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Las enzimas como herramientas
analíticasanalíticas
Dr. José Luis Cárdenas López
Las enzimas como herramientas analíticas
• Enzimas endógenas
• Enzimas exógenas• Enzimas exógenas
• Desarrollo de biosensores
Enzimas exógenas usadas para monitorear calidad de pescado
Enzima Medición Referencia
5’-Nucleotidasa, nucleosido
fosforliasa, xantina oxidasa
K-value (Lou, 1998)
Alcohol dehidrogenasa Etanol en pescado
enlatado
(Gill, 1990)
Diamina oxidasa, peroxidasa Histamina (Lopez-Sabater et al., 1993)
ELISA Identificación de
especies
(Carrera, 1996)
Glutamato dehidrogenasa Amoniaco (Huss, 1995) Glutamato dehidrogenasa Amoniaco (Huss, 1995)
Octopina dehidrogenasa, piruvato
oxidasa
Frescura de Scallops (Shin et al., 1998)
Purina nucleosido fosforilasa, xantina
oxidasa
ATPasa (Cheun et al., 1996)
Putrescina oxidasa Poliaminas (Chemnitius et al., 1992)
Trimetillamine dehidrogenasa Trimetilamina (Wong and Gill, 1987)
Ureasa Urea (Sheppard et al., 1996)
Xantina oxidasa Hipoxantina (Shen et al., 1996)
Análisis Principio Ventajas Desventajas Referencia
Hx · enzimas (xantina
oxidasa, XO)
inmovilizadas en una
· simple de usar tira de
ensayo
· rápido
· simple de usar fuera
del laboratorio
· semicuantitativo
· solamente puede
medir Hx (estados
finales del deterioro)
Jahns et al. (1976)
Hx, Ino · ensayo en tira, con
enzimas inmovilizadas
· rápido
· simple de usar fuera
del laboratorio
· semicuantitativo
· baja reproducibilidad
· limitado a Hx e Ino
(estados finales del
deterioro)
Ehira et al.(1986)
Relacionadas con degradación de nucleótidos
IMP, Ino, Hx · enzima cubierta con
electrodo de oxígeno
· rápido
· exacto
· más complicado y
consume más tiempo
que la tecnología de la
prueba mediante tira
Karube et al.(1984)
Indice-K · ensayo de enzima
acoplado "KV-101
Medidor de Frescura"
· rápido
· resultados
comparables a HPLC
· deben adquirirse
enzimas y reactivos
· ¿costo?
· disponible
comercialmente de
Orienta Electric, Niiza
Saitama 352, Japón
Indice-K · enzima cubierta con
electrodo de oxígeno
"Microfresh"
· rápido
· resultados
comparables a HPLC
· ¿costo? · disponible
comercialmente de
Pegasus Instruments,
Agincourt, ON, Canadá
• El etanol ha sido usado por muchos años como un indicador objetivo para la calidad de los productos pesqueros
• Puede ser obtenido a partir de carbohidratos por fermentación anaeróbica (glucólisis), y/o deaminación y decarboxilación de aminoácidos como la alanina, es un metabolito común a una gran variedad de bacterias
Etanol
• Ha sido usado para medir objetivamente la calidad de una variedad de pescados, incluyendo atún enlatado
• El medio más simple y confiable para medir etanol en el tejido de pescado es el uso del equipo para la prueba de enzima comercial, disponible de Boehringer Mannheim (Alemania) o de Diagnostic Chemicals (Charlottetown, P.E.I, Canadá)
• La ventaja de emplear etanol como indicador de deterioro es su estabilidad al calor (a pesar de ser volátil) y puede ser usado para evaluar la calidad de productos pesqueros enlatados
Las aminas biogénicas: histamina, putrescina y
cadaverina
H2N-(CH2)n-NH2
n=4: Putrescine; n=5: Cadaverina
u Formada por la biodegradación de los
aminoácidos ornitina y lisina por la
acción de bacterias de putrefacción
Sobresaturan las enzimas degradantes de
Histamina
u Formada por la decarboxilación de
histidina catalizada por las enzimas de
los microorganismos
N
NH
NH2
u Sobresaturan las enzimas degradantes de
la histamina, realzando el efecto tóxico
de la histamina
los microorganismos
u Estimula la contracción y relajación del
músculo liso
u Estimula neuronas sensoras y motoras
u Controla la secreción de ácidos
gástricos
amina oxidasa de cobre (AO)
u Fuentes biológicas : bacterias, hongos, plantas,
animales
u Funciones biológicas: involucradas enc crecimiento
celular, proliferación and diferenciación
u Cofactores:
Polímero Redox Activo(PVI13-dmeOs)
N
NN
N
a
b
O
NH
Reacción: R-CH2-NH2 + H2O + O2 → R-CHO + NH3 + H2O2
Topa quinona (TPQ) Cobre
Os
N
N N
NCl
2+/ 3+O
OH OCu(II)&
AOox
Eappl.= +200 mVvs. Ag/AgCl
Electrode
2e-
NH
NCH2
CH2
NH2NH3
Histamine
Mecanismo de trabajo para los electrodos
(monoenzimática)
AOred
NH
NCH2
CHO
OH2
Imidazoleacetaldehyde
Mecanismo de trabajo para los electrodos
(BIenzimática)
NH
NCH2
CH2
NH2
OH2
Histamine
AOox(TOPA -native)
H2O2
OH2
HRPred
HRPox
(Fe3+- native)
(Fe4+ = O, P+ inactive)
2e- Eappl.= -50 mVvs. Ag/AgCl
Electrode
2 Os2+
2 Os3+
2e-
NH
NCH2
OHC
NH3
Imidazoleacetaldehyde
AOred
(TOPA -inactive)O2
(Fe = O, P inactive)
Electrode type C
Electrode type DNo Os2+/3+
Muestras de pescado- (turbot)
15
20
25
30fish kept at -20°Cfish kept at 25°Cg h
ista
min
e/kg fish
0
5
10
0 2 4 6 8 10 12
•Contenido de histamina de pescado turbot en dos diferentes temperaturas (-20 y 25°C) analizado por el método de electródo bi-enzimático
g h
ista
min
e/kg fish
Days
AOox
AOred
ElectrodeH2O2
O2
NH
NCH2
CH2
NH2
NH
OH2
NH3
Histamine
+
+
Oxidación del producto de la rx de histamina
AOox
Eappl.= +200 mVvs. Ag/AgCl
Electrode
2e-
H2O2
NCH2
CHO
NH3
Imidazoleacetaldehyde
NH
NCH2
COOH
Imidazoleacetic acid
+
Putrescina y cadaverina forman compuestos cíclicos - ¡no se pueden oxidar más!
NH2
NH3
+
+ O2 + H2OAO
N
+ H2O2 + NH4+
Putrescine
1-Pyrroline
- H2O
NH2
O
NH3
+
NH2
+ O2 + H2OAO
N
+ H2O2 + NH4+
Cadaverine
1-Piperideine
- H2O
O
NH2
ELISA para
identificar
especies
Octopina deshidrogenasa para
medir frescura en escalopas
(NH2)2CO + H2O → CO2 + 2NH3
Ureasa
• Usada para medir amoníaco
• Amoníaco criterio de calidad microbiana • Amoníaco criterio de calidad microbiana
(tardía) de PM
• En A. clínicos la actividad de ureasa puede ser
indicadora de muchas condiciones patológicas
(piedras en vías urinarias, úlceras y males del
hígado)
Ureasa
• Hay muchos métodos para inmovilizar ureasa
y estimar la urea en muestras de pescado
• Paper usando conjugado de fulereno-ureasa
del 2013 en un electrodo potenciométricodel 2013 en un electrodo potenciométrico
– óptico[Kovacs, 2003], amperométric [Rajesh ,
2005; Tiwari, 2009;Kuralai 2006 ], térmico[Fulton,
1980; Xie, 1996] conductométrico[Castillo-Ortega,
2002], and potenciométrico [Ahuja, 2008, 2011;
Chen 2009]
Lo cotidiano
• Enzimas comerciales para medir algún
atributo
• Precio $$ y disponibilidad