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EL SULFURO DE HIDRÓGENO Y EL EL SULFURO DE HIDRÓGENO Y EL CARTÍLAGO ARTICULAR
Elena Fernández BurgueraCIBER-BBN, GBTTC-CHUACGrupo de Reumatología
INIBIC-Hospital Universitario A CoruñaA Coruña-España
EL SULFURO DE HIDRÓGENO (H2S)
Pequeña molécula gaseosa
Tóxico a altas concentraciones
2
Olor a huevos
podridos Inhibe la
citocromo C oxidasa
� Primeros estudios: Métodos de detección y prevención de riesgos
TERCER GASOTRASMISOR ENDÓGENO CONOCIDO
Gasotransmisor endógeno
3
Síntesis enzimática a partir de L-cistationina,
homocisteína o L-cisteína y las enzimas:
� CBS: Cistationina-β-sintasa - Citosólica
� CSE/CSH: Cistationina-γ-liasa – Citosólica
� MPST: Mercaptopiruvato azufre transferasa
Citosólica y mitocondrial
Múltiples efectos en diversas dianas biológicas:
� Mecanismos de acción:1) Interacción con los sistemas redox del organismo;2) Modulación de la actividad de los canales de K dependientes de ATP.3) Alteración de la expresión génica mediante la modulación de factores de
transcripción (NFκB), rutas de señalización (p38-MAPK) y otros genes;4) Otras reacciones con diversas proteínas, tales como quelación de
metaloproteínas, formación de enlaces per- y polisulfuro, o sulfuración deproteínas.
PRINCIPALES MECANISMOS DE ACCIÓN ENDÓGENOS
4
proteínas.
c
NIVEL DE H2S ESTÁ REDUCIDO EN ALGUNAS PATOLOGÍAS
5
PRODUCCIÓN ENDÓGENA DE H2S EN LA ARTROSIS
µM H2S en suero N vs OA
S.µ
M
56
150
S.µ
M/m
g te
jido
1,5
µM H2S/mg tejido en Cartílago N vs OA
� Método de medida: microelectrodo ion-selectivo
6
p=0.773N OA
H2S
.µM
p< 0.05
0
50
100
N OAH
2S.µ
M/m
g te
jido
0
0,5
1,0
*
ENZIMAS DE PRODUCCIÓN EN LA ARTICULACIÓN OA
Expresión de las enzimas de producción de H2S en los tejidos de la articulación:
� En hueso subcondral y sinovial no hay diferencias significativas
�En cartílago:
CBS CTH MPST
7
0,00,20,40,60,81,01,2
N OA
Exp
resi
ón re
lativ
a
0,00,20,40,60,81,01,21,4
N OA0,00,20,40,60,81,01,2
N OA
*
p<0.05
Cuantificación enzimas de producción de H2S en cartílago - IHQ
ENZIMAS DE PRODUCCIÓN EN LA ARTICULACIÓN OA
Normal OA
8
� En la OA, la producción endógena de H2S parece estar disminuida, por lo quela adición exógena podría ser beneficiosa.
� Cómo administrar H2S exógeno a las células:
1) Compuestos sintéticos
2) Fuentes naturales de H2S, por ej. aguas mineromedicinales sulfuradas
� Modelo in vitro: condrocitos/cartílago OA co-estimulados con IL-1β y H S
¿SUPLEMENTACIÓN EXÓGENA DE H2S?
9
� Modelo in vitro: condrocitos/cartílago OA co-estimulados con IL-1β y H2S
H2S de fuentes exógenas
CONDROCITOS+ IL-1β, 48h
CARTÍLAGO+ IL-1β, 21d
Efectos en marcadores pro-inflammatorios
SUPLEMENTACIÓN CON COMPUESTOS SINTÉTICOS
NO, iNOSPGE-2, COX2, PTGES
IL-6
Catabolismo
MMP13
� NaSH (disociación instantánea) o GYY4137 (hidrólisis lenta)
� Concentraciones de 50 a 1000 µM (48h)
RNS
10
02468
101214
BA
SA
L 50 100 200 500 1000
µM GYY4137
ROS
Flu
ore
scen
cia
O 2-
* * *
TINCIONES HISTOQUÍMICAS E INMUNOHISTOQUÍMICAS
11
39,6±7,8 4,9±1,1 49,3±6,2 54,4±9,1 31,9±3,4 56,3±5,7
TINCIONES INMUNOHISTOQUÍMICAS
0,5±0,2 10,4±3,2 7,6±3,5 4,3±0,1 0,3±0,1 1,0±0,5
4,0±1,0 84,1±8,2 77,8±5,6 41,4±7,3 33,2±2,9 12,5±3,5
29,7±2,2 18,5±6,7 25,6±3,8 36,1±2,0 24,1±5,6 30,9±3,2
12
AGUAS MINEROMEDICINALES SULFURADAS
� Fuente natural de H2S
� Tienen gran tradición como alternativa terapéutica no farmacológica
� Existen muchas emanaciones en Galicia
� Sector estratégico en Galicia
Carballo
Guitiriz
Lugo
Ley 5/1995, de 7 de junio, de regulación delas aguas minerales, termales, de manantial yde los establecimientos balnearios de laComunidad Autónoma de Galicia que sepromulgó “en atención a la notoria riquezapotencial en aguas minerales, termales y demanantial presentesen el territorio de la
13
Augas Santas
Lugo
21Cuntis Carballiño
manantial presentesen el territorio de laComunidad Autónoma gallega y al beneficioque su utilización -de indudable valorsanitario- tiene para la salud publica, asícomo al potencial desarrollo económico ysocial que su aprovechamiento racionalsupone, ya sea en establecimientosbalnearios por su valor terapéutico, yacomo aguas de bebida envasadas…”
� Reto 3 (RIS3): Novo modelo de vida saudable baseado no envellecemento activo:→ Deseñar novos produtos terapéuticos baseados no valor engadido dos
recursos termais de Galicia.
BALNEOTERAPIA
14
SUPLEMENTACIÓN CON AGUA SULFURADA
Manantial [H 2S] µM
1 70,6
2 27,6
3 64,93
4 16,1
5 14,26
� Agua sulfurada de 5 manantiales
Medio %W %SW
0 100 0
25 75 25
50 50 50
75 25 75
100 0 100
� Medio de cultivo con distintos % de SW
15
� Viabilidad celular en medio de cultivo con distintos % de SW
PTGES
Basal 0 25 50 75 1000
5
10
15
20
25[N
itrito
]
% Agua sulfurada en el medio de cultivo(todas con 5 ng/ml de IL-1β)
SUPLEMENTACIÓN CON AGUA SULFURADA
iNOS
100% W (Basal) IL-1β+100% W
� Condrocitos primarios OAC cultivados (48h) en DMEM reconstituido con distintasconcentraciones de agua sulfurada y estimulados con 5 ng/ml de IL-1β
Basal 0%SW 25%SW 50%SW 75%SW 100%SW0
50
100
150
200
250
300
PTGES
% agua sulfurada en el medio de cultivo
Exp
resi
ón
rela
tiva
Basal0%SW
25%SW50%SW
75%SW100%SW
02000400060008000
100001200014000
COX-2
% agua sulfurada en el medio de cultivo
Exp
res
ión
re
lativ
a
Basal0%SW
25%SW50%SW
75%SW100%SW
015
0030
0045
00
iNOS
% agua sulfurada en el medio de cultivo
Exp
res
ión
rel
ativ
a
Basal0%SW
25%SW50%SW
75%SW100%SW
0500
1000150020002500300035004000
MMP13
% agua sulfurada en el medio de cultivo
Exp
resi
ón
rela
tiva
IL-1β+25% SW
IL-1β+75% SW IL-1β+100% SW
IL-1β+50% SW
W: agua destilada; SW: agua sulfurada
16
OBJETIVOS
� Valorar si los efectos beneficiosos encontrados en los modelos in vitro se
reproducen en la articulación artrósica in vivo.
Para ello:
� Inducir OA mecánica:
1. Cuantificar [H2S] en líquido sinovial y sangre durante el estudio.
MODELO IN VIVO –ARTROSIS QUIRÚRGICA
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1. Cuantificar [H2S] en líquido sinovial y sangre durante el estudio.
2. Analizar escalas del dolor, valoración goniométrica y de la rigidez articular.
3. Cuantificar marcadores de la inflamación, de estrés oxidativo y degradación de
cartílago:
→Mediante histopatología y biología molecular en el tejido de la rodilla
→En suero
4. Estudiar la síntesis y la actividad de las enzimas de producción del H2S en la
articulación.
0 7 1530
CIRUGIA
TRATAMIENTO
[H2S] endógeno (sangre y liq. sinovial)
EUTANASIA1 mes
MODELO IN VIVO – ARTROSIS QUIRÚGICA
ACLIMATACIÓN
Se realizará el modelo de artrosis quirúrgica en ambas rodillas de cada una de lasratas, quitando el menisco medial y seccionando el ligamento colateral medial.
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Grado de dolor
- [H2S] endógeno (sangre y liq. sinovial)- Ejercicio y tamaño+goniometria
� IHQ y expresión génica de marcadores de inflamación, oxidación y degradación en tejido� IHQ Col II, agrecano, MMPs � IHQ y expresión génica de enzimas de producción de H2S� Marcadores de inflamación, oxidación y degradación de cartílago en suero
� Control 30: (5) Cirugía bilateral y ningún tratamiento.Eutanasia a los 30 días para estudiar la artrosis generada enel día 0.
� Control 60: (5) Cirugía bilateral y ningún tratamiento.Eutanasia a los 60 días para estudiar la artrosis generada ycompararla con los tratamientos.
� (6) Baño una vez al día en agua sulfurada (20 minutos). Cinco días de tratamiento y dos de descanso durante 3 semanas.
GRUPO CONTROL (10)
GRUPO BALNEOTERAPIA
(6+6)
TRATAMIENTOS
19
� (6) Placebo en agua corriente
� (6) Liberación de sulfuro de hidrógeno intra-articular losdías 0, 7 y 15.
� (6) Placebo inyección suero salino
(6+6)
GRUPO INTRAARTICULAR
(6+6)
GRUPO ORAL (6+6)
� (6) Una vez al día, durante 3 semanas, 1 ml de aguasulfurada mediante jeringa o sonda. Cinco días de terapiay 2 de descanso.
� (6) Placebo con agua corriente
19
CONCLUSIONES
� La biosíntesis de H2S en el cartílago OA está reducida
� La suplementación exógena con compuestos sintéticos que liberan H2S tiene
efectos anti-inflamatorios, anti-oxidantes y anti-catabólicos en condrocitos OA y
en cartílago OA
20
� La suplementación exógena con agua mineromedicinal sulfurada también tiene
efectos anti-inflamatorios y anti-oxidantes en condrocitos OA
� Mediante un modelo de artrosis quirúrgica se evaluará si estos efectos se
reproducen in vivo, y, en caso afirmativo, se determinará cual es la vía de
administración más efectiva
GBTTC
Elena F. BurgueraJoana Magalhães
Lucía GatoTamara Hermida
Dr. Francisco J. Blanco
Rheumatology GroupINIBIC-Hospital Universitario de A Coruña
Colaboradores
Ángela Vela AneroRosa Meijide Faílde
21
Noemí GómezMª Cristina ÁlvarezCristina Rodríguez
Purificación FilgueiraNoa Goyanes
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