disuelto alto (ODa). Anexo IV, tabla 33.
3.4 Método clásico de identificación de bacterias filamentosas
El método clásico de identificación de microorganismos filamentosos se basa en el
examen microscópico, principalmente a 1000X y con óptica de contraste de fases, de
una serie de características morfológicas y estructurales de los filamentos. Los
caracteres morfológicos en los que se basa la clasificación son los anteriormente
citados y descritos por Eikelboom (1975), y Jenkins et al., (2004).
La cuantificación con el método clásico sólo se puede hacer de modo indicativo, ya que
los microorganismos filamentos que se encuentran en el interior del flóculo pueden
pasar inadvertidos, y además el método tradicional es subjetivo y depende del nivel de
entrenamiento y experiencia del personal que realiza la identificación y/o
cuantificación.
3.5 Técnica FISH
3.5.1 Fijación y permeabilización de las muestras
Para llevar a cabo la técnica FISH fue necesario fijar las bacterias. Este primer paso es
necesario para que la estructura celular se mantenga rígida y estática y se conserve su
morfología favoreciendo la penetración de las sondas.
Para la fijación de las muestras se utilizó un reactivo diferente según la pared celular
de la bacteria (Gram + o Gram -). En el caso de las bacterias de este estudio, Gram - la
permeabilización se realizó con paraformaldehido. Una vez fijadas las muestras, se
conservaron a -20ºC.
Los pasos y reactivos para la fijación y permeabilización se describen en detalle a
continuación para bacterias Gram -.
o Lavar 1 ml de flóculo con 500 µl de PBS 1X (7000 r.p.m durante 3 minutos)
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o Añadir 3 vol de PFA (750 µl) a 1 vol (250 µl) de muestra y mantener a 4ºC
durante 3 h.
o Concentrar las células por centrifugación (7000 r.p.m durante 3 minutos) y
eliminar fijador
o Lavar las células con PBS 1X (500 µl)
o Resuspender las células con PBS 1X (500 µl) y etanol absoluto (500 µl) y
mantener a -20ºC
En la figura 12 se describen los pasos a realizar.
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Guardar a –20ºC
Resuspender 500µl
PBS 1X + 500µl EtOH
abs
Gram +
1 ml muestra
Lavar 1000 µl PBS 1X
Centrifugar 3 min 7000
rpm
Centrifugar 3 min 7000
rpm
Gram -
Centrifugar 3 min 7000
rpm
1 ml muestra
Lavar 1000 µl PBS 1X
Centrifugar 3 min 7000
rpm
Resuspender 250µl PBS
1X + 750µl PFA durante
3h a 4ºC
Centrifugar 3 min 7000
rpm
Resuspender 500µl PBS 1X
Resuspender 500µl
PBS 1X + 500µl
EtOH abs
Centrifugar 3 min 7000
rpm
Resuspender
500µl PBS 1X +
500µl EtOH abs
Centrifugar 3 min 7000
rpm
Mycolata
Centrifugar 3 min 7000
rpm
Resuspender 500µl PBS 1X
1 ml muestra
Lavar 1000 µl PBS 1X
Centrifugar 3 min 7000
rpm
Centrifugar 3 min 7000
rpm
Resuspender 250µl PBS
1X + 750µl PFA durante
1 min
Fijación
Figura 12: Protocolo de Fijación
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3.5.2 Hibridación in situ con sondas fluorescentes marcadas con fluoróforos (FISH)
Para la hibridación de las muestras describiremos detalladamente todos los pasos a
seguir. En el Anexo V, se describe la preparación de los reactivos para la técnica de
hibridación.
3.5.2.1 Tratamiento de los portaobjetos cubiertos con Teflón
Todos los portaobjetos utilizados en la técnica FISH se han de lavar y desengrasar.
Previamente a su empleo se les debe dar un baño en una solución de gelatina y de
sulfato potásico y cromo para favorecer la adhesión de la muestra. A continuación se
detallan los pasos a seguir para el tratamiento de los portaobjetos.
o Lavar con solución de limpieza
o Enjuagar con agua destilada
o Secar al aire (dejar escurrir todo 1 día, protegiendo del polvo ambiental
cubriendo los portas con papel aluminio)
o Cubrir con gelatina por inmersión en la solución 0,1% con cromato sulfato
potásico 0,01% (preparada en el momento, temperatura 60ºC)
o Secar al aire
3.5.2.2 Aplicación de las muestras a los portaobjetos
Los pasos para la aplicación de las muestras se describen a continuación:
o Poner un volumen entre 3 y 5 µl de muestra fijada en el portaobjetos FISH. En
este caso se ha colocado un volumen de 5 µl en cada pocillo del portaobjetos
o Secar al aire
o Deshidratar en etanol 50% durante 3 minutos por inmersión
o Deshidratar en etanol 80% durante 3 minutos por inmersión
o Deshidratar en etanol 100% durante 3 minutos por inmersión
o Secar al aire
3.5.2.3 Sondas utilizadas
Las diferentes sondas utilizadas en las hibridaciones, así como su secuencia de
nucleótidos del extremo 5’ al 3’ y el porcentaje de formamida óptimo a utilizar se
muestran en la tabla 6.
Las sondas marcadas con el fluoróforo TAMRA (rodamina, cuya longitud de onda de
absorción es de 565 nm y de emisión de 580 nm, rojo) fueron las siguientes: G123T y
G2M, Meg983 y Meg1028.
Las sondas marcadas con el fluoróforo FAM (Fluoresceína) cuya longitud de onda de
absorción es de 494 nm y de emisión de 518 nm (verde):G1B, G3M, TNI y TFR.
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Tabla 6: Sondas empleadas en la identificación de las bacterias filamentosas
Especificidad Sonda Secuencia (5’ – 3’) %FA Referencia
Thiothrix G123T CCTTCCGATCTCTATGCA 40 Kanagawa et al., (2000)
Comp. Thiothrix G123TC CCTTCCGATCTTCTACGCA 40 Kanagawa et al., (2000)
T. Disciformis G1B TGTGTTCGAGTTCCTTGC 30 Kanagawa et al., (2000)
T. eikelboomii G2M GCACCACCGACCCCTTAG 35 Kanagawa et al., (2000)
T. defluvii G3M CTCAGGGATTCCTGCCAT 30 Kanagawa et al., (2000)
T. nívea TNI CTCCTCTCCCACATTCTA 45 Wagner et al., (1994)
T. fructosivorans TFR CTCCTCTCCCACACTCTA 35 Kim et al., (1994)
Comp. TNI y TFR TEI TCCCTCTCCCACATTCTA 45/35 Kim et al., (2002)
“Meganema perideroedes”
Meg 983 CGGGATGTCAAAAGGTGG 35 Kragelund et al., (2005)
“M. perideroedes” Meg 1028
CTGTCACCGAGTCCCTTGC 35 Kragelund et al., (2005)
3.5.2.4 Hibridación “in situ”
Los pasos y reactivos del proceso de hibridación se describen en detalle a
continuación:
o En primer lugar se prepara la solución de hibridación con formamida en un
microtubo de 2 ml. La cantidad de reactivos dependerá del porcentaje óptimo
de formamida que a su vez dependerá de la sonda utilizada (tabla 7)
Tabla 7: Solución de hibridación según porcentaje de formamida
Reactivo % de Formamida
10 20 25 30 35 40 45
NaCl 5M 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl
HCL-Tris 1M 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl
Formamida 200 µl 400 µl 500 µl 600 µl 700 µl 800 µl 900 µl
H2O MiliQ 1398 µl 1198 µl 1098 µl 988 µl 898 µl 798 µl 698 µl
SDS 10% 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl
Volumen Final 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl
o Poner 9 µl de la solución de hibridación + 1 µl de sonda en cada pocillo y
repartir homogéneamente por todo el campo. En el caso de que junto con la
sonda se tenga que añadir sondas competidoras se deberá hacer una
combinación de todos ellos con la sonda hasta alcanzar la cantidad total de 1 µl
de sonda. A partir de la puesta en contacto con la sonda hay que evitar el
contacto con la luz para evitar la pérdida de fluorescencia del fluoróforo
o Poner un trozo de papel celulosa dentro de un tubo Falcón de 50 ml y verter
sobre el papel la solución de hibridación restante sin sonda, este paso es
necesario para crear una atmósfera húmeda en el tubo Falcón y favorecer la
hibridación.
o Introducir el portaobjetos en posición horizontal dentro del tubo Falcón de 50
ml
o Incubar a 46ºC durante al menos 1 hora y 30 minutos
o Para eliminar el exceso de sonda que no ha hibridado y la formamida de los
portaobjetos se prepara 50 ml de solución de lavado mezclando los reactivos
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presentes en la siguiente tabla dependiendo del porcentaje de formamida que
ha sido utilizado en la solución de hibridación (Tabla 8)
Tabla 8: Solución de lavado según porcentaje de formamida
Reactivo % de Formamida
10 20 25 30 35 40 45
NaCl 5M 4500 µl 2150 µl 1490 µl 1020 µl 700 µl 460 µl 300 µl
EDTA 0,5 M - 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl
HCL-TRIS 1M 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl
H2O MiliQ 44,45 ml 46,3 ml 47,94 ml 47,43 ml 47,75 ml 47,06 ml 48,15 ml
SDS 10% 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl
Volumen Final 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml l
o Sacar de la estufa y rápidamente lavar los portaobjetos e introducirlos dentro
del tubo con la solución de lavado, los tubos se forran con papel de aluminio
para protegerlos de la luz. Incubar en un baño a 48ºC durante 15 – 20 minutos.
o Lavar con agua Mili-Q
o Secar al aire en la oscuridad
o Si no se observa al microscopio inmediatamente, guardar el porta a -20ºC
3.5.2.5 Observación al microscopio
Una vez realizada la hibridación in situ con las sondas específicas se procede a la
observación con el microscopio y a la toma de imágenes.
A la hora de observar las muestras con el microscopio de epifluorescencia se precisa
utilizar un líquido de montaje (Vectashield) para evitar la pérdida de fluorescencia. Se
añaden unas gotas de este líquido en la zona central del portaobjetos y se coloca
encima un cubreobjetos, con ayuda de una punta se ejerce una pequeña presión sobre
éste para que el líquido de montaje se extienda de forma uniforme por toda la
muestra, a continuación se observa el pocillo a 600X.
El microscopio utilizado para la observación de las muestra ha sido un Olimpus BX 50.
Las fotografías en color se realizaron con una cámara digital Olimpus DP 10 acoplada al
microscopio con los filtros: U-MWIB (Fluoresceína, FAM) y U-MWIG (Rodamina,
TAMRA)
Para la cuantificación de los microorganismos se realizó un barrido de todos los
pocillos del portaobjetos con el microscopio de epifluorescencia una vez realizado el
proceso de hibridación in situ.
Se realizó la valoración de la abundancia de las bacterias filamentosas utilizando la
escala subjetiva de Eikelboom (2000, 2006).
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La escala de valoración de los organismos filamentos se muestra en la tabla 9.
Tabla 9: Escala de valoración de organismos filamentosos
Índice filamento
Abundancia Descripción
0 “Ninguno” Ningún filamento presente
1 “Pocos” Pocos filamentos y de forma ocasional en el flóculo
2 “Algunos” Filamentos en aproximadamente la mitad de los flóculos
3 “Comunes” Filamentos en todos los flóculos con baja densidad (1-5/flóculos)
4 “Muy comunes” Filamentos en todos los flóculos con densidad media(5-20/flóculos)
5 “Abundantes” Filamentos en todos los flóculos con alta densidad (>20/flóculos)
En la figura 13 se muestra la escala utilizada para valorar la abundancia de las bacterias
filamentosas.
Figura 13: Recuento de Índice Filamentoso
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3.6 Análisis estadístico
Para el análisis estadístico de todas estas variables medidas se utilizó el paquete
informático IBM Statistics SPSS versión 19.
En el análisis primeramente se realizó un resumen estadístico donde se tabularon los
valores mínimos, máximos, la media y la desviación estándar de cada una de las
variables operacionales, variables físico-químicas del afluente, del efluente y del licor
mezcla presentes en los fangos (Anexo IV).
Se integraron todo los datos de las cuatro depuradoras para obtener una matriz
general con un elevado número de muestras (140) y realizar primero un análisis
preliminar bivariante. Este análisis bivariante sirve para establecer la asociación
existente entre la abundancia de los distintos morfotipos filamentosos con las
variables del proceso de depuración, además de servir como análisis exploratorio junto
con el análisis de componentes principales.
Este primer análisis consistió en el cálculo del coeficiente de Spearman siendo un
análisis de medida no paramétrica sin hacer ninguna suposición de la ordenación de las
variables.
En el análisis estadístico se emplearon 140 variables medidas; habiendo sido
transformadas previamente para conseguir una distribución normal, (Esteban et al.,
1991) con la consiguiente transformación logarítmica, “LN (variable+1)”, dando lugar a
una matriz semejante a la que se muestra en la figura 14 de forma esquemática el
tratamiento estadístico de los datos.
Figura 14: Ejemplo de matriz
Físico-químicas Operacionales
Mu
estr
as 1
40
Afluente Efluente
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Seguidamente se empleó un análisis multivariante mediante la realización de un
Análisis de Componentes Principales (ACP) para permitir la síntesis de la información
contenida en una base de datos de gran dimensión en un nuevo subespacio de menor
dimensión (Aguado, 2004). Esta técnica debe usarse como una técnica exploratoria y
debe ayudar al investigador a que adquiera cierta percepción respecto a un conjunto
de datos. En la mayoría de los libros sobre métodos multivariados sugieren que los
objetivos principales de un ACP son:
- Reducir la dimensionalidad del conjunto de datos
- Identificar nuevas variables significativas subyacentes. (estas nuevas variables
son útiles por el cribado de datos, la verificación de la hipótesis y la verificación
de agrupaciones.)
A continuación se detallan cada uno de los métodos estadísticos realizados.
3.6.1 Coeficiente de correlación de Spearman.
El coeficiente de correlación de Spearman o por rangos, también llamado rs, es una
medida no paramétrica de asociación que requiere que ambas variables sean
aleatorias continuas, de forma que los objetos o individuos puedan colocarse en series
ordenadas (Siegel, 1983).
El Coeficiente de Spearman utiliza los números de orden (rangos) de cada grupo de
variables y compara dichos rangos (Conover, 1998). Si la asociación lineal entre ambas
variables fuera perfecta, esperaríamos que el rango de la variable X fuera exactamente
igual al rango de la variable Y, por lo tanto el coeficiente se calcula en base a las
diferencias registradas en los rangos entre ambas variables, esperando que estas
diferencias fueran cero. Conforme mayores son las diferencias observadas en las
ordenaciones de ambas variables, más se alejaría de la relación de ser perfecta. Para
evitar que las diferencias positivas anularan las diferencias negativas y comportaran la
toma de decisiones equivocadas, el estadístico se calcula en función de la suma de las
diferencias elevadas al cuadrado.
Este coeficiente es recomendable utilizarlo cuando los datos presentan valores
externos que afectan al coeficiente de Pearson o ante distribuciones no normales.
La fórmula para calcular el Coeficiente de Spearman es la siguiente:
∑
Dónde:
di: es la diferencia entre los rangos de X e Y,
N: es el número de valores de la muestra.
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Los valores de los rangos se colocan según el orden numérico de los datos de la
variable estudiada.
Su interpretación es semejante al coeficiente de correlación de Pearson. Para índices
cercanos a +1 la asociación es positiva, para valores cercanos a -1 la asociación es
negativa y 0 significa que no hay correlación entre las variables. (Siegel, 1983).
El coeficiente evalúa si existe una relación lineal, creciente o decreciente, entre ambas
variables. El coeficiente de correlación de Spearman únicamente puede adoptar
valores comprendidos entre -1 y 1, identificando el valor de -1 una relación
decreciente perfecta; lo que indica una asociación negativa, mientras que por el
contrario, el valor 1 identificaría una relación lineal creciente perfecta; o asociación
positiva. Si este valor es 0 significará que no hay correlación entre las variables. (Siegel,
1983).
Intuitivamente, el coeficiente de correlación debe examinar la relación lineal de dos
variables por lo que imaginemos que si la relación es muy evidente, los puntos se
separarán muy poco de la línea de puntos se ensanchará tanto que será imposible
extraer conclusiones sobre algún tipo de relación.
Aunque no existen valores estandarizados, a título indicativo se presenta la
interpretación de sus valores por intervalos en la tabla 11.
Tabla 10: Interpretación de Coeficiente de Spearman
Coeficiente Interpretación
0 Relación Nula
0 - 0,2 Relación muy baja
0,2 – 0,4 Relación Baja
0,4 – 0,6 Relación Moderada
0,6 – 0,7 Relación alta
0,8 – 1 Relación muy alta
1 Relación Perfecta
3.6.2 Análisis de Componentes Principales (ACP)
El análisis de componentes principales (ACP) se basa en un procedimiento matemático
que transforma un conjunto de variables correlacionadas de respuesta lineal en un
conjunto menor de variables no correlacionadas; a las cuales llamamos componentes
principales. Al observar cuidadosamente este nuevo conjunto de variables no
correlacionadas, se pueden obtener algunas conclusiones relevantes. Es probable que
estas primeras conclusiones determinen el uso de otros análisis de ordenación
ambiental (p.e. análisis de redundancia).
El ACP es quizá el más útil para cribar datos multivariados. Para casi todas las
situaciones de análisis de datos, se puede recomendar el APC como un primer paso. Se
debe realizar sobre un conjunto de datos, antes de realizar cualquier clase de análisis
multivariados. Los análisis de seguimiento sobre las componentes principales son útiles
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para comprobar las hipótesis que el investigador podría establecer acerca de un
conjunto de datos multivariados. Si se presentan algunas otras anormalidades en un
conjunto de datos multivariados, el ACP puede ayudar a revelarlos.
Para la selección de este análisis hemos tenido en cuenta el tamaño muestral; que
generalmente para un análisis de este tipo la muestra no debe ser inferior a 50
observaciones, y preferiblemente el tamaño muestral debería ser 100 o más grande.
Como regla general, el mínimo es tener por lo menos un número de observaciones
cinco veces mayor que el número de variables a ser analizadas
Además existen algunos supuestos que se deben tener en cuenta en la aplicación del
análisis factorial. Estos supuestos son:
- Multicolinealidad, dado que el objetivo es identificar series de variables
interrelacionadas.
- El investigador debe asegurar de que existen suficientes correlaciones para
justificar las aplicaciones del análisis factorial. El tratamiento por SPSS 19
proporciona la matriz de correlación anti-imagen, que es simplemente el valor
negativo de la correlación parcial. A anti-imágenes mayores, son indicativas de
una matriz de datos que no es quizá adecuada para el análisis factorial.
- Examinando la matriz de correlación entera. El contrates de esfericidad de
Bartlett, que es una prueba estadística para la presencia de correlaciones
entres las variables, es una de estas medidas. Proporciona la probabilidad
estadística de que la matriz de correlaciones de las variables sea una matriz de
identidad. El investigador debe tener en cuenta, sin embargo, que el
incremento del tamaño muestral da lugar a que la prueba de contrataste de
Bartlett sea más sensibles a la detección de correlaciones entres las variables.
Otra medida para cuantificar el grado de intercorrelaciones entra las variables y
la conveniencia del análisis factorial es la medida de suficiencia de muestreo
(MSA). Este índice se extiende de 0 a 1, llegando a 1 cuando cada variable es
perfectamente predicha sin error por otras. A menores valores más mediocre
será este análisis.
El ACP es una técnica de reducción de la información disponible sobre un grupo de
muestras, de los cuales se han tomado diversas variables sobre diversas
características. Por ejemplo si se tienen datos de N muestras referentes a p
características diferentes de éstos, es decir, X= (X1,….., Xp), el objetivo del ACP consiste
en reducir las dimensiones de la variable x creando una nueva variable U= (U1,….Ur),
donde r<p, cuyas componentes Ui sean combinación lineal de las Xi y que también
expliquen una proporción suficientemente grande de la dispersión total presente en
los datos originales (Pérez, 1996).
El proceso de cálculo del ACP es el siguiente:
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El primer componente se construye buscando un vector b= (b1,…bp) que, entre todos
los que tengan modulo unitario, atribuya a U1 la mayor varianza posible, de forma tal
que este nuevo componente constituya la mejor explicación unidimensional de la
varianza total en los datos (Pérez, 1996).
Procediendo con las variables sucesivas se construyen las componentes principales.
Este método logra sintetizar al máximo la información con el criterio de pérdida
mínima de capacidad explicativa con respecto a la covarianza de las series (Pérez,
1996).
Cuando se realiza un ACP sobre una matriz de datos X, se está realizando la siguiente
modelación (Aguado, 2004):
∑
Donde, pa son los vectores de pesos que definen las direcciones principales de máxima
varianza en el espacio X. Estas direcciones determinan un subespacio de menor
dimensión (A) que el espacio original.
La dimensión (A) se escoge de manera que no exista información importante de X en E
que es la matriz de residuos, y que, por tanto, representa el ruido es la estimación de
X a partir de modelo con A componentes.
En la figura 15 se muestran de forma gráfica las matrices del modelo APC.
Para una componente dada, los pesos son definidos como la dirección sobre la que se
están proyectando las observaciones y están poniendo de manifiesto la contribución
de las variables originales en la formación de dicha componente (Aguado, 2004).
X T E
𝑷𝑻
Figura 15: Matrices análisis de Componentes Principales
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3.6.3 Tratamiento por ordenador
Se introdujo una matriz con todos los parámetros a estudiar y se realizó un análisis
estadístico donde se incluían las correlaciones de Spearman. Este programa
estadístico, genera como salida de este estudio una hoja de cálculo con los valores de
las correlaciones y los p-valores (p <0,05; p <0,01).
Para realizar el ACP, se introdujo en el programa estadístico la matriz de datos y se
especificaron las variables con las que se deseaba hacer el análisis.
El programa genera como salida tablas de saturaciones de componentes, puntuaciones
de objetos y varianza total explicada, así como también matrices de coeficientes para
el cálculo de las puntuaciones en las componentes y de componentes.
Con estas tablas el programa genera los siguientes gráficos:
- Gráfico de Sedimentación: Se utiliza para determinar cuántos factores deben
retenerse, tomándose en cuenta la cantidad de varianza (en porcentaje)
explicada por dichos factores. Típicamente el gráfico muestra una fuerte
ruptura entre la pronunciada pendiente de los factores más significativos y el
descenso gradual de los restantes, denominados sedimentos.
- Gráfico de Componentes: En este se utiliza la rotación varimax para mostrar las
cargas factoriales de las distintas variables que forman cada componente.
- Gráfico de Saturaciones en componentes: representa las relaciones entre
variables, es decir, que variables son responsables de los patrones que
presentan las muestras. En este gráfico cuando dos variables se encuentran
muy cercanas entre si presentan correlaciones positivas entre sí, por el
contrario si se encuentran linealmente opuestas presentan correlaciones
negativas. En este gráfico se eliminaran aquellas cargas factoriales que no sean
significativas en función del número de observaciones.
- Gráfico de puntos de objetos etiquetados mediante número de caso: se
refiere a la distribución de las muestras en las zonas del diagrama de la
Dimensión 1- Dimensión 2 (o Componente 1- Componente 2) mostrándose que
los puntos que se encuentran próximos presentan valores parecidos de las
variables que determinan dichos componentes.
- Diagrama de dispersión biespacial: el cual contiene la información de los dos
diagramas anteriores y viene siendo una superposición del gráfico de
saturaciones en componentes y de los puntos de objetos, mostrando de forma
clara los grupos de muestras que se encuentran relacionadas con ciertas
variables debido a su cercanía en las zonas del gráfico.
En el ACP realizado se utilizó la misma nomenclatura específica para cada una de las
variables físico-químicas y operacionales, mostradas en los anexos III y IV.
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4. Resultados
Los resultados obtenidos durante la realización del proyecto corresponden, tal como
se explicó en apartados anteriores, a la realización de las hibridaciones mediante la
técnica FISH de 24 muestras tomadas quincenalmente en el fango activo de las
depuradoras de Quart Benàger, Denia, Carraixet y Castellón; durante un periodo de un
año. Las hibridaciones se realizaron con el fin de determinar y cuantificar la cantidad
de bacterias filamentosas del género Thiothrix presentes en el licor mezcla del reactor
biológico.
Seguidamente se realizó un análisis cualitativo y cuantitativo de las bacterias
hibridadas que dieron resultado positivo en las hibridaciones. Por último se realizó un
análisis estadístico bivariante (Spearman) y un análisis de componentes principales
(ACP), con los parámetros físico–químicos y operacionales de las especies identificadas
de Thiothrix presentes en el fango activo.
Previo al análisis de los resultados; se muestra un análisis de las muestras hibridadas
para detallar las características del género Thiothrix y los distintos morfotipos
estudiados.
4.1 Características morfológicas y estructurales de las bacterias
filamentosas del género Thiothrix
En las primeras imágenes se observó el género Thiothrix, marcado con la sonda G123T
en ellas se apreciaron rasgos diferenciales entre las distintas especies dentro del
género, como diversos grosores en los filamentos hibridados, comprobando que se
trataban de especies diferentes (figuras 16 A y B)
B A
Figura 16 A, B: A) Vista convencional, B) Vista con FISH sonda G123T, 1000X
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Para la sonda G2M que hibrida con la especie Thiothrix eikelboomii pudimos observar
que se encontró filamentos tanto intraflocularmente como interfloculares,
generalmente eran más fáciles de ver, y de mayor grosor que las otras especies
estudiadas, en ocasiones, se pudo observar los septos siendo estos muy visibles y de
tamaños regulares con formas rectangulares, como señalan las flechas de la figuras 17
A y B.
Se encontró una muestra en la que se aprecian filamentos totalmente paralelos unos
de otros como se observa en la figura 17. En esta imagen también se aprecia en
contraste de fases (A), como aparecen más filamentos que luego no hibridarán con la
sonda G2M, en la imagen de fluorescencia (B)
En las muestras correspondientes a la sonda TFR pudimos observar filamentos
generalmente intrafloculares, difíciles de observar (figura 18 A), con grosores muy
finos, encontramos algunas hibridaciones de pequeñas células aisladas de la bacteria T.
fructosivorans sin formar filamentos (flecha 18 B). Normalmente los filamentos eran
difíciles de observar.
BA
BA
C
Figura 17 A, B: A) Vista convencional, B) Vista FISH sonda G2M, 1000X
Figura 18 A, B y C: A) Vista convencional, B) Vista FISH y C) Superposición capas vistas a y b sonda TFR, 1000X
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Al igual que en la sonda TFR, en la sonda TNI hubo dificultades para el recuento de
filamentos en contraste de fase; como se aprecia en la siguiente imagen (figura 19 A y
B), aparecieron filamentos intrafloculares difíciles de observar (imagen A), y con poca
fluorescencia lo que hizo imposible discernir entre el filamento hibridado y la
fluorescencia de fondo (imagen B).
Figura 19 A, B: A) Vista Convencional, B) Vista FISH sonda TFR, 1000X
Como aparece en la figura 20 B, en la de hibridación se observó los septos que dividen
las células filamentosas, mucho más apreciables que en la técnica convencional, (figura
20 A).
Figura 20 A, B: A) Vista convencional, B) Vista FISH sonda TNI, 1000X
B A
B A
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4.2 Cuantificación e identificación de bacterias filamentosas del
género Thiothrix
4.2.1 Microscopia convencional
Los resultados de abundancias según el método convencional fueron extraídos del
proyecto “Estudio Integrado del Proceso de Fangos Activos” financiado por la EPSAR.
Las bacterias filamentosas se identificaron mediante una serie de características
morfológicas como puede apreciarse en las figuras 21 A y 22 A. Se ha conseguido
diferenciar especies intrafloculares mediante la técnica FISH que no son reconocibles
mediante la técnica convencional; como se muestran en figura 21 B y 22 B.
A B
B A
Figura 21 A y B: A) Vista Convencional G2M, y B) FISH sonda G2M (Quart), 1000X
Figura 22 A y B: A) Vista Convencional, B) FISH sonda TFR (Denia), 1000X
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4.2.2 Técnica molecular FISH
La sonda G2M se utilizó para la detección e identificación de filamentos pertenecientes
a la especie Thiothrix eikelboomii .En la figura 23 muestra un ejemplo de filamento
hibridado con la sonda específica en la depuradora de Quart. En primer lugar se realizó
la observación bajo el microscopio de epifluorescencia y se tomó la imagen,
seguidamente se fotografió el mismo campo en contraste de fases.
Para la detección del morfotipo Thiothrix nivea se utilizó la sonda TNI. En la figura 24 se
muestra un ejemplo de filamento hibridado con dicha sonda bajo contraste de fases y
epifluorescencia.
B A
A B
Figura 23 A y B: A) Vista Convencional Thiothrix Eikelboomii, B) FISH sonda G2M (Quart)
Figura 24 A y B: A) Vista Convencional y B) FISH sonda TNI (Castellón), 1000X
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En la imagen que muestra la sonda TFR (figura 25), que se utilizó para la detección del
morfotipo Thiothrix fructosivorans, se muestra un ejemplo de lo difícil que es
encontrar estas bacterias; pues normalmente aparecen intraflocularmente. Además en
algunas se apreció, que existen bacterias de este morfotipo pero no formando
filamentos sino como bacterias aisladas. Se muestran fotos en contraste de fases y
bajo epifluorescencia (figura 25).
Figura 25 A, B y C: A) Vista Convencional, B) FISH y C) superposición de imagen FISH y Convencional Sonda TFR. (Denia)
No se obtuvo ninguna señal positiva con las sondas G1B y G3M en ninguna de las EDAR
estudiadas.
Como conclusión en este apartado podemos decir que la presencia de las bacterias
filamentosas no es abundante en ninguna de las depuradoras estudiadas, aunque sí
que se encuentran en mayor proporción en las depuradoras de Quart Benàger y Denia
que en la de Castellón o en la de Carraixet, además se presenta los rangos, media y
desviación estándar de los índices de filamentos de cada uno de los morfotipos
filamentosos, (tablas 11,12,13, 14, 15, 16 y 17)
Tabla 11: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Carraixet L1
Parámetro Sondas Rangos Media ± desviación
Sonda Thiothrix G123T G123T 0.00-1.00 0.44 ± 0.51
Sonda Thiothrix eikelboomii G2M G2M 0.00-2.50 0.24 ± 0.6
Sonda T. nivea TNI TNI 0.00-1.00 0.13 ± 0.34
Sonda T. fructosivorans TFR TFR 0.00-1.00 0.17 ± 0.39
Tabla 12: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Carraixet L2
Parámetro Sondas Rangos Media ± - desviación
Sonda Thiothrix G123T G123T 0.00 -1.50 0.63 ± 0.53
Sonda Thiothrix eikelboomii G2M G2M 0.00-1.00 0.17 ± 0.39
Sonda T. nivea TNI TNI 0.00-1.00 0.04 ± 0.21
Sonda T. fructosivorans TFR TFR 0.00-1.00 0.09 ± 0.29
A B C
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Tabla 13: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Castellón L1
Parámetro Sondas Rangos Media ± desviación
Sonda Thiothrix G123T G123T 0.00-1.00 0.52 ± 0.51
Sonda Thiothrix eikelboomii G2M G2M 0.00 0
Sonda T. nivea TNI TNI 0.00-1.00 0.04 ± 0.21
Sonda T. fructosivorans TFR TFR 0.00-2.00 0.52 ± 0.59
Tabla 14: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Castellón L2
Parámetro Sondas Rangos Media ± desviación
Sonda Thiothrix G123T G123T 0.00-3.00 0.61 ± 0.72
Sonda Thiothrix eikelboomii G2M G2M 0.00 0
Sonda T. nivea TNI TNI 0.00-1.00 0.04 ± 0.21
Sonda T. fructosivorans TFR TFR 0.00-2.00 0.57 ± 0.59
Tabla 15: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Denia
Parámetro Sondas Rangos Media ± desviación
Sonda Thiothrix G123T G123T 0.00-3.00 2 ± 0.84
Sonda Thiothrix eikelboomii G2M G2M 0.00-1.00 0 ± 0.39
Sonda T. nivea TNI TNI 0.00-2.00 2 ± 0.80
Sonda T. fructosivorans TFR TFR 0.00-4.00 2 ± 0.83
Tabla 16: Valores mínimos, máximos, media y desviación estándar de las sondas en la EDAR Quart
Parámetro Sonda Rangos Media ± desviación
Sonda Thiothrix G123T G123T 0.00-5.00 2.40 ± 1.33
Sonda Thiothrix eikelboomii G2M G2M 0.00-3.50 0.90 ± 1.11
Sonda T. nivea TNI TNI 0.00-3.50 1.56 ± 1.32
Sonda T. fructosivorans TFR TFR 0.00-2.00 0.39 ± 0.67
4.3 Comparación microscopía convencional-FISH
Como se ha descrito en el apartado de objetivos del presente trabajo, se comparó el
método clásico y la técnica molecular FISH en la estimación de la abundancia de los
morfotipos en las cuatro depuradoras estudiadas.
Se pudo observar que no aparecieron datos de la sonda G1B, ni la de la G3M, como
ocurrirá en el resto de los resultados.
Tabla 17: Variables mínimos, máximos, media y desviación estándar de todas las sondas
Parámetro Nomenclatura Media ± Desviación Rangos
Sonda Thiothrix eikelboomii G2M G2M 0.15 ± 0.35 0.00-1.50
Sonda T. nivea TNI TNI 0.29 ± 0.45 0.00-1.50
Sonda T. fructosivorans TFR TFR 0.36 ± 0.45 0.00-1.50
Sonda Thiothrix G123T G123T 0.60 ± 0.50 0.00-1.79
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Se apreciaron diferencias significativas al comparar los resultados en la cuantificación e
identificación de estas bacterias filamentosas mediante las dos técnicas, convencional
y FISH. Generalmente la técnica convencional subestimó la presencia de Thiothrix
nivea (sonda TNI) en todas las depuradoras estudiadas. Estos datos se pueden
observar en las figuras de distribución de datos por depuradoras comparando la
técnica convencional con la de hibridación. Las gráficas de la 26 a la 31 muestran las
diferencias encontradas con el género Thiothrix. Desde la gráfica 32 hasta la 37 se
muestran las diferencias encontradas en las distintas especies del género Thiothrix.
Comenzaremos analizando la figura de la EDAR Quart (figura 26), pudímos ver como
generalmente los muestreos del género Thiothrix en contraste de fases suelen tener
índices muy dispares a los reales. Por ejemplo, si nos centramos en la muestra número
8 podemos ver que la columna de color azul que es el recuento realizado en contraste
de fases del género Thiothrix da una estimación del índice filamentoso en torno a 5, si
además sumamos la columna de color rojo que son filamentosas de la especie
Thiothrix eikelboomii tipo 021N, deberían ser el resultado que aparecen en la columna
de color verde (sonda G123T genérica para todos los tipos de Thiothrix), sin embargo el
recuento de filamentosas hibridadas; indica un índice de alrededor de 3, mucho más
bajo que lo que el determinado con microscopía de contraste de fases.
Figura 26: Valores IF Thiothrix, EDAR Quart.
0
1
2
3
4
5
6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
IF
Muestreo
Quart Thiothrixconvencional
Sonda G123TFISH
Tipo 021NConvencional
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En la figura correspondiente a la EDAR Denia (figura 27), obtuvimos resultados muy
parecidos a los de Quart, los índices filamentosos fueron mucho más bajos que en la
anterior depuradora, pero se llegó a la misma conclusión. Como pudimos apreciar en
cualquiera de las muestras, generalmente el sumatorio de las columnas azul y roja
debieron ser de igual valor que las columnas de color verde, sin embargo esto no llegó
a pasar en ninguna muestra.
Figura 27: Valores IF Thiothrix, EDAR Denia
En la Línea de Castellón 1 (figura 28), los IF no sobrepasaron el valor de 2. Esto indico
que la abundancia de filamentosas en esta planta es mucho menor que en las EDAR de
Quart y Denia. Además volvimos a observar el mismo patrón, el recuento de bacterias
filamentosas del género Thiothrix, de la columna azul más la roja no alcanzo el valor de
la columna verde. Incluso en esta figura pudimos observar como encontramos
muestreos en los que solo aparece una columna, ya sea verde o roja. Esto pudo ser
debido al índice tan bajo de bacterias filamentosas que se encuentra en la muestra.
.
Figura 28: Valores IF Thiothrix, EDAR Castellón Línea 1
0
1
2
3
4
5
6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
IF
Muestreo
Denia Thiothrix spConvencional
Sonda G123TFISH
Thiohtrix 021Nconvencional
0
1
2
3
4
5
6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
IF
Muestreo
Castellón L1 Thiothrix sp.Convencional
Sonda G123TFISH
Thiothrix 021NConvencional
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La línea de Castellón 2 (figura 29) es muy parecida a la anterior. Obtuvimos índices de
filamentos muy bajos, la única muestra con un valor de IF superior es la número 21. En
ella pudimos ver como el número de filamentosas obtenidas con el recuento
convencional en contraste de fases sigue siendo menor que el obtenido con la técnica
de hibridación in situ. También observamos que en la muestra 1, se obtiene un
resultado algo anormal. Puede ocurrir que al realizar el recuento en técnica
convencional se confundieran ciertas especies y contabilizáramos filamentosas que no
se corresponderían con las de tipo 021N, llegando a obtener mayores resultados en
este recuento que con la técnica FISH.
Figura 29: Valores IF Thiothrix, EDAR Castellón; Línea 2.
Por último los resultados del IF de la EDAR de Carraixet, (figuras 30 y 31) se obtuvieron
mayores aproximaciones de los recuentos con la técnica molecular que con la técnica
convencional de microscopia. Se observó claramente, tanto en la línea 1 como en la
línea 2, que los recuentos realizados con técnicas moleculares son más precisos,
llegando a igualar los resultados de las técnicas convencionales e incluso a superarlas
con total precisión. Se contabilizaron IF en muestreos donde con las técnicas
convencionales no se observó ni cuantifico nada, por ejemplo en las muestras 2, 3,
9,11, 18, 19 y 20 del gráfico de Carraixet línea 1, o en las muestras 2, 11, 15, 19 y 22 del
gráfico de Carraixet Línea 2.
Figura 30: Valores IF Thiothrix, EDAR Carraixet, Línea 1.
0123456
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
IF
Muestreo
Castellón L2 Thiothrix sp.Convencional
Sonda G123TFISH
Tipo 021NConvencional
0
1
2
3
4
5
6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
IF
Muestreo
Carraixet L1 Tipo 021NConvencional
Sonda ThiothrixG123T
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Figura 31: Valores IF Thiothrix, EDAR Carraixet; Línea 2
Seguiremos con los gráficos de los recuentos realizados con la técnica FISH
comparando las bacterias filamentosas por especie dentro del género Thiothrix en
cada depuradora.
En la figura 32 de la EDAR de Quart, es en la que se observó los valores de IF más altos
para las sondas por especies. Realizando el análisis de hibridación con distintas sondas,
observamos que las especies que más abundan son T. eikelboomii y T. nivea, siendo T.
fructosivorans la que poseía valores de IF más bajos (<2).
Figura 32: Valores IF Thiothrix, EDAR Quart.
0
1
2
3
4
5
6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
IF
Muestreo
Carraixet L2 Tipo 021NConvencional
Sonda G123TFISH
0
1
2
3
4
5
6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
IF
Muestreo
Quart Sonda 021NFISH
Sonda TNIFISh
Sonda TFRFISH
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En la EDAR Denia, (figura 32) la especie T. fructosivorans fue la más abundante y la
única que apareció en casi todos los muestreos, además se observó que los valores de
IF de T. nivea son más bajos que en la EDAR de Quart, al igual que ocurre con la
especie T. eikelboomii.
Figura 33: Valores IF Thiothrix, EDAR Denia
En la EDAR Castellón, tanto la línea 1 (figura 34), como la línea 2 (figura 35), se
contabilizaron bacterias de la especie T. fructosivorans y se detectó una muestra
aislada de T. nivea
Figura 34: Valores IF Thiothrix, EDAR Castellón Línea 1
Figura 35: Valores IF Thiothrix, EDAR Castellón Línea 2
0
1
2
3
4
5
6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
IF
Muestreo
Denia Sonda G2MFISH
Sonda TNIFISH
Sonda TFRFISH
0
1
2
3
4
5
6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
IF
Muestreo
Castellón L1 Sonda G2MFISH
Sonda TNIFISH
Sonda TFRFISH
0
1
2
3
4
5
6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
IF
Muestreo
Castellón L2 Sonda G2MFISH
Sonda TNIFISH
Sonda TFRFISH
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Por último, en los resultados de la EDAR Carraixet Línea 1 (figura 36) y línea 2 (figura
37) se observó que de los 24 muestreos realizados para cada línea, el índice
filamentoso para las sondas estudiadas fue muy bajo. A pesar de estos valores (IF=1) se
encontraron bacterias hibridadas con las tres sondas comparadas.
Figura 36: Valores IF Thiothrix, EDAR Carraixet, Línea 1
Figura 37: Valores IF Thiothrix, EDAR Carraixet; Línea 2
En resumen podemos decir que los valores obtenidos de IF más altos para Thiothrix se
obtuvieron en las EDAR de Quart y Denia. Siendo en las EDAR de Castellón y Carraixet
donde los IF son más bajos.
Dentro de los distintos tipos filamentosos estudiados con la sonda G1B (Thiothrix
disciformis) y G3M (Thiothrix defluvii) no se obtuvieron señales en ninguna de las
depuradoras, se consideró mejor obviar los datos en el apartado de resultados de
correlaciones y análisis de componentes principales.
0
1
2
3
4
5
6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
IF
Muestreo
Carraixet L1 Sonda G2M
Sonda TNI
Sonda TFR
0
1
2
3
4
5
6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
IF
Muestreo
Carraixet L2 Sonda G2MFISH
Sonda TNIFISH
Sonda TFRFISH
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4.4 Análisis estadísticos entre las bacterias filamentosas del género
Thiothrix y los parámetros operacionales y físico-químicos
El análisis estadístico realizado para relacionar la población de bacterias filamentosas
con los parámetros físico-químicos, operacionales se dividió en dos partes: primero un
análisis bivariante donde se determinó el coeficiente de Spearman y segundo un
análisis multivariante, correspondiente a un ACP.
Antes de hacer dichos análisis, se realizó un resumen estadístico de todos los
parámetros determinados durante el período de estudio. En estos resúmenes se
presentó el mínimo, máximo, media y desviación estándar de cada una de las
variables. Estas tablas se pueden observar en el anexo IV.
Posteriormente a la unión del conjunto de los datos se realizó el análisis bivariante de
Spearman.
4.4.1 Análisis Bivariante. Coeficiente de Spearman.
En las tablas 18 y 19 correspondientes a los parámetros físico-químicos del afluente;
encontramos que la sonda G2M que pertenece a T. eikelboomii, se vio afectada por las
cargas altas en afluente de nitrógeno, de nitrógeno soluble, de fósforo total, fósforo
soluble, de fosfatos, al igual que las cargas de sulfuros, sulfatos y tensoactivos; esto
quiere decir que a concentraciones altas de los compuestos citados el crecimiento de
Thiothrix eikelboomii se ve interrumpido y limita su proliferación en fangos activos. Por
el contrario las relaciones DBO5/NKT, DQO/NKT y las relaciones de DBO5/PT y DQO/PT
en el afluente de las depuradoras, favorecieron positivamente el crecimiento de la
especie.
Para la sonda TNI (Thiothrix nivea) se obtuvieron comportamientos parecidos a los de
G2M pero con números aún mayores que en los encontrados en G2M. Está se ve
afectada por cargas altas de nitrógeno, de nitrógeno soluble, de fosforo total, de
fosforo soluble, fosfatos, tensoactivos, pero no por la presencia de sulfuros o sulfatos
en el medio. A elevados valores de DBO5/NKT, DQO/NKT, DBO5/PT y DQO/PT, el
crecimiento de estas bacterias aumenta.
Para la sonda TFR (Thiothrix fructosivorans), los resultados fueron parecidos a los
comentados en la otras sondas, aunque en esta última los valores de los coeficientes
de Spearman no eran tan elevados. Se ve también como las concentraciones de
fósforo total y fosfatos no eran significativos para el crecimiento de la bacteria, no
pasa lo mismo con el fósforo orgánico particulado que sí pareció tener una relación
indirecta con el crecimiento de T. fructosivorans. La concentración de sulfuros en el
afluente favoreció la aparición de este tipo de bacterias. En G2M y TFR la
concentración de sulfatos afecto de forma negativa en su crecimiento.
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Tabla 18: Correlaciones Spearman de las sondas con los parámetros físico-químicos del afluente
G2M TNI TFR G123T
Coef. Correlación
Sig. Coef. Correlación
Sig. Coef. Correlación
Sig. Coef. Correlación
Sig.
NT -,233** 0.006 0.021 0.806 0.042 0.623 -0.098 0.252
CNT -,234** 0.006 -,490** 0 -,383** 0 -,483** 0
Nts -0.169 0.104 -0.057 0.59 -0.057 0.587 -0.18 0.085
CNTs -,284** 0.006 -,478** 0 -,297** 0.004 -,474** 0
N NH4 -0.156 0.067 -0.015 0.862 0.064 0.456 -0.014 0.871
%N-NH4 -0.026 0.761 0.131 0.126 ,189* 0.026 0.134 0.116
CN-NH4 -,249** 0.003 -,486** 0 -,334** 0 -,436** 0
N orgs -0.003 0.981 0.079 0.455 -0.183 0.082 -0.04 0.71
N orgp -,286** 0.001 -,575** 0 -,327** 0 -,469** 0
N org -0.137 0.108 0.073 0.394 -0.019 0.822 -0.088 0.305
PT -,298** 0 -,291
** 0.001 -0.072 0.398 -,325
** 0
CPT -,279** 0.001 -,559
** 0 -,336
** 0 -,520
** 0
PTs -,498** 0 -,464
** 0 -0.069 0.524 -,572
** 0
CPTs -,456** 0 -,533
** 0 -0.171 0.112 -,599
** 0
P PO4 -,364** 0 -,424
** 0 -0.012 0.888 -,409
** 0
%P PO4 -,295** 0.001 -,349
** 0 0.003 0.972 -,373
** 0
CP PO4 -,264** 0.002 -,535
** 0 -,213
* 0.013 -,483
** 0
P_orgs -0.207 0.056 -0.021 0.85 0.09 0.412 -0.175 0.107
P_orgp 0.187 0.082 0.082 0.451 -,354**
0.001 0.116 0.285
P org 0.059 0.504 0.132 0.132 0.052 0.552 0.126 0.151 p< 0,05(*), p<0,01 (**)
Tabla 19: Correlaciones Spearman de las sondas con los parámetros físico-químicos del afluente continuación
G2M TNI TFR G123T
Coef. Correlación
Sig. Coef. Correlación
Sig. Coef. Correlación
Sig. Coef. Correlación
Sig.
DBO5/NKT ,304** 0 ,208
* 0.015 -0.05 0.566 ,261
** 0.002
DQOs/NKTs ,332** 0.001 ,230
* 0.027 -0.172 0.099 ,257
* 0.013
DBO/PT ,343** 0 ,542
** 0 0.098 0.257 ,501
** 0
DQOs/PTs ,526** 0 ,485
** 0 0.05 0.642 ,582
** 0
Sulf -,283** 0.002 -0.153 0.091 ,236
** 0.008 -,180
* 0.046
CS -,322** 0 -0.169 0.061 ,215
* 0.017 -,218
* 0.015
Sulfa -,266** 0.002 -,347
** 0 -,188
* 0.027 -,304
** 0
CSO4 -,191* 0.025 -,565
** 0 -,433
** 0 -,487
** 0
Tensan -0.206 0.088 -0.174 0.15 0.037 0.759 -,243* 0.042
CTA -,327** 0.006 -,398
** 0.001 0.03 0.802 -,448
** 0
CARBO 0.159 0.063 0 0.999 -0.129 0.131 0.094 0.272
CCARBO 0.006 0.942 -,377** 0 -,385
** 0 -,293
** 0
Prot -0.003 0.97 0.034 0.696 -0.125 0.145 0.041 0.632
Cprot -0.159 0.063 -,416** 0 -,411
** 0 -,360
** 0
AGV -0.061 0.479 -0.035 0.681 0.019 0.823 0.071 0.41
CAGV -0.07 0.413 -0.091 0.29 -0.002 0.978 0.033 0.704
p< 0,05(*), p<0,01 (**)
En los datos obtenidos en el licor mezcla (tabla 20) destaco, que las bacterias de la
especie T. eikelboomii (G2M) estaban correlacionadas con la conductividad, la
concentración de sólidos suspendidos y el fósforo total en los sólidos suspendidos del
licor mezcla, indicando que a concentraciones altas de estos parámetros no esperamos
encontrar crecimiento de esta especie.
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74
Para la sonda TNI (T. nivea) se relacionó más positivamente con la sedimentabilidad y
con el índice volumétrico del fango (IVF), además de con la DQO.
La sonda TFR mostro correlaciones positivas con la conductividad, los sólidos
suspendidos, sólidos volátiles, fósforo de los sólidos volátiles y la DQO. Sin embargo se
vio afectada por valores de nitrógeno alto en los sólidos suspendidos volátiles y con la
temperatura, factores que no parecieron afectar a ninguna de las otras dos sondas de
estudio.
Tabla 20: Correlaciones Spearman de las sondas con los parámetros físico-químico Licor mezcla
G2M TNI TFR G123T
Coef. correlación
Sig. Coef. correlación
Sig. Coef. correlación
Sig. Coef. correlación
Sig.
pH 0.014 0.873 0.097 0.255 -0.106 0.216 0.137 0.109
Cond -,184* 0.03 0.082 0.337 ,424
** 0 0.12 0.159
SSLM -,191* 0.024 0.009 0.914 ,372
** 0 0.041 0.63
SSVLM -0.16 0.059 -0.007 0.937 ,322** 0 0.045 0.597
%SSVLM 0.137 0.107 -0.135 0.114 -,412** 0 -0.131 0.124
IVF 0.016 0.856 ,308** 0 ,242
** 0.004 ,195
* 0.021
NT SSVLM
0.153 0.072 -0.066 0.443 -,225** 0.008 -0.069 0.421
PT SSVLM
-,245** 0.004 -0.118 0.166 ,265
** 0.002 -0.064 0.453
DQO -0.026 0.763 ,377** 0 ,525
** 0 ,404
** 0
Tªr -0.027 0.751 -0.101 0.234 -,245** 0.004 -,202
* 0.017
p< 0,05(*), p<0,01 (**)
En el efluente (tabla 21), las correlaciones obtenidas para G2M dieron positivas para la
DQO soluble y para la DBO total y negativas con el rendimiento de DQO total y la DBO
filtrada; estos valores son totalmente contrarios a los obtenidos en las correlaciones de
TFR menos en la DBO filtrada que no se correlacionaba ni positiva ni negativamente
con esta sonda. Además para TFR obtuvimos correlaciones negativas en los sólidos
suspendidos totales, DQO total, rendimiento de DBO filtrada. Por último decir que TNI
apareció en el efluente con altos rendimientos de DBO total y suele no aparecer en
presencia de DBO filtrada.
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Tabla 21: Correlaciones Spearman de las sondas con los parámetros físico-químico Efluente
G2M TNI TFR G123T
Coef. Correlación
Sig. Coef. Correlación
Sig. Coef. Correlación
Sig. Coef. Correlación
Sig.
SST 0.033 0.697 -0.144 0.091 -,266** 0.002 -0.056 0.512
rSST -0.069 0.419 0.109 0.202 ,262** 0.002 0.024 0.775
DQOt 0.162 0.057 -0.054 0.531 -,360** 0 0.012 0.891
rDQOt -,223** 0.008 -0.044 0.604 ,278
** 0.001 -0.067 0.432
DQOs ,197* 0.02 0.055 0.522 -,220
** 0.009 0.117 0.172
rDQOs -0.038 0.658 0.123 0.153 ,271** 0.001 0.107 0.213
DBOf -,224* 0.034 -,318
** 0.002 -0.161 0.129 -,329
** 0.002
rDBOf -0.055 0.615 -0.062 0.573 -,315** 0.003 -0.082 0.458
DBOt ,212* 0.013 0.12 0.165 -,246
** 0.004 0.155 0.073
rDBOt -0.004 0.966 ,289** 0.001 ,267
** 0.003 0.148 0.105
p< 0,05(*), p<0,01 (**)
Según las variables operacionales de estudio, en la tabla 22; pudimos observar como la
especie T. nivea tuvo un comportamiento muy parecido a T. fructosivorans, aunque T.
fructosivorans estaba menos afectada por el tiempo de retención hidráulico o por el
oxígeno medio, y negativamente por la temperatura. La sonda G2M solo tuvo
correlación positiva con el tiempo de retención hidráulico y con el oxígeno bajo, y una
correlación negativa con el oxígeno alto.
Tabla 22: Correlaciones Spearman de las sondas con las Variables operacionales
G2M TNI TFR G123T
Coef. Correlación
Sig. Coef. Correlación
Sig. Coef. Correlación
Sig. Coef. Correlación
Sig.
CMdbo -0.074 0.384 -,343** 0 -,371
** 0 -,340
** 0
CMdqos -0.084 0.326 -,308** 0 -,245
** 0.004 -,289
** 0.001
TRHr ,340** 0 ,616
** 0 ,171
* 0.044 ,496
** 0
EF 0.114 0.182 ,438** 0 ,434
** 0 ,415
** 0
O_bajo ,182* 0.032 ,490
** 0 ,548
** 0 ,485
** 0
O_medio
0.109 0.203 ,353** 0 ,216
* 0.011 ,283
** 0.001
O_alto -,239** 0.005 -,566
** 0 -,432
** 0 -,515
** 0
p< 0,05(*), p<0,01 (**)
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4.4.2 Análisis de Componentes Principales (ACP)
Los gráficos de saturaciones mostrados en este apartado corresponden a los diagramas
de dispersión biespacial. Las dos dimensiones que explican la máxima varianza para las
variables físico-químicas y operacionales.
El ACP relativo a las variables del afluente (figura 38) presentó una medida de
adecuación de la muestra (KMO) de 0,826 y un nivel de significación < 0,05, lo que
indico que es un buen análisis factorial. El total de la varianza explicada con los dos
componentes fue del 62,44%, si hubiésemos utilizado un tercer componente la
varianza explicada hubiera sido del 71% (tabla 23) En la matriz de componentes
rotados se obtuvo una relación inversa entre la carga másica de proteínas, el amonio,
el fósforo total, el nitrógeno total, el fosfato, los carbohidratos, los aceites y grasas, los
ácidos grasos volátiles y la sonda TNI (T. nivea). Por otro lado existió una relación
directa entre la sonda TFR (T. fructosivorans) y la carga de ácidos grasos volátiles.
Además con la sonda G2M (T, eikelboomii) había una relación directa de la DBO5/NKT,
DBO/PT. El gráfico que deberíamos haber obtenido en tres dimensiones donde los
parámetros de G2M, DBO5/PT y DBO5/NKT estarían en ese tercer eje.
Tabla 23: Matriz de componentes rotados con porcentajes de las varianzas
Componente
1 (45,6%) 2 (16,9%) 3 (9,33)
Cprote ,925
CN-NH4 ,918
CPT ,897
CNT ,866
CP_PO4 ,865
CCARBO ,823
CAG ,806
DBO5/NKT ,815
DBO/PT ,769
G2M ,625
TNI -,412 ,422
TFR ,704
CAGV ,400 ,633
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Figura 38: ACP de las variables físico-químicas del afluente con las sondas G2M, TNI y TFR
En el análisis del ACP del licor mezcla (figura 39), se obtuvo una media de KMO de
0,762 y un nivel de significación < 0,05. La varianza explicada en el análisis con las dos
primeras dimensiones es del 54% (tabla 24), es un porcentaje válido para el análisis. En
la matriz de componentes rotados vimos unas correlaciones negativas entre T.
fructosivorans (sonda TFR) y T. nivea (sonda TNI) con la temperatura, lo que indico que
a mayor temperatura del licor mezcla menores IF de las sondas TNI y TFR. La sonda
G2M (T. eikelboomii) no se relacionó con ninguna variable operacional pero una vez
analizado el gráfico para un tercer componente más pudimos ver que G2M, se
relacionó con la sonda TNI.
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Tabla 24: Matriz de componentes rotados con el porcentaje de la varianza, licor mezcla.
Componente
1 (36,3 %) 2 (16,2 %) 3 (12,1%)
PT SSVLM ,868
SSLM ,748
%SSVLM -,831
NT SSVLM -,845
CondLMµS/cm ,580
pH -,515
G2M ,641
TNI ,821
TFR ,690
Tª -,798
Figura 39: ACP de las variables físico-químicas del licor mezcla con las sondas G2M, TNI y TFR
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Dentro de los parámetros físico-químicos del efluente, figura 40; los resultados con los
que se obtuvo un buen análisis de componentes principales fueron los relacionados
con la DQO soluble y las sondas. Es un análisis donde la media de KMO = 0,5 y un nivel
de significación < 0,05, a pesar de que el valor de KMO es algo bajo, el análisis es
todavía aceptable. La varianza acumulada para dos componentes en este análisis
explica un 70% del acumulado (tabla 26). Por último, se observó una relación directa
entre T. fructosivorans y el rendimiento de DQO soluble, al contrario que con las
especies T. nivea y T. eikelboomii que se obtuvieron valores relacionados directamente
con la DQO soluble. Con un nivel de depuración bajo del agua tratada estas dos
especies eran más representativas.
Tabla 25: Matriz de componentes rotados del
efluente con el porcentaje de la varianza
Componente
1 (38,2 %) 2 (32,7%)
TFR ,753
rDQOs ,634
DQOs -,600 ,576
TNI ,799
G2M ,667
Figura 40: ACP de las variables físico-químicas del efluente con las sondas G2M, TNI y TFR
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Por último en el ACP realizado de las variables operacionales; (figura 41) la media de
KMO = 0,722 y un nivel de significación < 0,05. La varianza explicada de este análisis
con los dos primeros componentes fue del 63,2 (tabla 26). En este último análisis de
componentes principales obtuvimos una; relación directa de T. nivea con el oxígeno
medio y oxígeno bajo, y relación inversa con la concentración de oxígeno alto. Por otro
lado, T. fructosivorans estaba más relacionada positivamente con la edad de fango e
inversamente con la carga másica de la DQO soluble. La especie T. eikelboomii (sonda
G2M) se encuentro representada en una tercera dimensión, sin relación con ninguna
otra variable.
Tabla 26: Matriz de componentes rotados de las variables
operacionales, con el porcentaje de la varianza
Componente
1(43,64 %) 2(9,50%) 3(4,14%)
O_medio ,934
O_bajo ,909
O_alto -,790
TNI ,542
G2M ,901
CMdqos -,883
EF ,850
TFR ,538
Figura 41: ACP de las variables operacionales con las sondas G2M, TNI y TFR
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5. Discusión
5.1 Técnica convencional versus FISH
Los métodos convencionales de detección e identificación de bacterias filamentosas, a
pesar de ser una gran ayuda para la observación en fangos activos de las EDAR, no son
una herramienta fiable debido a su baja especificidad a nivel de identificación como se
ha observado principalmente en las bacterias del presente estudio. Con la técnica
convencional se identificaron 2 morfotipos; Tipo 021N y Thiothrix, (Eikelboom, 2006;
Jenkins et al., 2004), sin embargo con la técnica FISH fueron identificadas 3 bacterias
pertenecientes a estas especies; Thiothrix nivea, Thiothrix eikelboomii y Thiothrix
fructosivorans (Kanagawa et al., 2000; Aruga et al., 2002; Howarth et al., 1999).
La técnica convencional depende principalmente de la experiencia del operador de
planta, de los conocimientos sobre los morfotipos filamentosos, de otros factores
externos; como puede ser el tipo de microscopio y el tiempo utilizado, así como el
nicho donde la bacteria filamentosa se encuentre (intraflocular o interflocular). De
estos parámetros depende su identificación y posterior cuantificación.
En nuestro caso de estudio, se apreciaron diferencias significativas al comparar los
resultados en la cuantificación e identificación de los morfotipos filamentosos
estudiados mediante las dos técnicas utilizadas (convencional y FISH). Los resultados
revelaron que la técnica convencional siempre subestimó la presencia del género
Thiothrix, principalmente por la gran dificultad que conlleva identificar bacterias de
localización intraflocular con respuesta negativa a las tinciones de Gram y Neisser.
Además, con la técnica convencional no se consiguieron diferenciar las distintas
especies dentro de este género. Este hecho dificulta avanzar en el estudio de la
fisiología de este género en los fangos activos de las EDAR, puesto que especies
pertenecientes a un mismo género pueden asociarse a condiciones ambientales
distintas, como es el presente estudio. Por tanto, el uso exclusivo de la técnica
convencional en las EDAR como medida de control y seguimiento de las poblaciones de
bacterias filamentosas del género Thiothrix se encuentra sometida a sesgos,
ocasionando que las medidas correctoras operacionales no sean las adecuadas para el
control de los episodios de bulking filamentoso. El uso complementario de la técnica
FISH permitirá evitar tomar medidas erróneas.
5.2 Correlaciones de Spearman
Según Bergeron y Pelletier, (2004); Thiothrix sp. y T. eikelboomii son organismos
versátiles, los cuales se comportan como quimioheterótrofos (Kämpfer et al., 1995),
quimiautótrofos (Tomei et al., 1999), actuando como fijadores de CO2 y oxidadores de
sulfuro (Strohl y Schimd, 1984; Williams y Unz, 1989), obligados mixotrófos (Williams y
Unz, 1989) así como aerobios estrictos (Richard et al., 1985; Hudson et al., 1994) o
anaerobios facultativos (Hudson et al., 1994).
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Para Jenkins et al., (1993), el crecimiento de Thiothrix y T. eikelboomii está promovido
por mezcla completa, sistemas con aportación continua de nutrientes, relaciones de
carga másica elevadas (> 0,1), déficit de nutrientes y septicidad. Además de las
condiciones descritas por Jenkins, Eikelboom (2000) también incluye un déficit de
oxígeno disuelto; conclusión a la cual también hacen referencia Bergeron y Pelletier,
(2004). Además, estos autores observaron que en sistemas convencionales de fangos
activos con mezcla completa se favorecía el crecimiento de Thiothrix y T. eikelboomii.
Observados los valores en el presente estudio de las correlaciones de Spearman para
la sonda G2M, se pudo afirmar que existen correlaciones importantes con los
nutrientes (variables físico-químicas del afluente), como; el nitrógeno total, nitrógeno
total soluble, amonio, nitrógeno orgánico particulado, fósforo total, fósforo total
soluble y fosfatos.
Williams y Unz, (1989) también encontraron que Thiohtrix sp. y T. eikelboomii podían
consumir urea, amonio, nitrito o nitrato. La especie T. eikelboomii predomino en
condiciones intermitentes de aporte de amonio. Otra aportación sobre la relación de
nutrientes, la encontraron en sistemas convencionales de fangos activos Bergeron y
Pelletier (2004), en el cual fluctuaciones en la relación DBO5/N se relacionaban con
“bulking” por T. eikelboomii. Thiothrix sp. utiliza preferentemente polifosfato y/o
amonio antes que urea/ácido fosfórico como fuentes de nitrógeno o fósforo,
respectivamente (Bergeron y Pelletier, 2004).
Las fluctuaciones de nutrientes así como deficiencias en la dosis de nutrientes
descritas anteriormente, parecían favorecer la proliferación tanto T. eikelboomii como
Thiothrix, (Bergeron y Pelletier, 2004). Como se comprobó en nuestro estudio entorno
a la deficiencia de nutrientes, señalamos la relación positiva encontrada de T.
eikelboomii con las relación DBO5/NKT, DQOs/NKTs, DBO5/PT, y DQOs/PTs. Donde
relaciones elevadas de estos cuatro parámetros, hicieron aumentar su crecimiento,
valores que comparte con la sonda de género (G123T) y con T. nivea. Estos resultados
están de acuerdo con los obtenidos por otros autores, (Jenkins et al., 1994, Bergeron y
Pelletier, 2004, Eikelboom, 2006).
Las bacterias pertenecientes al género Thiothrix son muy versátiles y muestran
incorporaciones de acetato y/o bicarbonato bajo condiciones heterótrofas, mixotrófas
y quimiolitotrófas (Nielsen et al., 2000). Estos microorganismos pueden crecer en
condiciones anerobias (sin oxígeno, con y sin nitrato) en estas condiciones forman
intracelularmente gránulos de azufre a partir de la utilización de acetato o tiosulfato,
(Nielsen et al., 2000). Como ya hemos visto al tratarse de bacterias relacionadas con el
ciclo del azufre, (Eikelboom y Buijsen, 1981; Jenkins et al., 1993; Seviour et al., 1999),
diferentes autores (Jenkins et al., 1994; Howarth et al., 1999 y Eikelboom, 2006),
concluyen que T. eikelboomii es capaz de almacenar compuestos de azufre inorgánico
reducido. En este estudio no se pudo obtener conclusiones que relacionaran T.
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eikelboomii con las concentraciones de sulfuros y sulfatos debido a la baja carga de
estos en el afluente. Así mismo no fue observado en las muestras en vivo metabolismo
del azufre (azufre in situ).
Añadir que el TRH del reactor parece influir de forma positiva en el crecimiento tanto
de T. eikelboomii como de T. fructosivorans y T. nivea, aunque habría que esperar a
decir algo más concluyente con análisis más avanzados.
En los valores presentados de oxígeno disuelto se pudo ver que con niveles de oxígeno
bajo incrementó la presencia de T. eikelboomii, valores contrarios a los que Bergeron y
Pelletier (2004) obtuvieron, donde T. eikelboomii creció con relaciones altas de carga
másica (0,2), y con oxígeno disuelto alto, por encima de 2 ppm; mientras que Thiohtrix
sp, generalmente proliferaba con relaciones de carga másica baja y oxígeno disuelto
bajo. Según Bergeron y Pelletier (2004), el oxígeno disuelto a bajas concentraciones
era determinante para el crecimiento del género Thiothrix, y solo los valores altos
favorecían a la especie T. eikelboomii, confirmando el metabolismo estrictamente
aerobio para esta especie descrito por (Richard et al., 1985; Hudson et al., 1994)
mientras otros autores aseguraron la versatilidad de la especie donde Thiothrix puede
crecer en sistemas anoxicos o anaerobios, en vez de aerobios (anaerobios facultativos
(Hudson et al., 1994, Nielsen et al., 2000), datos más correlacionados con los
obtenidos en nuestro estudio pues se observó cómo T. eikelboomii prolifero con
condiciones de oxígeno bajo.
Para la especie T. nivea, las relaciones con los nutrientes y con los parámetros
DBO5/NKT, DQOs/NKTs, DBO5/PT y DQOs/PT son más parecidas a T. eikelboomii que a T.
fructosivorans.
Analizando los parámetros del licor mezcla, vemos diferencias muy grandes dentro de
las distintas especies. Por ejemplo se encontró correlaciones positivas del IVF y la DQO
con T. nivea y T. fructosivorans, lo cual no se había descrito con anterioridad.
T. nivea tiene correlaciones importantes positivas con la mayoría de las variables
operacionales de estudio (TRHr, EF, ODb, ODm, ODa), sin embargo en presencia de
cargas másicas altas de DQO y DQOs esta especie no presenta crecimiento. Este
comportamiento se acercó más al que aparece en los valores de T. fructosivorans
En relación con los valores de T. fructosivorans no se correlaciona significativamente
con los parámetros DBO5/NKT, BQOs/NKTs, DBO5/PT y DQOs/PTs. Centrados en las
variables operacionales observamos una correlación negativa entre T. fructosivorans y
la CMDBO, CMDQOs y ODa (pero en todas las demás variables operacionales se
observaron correlaciones positivas (TRH, EF, ODb, ODm), exactamente igual que
ocurrió con T. nivea, estos valores son contrarios a los citados por Bergeron y Pelletier,
(2004) donde el género Thiohtrix sp, generalmente proliferaba con relaciones de carga
másica baja y oxígeno disuelto bajo.
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Conocidos los valores del análisis bivariante (Spearman), podemos resumir que los
comportamientos de T. nivea y T. fructosivorans, son más parecidos entre ellos que
con T. eikelboomii. Sin embargo, T. nivea tiene un comportamiento similar a T.
eikelboomii con respecto a la asociación con los nutrientes.
5.3 Análisis componentes principales
Dentro de los cuatro ACP realizados el comportamiento de T. eikelboomii es muy
distinto de T. nivea y T. fructosivorans. En la mayoría de los ACP realizados, T.
eikelboomii no se asocia a ninguna de los dos primeros componentes representados.
Una vez revisado todos los estudios publicados hasta el momento sobre estas
bacterias filamentosas no podemos contrastar resultados de otros autores con los
obtenidos en el ACP del presente trabajo. Todas esas investigaciones abarcaron
estudios sobre la morfología y/o fisiología del género Thiothrix, sin estudiar su relación
con las condiciones ambientales en las EDAR a escala real. Únicamente se encontró un
estudio en planta real, el cual trata aquellas variables operacionales que influyen en el
crecimiento solamente de Thiothrix sp y T. eikelboomii (Bergeron y Pelletier, 2004).
5.3.1 Parámetros físico-químicos del afluente
Los resultados corroboran en gran parte los obtenidos en el análisis bivariado.
Respecto a la deficiencia de nutrientes T. eikelboomii (G2M) está más relacionada que
T. nivea, (TNI) sin embargo esta última, se relacionó mucho más que T. eikelboomii,
con la baja concentración de nutrientes, carbohidratos y proteínas. (Bergeron y
Pelletier, 2004). Las fluctuaciones de nutrientes así como deficiencias en la dosis de
nutrientes descritas anteriormente, parecían favorecer la proliferación tanto T.
eikelboomii como Thiothrix, (Bergeron y Pelletier, 2004).
Por otro lado T. fructosivorans presenta una relación directa con los ácidos grasos
volátiles. Esto puede deberse a lo descrito por anteriores autores donde las especies
pertenecientes al género Thiothrix con capacidades muy versátiles, muestran
incorporaciones de acetato y/o bicarbonato bajo condiciones heterótrofas, mixotrófas
y quimiolitotrófas (Nielsen et al., 2000). Además, estos microorganismos pueden
crecer en condiciones anerobias (sin oxígeno, con y sin nitrato) en estas condiciones
forman intracelularmente gránulos de azufre a partir de la utilización de acetato o
tiosulfato, (Nielsen et al., 2000).
5.3.2 Parámetros físico-químicos del Licor Mezcla
En el ACP del licor mezcla solamente se obtuvo relación de las especies T. nivea y T.
fructosivorans con la temperatura del reactor. Influyendo positivamente en el
crecimiento de estas dos bacterias filamentosas cuando las temperaturas en el reactor
fueron bajas.
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86
5.3.3 Parámetros físico-químicos del efluente
En los valores para T. nivea y T. eikelboomii, se confirmó un comportamiento similar en
ambas especies, apareciendo principalmente con un menor rendimiento de la
eliminación de la materia orgánica. Contrariamente a los valores obtenidos para la
especie T. fructosivorans, la cual solo apareció con buenos rendimientos de
eliminación.
5.3.4 Parámetros operacionales
Respecto a los parámetros operacionales, T. nivea presenta su máxima abundancia en
valores por debajo de 2 ppm de oxígeno disuelto sin embargo Bergeron y Pelletier,
(2004) concluyeron que el oxígeno disuelto era determinante a bajos niveles para la
proliferación del género Thiothrix, (Bergeron y Pelletier 2004); y que valores altos de
oxígeno disuelto favorecían a la especie T. eikelboomii. Esto no tiene relación con
nuestros datos, aunque podemos decir que como ya hemos comentado al ser una
familia tan versátil en cuanto a comportamientos de oxígeno no sea un factor claro o
determinante para proporcionar conclusiones sobre la relación de su metabolismo con
las concentraciones de oxígeno disuelto en el medio.
T. fructosivorans se relacionó con una baja carga másica y alta edad de fango, no
obteniéndose valores que relacionen estos parámetros con las otras dos especies (T.
nivea y T. eikelboomii), a pesar de que según Jenkins et al., 2004 publico rangos de 0,1-
0,7 de carga másica (kgDBO5/kgLMSS, día) y de 2–20 de edad del fango (días) para el
morfotipo T. eikelboomii.
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6. Conclusiones
Las conclusiones obtenidas en el presenta trabajo han sido las siguientes:
- Se apreciaron diferencias significativas al comparar los resultados en la
cuantificación e identificación del género Thiothrix, mediante microscopía
convencional y técnica molecular FISH. La técnica convencional presenta una
serie de inconvenientes que le impide ser una herramienta ideal. El futuro de la
identificación y valoración se encuentra en las técnicas moleculares debido a la
alta especificidad de estas pruebas.
- Los mayores valores de IF encontrados fueron los de T. eikelboomii seguidos de
T. nivea.
- Las especies T. nivea y T. fructosivorans se comportaron de igual forma para
baja carga másica y alta edad de fango. Estos parámetros influyen
positivamente en la aparición de estas especies.
- Thiothrix nivea y T. eikelboomii se relacionaron con la deficiencia de nutrientes
(DBO5/NKT, BQOS/NKTS, DBO5/PT, DQOS/PT) observándose una mayor relación
de esta última bacteria filamentosa, con los parámetros antes citados.
- La abundancia de Thiothrix fructosivorans se asoció con altos valores de ácidos
grasos volátiles.
- Bajas temperaturas en el reactor biológico favorecieron la aparición de T.
fructosivorans y T.nivea.
- Las relaciones estudiadas entre el género Thiothrix y los parámetros descritos
permitirá relacionar episodios de “bulking” en diferentes EDAR pudiendo
identificar el tipo de bacteria y actuando sobre las variables que afecta a su
crecimiento.
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B i b l i o g r a f í a
90
7. Bibliografía
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A n e x o s
96
8. Anexos
I. Vistas aéreas de las EDAR estudiadas
Figura 42: Vista aérea EDAR Carraixet
Figura 43: Vista aérea EDAR DENIA
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A n e x o s
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Figura 44: Vista aérea EDAR QUART
Figura 45: Vista aérea EDAR CASTELLÓN
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A n e x o s
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II. Relación fechas muestreo por depuradora
Tabla 27: Relación de muestras estudiadas. L.1: Línea 1; L.2: Línea 2; L(A+B): Línea A+B; L(C+D): Línea (C+D)
Castellón Carraixet Denia Quart
03/12/2008 L.1 03/06/2009 L.2 10/12/2008 L (A+B)
10/06/2009 L (C+D)
10/12/2008 04/12/2008
03/12/2008 L.2 17/06/2009 L.1 10/12/2008 L (C+D)
24/06/2009 L (A+B)
22/12/2008 17/12/2008
17/12/2008 L.1 17/06/2009 L.2 23/12/2008 L (A+B)
24/06/2009 L (C+D)
08/01/2009 14/01/2009
17/12/2008 L.2 01/07/2009 L.1 23/12/2008 L (C+D)
08/07/2009 L (A+B)
21/01/2009 28/01/2009
15/01/2009 L.1 01/07/2009 L.2 07/01/2009 L (A+B)
08/07/2009 L (C+D)
04/02/2009 11/02/2009
15/01/2009 L.2 15/07/2009 L.1 07/01/2009 L (C+D)
22/07/2009 L (A+B)
18/02/2009 25/02/2009
28/01/2009 L.1 15/07/2009 L.2 21/01/2009 L (A+B)
22/07/2009 L (C+D)
04/03/2009 11/03/2009
28/01/2009 L.2 09/09/2009 L.1 21/01/2009 L (C+D)
16/08/2009 L (A+B)
16/03/2009 28/03/2009
11/02/2009 L.1 09/09/2009 L.2 04/02/2009 L (A+B)
16/09/2009 L (C+D)
01/04/2009 07/04/2009
11/02/2009 L.2 23/09/2009 L.1 04/02/2009 L (C+D)
30/09/2009 L (A+B)
29/04/2009 22/04/2009
25/02/2009 L.1 23/09/2009 L.2 18/02/2009 L (A+B)
30/09/2009 L (C+D)
13/05/2009 06/05/2009
25/02/2009 L.2 07/10/2009 L.1 18/02/2009 L (C+D)
14/10/2009 L (A+B)
27/05/2009 20/05/2009
11/03/2009 L.1 07/10/2009 L.2 04/03/2009 L (A+B)
14/10/2009 L (C+D)
10/06/2009 03/06/2009
11/03/2009 L.2 21/10/2009 L.1 04/03/2009 L (C+D)
27/10/2009 L (A+B)
24/06/2009 17/06/2009
25/03/2009 L.1 21/10/2009 L.2 01/04/2009 L (A+B)
27/10/2009 L (C+D)
08/07/2009 01/07/2009
25/03/2009 L.2 04/11/2009 L.1 01/04/2009 L (C+D)
11/11/2009 L (A+B)
22/07/2009 15/07/2009
22/04/2009 L.1 04/11/2009 L.2 29/04/2009 L (A+B)
11/11/2009 L (C+D)
16/09/2009 09/09/2009
22/04/2009 L.2 18/11/2009 L.1 29/04/2009 L (C+D)
25/11/2009 L (A+B)
30/09/2009 23/09/2009
06/05/2009 L.1 18/11/2009 L.2 13/05/2009 L (A+B)
25/11/2009 L (C+D)
14/10/2009 07/10/2009
06/05/2009 L.2 16/12/2009 L.1 13/05/2009 L (C+D)
09/12/2009 L (A+B)
11/11/2009 21/10/2009
20/05/2009 L.1 16/12/2009 L.2 27/05/2009 L (A+B)
09/12/2009 L (C+D)
25/11/2009 04/11/2009
20/05/2009 L.2 29/12/2009 L.1 27/05/2009 L (C+D)
21/12/2009 L (A+B)
15/12/2009 18/11/2009
03/06/2009 L.1 29/12/2009 L.2 10/06/2009 L (A+B)
21/12/2009 L (C+D)
21/12/2009 16/12/2009
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A n e x o s
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III. Parámetros físico-químicos y variables de estudio
Tabla 28: Listado completo de los parámetros físico-químicos y las variables operacionales, nomenclatura y ubicación en el tratamiento
Parámetros Nomenclatura Aflu Eflu LM V.O. Unidades
Porcentaje de sólidos suspendidos volátiles del licor mezcla
%SSVLM
x
%
Ácidos grasos volátiles AGV x
mg AGV/l
Carga Másica de Ácidos Grasos Volátiles CAGV x
KgAGV/kgSSVLM*d
Carbohidratos CARBO x
mg/l
Carga Másica de Carbohidratos CCARBO x
Kg Carbo/kgSSVLM*d
Carga Másica CM
x KgDBo5/kgSSVLM*d
Caga Másica de DBO CMDBO
x Kg DBO/kgSSVLM*d
Carga Másica DQOs CMDQOs
x Kg DQOs/kgSSVLM*d
Carga Másica del Nitrógeno Total CNT x
Kg Nt/kgSSVLM*d
Carga Másica del Nitrógeno Total soluble CNTs x
Kg NTs/kgSSVLM*d
Carga Másica del Nitrógeno Amoniacal CN_NH4 x
Kg NH4/kgSSVLM*d
Carga Másica del Fósforo Total CPT x
Kg Pt/kgSSVLM*d
Conductividad Cond
x
µS/cm
Carga Másica del Fósforo Total CPT x
Kg Pt/KgSSVLM*D
Carga Másica del Fósforo Total Soluble CPTs x
kg Pts/kgSSVLM*d
Carga Másica del Fósforo como ortofosfato
CP_PO4 x
kg P-PO4/kgSSVLM*D
Carga Másica de Proteínas CPROT x
Kg Prot/KgSSVLM*d
Carga Másica del sulfuro CS x
kg S/KgSSVLM*d
Carga Másica de sulfatos CSO4 x
KgSO4/KgSSVLM*d
Carga másica de Tensoactivos CTA x
KgTenso/KgSSVLM*D
Demanda Biológica de Oxígeno Total a los 5 días
DBO5
mg O2/l
Demanda Biológica de Oxígeno filtrada DBOF
x
mg O2/l
Demanda Biológica de Oxígeno Total DBOT x
mg O2/l
Demanda Biológica de Oxígeno soluble DBOS mg O2/l
Relación Demanda Biológica de Oxígeno/ Nitrógeno Kjeldahl
DBO5/NKT x
-
Relación Demanda Biológica de oxígeno/ Fósforo Total
DBO5/PT x
-
Relación Demanda Biológica de oxígeno/ Fósforo total soluble
DBO5/PTS -
Demanda Química de Oxígeno total efluente
DQOT x
mg O2/l
Demanda Química de Oxígeno total licor mezcla
DQOTLM
x
mg O2/l
Demanda Química de Oxígeno Soluble efluente
DQOS
x
mg O2/l
Relación Demanda Química de Oxígeno/ Nitrógeno Kjeldahl Soluble
DQOs/NKTs x
-
Relación Demanda Química de oxígeno/ Fósforo total soluble
DQOs/PTs x
-
Relación Demanda Química de Oxígeno x Demanda Biológica de Oxigeno
DQOxDBO x
-
Demanda Química de Oxígeno del Licor Mezcla
DQOLM
x
mg O2/l
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A n e x o s
100
Edad del Fango EF
X Días
Índice Volumétrico de Fango IVF
X
ml/g
Nitrógeno Orgánico soluble N_orgs x
mg N/l
Nitrógeno Orgánico particulado N_orgp x
mg N/l
Nitrógeno Orgánico N_org x
mg N/l
Nitrógeno Total NT x
mg N/l
Nitrógeno Total de Licor Mezcla NTLM
x
mg /gSSTLM
Nitrógeno Total Soluble NTs x
mg N/l
Nitrógeno Total de los Sólidos suspendidos volátiles del Licor mezcla
NT-SSVLM
x
mg NSSVLM/l
Oxígeno Disuelto bajo ODb
X %
Oxígeno Disuelto Medio Odm
X %
Oxígeno Disuelto Alto ODa
X %
pH pH
x
-
Proteínas PROT x
mg/l
Fósforo Orgánico P_org x
mg P/l
Fósforo Orgánico particulado P_orgp x
mg P/l
Fósforo relativo al Ortofosfato P_PO4 x
mg P/l
Fósforo Total PT x
mg P/l
Fósforo Total Soluble PTs x
mg P/l
Fósforo Total del Licor Mezcla PTLM
x
Mg PSSVLM/l mg/g SSLM
Fósforo Total Sólidos suspendidos volátiles del Licor Mezcla
PT-SSVLM
x
mg P/l
Rendimiento de la Demanda Biológica de Oxígeno filtrada
rDBOf
x
-
Rendimiento de la Demanda Biológica de Oxígeno Total
rDBOT
x
-l
Rendimiento de la Demanda Química de Oxígeno Total
rDQOt
x
-
Rendimiento de la Demanda Química de Oxígeno Soluble
rDQOs
x
-
Rendimiento de eliminación de los sólidos suspendidos totales
rSST
x
-
Sólidos en suspensión del Licor Mezcla SSLM
x
mg/l
Sólidos Suspendidos totales del efluente SSTefl
x
mg/l
Sólidos en suspensión volátiles del Licor Mezcla
SSVLM
x
mg/l
Sulfatos Sulfa x
mg/l
Sulfuros Sulfu x
mg/l
Temperatura del reactor biológico Tªr
x ºC
Tensoactivos Tensan x
mg/l
Tiempo de retención hidráulico en el reactor biológico
TRHr
x Horas
MASTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL VERONICA ROMERA LOZANO
A n e x o s
101
IV. Rangos de los parámetros operacionales y físico-químicos
Tabla 29: Media, desviación estándar e intervalos de las variables físico-químicas del afluente por depuradora
EDAR QUART DENIA CASTELLÓN L1 CASTELLÓN L2 CARRAIXET L1 CARRAIXET L2
Características INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV
FÍSI
CO
– Q
UÍM
ICO
AFL
UEN
TE
NT 31.5-83.5 53.6±17 26.00-103.00 52.05±17.96 36.00-80.00 58.47±10.55 39.00-92.00 61.65±13.91 19.95-88.80 47.65±17.67 19.95-88.80 47.65±17.67
CNT 0.03-0.10 0.05±0.02 0.01-0.06 0.03±0.01 0.04-0.14 0.09±0.02 0.05-0.16 0.09±0.03 0.04-0.19 0.12±0.05 0.04-0.19 0.12±0.05
Nts 24.0-72.0 43.4±15.7 17.80-63.30 39.79±12.68 35.00-78.00 51.08±9.69 35.00-87.00 51.47±14.81 0.00-0.00 - 0.00-0.00 -
CNTs 0.02-0.08 0.04±0.02 0.02-0.04 0.03±0.01 0.04-0.14 0.08±0.02 0.03-0.15 0.07±0.02 0.00-0.00 - 0.00-0.00 -
N_NH4 24.0-62.2 40.3±12.1 5.30-56.00- 27.33±12.67 32.00-66.00 46.56±7.06 32.00-66.00 45.43±9.53 7.08-40.95 25.66±7.47 7.08-40.95 25.66±7.47
%N-NH4 66.1-88.3 75.8±6.24 29.77-94.16 65.43±19.39 72.86-91.30 80.07±5.14 52.17-86.04 74.41±8.10 35.49-86.63 55.97±13.56 35.49-86.63 55.97±13.56
CN-NH4 0.02-0.08 0.04±0.01 0.00-0.03 0.02±0.01 0.03-0.11 0.07±0.02 0.03-0.11 0.06±0.02 0.01-0.10 0.06±0.02 0.01-0.10 0.06±0.02
N_orgs 0.00-13.7 5.26±4.18 1.70-31.20 13.19±8.25 0.00-12.00 4.52±3.94 0.00-21.00 6.04±5.84 3.60-57.10 22.00±13.19 3.60-57.10 22.00±13.19
N_orgp 0.50-15.0 8.22±3.07 0.00-42.00 12.31±12.13 1.00-16.00 7.39±4.22 0.00-34.00 10.17±8.02 0.00-0.00 - 0.00-0.00 -
N_org 4.40-23.9 13.48±5.86 10.10-47.00 25.37±11.73 4.00-19.00 11.91±4.23 6.00-44.00 16.21±7.81 0.00-0.00 - 0.00-0.00 -
PT 3.10-9.70 5.24±1.96 0.76-8.24 4.79±1.83 5.00-20.00 10.47±3.59 4.70-31.00 11.91±5.47 1.85-13.40 6.26±2.92 1.85-13.40 6.26±2.92
CPT 1.81-8.99 4.79±2.04 0.69-5.95 3.46±1.12 5.94-36.77 16.39±6.22 7.40-34.94 17.76±8.03 3.77-30.12 15.20±6.98 3.77-30.12 15.20±6.98
PTs 1.00-5.50 2.84±1.31 0.63-7.50 3.97±1.89 4.30-19.00 8.82±3.43 3.30-17.00 8.50±3.44 0.00-0.00 - 0.00-0.00 -
CPTs 0.72-5.70 2.60±1.33 0.57-5.14 2.82±1.23 4.56-34.93 13.82±5.95 5.55-24.66 12.49±4.66 0.00-0.00 . 0.00-0.00 .
P_PO4 1.00-4.80 2.52±1.22 0.19-5.20 2.98±1.71 3.92-16.35 7.78±3.00 3.27-17.00 7.87±3.27 1.09-9.36 4.68±1.99 1.09-9.36 4.68±1.99
%P_PO4 32.25-80.55 47.00±10.95 5.37-93.19 60.36±24.62 50.53-96.88 74.47±10.73 29.53-98.10 68.96±17.58 58.65-92.29 75.70±8.77 58.65-92.29 75.70±8.77
CP_PO4 0.72-5.36 2.31±1.27 0.16-4.44 2.15±1.28 4.16-30.06 12.11±4.98 4.92-19.49 11.56±4.25 2.21-19.27 11.40±4.82 2.21-19.27 11.40±4.82
Porg 0.00-1.10 0.28±0.22 0.01-3.74 1.19±1.23 0.00-3.34 1.03±0.91 0.00-2.51 0.64±0.68 0.00-0.00 - 0.00-0.00 -
P_orgp 0.50-4.30 2.41±0.89 0.00-3.66 0.99±0.93 0.20-6.50 1.65±1.27 0.00-20.00 3.40±4.13 0.00-0.00 - 0.00-0.00 -
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A n e x o s
102
Tabla 30: Media, desviación estándar e intervalos del afluente continuación
EDAR QUART DENIA CASTELLÓN L1 CASTELLÓN L2 CARRAIXET L1 CARRAIXET L2
Características INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV
FÍSI
CO
– Q
UÍM
ICO
AFL
UEN
TE
DBO5/NKT 2.65-7.93 4.54±1.14 1.15-6.61 3.12±1.21 1.64-4.67 3.07±0.76 1.48-6.67 3.20±1.17 2.16-5.37 3.11±0.70 2.16-5.37 3.11±0.70
DQOs/NKTs 2.88-10.12 4.86±1.52 1.34-4.24 2.59±0.83 1.62-4.88 3.29±0.83 1.56-4.48 2.88±0.79 0.00-0.00 - 0.00-0.00 -
DBO5/PT 27.27-97.87 48.76±13.97 17.74-46.51 33.95±6.67 5.00-20.00 10.47±3.59 7.85-40.42 18.27±8.37 16.67-41.13 24.43±5.95 16.67-41.13 24.43±5.95
DQOs/PTs 32.97-138.70 83.76±32.97 6.33-49.76 29.98±11.68 9.64-37.74 20.33±6.65 9.53-36.09 18.50±6.53 0.00-0.00 - 0.00-0.00 -
Sulfu 0.05-0.00 0.02±0.1 0.02-30.90 3.68±7.52 0.40-9.00 1.78±2.16 0.40-15.00 2.36±3.53 0.00-0.24 0.02±0.06 0.00-0.24 0.02±0.06
CS 0.00-0.00 - 0.02-16.35 2.29±4.43 0.04-14.98 3.02±3.76 0.36-14.43 3.08±3.71 0.00-0.46 0.03±0.12 0.00-0.46 0.03±0.12
Sulfa 159.0-293.0 221.04±34.63 131-383 248.52±65.42 182.0-375.0 266.08±50.49 154-376 265.17±51.74 183.00-429.3 339.94±58.18 183.00-429.3 339.94±58.18
CSO4 0.11-0.33 0.20±0.05 0.10-0.31 0.18±0.05 0.22-0.58 0.42±0.09 0.14-0.70 0.41±0.14 0.43-1.38 0.83±0.25 0.43-1.38 0.83±0.25
Tensan 1.23-7.50 3.27±1.82 0.00-0.00 - 1.50-7.00 4.53±1.13 1.10-12.00 4.53±2.29 0.00-0.00 - 0.00-0.00 -
CTA 0.87-10.20 3.09±2.17 0.00-0.00 - 1.50-9.98 7.11±1.81 1.38-12.54 6.58±2.70 0.00-0.00 - 0.00-0.00 -
CARBO 5.00-15.00 8.67±3.00 2.00-10.00 4.56±1.80 5.00-12.00 7.04±1.79 4.00-10.00 6.52±1.67 2.00-34.00 7.00±6.35 2.00-34.00 7.00±6.35
CCARBO 3.74-19.34 8.37±4.16 1.92-10.44 3.41±1.75 6.67-22.06 11.27±3.59 5.23-19.39 9.97±3.69 4.06-59.57 16.71±11.63 4.06-59.57 16.71±11.63
PROT 30.00-111.0 62.33±21.30 4.00-57.00 30.43±16.52 40.00-80.00 56.04±11.20 38.00-95.00 55.30±13.52 9.00-75.00 39.00±14.63 9.00-75.00 39.00±14.63
CPROT 25.17-140.50 59.92±29.18 3.59-40.13 21.36±9.77 46.9-147.08 89.98±24.02 41.25-153.20 85.19±30.45 18.33-153.84 94.55±37.49 18.33-153.84 94.55±37.49
AGV 0.00-169.00 27.78±42.05 0.00-30.80 2.47±7.08 0.00-79.60 26.13±27.10 0.00-78.7 29.84±24.36 0.00-45.00 3.62±10.04 0.00-45.00 3.62±10.04
CAGV 0.00-279.19 31.32±62.44 0.00-16.29 1.43±3.92 0.00-127.23 40.55±41.35 0.00-107.08 44.53±34.57 0.00-108.65 8.61±23.64 0.00-108.65 8.61±23.64
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A n e x o s
103
Tabla 31: Media, desviación estándar e intervalos de las variables físico-químicas del licor mezcla por depuradora
EDAR QUART DENIA CASTELLÓN L1 CASTELLÓN L2 CARRAIXET L1 CARRAIXET L2
Características INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV
FÍSI
CO
– Q
UÍM
ICO
LIC
OR
MEZ
CLA
pH 7.05-7.79 7.44±0.18 6.92-8.00 7.40±0.26 6.85-7.60 7.19±0.20 6.85-7.60 7.19±0.21 7.00-7.88 7.44±0.20 7.08-7.76 7.46±0.15
Cond 1330-2740 2043.4±433.6 986-5440 2783±1050 1895-4840 2906±690.5 1895-4840 2906±690.5 946.0-2540.0 1625±351.23 984-2150 1607±299.00
SSLM 1790-3120 2435.2±373.4 2500-3780 3225±289 2460-6800 4126±1156 2460-6800 4126±1156 1100-2980 1938±549.07 1080-2770 1831±450.00
SSVLM 1455-2490 1924.17±288.5 1790-2730 2238±229.9 1490-4920 2996±890.1 1490-4920 2996±890.1 905.0-2410.0 1605.4±435.5 900.00-2290 1513±364.00
%SSVLM 68.00-87.00 79.08±3.71 62.00-74.80 69.38±3.31 461.00-81.00 72.22±4.74 61.00-81.00 72.20±4.74 70.00-91.00 83.09±4.60 73.00-88.00 83.00±4.00
IVF 59.00-167.00 119.38±27.62 103.3-234.1 143.0±32.62 64.00-160.0 108.7±28.73 64.00-160.00 108.7±28.72 71.43-231.18 120.83±45.27 76.00-286.00 131.00±60.00
NT SSVLM 41.06-107.55 71.93±20.95 31.08-78.15 57.49±11.49 31.02-109.09 51.91±23.12 31.00-109.09 51.92±23.12 72.14-140.29 95.94±18.27 67.00-138.00 96.00±18.00
PT SSVLM 18.66-40.44 29.63±5.45 25.91-42.75 35.07±3.70 27.05-76.17 56.96±12.72 27.05-76.17 56.96±12.72 18.73-38.56 24.32±4.83 20.00-40.00 26.00±5.00
DQOtLM 1.25-1.63 1.42±0.09 2862-3885 3270±297.3 1.30-1.53 1.42±0.06 1.30-1.53 1.42±0.06 1.21-1.54 1.38±0.09 1.15-1.67 1.39±0.11
Tª LM 14.40-28.50 21.44±3.72 10.80-25.50 18.49±4.23 15.4-29.1 22.08±4.05 15.40-29.10 22.08±4.05 15.00-26.60 20.21±3.51 15.00-26.00 20.00±4.00
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A n e x o s
104
Tabla 32: Media, desviación estándar e intervalos de las variables físico-químicas del efluente por depuradora
EDAR QUART DENIA CASTELLÓN L1 CASTELLÓN L2 CARRAIXET L1 CARRAIXET L2
Características INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV
FÍSI
CO
– Q
UÍM
ICO
EFLU
ENTE
SSTefl 4.00-211.00 48.33±59.23 1.00-10.00 3.95±2.42 5.70-92.00 24.06±25.58 5.00-177.00 24.40±38.07 5.00-25.00 10.00±5.00 4.67-25.00 10.02±5.24
rSST 0.00-95.38 66.66±33.70 94.92-99.49 97.74±1.33 0.00-95.84 77.99±27.93 0.00-97.96 82.20±26.95 88.00-99.00 93.00±3.00 87.75-98.75 92.93±2.87
DQOt 38.00-352.00 101.88±85.55 13.20-31.40 22.60±4.81 20.00-214.00 57.87±48.60 26.00-361.00 58.39±74.93 25.00-63.00 39.00±11.00 25.15-62.85 38.93±10.88
rDQOt 35.65-91.29 75.99±15.76 68.19-96.76 90.47±6.19 36.31-93.61 83.05±15.61 0.00-94.31 83.77±21.72 70.00-95.00 86.00±5.00 70.49-94.77 86.48±4.76
DQOs 34.00-96.00 48.38±13.19 12.90-30.50 20.11±4.73 20.00-97.00 34.35±16.34 23.00-40.00 29.96±3.94 13.00-37.00 25.00±5.00 12.80-36.60 25.49±5.50
rDQOs 52.94-88.68 74.66±9.59 62.18-96.00 83.21±8.32 0.00-89.59 76.40±19.17 37.50-90.04 75.34±13.48 44.00-90.00 70.00±9.00 43.86-90.23 69.50±9.38
DBOf 2.00-19.00 6.19±4.54 4.00-9.00 5.82±1.43 57.69-96.84 87.94±10.35 57.69-96.84 87.94±10.35 19.00-41.00 29.00±6.00 19.00-41.00 29.00±6.00
rDBOf 75.71-98.00 94.22±5.48 80.00-96.00 91.37±4.55 43.21-90.04 78.19±11.01 43.21-90.04 78.19±11.01 29.00-85.00 70.00±12.00 29.00-85.00 70.00±12.00
DBOt 4.00-49.00 17.45±13.12 4.00-9.00 6.47±1.41 4.00-110.00 18.87±24.16 4.00-110.00 16.39±23.26 4.00-14.00 8.00±3.00 4.00-14.00 8.34±2.66
rDBOt 72.78-97.71 92.56±5.74 86.66-97.94 95.19±2.41 15.35-98.26 88.13±17.79 0.00-98.18 89.51±20.18 83.00-97.00 94.00±3.00 83.00-97.39 93.51±2.96
Tabla 33: Media, desviación estándar e intervalos de las variables operacionales por depuradora
EDAR QUART DENIA CASTELLÓN L1 CASTELLÓN L2 CARRAIXET L1 CARRAIXET L2
Características INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV INTERVALO MED±DESV
VA
RIA
BLE
S
OP
ERA
CIO
NA
LES
CM 0.09-0.85 0.25±0.16 0.03-0.19 0.11±0.04 0.10-0.56 0.30±0.11 0.10-0.56 0.30±0.11 0.10-0.51 0.33±0.12 0.10-0.51 0.33±0.12
CMDBO 0.08-0.47 0.20±0.09 0.03-0.19 0.13±0.04 0.15-0.53 0.27±0.10 0.15-0.53 0.27±0.10 0.12-0.43 0.29±0.09 0.12-0.43 0.29±0.09
CMDQOs 0.10-0.49 0.18±0.09 0.03-0.12 0.09±0.02 0.10-0.36 0.21±0.05 0.10-0.36 0.21±0.05 0.08-0.29 0.17±0.05 0.08-0.29 0.17±0.05
TRHr 13.48-21.90 16.83±1.74 12.35-18.86 14.89±1.92 4.87-6.23 5.40±0.38 4.87-6.23 5.40±0.38 5.27-6.85 6.42±0.37 5.27-6.85 6.42±0.37
EF 5.24-28.97 10.57±5.69 10.02-30.45 17.17±5.38 3.12-13.36 7.30±2.74 3.12-13.36 7.30±2.74 3.30-21.70 7.52±5.18 3.30-21.70 7.52±5.18
ODb 4.63-69.44 33.47±18.33 64.48-37.11 55.42±6.48 0.00-50.36 22.28±13.51 0.00-50.36 22.28±13.51 0.00-10.41 0.72±2.38 0.00-10.41 0.72±2.38
ODm 11.81-95.14 61.11±19.62 20.63-38.04 30.22±3.82 20.95-49.19 49.19±20.95 20.95-49.19 49.19±20.95 0.00-23.43 3.62±6.08 0.00-23.43 3.62±6.08
ODa 0.00-40.39 5.43±9.96 7.70-42.26 14.38±7.02 13.29-73.50 39.36±8.53 13.29-73.50 39.36±8.53 66.14-100 95.97±8.45 66.14-100 95.97±8.45
Tº r 28.5-14.4 21.44±3.72 10.80-25.50 18.50±4.23 15.40-29.10 22.09±4.05 15.40-29.10 22.09±4.05 15.00-26.60 20.21±3.51 15.00-26.60 20.21±3.51
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V. Preparación de los reactivos para la técnica FISH
A continuación se describe el protocolo de preparación de los reactivos necesarios en
los procesos de fijación, lavado e hibridación.
Paraformaldehido (para fijación)
o Calentar 65 ml de agua bidestilada hasta 60ºC
o Añadir 4 g de paraformaldehido (PFA)
o Añadir 1 gota de una solución de NaOH 2M y agitar rápidamente hasta
que la solución se haya clarificado.
o Quitar de la fuente de calor y añadir 33 ml de PBS 3X
o Ajustar el pH a 7,2 con HCl
o Eliminar cualquier resto de cristales por filtración a través de 0,2µm
o Enfriar rápidamente a 4ºC y conservar a esta temperatura
Tampón fosfato salino (para fijación)
o Concentración PBS 1X (para fijación, resuspensión)
NaCl 7,60 g
NaH2PO4 H20 1,38 g
Na2HPO4 H20 1,78 g
Agua destilada 1000 ml
pH 7,2
o Concentración PBS 3X (para fijación Inicialmente)
NaCl 22,8 g
NaH2PO4 H20 4,1 g
Na2HPO4 H20 5,3 g
Agua destilada 1000 ml
pH 7,2
Preparación: Primero disolver los fosfatos y luego el cloruro sódico.
Esterilizar por filtración 0,45µm o 0,2 µm y conservar a 4ºC
Solución de gelatina (para preparación de portaobjetos)
o Gelatina………………………………….0,1%
o Sulfato potásico cromato……….0,01% (sigma ref C-59236,12 H2O)
Calentar previamente el agua destilada hasta 60ºC
Fundir la gelatina (100 mg 0,1% + 10mg sal de cromato 0,01 %)
en 100 ml de agua destilada
Enfriar a 50ºC para sumergir los portar.
Solución de limpieza de portaobjetos (para preparación de portaobjetos)
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o Etanol con 10% KOH
Etanol (para deshidratación)
o 50%
o 80%
o 100%
Cloruro sódico 5M (para tampón de hibridación y tampón de lavado)
o Cloruro sódico ……………………………………292,2g
o Agua destilada……………………………………1000 ml
Disolver el NaCl en 800 ml de agua destilada y ajustar el volumen hasta
1 litro. Distribuir en alícuotas. Esterilizar en autoclave 121ºC durante 15
minutos y por filtración.
EDTA 0,5M (cuando la concentración de formamida es mayor o igual a 20%)
o EDTA 2 H2O…………………………………………186,1g
o Agua destilada ……………………………………hasta 1000ml
Preparación: pesar el EDTA y añadir a 800 ml de agua destilada. Ajustar
el pH a 8,0 NaOh (el reactivo no se disuelve hasta ajustar el pH a 8,0).
Completar hasta 1000 ml con agua destilada. Esterilizar en autoclave
121ºC durante 15 minutos y por filtración.
Tris –HCl pH 8,0 (Tampón de hibridación y tampón de lavado)
o Tris Base……………………………………………121,1g
o H-Cl……………………………………………………..42 ml de HCl concentrado
o Agua destilada……………………………………Hasta 1000 ml
Preparación: pesar el Tris y añadir a 800 ml de agua destilada. Añadir 42
ml de HCl concentrado y completar hasta 1000ml con agua destilada.
Esterilizar en autoclave 121ºC durante 15 minutos y filtración.
SDS 10% (para tampón de hibridación y tampón de lavado)
o SDS ……………………………………………………..10g
o Agua destilada ……………………………………hasta 100 ml
Esterilizar por filtración
Agua Mili-Q
Reactivo de montaje
o Vectashield, evita la pérdida de fluorescencia en el montaje de las
muestra para observación en el microscopio.
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VI. Resumen del articulo presentado en V International Conference on
Environmental, Industrial and Applied Microbiology. Madrid,
Spain/ 2-4 October 2013
Identification and abundance of Thiothrix in wastewater treatment
plants treating domestic wastewater using fluorescence in situ
hybridization
V. Romera, A. Zornoza, and J.L. Alonso 1Instituto Universitario de Ingeniería del Agua y Medio Ambiente, Universitat Politècnica de València,
46022 Valencia, Spain
Bacteria that belong to the genus Thiothrix are characterized by distinctive morphological
features, such as filamentous growth and accumulation of sulphur granule when incubated in
the presence of sulphide or thiosulphate. The Thiothrix morphotypes occur in municipal and
industrial WWTPs with and without nutrient removal [1]. Traditionally, the problems of
biological bulking have been monitored by classical microscopy such as morphological
observation and polychromatic staining [2]. Few works have been carried out for the
detection of Thiothrix in WWTP samples with molecular procedures such as the fluorescence
in situ hybridization (FISH) technique. In this study, we investigated several Spanish
WWTPs with the FISH technique to analyze the composition of Thiothix species and their
relathionships with physico-chemical and operational parameters. Samples of activated
sludge were collected from four Spanish WWTPs and analyzed by light microscopy and
quantitative FISH. In the FISH analysis a set of 10 rRNA-targeted nucleic acid FISH probes
covering Thiothrix genus and species were used. The abundance of filamentous bacteria in the
139 activated sludge samples was measured according to the subjective scoring method of
Eikelboom (2000) where observations are rated on scale from 0 (none) to 5 (extensive
growth). Thiothrix filaments were present in the four WWTP analyzed. In 92 (66,2 %) of the
samples, Thiothrix filaments were observed with the probe G123T. It was evident that
mixed populations of Thiothrix spp. were present in the activated sludge samples investigated,
the observed differences were in the relative abundance of the various groups. These findings
were supported by the results obtained using conventional microscopy. T. eikelbomii, T. nivea
and T. fructosivorans were common (FI>3) in two of the four WWTP analyzed. No
fluorescence signal was detected with the probes G1B (T. disciformis), G3M (T. defluvii) and
Meg1028+Meg 983 (Meganema perideroedes). Redundancy analysis (RDA) ordination
diagram (biplot) suggested different behaviour among species within genus Thiothrix. T.
eikelbomii showed a positive relationship with the reactor temperature (Tr). Conversely, T.
fructosivorans was negatively related with Tr. T. nivea and T. fructosivorans were associated
with high sludge retention time (SRT) values and low values of organic loading rate (OLR).
T. nivea showed a positive relationship with the hydraulic retention time (HRT) and negative
with the influent carbohydrates and proteins. T. eikelbomii and T. nivea were associated with
nitrogen and phosphorus deficit (BOD5/TN/TP).
Keywords Thiothrix, WWTP, FISH, activated sludge, bulking
References
[1] Eikelboom D (2000) Process control of activated sludge plants by microscopic investigation. IWA
Publishing, London, England.
[2] Jenkins D., Richard M., Daigger G. (2004) Manual on cases and control of activated sludge bulking
and foaming. Lewis Publishers, Chelsea, Michigan.
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