1 Estadistica Aplicada Cm r

Su aliado estratégico

SEMINARIO INTERNACIONALEstimación de la incertidumbre y validación de métodos. 1

Instructor: Lic. Sergio Gustavo Chesniuk

Email: [email protected]éfono: +54 351 4710602

Skype: sergio.chesniuk

Mayo 27 - 28 del 2010Barranquilla ‐ Colombia



Jueves 27/05 Viernes 28/05

Introducción a la estadística para los

cálculos de incertidumbre

Validación de métodos de ensayo

microbiológicos

Estimación de la Incertidumbre



Se pretende que al finalizar la disertación el participante sea capaz adquirir información suficiente para afrontar la estimación de la incertidumbre en sus métodos de ensayos químicos y microbiológicos



http://www.metroquimica.com.ar/cursos/moodle/course/view.php?id=107

Contraseña: controlmetrologico



•ISO/IEC 17025:2005 Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y de calibración

•International Vocabulary of Metrology — Basic and general concepts and associated terms (VIM). JCGM 200:2008

•Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement , BIPM, IEC, IFCC, ISO, IUPAP, IUPAC, OIML (1995) y su actualización: ISO/IEC Guide 98-3:2008

•EURACHEM / CITAC Guide. Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement. Second Edition (2000).

•Harmonized Guidelines for Internal Quality Control in Analytical Chemistry Laboratories. IUPAC. 1995.

•Series ISO 5725 (Partes 1 a 4), First edition (1994) & corrigendums.

•Handbook for Calculation of Measurement Uncertainty in Environmental Laboratories (Nordtest, Finlandia, 2003)

•Uncertainty of quantitative determinations derived by cultivation of microorganisms. ADVISORY COMMISSION FOR METROLOGY. Chemistry Section. Expert Group for Microbiology. Seppo I. Niemelä Helsinki 2003

•ISO/TR 13843 F – Water quality – Guidance on validation of microbiological methods. First edition (2000)



Fuente: Analytical chemistry at the interface between metrology and problem solving. M. Valcarcel , B. Lendl. Trends in Analytical Chemistry, Vol. 23, No. 8, 2004





Parámetros estadísticos usados en el tratamiento de datos analíticos

QUIMIOMETRIAQUIMIOMETRIA

Estadística aplicada a los datos químico-analíticos, cuyo objetivo es ampliar y mejorarla información analítica con ahorro de tiempo y esfuerzo

CUALIMETRIACUALIMETRIA• QUMIOMETRIA• INFORMATICA• CALIDAD

Las herramientas cualimétricas









Triángulo de Pascal



Distribución binomial





Distribución de Poisson

•Es un caso especial de la distribución binomial•Asociada con eventos raros•Tiene a la normalidad cuando λ es grande



Distribución BinomialNegativa

•Cuando k tiende a infinito (desagrupamiento) la distribución converge a Poisson•Cuando k tiende a cero (agrupamiento) a la distribución logaritmica





Relaciones entre distribuciones de frecuencias



Funciones transformación






Estimador del valor central

Media aritmética

Las herramientas cualimétricas.Media y Varianza.

Estimador de la dispersión

Varianza






Parámetros estadísticos que estiman el valor central

Media aritmética Mediana Moda

( )

Se ordenan los datos según su magnitud y se elige/n el/los central/es

(semisuma).

Es el valor mas frecuente de la

distribución



Poblaciones y muestras

Las herramientas cualimétricas. Distribución Normal.

n Media aritmética

Desviación estándar

Población ∞ (n > 30) µ σMuestra (n < 30) sx





Herramientas para graficar mediciones repetitivas Histogramas

Curva de distribución

normal

# clases = n

Área total = 1 (100%)


SEMINARIO INTERNACIONALEstimación de la incertidumbre y validación de métodos.

La ecuación de la curva viene dada por la expresión

Los valores de x están distribuidos normalmente conpromedio µ una varianza σ2

]2/)(exp[2

1)( 22 σµπσ

−−= xxf

),( 2σµNx ≈



Función de densidad de probabilidad normal para distintos valores de µ2 y σ2.



La desviación estándar, σ, mide la distancia desde la media, µ, hasta elpunto de inflexión de la curva.

Un 95% de los valores están comprendidos en el interyalo µ 1,9600σ.

Un 99% de los valores están comprendidos en el intervalo µ 2,576σ.

Un 99,7% de Ios valores están comprendidos en eI intervalo µ 3,290σ.





Estandarización de variables

Planillas decálculo, tablas

σµ−

=xz

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛−=

2exp

21)(

2zzfπ



Intervalos de confianza

Para una distribución normal el 95 % de los datos cae dentro de los límites z=-1,96 a z=1,96 (µ 1,96σ)

Los promedios de las muestras tambien se

distribuyen normalmente

Existe un 95 % de probabilidad de que (estimador de µ) este

comprendido en ese rango X



Para muestras grandes (n>30), los límites de confianza de la media vienen dados por :

nzσµ ±Donde z depende del nivel de confianza requerido

Para el 95%, z = 1.96Para el 99%, z = 2.58Para el 99.7%, z = 2.97



Las herramientas cualimétricas. Distribución t de Student.

Para muestras pequeñas (n<20), los límites de confianza de la media vienen dados por :

ntsx ±Donde t depende del nivel de confianza requerido y los grados de libertad.



El teorema del límite central proporciona el fundamento estadístico quepermite esperar dicha tendencia de los datos experimentales.

“Aún cuando la población original no esté distribuida normalmente,tiende a la distribución normal cuando aumenta n” (valores medios)

Las herramientas cualimétricas.Teorema del límite central.




Función estadística básica de MS-Excel para el cálculo de la probabilidad en función de t,

grados de libertad y número de colas



Distribución t (tablas o planilla de cálculo)




Desviaciones de la normalidad

Asimetría positiva

Asimetría negativa

Curtosis negativa



En el trabajo analítico suelen presentarse a menudo comparaciones en lasque intervienen más de dos medias.

Ejemplos

Comparar la concentración media de proteína en una solución para muestras almacenadas en condiciones diferentes

Comparar los resultados medios obtenidos de la concentración de un analito utilizando diferentes métodos

Comparar la media de los resultados en una valoración obtenidos por diferentes operadores que usan los mismos aparatos

Determinar una varianza de muestreo

Las herramientas cualimétricas. Anova



ANOVA se utiliza para “analizar medidas que dependen de varios tipos de efectos que actuan

simultáneamente con el doble fin de decidir cuales de ellos son importantes y de poder estimarlos”

(Scheffé, 1953)

Compara medias de diversos conjuntos, a través de sus varianzas



Es posible separar la variación debida al error aleatorio de cualquier otra variación provocada al cambiar el factor de control. Podemos así evidenciar si una modificación del factor de control genera diferencias significativas entre los valores medios obtenidos.

Es posible separar la variación debida al error aleatorio de cualquier otra variación provocada al cambiar el factor de control. Podemos así evidenciar si una modificación del factor de control genera diferencias significativas entre los valores medios obtenidos.

41

Posibles fuentes de variación

Errores aleatorios Factor controlado

Para los ejemplos anteriores

Condiciones bajo las cuales se almacenó la solución

Método de análisis empleado

Operadores que realizaron la titulación



ANOVA puede emplearse en situaciones donde existe más de unafuente de variación aleatoria

Por ejemplo: Una situación de muestreo

Las muestras se toman al azar



Ambos tipos de análisis estadísticos, en donde hay un factor,ya sea controlado o aleatorio, además del error aleatorio delas medidas, se conoce como ANOVA de un factor

Este tipo de análisis, con mayor grado de dificultad, también esaplicable a situaciones más complejas en las que existen dos omás factores, posiblemente interactuando entre sí



Ejemplo:

Ejercicio interlaboratorio: Se comparan k laboratorios que determinan nj veces la concentración de una determinada especie en una misma muestra con un mismo método.

Quien patrocina el ejercicio intentará detectar si alguno de los laboratorios genera resultados estadísticamente diferentes al resto

Hipótesis a cumplirse

• Los conjuntos de datos son independientes entre si

• La distribución de los datos obtenidos para cada conjunto es normal

• Las varianzas de cada conjunto de datos no difieren significativamente





Medida de dispersión

dentro de los laboratorios

Medida de dispersión entre los

laboratorios

( ) ( ) ( )∑∑∑∑∑ −+−=−i

iik

iyii j

y xxnxxxx 222

TSS RSS labSS

)()1(

kNSSkSSF

R

labcal −

−=



Si Fcal > Ftab

Al menos uno de los laboratorios genera

valores diferentes del resto



ANOVA no nos indica cuantos laboratorios difieren entre si ni cuales son

ANOVA evidencia o no la existencia de diferencias significativas entre laboratorios

Pero ...



Ejemplo:Se analizan los resultados obtenidos en una investigación acerca de laestabilidad de un reactivo fluorescente en diferentes condiciones de almacenamiento. Los valores dados son las respuestas de fluorescencia(en unidades arbitrarias) de soluciones diluidas de la misma concentración. Se tomaron tres medidas sobre cada muestra.

Condiciones Medidas repetidas Media A recientemente preparada 102, 100, 101 101 B una hora en la oscuridad 101, 101, 104 102 C una hora con luz tenue 97, 95,99 97 D una hora con luz brillante 90, 92, 94 92

Media global 98



[04/07/00 21:46 "/Data1" (2451852)]One-Way ANOVA on columns selected between

Col(A) -> Col(D):

Data Mean Variance N------------------------------------------------------------A 101 1 3B 102 3 3C 97 4 3D 92 4 3------------------------------------------------------------F = 20.66667p = 4.00152E-4------------------------------------------------------------At the 0.05 level,the means are significantly different.



Fuente: Estadística y Quimiometría para Química Analítica. 4ta Ed. Miller & Miller

Varianza en la medida

Varianza muestral

20σ21σ





Grupos Cuenta Suma Promedio VarianzaFila 1 4 395,2 98,8 0,006666667Fila 2 4 396,0 99,0 0,086666667Fila 3 4 394,4 98,6 0,06Fila 4 4 390,4 97,6 0,1Fila 5 4 398,0 99,5 0,073333333

Grupos Cuenta Suma Promedio VarianzaFila 1 4 395,2 98,8 0,006666667Fila 2 4 396,0 99,0 0,086666667Fila 3 4 394,4 98,6 0,06Fila 4 4 390,4 97,6 0,1Fila 5 4 398,0 99,5 0,073333333

Origen de las variaciones

Suma de cuadrados

Grados de libertad

Promedio de los

cuadradosF Probabilida

dValor crítico

para F

Entre grupos 7,84 4 1,96 30 5,343E-07 3,05556828Dentro de los

grupos 0,98 15 0,065333333

Total 8,82 19

Origen de las variaciones

Suma de cuadrados

Grados de libertad

Promedio de los

cuadradosF Probabilida

dValor crítico

para F

Entre grupos 7,84 4 1,96 30 5,343E-07 3,05556828Dentro de los

grupos 0,98 15 0,065333333

Total 8,82 19

Cuadrado medio entre muestras =

varianza de muestreo!

21

20 σσ n+



Métodos ampliamente utilizados en el campo del análisis instrumental

Se calculan los resultados y se evalúan los errores aleatorios de una manera diferente a la que se utiliza cuando se repite una solamedición varias veces

Permite trabajar en un intervalo amplio de concentraciones

Curva de calibración (señal vs [analito])

Comparación de dos métodos analíticos

RL puede aplicarse en:

Las herramientas cualimétricas. Regresión lineal



Grado de linealidad en nuestro intervalo de trabajo

Límites de confianza para la pendiente y la ordenada en el origen de la recta

Errores y límites de confianza para la concentración determinada de una muestra incógnita

Límite de detección del método (menor concentración de analito que se puede detectar con un nivel de confianza predeterminado)

y = bx + a

Pendiente

Ordenada al origen

Parámetros a tener en cuenta



Análisis de regresión: Curva de Calibración

La concentración de muestras incógnita se determina generalmente por interpolación y no por extrapolación

Inclusión de muestra blanco

Utiliza dos suposiciones básicas

Los errores en la calibración sólo ocurren en los valores de ordenadas (señal)

La magnitud de los errores en ordenadas es constante (homocedasticidad) e independiente de la concentración de analito



y = bx + a

Grado de linealidad

Coeficiente de correlación r



y = bx + a

Interpretaciones erróneas de r

Es necesario tambien efectuar la representación gráfica y tal vez un

test estadístico

t se compara con el valor tabulado para el nivel de significación deseado usando un prueba t de dos colas y (n-2) grados de libertad.

H0 : no existe correlación entre x e y.

Si tcal > ttab , H0 debe rechazarse.



Para y = bx + a

El método de los cuadrados mínimos encuentra la recta de regresión de y sobre x que mejor se ajusta a nuestros puntos experimentales

La obtención de rectas de regresión ponderadas se adaptan mejor al problema pero requieren informacion adicional respecto a los errores en distintos niveles de concentración



Errores en la pendiente y ordenada al origen

y = bx + a



Es posible obtener los límites de confianza para la pendiente y la ordenada al origen de nuestra recta de ajuste

b ± tSb a ± tSa

Para un nivel de confianza deseado y (n-2) grados de libertad

y = bx + a



Cálculo de una concentración

x0 = (y0 – a)/b

Señal obtenida de la incógnita

Error asociado a X0

De determinación compleja



Expresiones aproximadas comúnmente utilizadas

Solo una lectura de y0

m lecturas de y0

Los límites de confianza se calculan como: x0 tsx0 , con (n-2) grados de libertad para los niveles de confianza deseados



Forma general de los límites de confianza para una concentración dada empleando una recta de regresión no ponderada



Ejemplo

Mediante Espectrometría de Absorción Atómica se obtuvieron la siguientes respuestas para soluciones patrón de mercurio (UAA: Unidades Arbitrarias de Absorbancia)

[Hg] µg/l Respuesta (UAA)

0 2.12 5.04 9.06 12.68 17.3

10 21.012 24.7



y = 1.9304x + 1.5179R = 0.9989

05

1015202530

0 5 10 15

[Hg] / ppb

Res

pues

ta /

UAObtención de la pendiente, ordenada al origen y coeficiente

de correlación (software)



El coeficiente de correlación es significativo?

H0: No existe correlación entre x e y

tcal = 47.6

t0.025, 5 = 2.57

Se rechaza H0:

Existe correlación significativa al 95 % entre x e y



[05/11/00 20:46 "/Graph1" (2451853)]

Linear Regression for DATA1_B:

Y = A + B * X

Parameter Value Error

------------------------------------------------

a 1.51786 Sa = 0.29494

b 1.93036 Sb = 0.0409

------------------------------------------------b = 1.93 2.57 * 0.0409 = 1.93 0.11

a = 1.52 2.57 * 0.2949 = 1.52 0.76

Cálculo de límites de confianza para b y a

Valor de t (n-2) = 5 al nivel de confianza del 95 %



Cálculo de una concentración

Para la curva de calibración anterior, determinar los valores de x0 y sx0 y los límites de confianza de x0 para soluciones cuyas respuestan son 2.9, 13.5, y 23.0 UA.

A partir de x0 = (y0 – a)/b obtenemos los valores de x0 respectivos:

0.72, 6.21 y 11.3 µg/L

Utilizando y números precedentes:

Obtenemos los valores sx0 respectivos: 0.26, 0.24, 0.26. Los límites de confianza al 95 % (t = 2.57) son:

0.72 0.68, 6.21 0.62 y 11.3 0.68 µg/L respectivamente



0 2 4 6 8 10 120

5

10

15

20

25

Res

pues

ta /

UA

[Hg] / ppb

Linear Fit of Data1_B Upper 95% Confidence Limit Lower 95% Confidence Limit

Hacia el centro de la curva los intervalos de confianza decrecen

En los extremos de la curva los intervalos de confianza se incrementan



Límite de detección

Aquella concentración que proporciona una señal en el instrumento significativamente diferente (¿?) de

la señal del “blanco” o señal de fondo

Cantidad de concentración de analito que proporciona una señal igual a la señal del blanco, yB, mas tres

veces la desviación estándar del blanco , sB

y – yB = 3sB



Suposición: La variación está distribuida normalmente (solo en y) con una desviación estándar estimada por sy/x (es por ello que las distribuciones de las curvas en la grafica tiene la misma amplitud).



Obtención de los términos yB y sB utilizando una recta de regresión convencional para la calibración

Se utiliza sy/x en lugar de sB para estimar el limite de detección

a puede utilizarse como una estimación de yB (la señal del blanco)



Ejemplo:

Estimar el limite de detección para el ejemplo anterior (curva de calibración para patrones de mercurio)

Utilizamos: y – yB = 3sB

1.52 + 3 * 0.4329 = 2.82 (señal estadísticamente distinguible de la línea de fondo),

Introducimos este valor en x0 = (y0 – a)/b

[Hg]límite = 0.67 µg / L





Al ser un método de extrapolación es menos preciso que uno de interpolación

Método de las Adiciones Estándar

Minimiza el efecto matriz

Se agregan cantidades conocidas de un determinado analito a una misma muestra o a porciones de ésta y se representa la curva.

Se debe extrapolar a y = 0

La desviación estándar del valor extrapolado se calcula según:

Al aumentar n mejora la precisión al igual que maximizando:

Los limites de confianza se calculan como xE ± tsxE



Desde las ecuaciones anteriores se obtiene que: a = 0.3218 y b = 0.0186.

Su cociente proporciona el valor de [U] en la muestra: 17.3 µg/L.

Los limites de confianza son calculados teniendo en cuenta:

Ejemplo:

La [U] en una muestra de orina de un trabajador de una mina de este metal, es determinada por técnicas voltamperométricas con preconcentración utilizando el método de las adiciones estándar:

U adicionado, µg/L en lasolucion de la muestra original

0 5 10 15 20 25 30

Corriente de pico / µA 0.32 0.41 0.52 0.60 0.70 0.77 0.89



Entonces sxE = 0.749, por lo tanto los límites de confianza son:

17.3 ± 2.57 * 0.749 = (17.3 ± 1.9) µg/L



Comparacion de métodos analíticos

Identificación de errores sistemáticos

Se utilizan para intervalos relativamente grandes de concentración

En cada eje se representan los resultados de cada método a analizar

Si se utiliza el método de los cuadrados mínimos debe colocarse en el eje x el método analítico mas preciso (referencia), (este método no admite error en el eje de abscisas)

Recientemente se ha desarrollado el test conjunto para la ordenada al origen y la pendiente considerando errores en ambos métodos analíticos (RIU 1996)

Si los dos métodos comparados producen resultados que no difieren significativamente a un nivel de significancia α la ordenada de la recta de regresión no ha de ser estadísticamente diferente de 0 y la pendiente no ha de serlo de 1

Supone que los errores en el eje de ordenadas son constantes



Situacion ideal: a = 0, b = r= 1 curva a

Un error sistemático proporcional: b ≠ 1 curva b

Un error sistemático constante: a ≠ 0 curva c

Error sistemático constante + error sistemático proporcional + errores aleatorios: curva d



El nivel de plomo de diez muestras de jugo de fruta se determinó por un nuevo método de análisis potenciométrico de redisolución (APR) empleando un electrodo de trabajo de carbono vítreo, y los resultados fueron comparados con los obtenidos mediante la técnica de espectrometría de absorción atómica de llama (EAA). Se obtuvieron los siguientes datos (todo los resultados en µg/L).

Ejemplo

Muestra EAA APR1 35 352 75 703 75 804 80 805 125 1206 205 2007 205 2208 215 2009 240 25010 350 330



y = 0.9634x + 3.8666R2 = 0.9891

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 50 100 150 200 250 300 350 400

EAA [Pb] / ug/L

APR

[Pb]

/ ug

/L



El nivel de plomo de diez muestras de jugo de fruta se determinó por un nuevo método de análisis potenciométrico de redisolución (APR) empleando un electrodo de trabajo de carbono vítreo, y los resultados fueron comparados con los obtenidos mediante la técnica de espectrometría de absorción atómica de llama (EAA).Se obtuvieron los siguientes datos (todo los resultados en µg/L).

Ejemplo

Desde las expresiones anteriores:

a = 3.87, b = 0.968, r = 0.9945

sy/x = 10.56, sa = 6.64, sb = 0.0357

Para 8 grados de libertad y 95 % de confianza: t = 2.31

a = 3.87 15.34 y b = 0.968 0.083

No existe diferencia significativa entre 0 y 1 respectivamente (valores ideales)



Ensayos prácticos y simulaciones muestran que esta aproximación conduce a resultados fiables siempre y cuando:

El método mas preciso se represente en el eje x

Se comparen al menos 10 puntos

El rango de concentración de interés esté cubierto uniformemente por

puntos experimentales



mxpss *0 +=

La función precisión





La desviación estándar de una predicción sobre la concentración viene dada por:



Regresión lineal ponderada con Origin





Asegurar y Controlar la Calidad

Infraestructura del Aseguramiento de la Calidad

Elección del Método Analítico

Control de Calidad Interno

Pruebas de Aptitud



Procedimientos para el control de calidad interno

Búsqueda de errores sistemáticos y aleatorios superiores a lo aceptable

Referencia

Errores Sistemáticos

Duplicación

Errores Aleatorios



•Diagramas de Shewhart para valores individuales

•Diagramas de Shewhart para valores medios

•Diagramas de Shewhart para rangos de valores

Control de calidad interno. Gráficos de control



σ Capacidad del proceso

Gráficos de control. Diagramas de Shewhart para valores individuales



99.8 % 95 %

1.96s

-1.96s

3.09s

-3.09s

Basado en medidas previas

Permite verificar si nuestro sistema está bajo control

estadístico

Para valores pequeños de n debe

emplearse t




99.7 %

95 %

Permite verificar si nuestro sistema está bajo control

estadístico

Para valores pequeños de n debe

emplearse t




Ejemplos

Efectos que pueden detectarse en gráficos de control

Gráficos de control. Diagramas de Shewhart para valores medios



Aplicables a:

>> Diagramas de Shewhart de valores individuales>> Diagramas de Shewhart de valores medios

Debe dividirse el gráfico en

Gráficos de control. Las reglas de Western Electric (Western Electric 1956)



Se considera que el procedimiento analítico se encuentra fuera de control cuando:

1 punto mas allá de la zona de control o acción P < 0.3%.

2 de 3 puntos consecutivos en la zona de control P < 0.0625%.

6 puntos consecutivos en línea ascendente o descendente.

9 puntos consecutivos a un lado de la línea central.

14 puntos consecutivos alternando arriba o abajo (cíclicos o series temporales).

15 puntos consecutivos en la zona de control.

4 de 5 puntos consecutivos en la zona de aviso o mas allá.

8 puntos consecutivos por encima y por debajo de la zona de control: 2 poblaciones

diferentes.



Detectan cambios en la variabilidad del

procedimiento analítico

Gráficos de control. Diagramas de Shewhart para rangos



Gráficos de control. Ejemplos



Docente: Lic. Sergio Chesniuk

¡¡MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCION!!

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1 Estadistica Aplicada Cm r