Generalidades de Tecnicas de tincion en histologia

Barrera Briseño Nancy Karina

Técnicas de tinción en histología

Laboratiorio de Biolocia Celular

Medicina 1er. Semestre Dr. Horacio|

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIAFacultad de Medicina y Psicología

Introducción

Tinción de Gram; Permite diferenciar entre dos grupos de bacterias:

- Bacterias Gram positivas- Bacterias Gram negativas

Imagen tomada de: BIOLOGÍA (2º BACHILLERATO A DISTANCIA):

TUTORÍAS EN LA WEB Paloma Román Gómez 2008

http://perso.ya.com/geopal/biologia_2b/unidades/ejercicios/act5bact

ema7.htm

Por ello se desarrollaron unas

técnicas conocidas como tinciones

Para poner de manifiesto las diferentes estructuras que

integran una sección histológica, es necesario crear

artificialmente un contraste diferencial entre los diversos

elementos del tejido.

Una tinción es un procedimiento para

visualizar un tejido que puede implicar el

uso de uno o varios colorantes de modo

simultáneo o sucesivo.

¿Que es una tinción?

Citología cervicovaginal teñida con Papanicolau

ColorantesPrimero, debemos definir qué son estas sustancias,

su conformación, clasificación y otros aspectos

importantes

Naturaleza química de los colorantes

Un compuesto químico es coloreado porque sus moléculas absorben

cuantos de radiación electromagnética en la parte visible del espectro.

En las moléculas orgánicas

Los dobles enlaces se alternan

con sencillos provocando que

los electrones del enlace se

muevan de un átomo al otro

cambiando las posiciones de

los enlaces.

Generalmente, los colorantes presentan

anillos aromáticos en su estructura.

Características de los

colorantes

Un colorante

debe ser capaz

de realizar dos

cosas:

1.- Teñir o

colorear

2.- Unirse a las

estructuras

celulares

Molécula

orgánica

Teñir

Unirse

COLORANTE

Los colorantes suelen ser moléculas

orgánicas que presentan anillos aromáticos

y que absorben la luz visible por efecto de

los electrones asociados a combinaciones

de átomos llamados Cromóforos.

Capacidad de teñir

Espécimen histológico de tejido pulmonar humano teñido con hematoxilina y eosina.

Anillo

aromático++

Grupo

cromóforo

Cromógenos

Para que el colorante pueda teñir un

tej ido ha de ser capaz de unirse a

las estructuras celulares. El

elemento químico que le confiere

esta capacidad se denomina grupo

Auxocromo

Capacidad de unirse

Tinción simple con cristal violeta de Staphylococcus aureus, nos proporciona información sobre la forma y la agrupación en racimos

COLORANTE

Cromógeno

Gpo. Cromóforo

Gpo. Auxocromo

Principales grupos

Básicos

Aminas primarias NH2

Aminas secundarias NHR

Aminas terciaciarias NR2

Ácidos

Hidroxilo –OH

Carboxilo –COOH

Sulfhidrilo SH2

Gpo. Auxocromo

El grupo nitro -NO2

El grupo nitroso –N=O

El grupo indamina (imino) >C=N-

El grupo azo –N=N-

Configuración quinonica

Gpo. Cromóforo

Clasificación de colorantes

Por origen Por gruposPor

incorporación

ClasificaciónDe los colorantes por grupo

SEGÚN EL GRUPOCROMOFORO

SEGÚN EL GRUPO AUXOCROMO

Básicos o catiónicos

Azul de metileno

Nitrados Acido pícrico

Ácidos o aniónicos

Eosina Colorantes azoicos Orange G, Sudan negro, etc

Sin carga (neutros)

IsiotiocianatosÁcido + Básico

Derivados del xanteno Eosina Y, Fluoresceína sódica

Derivados de la acridina Acriflavina

Derivados de las iminasquinónicas

Orceína

Derivados de diarilmetanos y triarilmetanos

Amino-triarilmetanos

Derivados de la antraquinona Rojo nuclear rápido

Derivados de las ftalocianinas Azul alcián

Flavonoides Hematoxilina

ClasificaciónDe los colorantes por incorporación

COLORANTES VITALES COLORANTES DE EXCLUSIÓN

Aquellos que son captados únicamente por células vivas

Solo son incorporados por células muertas presentes en cultivo

Son a los que se les permite la entrada a través de la membrana.

Se basa en que la membrana de las células muertas no es capaz de funcionar como barrera de entrada

para ese colorante.

Ej. Rojo neutro y verde Janus Ej. Azul tripán

La tinciones mas habituales son:Tetraciclinas, Alizarina, Colorantes de tipo

Procion.-

Permiten estudiar el crecimiento del tejido óseo

Cuantificar la proporción de células vivas (no teñidas) o detectar mortalidad en cultivos celulares.

Naturales Artificiales

Hematoxilina Azul de metileno

Carmín Safranina

Azafrán Azul de anilina

Orceína Naranja G

ClasificaciónSe pueden clasificar, en función de su origen, en naturales y artificiales. Por

ejemplo:

Tinción de hematoxilina-eosina. Esclerosis segmentaria con formación de sinequias. Intersticio con infiltrado linfocitario. Fibrosis y atrofia tubular (x 400).

Fibras elásticas teñidas con orceína nítrica (flechas) x 400.

CELULAS EPITELIO BUCAL: 400X

¿Como se unen los

colorantes al tejido?

¿Cuáles son los

fenómenos fisicoquímicos

implicados?

MECANISMOS DE UNIÓN Tinción-Sustrato

Relaciones electrostáticas Acido-Base

Enlaces coordinados, mordientes y quelantes

Aumentan la reactividad del tejidoestableciendo una interacción

tejido colorante.

Enlaces covalentes Isiotiocianatos - Sustrato

Puentes de hidrógenoColorante-sustrato en soluciones

no acuosas

Interacciones hidrófobas en la disolución diferencial: coloraciones

de lípidosFuerzas de Van der Waals

Impregnaciones

El colorante forma agregados metálicos insolubles que quedan retenidos en el tejido gracias a la

malla molecular creada en el proceso de fijación.

Esto ocurre porque los iones del colorante unidos

al sustrato cambian la longitud de onda de

absorción de luz y, por lo tanto, el color observado

del objeto teñido es distinto al del colorante libre.

MetacromasiaSi es azul ¿Por qué tiñe de rojo?

Cromotrópicos

Antes de continuar

debemos definir algunos

conceptos

Glosario de términos relacionados

con las tinciones

Término Definición

Mordiente Reactivo que aumenta la reactividad del tejido estableciendo una interacción tejido colorante

Alumbre Modifica el colorante añadiéndole grupos auxocromos y confiriéndole un carácter muy básico

Coloración indirecta en un tiempo Aquella en la que el tratamiento del tejido con el colorante y el mordiente se realiza simultáneamente en una misma solución

Coloración indirecta en dos tiempos Cuando colorante y mordiente actúan separadamente

Glosario de términos relacionados

con las tinciones

Término Definición

Tinción progresiva Tinciones en las que los colorantes y mordientes se aplican siguiendo una secuencia definida y bajo estricto control de los tiempos para lograr una intensidad determinada.

Tinción regresiva Primero se sobre colorea y posteriormente se elimina el exceso de colorante por diferenciación

Diferenciacion Consiste en eliminar el exceso de colorante mediante agentes diferenciadores (disoluciones alcoholicasde acidos o alcalis, etanol, acetona, etc.)

Tinciones más

utilizadas

Tinción de hematoxilina-

eosina. Esclerosis

segmentaria con formación de

sinequias. Intersticio con

infiltrado linfocitario.

Fibrosis y atrofia tubular

(x 400).

Tinción general, contiene un colorante básico para las

estructuras acidas como (ADN Y ARN) y otro acido para el

citoplasma y estructuras extracelulares.

Hematoxilina: C.I. 75290) es un compuesto que se obtiene

de la planta leguminosa Haematoxylum campechianum ,

conocida también con el nombre de palo de Campeche.

Requiere ser oxidada para convertirse en una molécula

coloreada. AZUL

Eosina: Derivado halogenado del xanteno. Molécula

autofluorescente por sus átomos halógenos y es soluble

en agua y en alcoholes lo que le confiere mucha

versatilidad para la tinción histológica. Presenta un cierto

carácter ácido. ROSA

Hematoxilina-eosina

Ejemplos de tinciones

tricrómicas:

El tricrómico de Masson

El tricrómico de Van Gieson

Es una técnica para la coloración de fibras

colágenas y elásticas. Se observan colores

distintos; tejido conjuntivo de verde, tejido

muscular de verde pardo, eritrocitos de

rojizo, núcleos azul negro y citoplasma y

fibras musculares rosa.

Tricrómicos

Extensión de sangre

periférica (Tinción May

Grünwald- Giemsa):

eritrocitos de tamaño y

contenido de hemoglobina

inferior al normal

característicos de la Anemia

de Cooley

Es una tinción general que se emplea mucho

en hematología, permite distinguir, por su

coloración, los gránulos de los diferentes

leucocitos polimorfonucleares. Contiene una

mezcla de colorantes catiónicos (azul de

metileno) y aniónicos (eosina)

Giemsa

Citología ginecológica

Tinción de Papanicolaou

Coloración histológica empleada

principalmente para extensiones citológicas,

sirve para la detección precoz del carcinoma

de cérvix. Contiene una mezcla de

colorantes que no produce sobre coloración.

Normalmente tiene 4 colorantes: uno nuclear

(hematoxilina), eosina Y, que tiñe de rosa el

citoplasma, verde brillante que tiñe el moco

y Orange G que tiñe la queratina.

Papanicolau

Tinciones aplicables a

tejidos concretosAlgunas tinciones nos sirven para teñir ciertos tejidos específicos, a

continuación veremos los ejemplos mas relevantes.

TINCIONES APLICABLES A TEJIDOS CONCRETOS

Tejido nervioso Impregnaciones argénticas

Tejido conjuntivoTécnica de reticulina, de Wigert de

resorcina-fucsina, etc.

Musculo estriadoTinción de hematoxilina

fosfotúngstica ácida PTAH

HuesoExigen descalcificación o desgaste.

Coloración con tionina o tinción negativa

HigadoH-E, Tinción tricrómico, reticulina, PAS y PAS-distasa, azul de Pearls.

Neurona

TINCIONES APLICABLES A TEJIDOS CONCRETOS

RiñónH-E, PAS, tricrómico y técnica de

metenamina de plata.

PielPAS, Técnica de argentafinidad de

Masson Fontana, Tricrómico de Gallego

Microorganismos en diversos órganos

Hongos – PAS o meteanina de plata de Grocott

Bacterias: Gram, Ziehl Neelsen, Giemsa

Riñon H-E

Piel Tricrómico de Gallego

Gram

Tinciones

subcelularesEn microscopia óptica también podemos resaltar e identificar determinados

orgánulos mediante tinciones mas o menos especificas y diferenciales. A

continuación se citan ejemplos de métodos de tinción mas utilizados:

TINCIONES SUBCELULARES

Núcleo

EN CORTES. Hematoxilina férrica, safranina-light green o verde metilo.EXTENSIONES CROMOSOMICAS. Carmín acético u Orceína acética.

NucléoloGrumos de Nissil: azul toluidina, violeta de cresilo y verde metilo-pronina

MitocondriaEN CELULAS VIVAS. Verde JanusEN CORTES. Fucsina de Altmann

Aparato de Golgi Impregnaciones argénticas

Gránulos de secreción y cuerpos de inclusión

Método de Mann, con eosina amarillenta y azul de metileno, posterior diferenciación en Orange G.

Vacuolas de los fagocitos

Se inyecta al animal una suspensión de partículas de carbón antes de obtener el tejido. Las células que fagocitan el carbón las acumulan en sus vacuolas de fagocitosis.

Impregnaciones

ArgénticasSe le denomina así a toda coloración histológica en la que se emplean sales

metálicas para generar precipitados metálicos sobre estructuras que se pretenden

destacar.

1. IMPREGANCION PRIMARIA

Los tejidos don expuestos a una solución ligeramente alcalina en

la que hay una concentración no muy alta de AgNO3 que proporciona

iones de plata en exceso

2. SEGUNDA FASE

Los cortes son tratados con una solución (hidroquinona y sulfito)

que captura parte de los iones de plata que se han unido débilmente al

tejido

Impresiones ArgénticasImplica 2 pasos

Tinción negativaNo todos los colorantes se unen a las

estructuras tisulares. Algunas tinciones se

basan en la exclusión de la coloración. El

contraste negativo consiste en teñir todo

menos la estructura que queremos visualizar.

Referencias

ATLAS de HISTOLOGÍA VEGETAL y ANIMAL, Departamento de Biología Funcional y Ciencias de la Salud. Facultad de

Biología. Universidad de Vigo. España Recuperado el 25 de Agosto del 2014 de:

http://webs.uvigo.es/mmegias/inicio.html

TÉCNICAS DE TINCIÓN HISTOLÓGICA, Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina. Departamento de Anatomía

Patológica. Recuperado el 25 de Agosto del 2014 de:

http://www.uam.es/departamentos/medicina/patologia/Tecnicas.htm

Técnica de Tinción de Gram, Paloma Román Gómez 2008. Consejería de educación comunidad de Madrid. Recuperado el 07

de Septiembre del 2014 de:

http://perso.ya.com/geopal/biologia_2b/

"Spunic". (s.f.). COLORACIÓN. 27 de Septiembre del 2014, de Rincón del vago Sitio web:

http://html.rincondelvago.com/coloracion.html

Ilarraza Aleida. (4 de junio de 2011). HEMATOXILINA-EOSINA. 27 de Septiembre del 2014, de Blogspot Sitio web:

http://hematoxilina-eosina-uc.blogspot.mx

Gracias

¿Que es un cuanto?

¿Qué es la radiación electromagnética?

Molécula orgánica

Espectro visible

Enlaces conjugados

Resonancia

Cromóforos

Mordiente

Fuerzas de Van der Waals

Metacromasia

Alumbre

Tinción Argéntica

Preguntas

información extra

¿Que es un cuanto?

• Un quantum o cuanto es la menor cantidad de

energía que puede transmitirse en cualquier

longitud de onda.

• Considerado el creador de la teoría cuántica, el

físico alemán Max Planck enunció que la radiación

electromagnética se emite en unidades discretas de

energía denominadas quantum o quantos.

http://www.astromia.com/glosario/quantum.htm

¿Qué es la radiación electromagnética?

• La radiación electromagnética es un tipo de campo

electromagnético variable, es decir, una

combinación de campos eléctricos y magnéticos

oscilantes, que se propagan a través del espacio

transportando energía de un lugar a otro

http://blog.educastur.es/proyectosiesvegadeo/files/2010/01/la-radiacion.pdf

Molécula orgánica

• Compuesto orgánico o molécula orgánica es una

sustancia química que contiene carbono, formando

enlaces carbono-carbono y carbono-hidrógeno

http://es.wikipedia.org/wiki/Compuesto_org%C3%A1nico

Espectro visible• Se llama espectro visible a la región del espectro electromagnético

que el ojo humano es capaz de percibir. A la radiación

electromagnética en este rango de longitudes de onda se le llama

luz visible o simplemente luz. No hay límites exactos en el espectro

visible: un típico ojo humano responderá a longitudes de onda de

400 a 700 nm, aunque algunas personas pueden ser capaces de

percibir longitudes de onda desde 380 hasta 780 nm.

http://es.wikipedia.org/wiki/Espectro_visible

Enlaces conjugados

• Un sistema conjugado se da cuando en un compuesto

químico con enlaces simples y dobles alternados, los

electrones que forman los enlaces dobles se deslocalizan,

es decir, se sitúan de manera uniforme alrededor del

compuesto. Estos electrones deslocalizados no forman en

realidad enlaces dobles entre dos átomos en particular,

sino que pertenecen a todo el grupo de átomos, y le dan

más estabilidad y fuerza al enlace simple, sin llegar a ser

un doble enlace.

http://es.wikipedia.org/wiki/Compuesto_org%C3%A1nico

Resonancia

• La Resonancia (denominado también Mesomería) en

química es una herramienta empleada

(predominantemente en química orgánica) para

representar ciertos tipos de estructuras moleculares. La

resonancia consiste en la combinación lineal de estructuras

de una molécula (estructuras resonantes) que no coinciden

con la estructura real, pero que mediante su combinación,

nos acerca más a su estructura real.

http://www.ecured.cu/index.php/Resonancia_qu%C3%ADmica

Cromóforos

• Un cromóforo es la parte o conjunto de átomos de una

molécula responsable de su color. También se puede

definir como una sustancia que tiene muchos electrones

capaces de absorber energía o luz visible, y excitarse para

así emitir diversos colores, dependiendo de las longitudes

de onda de la energía emitida por el cambio de nivel

energético de los electrones, de estado excitado a estado

fundamental o basal.

http://es.wikipedia.org/wiki/Crom%C3%B3foro

Radical químico incorporado a una molécula orgánica y responsable del

color.

Los Cromóforos mas abundantes en colorantes biológicos son:

El grupo nitro -NO2

El grupo nitroso –N=O

El grupo indamina (imino) >C=N-

El grupo azo –N=N-

Configuración quinonica

Mordiente

• Aquella sustancia que sirve para unir un colorante a un

sustrato. // Reactivo que aumenta la reactividad del tejido

estableciendo una interacción tejido-colorante// Reactivos

mordientes. Son los reactivos o sustancias que preparan al

tejido para la coloración

http://www.ecured.cu/index.php/Reactivos_mordientes

Fuerzas de Van der Waals

• En fisicoquímica, las fuerzas de Van der Waals, o

interacciones de Van der Waals, es la fuerza atractiva o

repulsiva entre moléculas (o entre partes de una misma

molécula) distintas a aquellas debidas al enlace covalente

o a la interacción electrostática de iones con otros o con

moléculas neutras.

http://es.wikipedia.org/wiki/Fuerzas_de_Van_der_Waals

Metacromasia

• Ocurre porque en la reacción del colorante con

determinadas estructuras las moléculas de colorante se

aproximan mucho entre ellas, de modo que se produce un

cambio en su rango de absorción lumínica lo que hace que

eras estructuras se vean de diferente color.

Alumbre

• Se trata de un tipo de reactivo utilizado en los procesos de

tinción. Esta constituido por una sal doble de sulfato de un

metal trivalente y otro monovalente. Generalmente, los

metales son aluminio y potasio o amonio (NH4). El alumbre

modifica el colorante añadiéndole grupos auxocromos y

confiriéndole un carácter muy básico.

Tinción Argéntica

• La tinción argéntica es el uso de plata (en latín, Argentum)

para modificar selectivamente el color o la apariencia de un

objeto. Es una técnica frecuente de tinción en histología

donde se utiliza para revelar detalles extremadamente

finos.

http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_arg%C3%A9ntica

Tinción Negativa

• Tinción negativa es una técnica de microscopía que permite

contrastar las muestras mediante una sustancia opaca a los fotones

(microscopía óptica) o a los electrones (microscopía electrónica). En

el primer caso, se emplea nigrosina o tinta china; para el caso de

bacterias que esporulan, esta técnica permite visualizar las esporas

como entes refringentes sobre un campo de fondo oscuro.1 En caso

de microscopía electrónica de transmisión, se emplean sustancias

de alto número atómico que, por tanto, resultan opacas a los

electrones transmitidos. Típicamente, estas sustancias son acetato

de uranilo, citrato de plomo o molibdato de amonio. Al electrónico,

esta técnica permite visualizar virus, flagelos, bacterias y otros entes

de escaso tamaño.

http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_negativa