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La Fermentación Alcohólica

Felipe Laurie

Facultad de Ciencias AgrariasUniversidad de Talca

Fermentación alcohólica

Levaduras

C6H12O6 2CH3CH2OH + 2CO2

pm 180 pm 46

Manejo de las fermentaciones

Primera decisión

¿Inocular o no inocular?

Orígenes de Saccharomyces

• Flora de la viña

• Flora de la bodega

• Inóculo

Fermentaciones con inóculo

• Levadura seca activa

• Cultivo líquido en el jugo

• Pie de cuba

• Nivel: 105 a 106 células/mL

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Fermentaciones con flora nativa

• No hay inoculación deliberada con saccharomyces

• ¿Beneficios?

• ¿Perjuicios?

Beneficios de la inoculación

• Fermentación predecible

• Menor probabilidad de defectos

• Neutralidad aromática

Perjuicios de la inoculación

• Fermentación muy rápida

• Menor complejidad

• Mucho aroma a levadura

Segunda decisión

¿Promover o reprimir flora de la uva?

Flora de la uva

• Bacterias:– Bacillus

– Pseudomonas

– Micrococcus

– Bacterias lácticas

– Bacterias acéticas

• Hongos• Levaduras

Flora de la uva

• Bacterias:• Hongos– Aspergillus

– Penicillium

– Rhizopus

– Mucor

– Botrytis

• Levaduras

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Flora de la uva

• Bacterias:• Hongos• Levaduras– Kloeckera/hanseniaspora

– Metschnikowia pulcherrima

– Hansenula species

– Candida species

– Saccharomyces

Microflora de la baya

• 95 a 98 % de los microorganismos son bacterias y hongos

• 2 a 5 % son levaduras (principalmente del género Hanseniaspora and Metschnikowia

• Levaduras no Saccharomycespresentes a 105-106 organismos/mL, mientras que Saccharomyces: 102-103

células/mL

Factores que afectan la microflora de la baya• Lluvia• Temperatura• Insectos vectores• Altitud• Pesticidas en la viña• Variedad de uva (Ej. racimos

cerrados)• Etc.

Factores que afectan la persistencia de microflora en mosto/jugo

• pH (<3.5 inhibe bacterias, no levaduras)

• Temperatura (baja temp inhibe bacterias y selecciona para levaduras no saccharomyces)

• Oxígeno (Falta de oxígeno inhibe hongos y bacterias aeróbicas. Es estimulatorio para levaduras).

Factores que afectan la persistencia de microflora en mosto/jugo

• Nutrientes (Composición del mosto/jugo, correcciones, tiempo de adición).

• Presencia de inhibidores (Fungicidas del campo y SO2).

• Interacciones microbianas (producción de inhibidores, competencia x nutrientes, estimulación).

Factores que afectan la persistencia de microflora en mosto/jugo

• Prácticas de inoculación (inoculacióntemprana con dosis altas)

• Prácticas de bodega (sanitización, SO2, nutrientes, temperatura de fermentación, etc.)

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Para promover fermentaciones con levaduras nativas

• No inocular con Sacchamoryces

• Agregar nutrientes temprano (molienda)

• Mantener el mosto/jugo a bajas temperaturas

• No muy bajo SO2

• Ajustar pH

Para reprimir fermentaciones con levaduras nativas

• Adición de SO2 temprana

• Inoculación temprana con Sacchamomyces

• Dosis alta de Saccharomyces

• Agregar nutrientes después del establecimiento de Sacchamomyces

• Evite incubaciones a bajas temps.

Monitoreo de fermentación

Monitoreo de:

• Consumo de azúcar

• Disponibilidad/consumo de nitrógeno

• Flora microbiana

• Actividad microbiana

• Cambios en acidez

Cinetica de fermentacion Cárménere 2007

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Días de fermentación

Temperatura ºC

990

1010

1030

1050

1070

1090

1110

Densidad gr/l

Temperatuta Densidad

Monitoreo de consumo de azúcares:

• Densímetros

• Evolución de CO2

• Pérdida de glucosa/fructosa

• Evolución del etanol

• Cambios de temperatura

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Monitoreo de niveles de nitrógeno:

• Aminoácidos

• Nitrógeno fácilmente asimilable

• NOPA (N por OPA)

Monitoreo de flora microbiana:

• Observaciones al microscopio

– Conteos totales

– Evaluación cualitativa

• Siembra (conteo en platos)

– Conteos totales viables

– Medios de cultivo diferenciales

Monitoreo de la actividad microbiana:

• Acidez volátil

• Vinyl fenoles

• Ac. sulfhídrico

• Evaluación olfativa

Monitoreo de cambios en acidez:

• Acidez titulable

• pH

• Análisis de ácidos– Cromatografía

– Electroforesis capilar

– Métodos enzimáticos

– Etc.

Estrategia de monitoreo

• Tiempo (oportunidad)

• Número de veces

• Costo

• ¿Es toda esta información necesaria?

Temperatura de fermentación

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Alta temperatura

• Alta tasa de fermentación

• Reprime diversidad de flora

• Mejora extracción (tintos)

• Mayor pérdida de aromas por volatilización

• Aumenta riesgo de paralización de fermentación

Baja temperatura

• Favorece flora no Saccharomyces

• Mejor retención de volátiles

• Tasa de fermentación más lenta

Biología de Levaduras

Ecología de levaduras

• Levadura = Hongo unicelular– Requiere fuente de carbono y nitrógeno

– No móvil

– Reproducción vegetativa (gemación y fisión)

– Reproducción sexual en algunas especies (meiosis)

– Heterótrofos

Ecología de levaduras

• Levadura = Hongo unicelular– Ascomicetes y basidiomicetes

– Saccharomyces cerevisiae : Primer genoma eucariótico secuenciado

Ecología de levaduras

• Anamorfos : Forma asexual de especies con reproducción sexual. Ej. Brettanomyces

• Teleomorfos: Estado de reproducción sexual. Ej. Dekkera

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www.mansfield.ohio-state.edu/

www.whatischurch.comwww.biochem.wisc.edu/

Monopolar, multipolar, bipolar

• Esporulación

Células vegetativa2N 4 x 1N

Espora

Asca

La fermentación alcohólica: Biología de levaduras

Fermentación alcohólica

• Conversión microbiológica de azúcares de la uva (glucosa y fructosa) a etanol.

• En términos genéricos: Se produce fermentación cuando un compuesto orgánico sirve como aceptor terminal de electrones.

Fermentación alcohólica

• Conducida por las levaduras:– Saccharomyces cerevisiae, o

– Saccharomyces bayanus

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Saccharomyces

• Eukariote: Posee una membrana nuclear

Núcleo Retículo endoplasmático

El núcleo está rodeado por una doble membrana.La membrana externa es contigua al retículo endoplasmático

Saccharomyces

• No móviles

Glucólisis

• Reacciones bioquímicas de conversión de hexosas (6 C) a compuesto tricarbonado (piruvato) con emisión de energía almacenada en la forma de ATP

Glucólisis

Glucosa + 2 ATP + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi

2 Piruvato + 4 ATP + 2 NADH + calor

Glucólisis glucosa

glucosa-6-fosfato

fructosa-6-fosfato

fructosa 1,6-difosfato

dihidroxiacetona fosfato gliceraldehido 3-fosfato

1,3 -difosfoglicerato

3-fosfoglicerato

2-fosfoglicerato

fosfoenolpiruvato

piruvato

fructosaATP

ATP

NAD+

NADHATP

ATP

Glucólisis

• Consume 2 ATP

• Produce 4 ATP

• Producción neta: 2 moléculas de ATP

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Formación del etanol

• Los productos terminales de la glucólisis son: Piruvato y NADH (cofactor reductor)

• Las levaduras regeneran el NAD+ transfiriendo una molécula de hidrógeno (electrón) al acetaldehído

Formación del etanol

CH3-CO-COOH

CO2↑ + CH3-CHO

CH3-CH2OH

NADH

NAD+H+

Piruvato

Acetaldehído

Otros microorganismos usan distintas estrategias para regenerar NAD+, produciendo una amplia variedad de productos distintos al etanol.

Distribución de Carbón al final de la fermentación• Etanol + CO2 = 95%• Nuevas células = 1 %• Otros productos terminales = 4%– Piruvato– Acetato– Acetaldehído– Glicerol– Lactato

Fermentación

1M glucose (fructose)

2 M CO2 + 2 M ethanol

Levaduras convierten azúcares a etanolincluso en presencia de oxígeno

Selección y nutrición de levaduras

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Elección de levaduras

• Término de fermentación

( a sequedad)

• Buena tasa de fermentación

• Tolerancia a etanol

• Tolerancia a temperatura

• SO2 tolerancia

Elección de levaduras

• Baja producción de aromas/sabores no deseados– Volátiles de azufre– Ácido acético– Etilcarbamato

• Baja inhibición de otros microorganismos deseados

• Resistencia a factor killer• Producción de aromas deseados

Nutrición de levaduras

• Macro nutrientes: Necesarios para la formación de nuevo material celular

• Micro nutrientes: Catalizadores de rx bioquímicas

Macro Nutrientes

• Carbón/fuentes de energía: Glucosa, fructosa, sacarosa, y sustratos oxidativos(piruvato, glicerol, etanol, etc.)

• Fuentes de nitrógeno: aminoacidos, amonia, bases nucleotídicas, péptidos

• Fuentes fosfatadas: Fosfato inorgánico y orgánico

• Fuentes sulfuradas: Sulfato inorgánico y compuestos de sulfato orgánicos

Micro Nutrientes

• Minerales y elementos traza: Mg, Ca, Mn, K, Zn, Fe, Cu

• Vitaminas: Biotina (la única requerida. El resto son estimulatorias).

Fases de fermentación

# cels

Tiempo

Acostumbramiento

log

Estacionaria

muerte

Brix

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Factores de supervivencia

• Oxígeno

• Ácidos grasos

• Esteroles

• Factores nutricionales

Rol de los factores de supervivencia

• Mantener viabilidad de células

• Aumentar la tolerancia a etanol

• Mantener la generación de energía