2.18 Calidad Nutritiva de Los Alimentos

2.18. Calidad nutritiva de los alimentos

Francisca Prez Llamas Elvira Larqu Daza Salvador Zamora Navarro

1. Introduccin

2. Concepto de calidad nutritiva

3. Valoracin energtica de los alimentos

4. Valoracin fsico-qumica de los alimentos4.1. Anlisis general de los alimentos

4.1.1. Agua4.1.2. Cenizas totales4.1.3. Protena bruta4.1.4. Extracto etreo4.1.5. Fibra bruta4.1.6. Materia extractiva libre de nitrgeno

4.2. Anlisis especficos de los alimentos4.2.1. Protena y aminocidos4.2.2. cidos grasos y colesterol4.2.3. Azcares y almidones4.2.4. Fibra alimentaria4.2.5. Minerales4.2.6. Vitaminas

5. Valoracin biolgica de los alimentos5.1. Diseo de un experimento biolgico5.2. Estudios de utilizacin digestiva5.3. Estudios de utilizacin metablica5.4. Estudios biolgicos especficos de la protena5.5. Estudios biolgicos especficos de vitaminas5.6. Otros ndices biolgicos

6. Valoracin microbiolgica de los alimentos

7. Valoracin de sustancias antinutritivas en los alimentos7.1. Sustancias antinutritivas que afectan a las protenas7.2. Sustancias antinutritivas que afectan a los hidratos de carbono7.3. Sustancias antinutritivas que afectan a los lpidos7.4. Sustancias antinutritivas que afectan a las vitaminas7.5. Sustancias antinutritivas que afectan a los minerales

Captulo 2.18.

Calidad nutritiva de los alimentos

8. Resumen

9. Bibliografa

10. Enlaces web

n Definir el concepto de calidad nutritiva de un alimento.n Identificar los diversos tipos de tcnicas que se aplican en la valoracin de la calidad nutritiva de un alimento.n Conocer cmo se estima el valor energtico bruto y la energa metabolizable de un alimento.n Conocer cmo se realizan los anlisis fsico-qumicos que permiten valorar el contenido en principios inmediatos

de los alimentos.

n Identificar los anlisis fsico-qumicos especficos en los alimentos de mayor inters desde el punto de vista nutricional.

n Conocer las implicaciones de la valoracin biolgica de los alimentos y la informacin que aportan estos ensayos.

n Ser capaces de disear un laboratorio para realizar estudios de digestibilidad y de balance.n Diferenciar los conceptos de digestibilidad, coeficiente de digestibilidad aparente y verdadero, as como retencin

porcentual de un nutriente.

n Definir otros ndices biolgicos de inters como el ndice de eficacia alimentaria, coeficiente de eficacia en cre-cimiento, y valor productivo de la protena.

n Conocer la forma de valorar la capacidad de mutagnesis de sustancias qumicas que puedan estar presentes en los alimentos.

n Identificar y determinar la presencia de sustancias antinutritivas en los alimentos.

Objetivos

Los alimentos estn constituidos por una gran diversidad de sustancias de distinta naturaleza que pueden agruparse segn las siguientes categoras:a) Compuestos nutritivos. Son sustancias que pueden ser utilizadas por el organismo en su metabolismo y que desempean funciones bien estableci-das. En esta categora, que representa la fraccin mayoritaria del alimento en sustancia seca (90%), se incluyen protenas, hidratos de carbono, lpidos, mi-nerales y vitaminas.

b) Compuestos sin carcter nutricional que se encuentran presentes de forma natural en los alimentos. En este grupo se incluyen sustancias que pueden tener efectos beneficiosos en el consumidor, como ciertos polifenoles (resveratrol, isoflavonas) y pigmentos liposolubles (licopeno, zeaxantina), o bien todo lo contrario, como son las sustancias antinutritivas (avidina, antitripsinas, fitatos, oxalatos) o los propios txicos naturales (micotoxinas y venenos de ciertas setas).

c) Compuestos presentes en los alimentos de forma accidental o fortuita, procedentes del medio ambiente y generalmente debido a la accin contaminante del hombre. Son los contaminantes, tales como metales pesados (plomo, mercurio, cadmio), restos de plaguicidas, anabolizantes, etc. Deben encontrarse en una concentracin inferior a los lmites mximos permitidos para que el alimento que los contiene sea considerado apto para el consumo humano.

d) Compuestos de origen exgeno presentes en los alimentos, adicionados de forma voluntaria por el hombre con un fin determinado, como facilitar el procesado de los alimentos, mejorar las propiedades organolpticas o aumentar la fecha de consumo preferente, algunos pueden tener carcter nutricional (vitaminas C y E). Se trata de los aditivos, que se aaden en concentraciones cuyos lmites han sido previamente establecidos por comisiones de expertos.

El conocimiento de todas las sustancias que constituyen los alimentos, y el estudio de su utilizacin (digestiva y metablica) por el organismo, son necesarios para valorar o establecer la calidad nutritiva de los mismos. Se han desarrollado diversos tipos de tcnicas, tanto in vitro como in vivo, que permiten conocer la calidad nutritiva de los alimentos. La utilidad de los mtodos analticos a emplear siempre depender del objetivo del estudio. Si ste es conocer la utilizacin digestiva y/o metablica que el organismo hace de un nutriente, sin duda, el ms apropiado es el mtodo biolgico. No obstante, tambin hay que decir que se han diseado tcnicas fsico-qumicas, como en el caso de la valoracin de la calidad proteica, que permiten resultados prximos a los obtenidos por los mtodos biolgicos.

1. Introduccin

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Captulo 2.18. Calidad nutritiva de los alimentos

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F. Prez Llamas | E. Larqu Daza | S. Zamora Navarro

En este Captulo se describen diversos mtodos analticos que en la actualidad se aplican en la valo-racin de la calidad nutritiva de los alimentos, des-de diversos puntos de vista: valoracin energtica, fsico-qumica, biolgica y microbiolgica, haciendo especial referencia a las tcnicas oficiales de anli-sis de los alimentos, las cuales han sido establecidas por diversos comits de expertos, ofrecen garan-tas de reproducibilidad y son aceptadas interna-cionalmente, por lo que deben ser las utilizadas co-mo referencia.

2. Conceptode calidad nutritiva

La calidad nutritiva de un alimento, propiamente dicha, viene determinada tanto por la cantidad co-mo por la calidad de los nutrientes que contiene. Estos dos aspectos, cantidad y calidad, permi-ten diferenciar entre dos conceptos, el de calidad nutritiva terica, es decir, su aporte en nutrien-tes (composicin qumica), y el de calidad nutriti-va real, que hace referencia a la proporcin de los mismos que puede ser aprovechada por el organis-mo, tanto en el contexto digestivo como en el me-tablico (biodisponibilidad).

Sin embargo, en los alimentos existen no slo nutrientes, sino tambin otra serie de componen-tes de carcter no nutritivo, como ya se ha indica-do. Es por ello que el concepto de calidad nutriti-va debe ser considerado en un sentido ms amplio, contemplando otros puntos de vista.

Por un lado, es necesario valorar la calidad sa-nitaria o microbiolgica de los alimentos, que es-t relacionada con el grado de contaminacin y, por tanto, determina y establece el posible nivel de peligrosidad de un alimento para el potencial consumidor. La ingestin de un alimento conta-minado puede ocasionar alteraciones de mayor o menor gravedad, como infecciones, intoxica-ciones o toxiinfecciones alimentarias, segn sea el agente causal (microorganismos patgenos, toxinas, o ambos), desencadenando tanto gas-troenteritis como procesos alrgicos. En otros casos, estos trastornos pueden ser ocasiona-dos no por un material bitico (bacterias, virus, parsitos), sino por un material abitico, es de-cir, por sustancias qumicas txicas (metales pe-

sados, restos de plaguicidas o de anabolizantes, etc.), de uso muy extendido.

En ocasiones, este fenmeno de la contamina-cin es un proceso extraordinariamente raro, y el contaminante se encuentra en el alimento de for-ma muy excepcional, pero otras veces puede ser consecuencia de los propios procesos que dan ori-gen a los alimentos, como son los lugares donde se producen, almacenan, transportan, etc. En este se-gundo caso, el proceso de contaminacin es sufi-cientemente posible, y el alimento requiere de tra-tamientos tan importantes como la esterilizacin, la pasteurizacin, etc. Con todo ello, lo que se pre-tende es asegurar la calidad sanitaria del alimento que impida el primer paso: que el consumo de un alimento ponga en peligro la salud o, an peor, la vi-da de los consumidores.

Una segunda manera de abordar la calidad nutri-tiva de un alimento es estudiando o determinando su calidad organolptica. Una de las funciones ms importantes de los alimentos es la de producir pla-cer y satisfaccin a la persona que los consume; en este sentido, las caractersticas organolpticas (co-lor, sabor, olor, textura) son de trascendental im-portancia, porque a travs del estmulo de los re-ceptores visuales, gustativos, olfativos y tctiles se produce un conjunto de sensaciones que se pue-den traducir en impresiones agradables o des-agradables, y que en definitiva desencadenan una conducta de aceptacin o repulsin, o incluso de indiferencia, respecto a un alimento.

Estas caractersticas, que indirectamente pue-den estar estableciendo el grado de madurez o la bondad de la manipulacin, del almacenamiento, de la conservacin, etc., dependiendo de que se trate de productos ms o menos procesados, animales o vegetales, o derivados de ellos, y que estos estn tecnolgicamente conservados o en estado natu-ral, pueden condicionar el grado de aceptacin del alimento por el consumidor.

La calidad de un alimento, entendida como el conjunto de sus caractersticas organolpticas, tie-ne un gran inters para la industria agroalimentaria, puesto que, adems de servir para identificar un determinado producto, lo hace, como ya se ha co-mentado, deseable o no por el consumidor.

Por ltimo, la calidad nutritiva propiamente di-cha es funcin de su contenido en nutrientes y est relacionada con el beneficio que el alimento proporciona al consumidor una vez ingerido y de

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la capacidad que ste presenta para ser digerido, absorbido, y en definitiva utilizado, bien sea para fi-nes energticos, estructurales o reguladores.

El anlisis qumico permite conocer, incluso a ve-ces con una gran precisin, la concentracin de un nutriente presente en el alimento, pero este tipo de anlisis no garantiza que dicho nutriente pue-da ser aislado del alimento mediante los procesos digestivos, ni tampoco permite saber cunto de l ser absorbido y menos an la cantidad que va a ser utilizada en el metabolismo o incorporada a los tejidos del individuo.

Para resolver este problema, se necesita cono-cer no slo la cantidad total de un nutriente pre-sente en el alimento, que la proporciona el anli-sis qumico, sino la proporcin del nutriente que digestiva y metablicamente est disponible, es decir, lo que se denomina biodisponibilidad del nutriente.

Para determinar la biodisponibilidad se dispone de diferentes modelos metodolgicos, tanto in vi-tro como in vivo, que permiten conocer, en ciertos casos con gran precisin, la cantidad de nutrien-tes que estaran disponibles para ser absorbidos y, por tanto, en condiciones de ser utilizados por el individuo.

Los modelos in vitro abarcan una gran variedad de tcnicas, qumicas, microbiolgicas, enzimticas, etc. Existen mtodos qumicos, ms o menos com-plejos, que permiten valorar la fraccin disponible del nutriente, como por ejemplo las tcnicas que determinan la lisina disponible. Tambin se dispo-ne de mtodos microbiolgicos, como los emplea-dos para medir el aminocido azufrado metionina o el triptfano, basados en el grado de desarrollo de un cultivo bacteriano.

Otros mtodos se basan en simular en el la-boratorio las condiciones del proceso de diges-tin, mediante la incubacin en agitacin del ali-mento en presencia de enzimas (pepsina, tripsina, papana), a distintos valores de pH, generalmen-te a una temperatura de 37 C, y durante dife-rentes tiempos dependiendo del proceso que se desea simular, digestin gstrica o intestinal. Por ltimo, una serie de mtodos determinan la bio-disponibilidad in vitro mediante procesos de di-gestin qumica o enzimtica, seguidos de mode-los de dilisis de los componentes alimentarios a travs de una membrana de celulosa semiper-meable con un determinado tamao de poro, si-

mulando as en conjunto los procesos de diges-tin y absorcin.

Los modelos in vivo constituyen el mtodo bio-lgico, que implica la utilizacin de animales de ex-perimentacin vivos y est basado en suministrar a stos el alimento o componente alimentario que se desea investigar. El mtodo biolgico permite valorar la eficacia digestiva a partir de la cantidad absorbida mediante el denominado coeficiente de digestibilidad, que mide la proporcin del nutrien-te que es absorbida respecto a la cantidad ingeri-da del mismo. Por otro lado, permite determinar la proporcin de ste que es utilizada con fines ener-gticos e incluso con fines plsticos o estructura-les, mediante el empleo de cmaras respiratorias o cmaras metablicas, en las que se puede deter-minar el valor biolgico y el coeficiente de utiliza-cin neta de la protena, el coeficiente de eficacia en crecimiento, el valor productivo de la grasa o de la protena, etc.

Por tanto, mediante el mtodo biolgico se pue-de valorar, con suficiente precisin, la biodisponibi-lidad de distintos nutrientes contenidos en un ali-mento o en una dieta completa. Pero adems de su valor como medida de la calidad nutritiva de los alimentos, tambin puede ser utilizado para otros objetivos, como son los estudios de la influencia que los procesos tecnolgicos o culinarios tie-nen sobre la cantidad y calidad de los componen-tes alimentarios, o bien de la respuesta fisiolgica del individuo, tanto en lo que se refiere al proce-so digestivo como en lo que atae a los procesos metablicos.

3. Valoracin energtica de los alimentos

La energa se puede obtener de los alimentos, y ms concretamente de los tres macronutrientes (hidratos de carbono, protenas y lpidos) y del al-cohol etlico contenidos en los mismos. Por tanto, el valor energtico de un alimento dado depender de su contenido en los citados componentes.

La estimacin de valor energtico bruto de los alimentos (in vitro), se realiza mediante una bom-ba calorimtrica que contiene de 25 a 30 atmsfe-ras de oxgeno y que dispone de una cmara donde se introduce una fraccin de peso conocido del ali-

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mento que se quiere valorar; se produce en esta c-mara su combustin completa (oxidacin), y el calor generado en dicha combustin se transmite a tra-vs de las paredes de la cmara y eleva la tempera-tura de una masa de agua de volumen conocido que la rodea y envuelve. Finalmente, dicho incremento en temperatura es traducido en caloras. El calor de combustin o valor energtico bruto de los macro-nutrientes y del alcohol se recoge en la Tabla 1.

Sin embargo, y ms que el contenido en ener-ga bruta de los alimentos, es de inters desde el punto de vista alimentario y nutricional la valo-racin de la energa metabolizable, es decir, de la fraccin de la misma que puede ser utilizada por el organismo.

La oxidacin de hidratos de carbono, protenas, lpidos y alcohol en el organismo (medida in vivo), ocurre de forma similar, pero no idntica, a la me-dida in vitro. Hay dos aspectos interesantes que se debe destacar:

1. La absorcin intestinal de estos compues-tos en el organismo no es del 100%. Por tanto, se tiene que restar al valor energtico bruto las pr-didas de energa que se producen como conse-cuencia de la eliminacin fecal de los nutrientes no absorbidos.

2. La oxidacin no es completa hasta CO2 y agua para todos los compuestos. En el caso de las prote-nas, adems de CO2 y agua, se excreta urea como producto final de su catabolismo, y las molculas de urea todava contienen energa, concretamente 1,25 kcal/g de protena oxidada, cantidad que tambin tendr que restarse al valor energtico bruto.

Por tanto, en el organismo, la cantidad de energa extrada es aproximadamente de 4 kcal/g en el caso de la oxidacin de hidratos de carbono y protenas, de 9 kcal/g en el caso de la oxidacin de lpidos y

de 7 kcal/g para el alcohol. Conociendo los conteni-dos de estos cuatro componentes en el alimento, se puede estimar la cantidad total de energa en el mis-mo. Los citados valores (4, 4, 9 y 7 kcal/g), deducidos por Atwater et al. de sus clsicas investigaciones de digestibilidad y balance, son conocidos como facto-res de Atwater (Tabla 1). Dichos factores fueron revisados posteriormente y considerados como sa-tisfactorios para la estimacin del valor energtico de los alimentos.

El sistema de Atwater sigue vigente en la actuali-dad, constituyendo en muchos casos la base para el clculo del valor energtico en las Tablas de Com-posicin de Alimentos, as como para la estimacin del gasto energtico.

4. Valoracin fsico-qumica de los alimentos

El estudio de la calidad nutritiva de los alimen-tos por mtodos fsico-qumicos se puede abordar atendiendo a muy diversos criterios, entre los que cabe destacar el objetivo planteado en el estudio, la clase de alimento, la disponibilidad tanto de la mues-tra como de la instrumentacin cientfica requeri-da, as como el tipo y la concentracin del nutriente que se pretende investigar. El planteamiento de este apartado no es la descripcin detallada de unas tc-nicas determinadas, ya que para ello existen textos especficos a los que el lector puede recurrir en ca-so de necesidad, sino el de dar una visin general de los mtodos ms usuales en este tipo de estudios.

Se pueden considerar, dentro de la valoracin f-sico-qumica de los alimentos, dos grandes grupos de estudios:

Tabla 1. CALOR DE COMBUSTIN Y ENERGA BIOLGICAMENTE DISPONIBLE

Calor de Absorcin Prdida Factor de combustin (%) en orina Atwater (kcal/g) (kcal/g)

Protenas 5,6 92 1,25 4 Hidratos de carbono 4,1 99 - 4 Lpidos 9,4 95 - 9 Alcohol 7,1 100 Trazas 7

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1. El anlisis general de los alimentos, que nos aporta una informacin cuantitativa y aproximada de la composicin nutritiva.

2. Los anlisis especficos de los alimentos, que proporcionan, adems de una descripcin cuanti-tativa ms fiable, una informacin sobre la calidad de los diferentes nutrientes que componen ese ali-mento en particular.

4.1. Anlisis generalde los alimentos

El primer paso en la valoracin fsico-qumica de los alimentos es el anlisis del contenido de los principios inmediatos. Este primer estudio aproxi-mativo de la calidad nutritiva de los alimentos fue diseado por investigadores de la Estacin Expe-rimental de Wende. Ofrece una informacin cuan-titativa en muchos casos incierta y, por tanto, bas-tante limitada, pero sigue realizndose como paso previo en el conocimiento de la calidad nutritiva de los alimentos.

Tras obtener una muestra bien homogenizada del alimento, se determinan los contenidos de las seis fracciones mayoritarias que lo constituyen:

a) Agua.b) Cenizas totales.c) Protena bruta.d) Extracto etreo.e) Fibra bruta.f) Materia extractiva libre de nitrgeno. El anlisis se hace directamente para cinco de

estas fracciones y la sexta se determina por dife-rencia hasta 100, tras expresar las cinco restantes como porcentajes de la muestra.

4.1.1. Agua

El contenido en agua o humedad de un alimen-to se define como la prdida de peso que experi-menta una muestra sometida a desecacin hasta al-canzar un peso constante, y la forma ms usual y simple de anlisis es mediante desecacin en estu-fa a presin atmosfrica (105 C) o a vaco (40 C). Otros mtodos alternativos, ms sofisticados pe-ro tambin ms precisos, son los termogravim-tricos, de conductividad y de resonancia magnti-ca nuclear.

4.1.2. Cenizas totales

Las cenizas totales se corresponden con la ma-teria inorgnica del alimento y se obtienen me-diante incineracin en horno mufla a 450 C has-ta peso constante. El proceso se puede acelerar mediante la adicin, despus de enfriar, de unas gotas de cido ntrico y posterior calentamien-to a 450 C durante unas horas (mineralizacin por va seca).

La informacin que proporciona el anlisis de esta fraccin es escasa y limitada, porque indica nicamente el contenido total en minerales. Sin embargo, el anlisis es sencillo y til para determi-nar por diferencia la sexta fraccin. Adems, es un mtodo de rutina, previo y necesario para el estu-dio del contenido de un determinado mineral, pues mediante la mineralizacin se consigue la concen-tracin del mismo en la muestra.

4.1.3. Protena bruta

La cuantificacin de protenas en los alimen-tos se realiza generalmente de forma indirecta y aproximada, de ah que se utilice el trmino de protena bruta para referirse a esta fraccin. Se estima, por convenio internacional, a partir del producto resultante de la multiplicacin del contenido total de nitrgeno en el alimento por un factor de conversin de nitrgeno en pro-tena (6,25), basado en el contenido de nitrge-no (16%) en la protena (16 g N x 6,25 = 100 g protena).

Se trata de un mtodo de precisin e infor-macin limitadas, ya que se basa en dos supues-tos falsos:

1. Que todo el nitrgeno contenido en el ali-mento se encuentra formando parte de protenas.

2. Que todas las protenas contienen un 16% de nitrgeno.

No obstante, tambin hay que decir que se sigue utilizando y es aceptado como mtodo de rutina, ya que la fraccin mayoritaria del nitrgeno del ali-mento, con gran diferencia, se encuentra en forma de protena. Adems, muchas protenas contienen el citado porcentaje de nitrgeno (Tabla 2).

El mtodo clsicamente ms utilizado en la cuantificacin del nitrgeno total en alimentos es el mtodo de Kjeldahl (1883), basado en la mine-

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ralizacin de la muestra en cido sulfrico concen-trado, formacin de sulfato de amonio, y posterior desprendimiento del amoniaco en un medio bsico fuerte (NaOH al 30%). El amoniaco desprendido es fijado en un cido dbil (H3BO3), y posteriormente valorado por titulacin volumtrica mediante HCl y colorantes indicadores cido-base.

Con esta tcnica se cuantifica slo el nitrgeno orgnico de la muestra (grupos amino); por tanto, no se valoran los nitratos y nitritos, pero s compuestos nitrogenados no proteicos, tales como aminocidos libres, bases pricas y pirimidnicas, creatina y crea-tinina, aminas bigenas, urea y otras amidas, etc. No obstante, las cantidades de estos compuestos no proteicos en los alimentos suelen ser muy bajas.

Otro procedimiento alternativo es el mtodo de Dumas (1831), en el que, tras la combustin de la muestra, los xidos de nitrgeno se reducen catalti-camente en presencia de cobre a gas nitrgeno, que es cuantificado en un detector de conductividad tr-mica. Con esta tcnica se valora todo el nitrgeno de la muestra, incluido el inorgnico (nitratos y nitritos).

En cuanto al factor de conversin de nitrge-no en protena, salvo que se indique lo contra-

rio, o bien, y excepto en el estudio de algn tipo de alimento en particular, por convenio interna-cional, se utiliza el valor de 6,25. Sin embargo, como puede observarse en la Tabla 2, el con-tenido de nitrgeno proteico difiere entre ali-mentos (16-19%) y, por ende, difiere tambin el factor de conversin de nitrgeno en protena (5,18-6,38).

Existen otros mtodos alternativos para el an-lisis cuantitativo de protenas en los alimentos, que ofrecen una informacin mucho ms precisa y fia-ble; son los mtodos de valoracin directa, como se comentar ms adelante.

4.1.4. Extracto etreo

El extracto etreo, o contenido en grasa bruta del alimento, es la fraccin obtenida tras la extraccin con disolventes apolares (ter etlico, ter de petr-leo, cloroformo o benceno) del componente liposo-luble del alimento. Se trata tambin de un mtodo aproximativo, pues se extraen junto con los lpidos otros componentes liposolubles, tales como pigmen-

Tabla 2. FACTORES DE CONVERSIN DE NITRGENO EN PROTENA

Alimentos % de nitrgeno Factor de en la protena conversin

Leche y derivados 15,7 6,38 Carnes y pescados 16,0 6,25 Huevos 16,0 6,25 Maz 16,0 6,25 Judas 16,0 6,25 Guisantes 16,0 6,25 Arroz 16,8 5,96 Trigo 17,1 5,83 Avena 17,1 5,83 Mijo 17,1 5,83 Cebada 17,1 5,83 Centeno 17,1 5,83 Soja 17,5 5,71 Cacahuetes 18,3 5,46 Avellanas 18,9 5,30 Nueces 18,9 5,30 Girasol 18,9 5,30 Almendras 19,3 5,18

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tos (clorofilas, carotenoides, licopeno, etc.) o resinas. A pesar de ello, se acepta como mtodo de refe-rencia, pues el error que se comete es relativamen-te bajo dado que el componente liposoluble mayo-ritario del alimento est constituido por las grasas neutras (triglicridos). La tcnica ms empleada es el mtodo de Soxhlet, basado en la extraccin con ter etlico (libre de perxidos), a una temperatu-ra de 60 C, durante 6 horas, previa deshidratacin parcial de la muestra con sulfato sdico anhidro.

4.1.5. Fibra bruta

La fraccin denominada fibra bruta se define como el residuo insoluble que se obtiene tras la ebullicin sucesiva de la muestra con cido y lca-li dbiles, y posterior eliminacin de la grasa por extraccin con un disolvente apolar como la ace-tona (mtodo de Wende). Inicialmente se pens que se corresponda con la porcin no digestible del alimento. Actualmente se sabe de la inexac-titud del mtodo, pues, como se puede apreciar en la Tabla 3, pequeas cantidades de celulosa y cantidades mayores de hemicelulosa y lignina no se cuantifican con el mismo, por lo que se pue-de considerar un mtodo de poca utilidad, aun-que tiene la ventaja de ser bastante simple y po-co costoso.

4.1.6. Materia extractiva libre de nitrgeno

La materia extractiva libre de nitrgeno (MELN) es la fraccin formada por los hidratos de carbono

digestibles, es decir, una mezcla de almidones, dex-trinas, fculas, monosacridos (pentosas y hexosas) y disacridos (sacarosa, maltosa y lactosa), aunque tambin incluye, como ya se ha comentado ante-riormente, parte de la hemicelulosa y de la lignina del alimento cuando la fraccin anterior se deter-mina por el mtodo de Wende.

En general, es este ltimo componente alimen-tario el que se determina indirectamente, por dife-rencia entre 100 y el total de las fracciones analti-camente determinadas.

Por tanto, la fiabilidad del contenido de es-ta ltima fraccin depender lgicamente de la de los mtodos empleados en la determinacin de las restantes cinco fracciones. No obstante, tambin se han diseado mtodos directos es-pecficos para la determinacin de los conteni-dos totales en azcares y en almidones (fsicos, qumicos y enzimticos), como se describir ms adelante.

4.2. Anlisis especficos de los alimentos

Sera imposible describir aqu la enorme can-tidad de mtodos disponibles para el estudio ms detallado de la calidad nutritiva de los ali-mentos, entre los que se encuentran los dise-ados para cuantificar directamente y con ex-traordinaria precisin el contenido de todos y cada uno de los nutrientes, as como aquellos para identificar y valorar la calidad de los mis-mos, por lo que se comentarn tan slo los que, en opinin de los autores, pueden tener un ma-yor inters.

Tabla 3. EFECTOS DEL MTODO DE WENDE SOBRE EL ALIMENTO EXENTO DE GRASA

Componente Ebullicin con SO4H2 Ebullicin con KOHalimentario (1,25%) (1,25%)

Protena Extraccin parcial Extraccin completa Almidones y azcares Extraccin completa - Celulosa Extraccin ligera Extraccin ligera Hemicelulosa Extraccin variable Extraccin extensa Lignina Extraccin ligera Extraccin extensa

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4.2.1 Protena y aminocidos

4.2.1.1. Cuantificacin de la protena total

Los mtodos directos de cuantificacin de la pro-tena se basan en algunas caractersticas propias de las estructuras proteicas, como la capacidad de redu-cir determinados iones, propiedades del enlace pept-dico o el contenido de algn aminocido en particular, y a partir de estos datos se puede deducir la cantidad total de protena presente en la muestra.

Entre las tcnicas colorimtricas diseadas para este fin se encuentran: el mtodo de Lowry (1951), basado en la cuantificacin de los grupos fenlicos, que permite valorar el aminocido tirosina, nico aminocido fenlico de las protenas; el mtodo de Bradford (1976), que cuantifica los aminocidos b-sicos y aromticos; el mtodo de Biuret (1914), ba-sado en la reaccin coloreada caracterstica del en-lace peptdico, y el mtodo del cido bicinconnico, basado en la propiedad de las protenas de reducir el in cprico a cuproso, que es un mtodo mucho ms sensible y fiable que los anteriores.

Otros mtodos permiten cuantificar la protena en combinacin con el mtodo de Kjeldahl, ya des-crito anteriormente, como es el caso del anlisis de protena verdadera, que se basa en la propiedad que tienen las protenas de precipitar en presencia de sulfato de cobre; tras el proceso de precipita-cin, se separa el sobrenadante por filtrado y, una vez obtenido el precipitado, ste ltimo se anali-za por un sistema de Kjeldahl, determinando as el contenido total de nitrgeno, que en este caso s es exclusivamente de naturaleza proteica.

4.2.1.2. Separacin e identificacin de protenas

La separacin se lleva a cabo mediante electrofo-resis (1950). Con esta tcnica, las molculas protei-cas o peptdicas, bajo el efecto de un campo elctri-co, se van desplazando a una determinada velocidad, dependiendo de la carga y del peso molecular de las molculas. Tras la migracin, se puede realizar la identificacin de las distintas fracciones mediante colorantes y reacciones de coloracin especficas.

4.2.1.3. Aminograma

La identificacin y cuantificacin de cada uno de los aminocidos que constituyen las protenas

(aminograma) se lleva a cabo mediante cromato-grafa de intercambio inico tras hidrlisis previa, que ser cida para todos los aminocidos, excep-to el triptfano (hidrlisis bsica) y los aminoci-dos azufrados metionina y cistena, que requieren oxidacin total previa a la hidrlisis, transformn-dose en metionina sulfona y sulfxido y en cido cisteico, respectivamente. Los aminocidos se van separando al ser sometidos a gradientes de pH y temperatura, en funcin de su punto isoelctri-co y peso molecular, y se eluyen segn un tiempo de retencin determinado. Se trata de una tcni-ca de gran inters, ya que aporta informacin tan-to cuantitativa como cualitativa. Adems, el estudio del aminograma es un paso previo y obligado para el clculo de diversos ndices qumicos de calidad nutritiva de la protena, que aportan, al menos algu-nos de ellos, unos resultados muy prximos a los obtenidos por los mtodos biolgicos.

4.2.1.4. ndices qumicos de calidad proteica

La valoracin de la calidad nutritiva de una prote-na por ndices qumicos se puede llevar a cabo a par-tir del estudio del aminograma y por comparacin con una protena patrn, considerada, por convenio, de mxima calidad o de calidad proteica = 100.

Existen diversos patrones de calidad proteica 100, como la mezcla de casena y metionina, adicio-nada sta ltima al 5%, la mezcla estndar de ami-nocidos esenciales recomendada por la FAO, o bien la ms frecuentemente utilizada, que es la pro-tena de polvo de huevo completo desecado. En la Tabla 4 se muestra la composicin en aminoci-dos esenciales de sta ltima y de una protena en estudio que se tomar como ejemplo en este apar-tado, la del arroz. En el estudio se consideran los ocho aminocidos esenciales y tambin se incluyen los dos semiesenciales (tirosina y cistena).

Block y Mitchell consideraron que la calidad nu-tritiva de una protena dependa de la deficiencia en algn aminocido esencial. En consecuencia, calcu-laron la relacin en tanto por ciento entre el con-tenido de cada aminocido esencial de la protena en estudio y el contenido de ese mismo amino-cido en la protena patrn, denominada relacin huevo del aminocido (Tabla 4). El aminocido limitante de la protena en estudio, segn el con-cepto de Block y Mitchell, ser aqul que presen-te el menor valor de relacin huevo (en el ejem-

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plo de la Tabla 4, es la metionina), y la valoracin qumica de la protena, cmputo qumico, puntua-cin qumica o Chemical Score es el valor numri-co de la relacin huevo del aminocido limitante (en este caso, 39), que nos informa que a la prote-na en estudio le falta el 61% para llegar a la calidad de la protena del huevo. Slo para determinadas protenas, aquellas que presentan un nico amino-cido limitante, la valoracin qumica se correlacio-na de forma significativa con los ndices biolgicos. En estos casos, la adicin del aminocido limitan-te a la protena en estudio puede mejorar su cali-dad nutritiva.

Oser pens que sera ms apropiado, para valo-rar la calidad nutritiva de una protena, considerar no slo la relacin huevo del aminocido limitante, sino la de todos los aminocidos esenciales, por lo que dise el ndice de aminocidos esenciales de Oser (AAE), que se define como la media geom-trica de las relaciones huevo de los 10 aminoci-dos considerados (en el mismo ejemplo anterior, el valor de este ndice es de 67). El ndice de Oser se correlaciona ms que el cmputo qumico con el valor biolgico, ndice biolgico que se describi-r ms adelante.

Posteriormente, Mitchell introdujo una peque-a variacin en el ndice anterior, pasando a deno-minarse ndice de Oser modificado por Mitchell (MAAE). Dado que la cistena se forma a partir de la metionina, y la tirosina a partir de la fenilalanina, la modificacin consisti en sumar tanto en la pro-tena del huevo como en la de estudio, previamente,

los dos pares de aminocidos, tirosina y fenilalanina por un lado, y por otro cistena y metionina, y a con-tinuacin calcular la media geomtrica de las ocho relaciones huevo. El valor que se obtiene todava se asemeja ms al valor biolgico; en el ejemplo de la protena de arroz, el valor de este ndice es de 68.

Otro ndice qumico de calidad proteica es el cl-culo de la lisina disponible, que es aquella que pre-senta uno de sus dos grupos amino libre, y cuyo valor se correlaciona con el valor biolgico de la protena, por ser un aminocido esencial que fre-cuentemente aparece como el limitante en las pro-tenas. Adems, se trata de un aminocido cuyo grupo amino libre se encuentra especialmente ex-puesto al bloqueo por azcares reductores, median-te las denominadas reacciones de Maillard, sobre todo durante la aplicacin de los procesos tecno-lgicos (calefaccin). El anlisis de la lisina disponi-ble se basa en la reaccin de los grupos amino libres con un reactivo especfico (dinitrofluorobenceno), con formacin del complejo dinitrofenil-aminocido y posterior cuantificacin por colorimetra.

4.2.1.5. Protena digestible

Se han diseado diversas tcnicas para deter-minar la digestibilidad de la protena por mtodos in vitro, y para su comparacin entre distintos ali-mentos. Son mtodos basados en la simulacin de los procesos que tienen lugar en el tubo digesti-vo durante la digestin de los alimentos. La mues-tra de alimento se incuba en presencia de enzimas

Tabla 4. AMINOCIDO LIMITANTE Y CMPUTO QUMICO DE LA PROTENA DE ARROZ

Aminocidos % en la protena % en la protena Relacin huevo de huevo de arroz

Cistena 2,4 1,9 79 Fenilalanina 6,3 4,5 71 Isoleucina 8,0 4,4 55 Leucina 9,2 8,0 87 Lisina 7,2 3,6 50 Metionina 4,1 1,6 39 Tirosina 4,5 3,8 84 Treonina 4,9 3,5 71 Triptfano 1,5 1,0 67 Valina 7,3 6,8 93

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digestivas (proteasas) a pH fisiolgico, bien en un bao termostatizado (37 C) que permite la agita-cin constante o bien en estufa (37 C).

Los mtodos in vitro proporcionan slo una in-formacin relativa en la valoracin de las cantida-des de nutrientes que estn disponibles para la ab-sorcin, porque es imposible llegar a repetir todas las complejas condiciones que simultneamente se puedan dar en el tubo digestivo (situacin in vivo). No obstante, diferentes autores han mostrado la utilidad de los mtodos in vitro en este tipo de es-tudios, encontrando interesantes correlaciones en los resultados de disponibilidad de nutrientes en-tre mtodos in vivo e in vitro.

La tcnica clsica empleada en la determinacin de protena digestible es la digestin clorhidropp-sica, que consiste en incubar una muestra de ali-mento en presencia de pepsina y cido clorhdri-co a una temperatura de 37 C; tras el filtrado del producto, se determina por el mtodo de Kjeldahl el contenido de protenas que quedan retenidas en el filtro, y restando este valor al del total de pro-tena bruta, previamente determinado, se calcula el contenido de protena digestible.

Otras tcnicas ms complejas incluyen dos eta-pas, digestin con pepsina a pH 2 y digestin con pancreatina (mezcla de enzimas de origen pan-cretico) a pH 8 y en presencia de sales biliares, tratando de simular no slo lo que ocurre en el estmago, sino tambin lo que ocurre en el duo-deno. Este mtodo se aplica tambin a otros com-ponentes del alimento, como minerales y elemen-tos traza.

4.2.2. cidos grasos y colesterol

Desde el punto de vista nutricional es importan-te considerar no slo la cantidad de grasa de un ali-mento sino tambin el tipo de grasa, y ste depende fundamentalmente de los cidos grasos constituyen-tes. En los alimentos, los cidos grasos se encuen-tran mayoritariamente esterificados con glicerol en forma de triglicridos, aunque tambin pueden apa-recer minoritariamente como cidos grasos libres o constituyendo parte de las estructuras de fos-folpidos, mono y diglicridos, o esteroles. El perfil de cidos grasos es la huella digital de los aceites y grasas, y es caracterstico para cada uno de ellos (Figura 1).

4.2.2.1. Cuantificacin de cidos grasos

La determinacin de los distintos tipos de ci-dos grasos de un alimento, tanto cualitativa co-mo cuantitativamente, se realiza mediante la utili-zacin de tcnicas de cromatografa de gas-lquido. Para aplicar estas tcnicas es necesario realizar un tratamiento previo de las muestras que incluye va-rias etapas:

1. Extraccin previa de la grasa del alimento con disolventes apolares. Entre los mtodos de extrac-cin recomendados por la American Oil Chemists Society (AOCS) se encuentran la utilizacin de clo-roformo: metanol (2:1) (conocido tambin como mtodo de Folch) o la digestin del alimento con HCl 4N seguido por una extraccin con ter etlico.

2. Transesterificacin de la grasa extrada para formar steres metlicos de los cidos grasos ms voltiles. Para ello usualmente se realizan reaccio-nes de transesterificacin de la grasa, bien bajo ca-tlisis cida, utilizando cido clorhdrico: metanol a 85 C, o bien mediante catlisis bsica con trifluo-ruro de boro o metxido sdico.

3. Los steres metlicos de los cidos grasos obtenidos son finalmente extrados con hexano u otro disolvente apolar e inyectados en el cromat-grafo de gas-lquido para ser analizados.

Dependiendo de las condiciones cromatogrfi-cas y la columna empleada, los cidos grasos apa-recern separados en un cromatograma, pudiendo ser identificados con la ayuda de los correspon-dientes patrones comerciales. Para su cuantifica-cin se usan estndares internos como el 13:0, 15:0 o 17:0, o bien estndares externos. El perfil de los cidos grasos de un alimento se suele tambin ex-presar como porcentaje de los cidos grasos indivi-duales respecto al total de cidos grasos extrados.

A partir del perfil de cidos grasos individuales de un alimento se pueden, adems, calcular distin-tos ndices de inters desde el punto de vista nu-tricional, como son:

Cantidad de cidos grasos saturados, monoin-saturados y poliinsaturados. Ya que cada uno de es-tos grupos tiene efectos diferentes sobre la salud del individuo.

Relacin de cidos grasos insaturados/saturados. Es un indicador de la estabilidad oxi-dativa de la grasa del alimento. Valores de es-te ndice para diversos alimentos se muestran en la Tabla 5. Cuanto ms insaturada sea la grasa

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de un alimento, mayor posibilidad tendr de oxi-darse. El grado de insaturacin de una grasa tam-bin puede estimarse mediante la medida del n-dice de yodo.

Cantidad de cidos grasos poliinsaturados de la serie n-3 o n-6. Son cidos grasos con importan-tes funciones biolgicas: son precursores de los ei-cosanoides, determinan la estructura y fluidez de las membranas biolgicas, son seales intracelula-res, etc.

ndice aterognico (IA) e ndice trombognico (IT). Se utilizan para valorar y comparar la posible capacidad aterognica y trombognica de la grasa de los alimentos (Ulbricht y Southgate, 1991).

(aSI + bSII + cSIII)IA = __________________

(dP + eM + fM)

Donde: SI = 12:0; SII = 14:0; SIII = 16:0; P = suma de las series n-3 y n-6 de cidos grasos poliinsaturados; M = cis 18:1; M = suma del resto de cidos grasos monoinsaturados; b = 4; a = c = d = e = f = 1.

mSIV

IT = _________________________________

(nM + oM + p(n-6) + q(n-3) + (n-3/n-6)

Donde SIV = suma de 14:0, 16:0 y 18:0; (n-6) = su-ma de los cidos grasos poliinsaturados de la serie n-6; (n-3) = suma de los cidos grasos poliinsaturados de la serie n-3; m = 1; q = 3; n = o = p = 0,5.

El ndice aterognico define la capacidad poten-cial de las grasas para producir agresiones en el endotelio de los vasos sanguneos (formacin de placas de ateroma), en personas especialmente susceptibles. Los alimentos que presentan el me-nor IA entre los mostrados en la Tabla 5, son: cerdo, pollo y pavo. Segn este ndice, los alimentos de origen terrestre son tan aconsejables como los de origen marino, o incluso ms.

La capacidad potencial de un alimento para in-ducir trombosis o embolia en individuos espe-cialmente sensibles, medida por el ndice trom-bognico, depender fundamentalmente de los contenidos en cidos grasos poliinsaturados de las series n-3 y n-6. Los alimentos de origen mari-

Figura 1. Porcentaje de cidos grasos presente en diversas grasas y aceites.

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no, tales como atn, merluza o sardina (Tabla 5), como es lgico, presentan una clara ventaja fren-te a los de origen terrestre. Las carnes, como ter-nera, cordero, pavo o cerdo, ricas en cidos grasos poliinsaturados de la serie n-6, tienen mayor faci-lidad para favorecer el desarrollo de trombos, por la presencia de cido araquidnico (20:4 n-6) y de los eicosanoides de l derivados, sobre todo el tromboxano A2 (TXA2). Por el contrario, los pes-cados, con los valores ms bajos de dicho ndice, son ricos en cidos grasos poliinsaturados de las series n-3, especialmente de cido eicosapentae-noico (20:5 n-3), que producen eicosanoides de baja capacidad proagregante, como el tromboxa-no A3 (TXA3).

4.2.2.2. Cuantificacin de cidos grasos trans

En los ltimos aos se est planteando entre la comunidad cientfica la necesidad de determinar la cantidad de cidos grasos trans de los alimentos. Estos cidos grasos trans son cidos grasos insatu-rados con dobles enlaces en configuracin o geo-metra de tipo trans, diferentes de los cidos grasos sintetizados por animales y vegetales que son ni-camente con configuracin de tipo cis.

Los cidos grasos trans se originan por la hidro-genacin parcial de las grasas en la industria, y por la biohidrogenacin que produce la flora bacteria-na de los rumiantes sobre el bolo alimenticio. En-tre los alimentos que aportan a la dieta una mayor

cantidad de cidos grasos trans se encuentran pro-ductos de bollera, snacks, margarinas, etc.; estos alimentos incluyen en su composicin grasas vege-tales parcialmente hidrogenadas y suelen contener entre un 10 y un 20% del total de cidos grasos del alimento como cidos grasos trans. En la leche, ex-trada de los rumiantes, los cidos grasos trans su-ponen de un 2 a un 7% del total de cidos grasos. Actualmente la legislacin limita la concentracin de cidos grasos trans en frmulas infantiles a no ms del 4% del total de la grasa (DOCE, Directiva 96/4, de 16 de febrero de 1996).

La ingesta en la dieta de cidos grasos trans se ha relacionado con elevacin del LDL-colesterol en humanos. Adems, se han detectado efectos nega-tivos de los cidos grasos trans sobre la formacin de cidos grasos poliinsaturados de cadena larga en la etapa perinatal.

Hoy da se puede realizar un anlisis comple-to de cidos grasos cis y trans empleando tcni-cas de cromatografa gas-lquido con columnas capilares de gran longitud (60-100 m), siendo ste el mtodo de eleccin de la Association of Official Analytical Chemists (AOAC) para mues-tras con menos del 5% de cidos grasos trans en su composicin. No obstante, debido al solapa-miento que se produce entre algunos ismeros 18:1 trans y el cido oleico (18:1 cis), no se debe aplicar como nica tcnica en muestras de acei-tes hidrogenados que contengan altos niveles de ismeros cis y trans.

Tabla 5. NDICES QUMICOS DE CALIDAD DE LA GRASA DE DISTINTOS ALIMENTOS

Alimento AGI/AGS ndice aterognico ndice trombognico

Cerdo (pierna) 1,83 0,36 1,09 Conejo (entero) 1,86 0,57 0,81 Cordero (pierna) 1,57 0,53 1,13 Pavo (pechuga) 1,77 0,48 1,12 Pollo (pechuga) 1,98 0,47 0,93 Ternera (pierna) 1,19 0,72 1,69 Atn 1,97 0,52 0,49 Dorada 1,40 0,86 0,82 Merluza 2,29 0,61 0,43 Sardina 1,50 0,90 0,48

AGI: cidos grasos insaturados; AGS: cidos grasos saturados.Fuente: Prez-Llamas et al., 1998.

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La tcnica de eleccin para tales muestras es la cromatografa de gas-lquido en columnas ca-pilares en combinacin con otras tcnicas, como cromatografa en capa fina de argentacin o es-pectroscopa de infrarrojos. La realizacin de cro-matografa en capa fina de argentacin permite la separacin de los monoinsaturados cis de los monoinsaturados trans y, con el posterior anlisis de las bandas separadas por cromatografa gaseo-sa, se puede conocer y cuantificar individualmen-te cada ismero monoinsaturado en cualquier ti-po de muestra.

Los perfiles lipdicos de ismeros trans de grasas vegetales hidrogenadas industrialmente son muy diferentes de los de las formadas por la biohidro-genacin realizada por las bacterias en los rumian-tes, aunque actualmente se desconoce el efecto de estos cidos grasos trans de forma individualizada (Figura 2).

4.2.2.3. Cuantificacin de colesterol

En las normas de etiquetado sobre propiedades nutritivas de los productos alimenticios, regulado en el Real Decreto 930/1992, se incluye la idonei-dad de indicar no slo la cantidad de grasa bruta,

sino tambin la cantidad de cidos grasos satura-dos, monoinsaturados y poliinsaturados (expresa-da en g), as como de colesterol (expresada en mg) del producto alimenticio.

El colesterol es el principal esterol en la grasa de origen animal, mientras que en la grasa de ori-gen vegetal lo son los fitosteroles. Inicialmente, los estudios clnicos, en animales de experimentacin y epidemiolgicos parecan indicar que, en gene-ral, el colesterol de la dieta elevaba los niveles de colesterol srico total y de LDL-colesterol y au-mentaba el riesgo de aterosclerosis y enfermedad coronaria. Por ello, durante mucho tiempo se ha credo que el colesterol de la dieta influa direc-tamente sobre el colesterol plasmtico. General-mente, el colesterol acompaa en los alimentos a las grasas animales, por lo que su efecto es difcil de disociar del de la propia grasa. Se acepta que un exceso de colesterol en la dieta produce aumen-to de LDL-colesterol, pero hay que hacer notar que este efecto slo se aprecia cuando los niveles dietticos son realmente muy altos y se circuns-cribe nicamente a los individuos susceptibles. En los dems casos, el organismo hace frente al exce-so de aporte diettico mediante la inhibicin de su sntesis endgena y el aumento de su excrecin

Figura 2. Distribucin posicional de la fraccin de cidos grasos 18:1 trans en margarina (grasa vegetal hidrogenada indus-trialmente) y mantequilla (derivado lcteo animal). Fuente: Craig-Schmidt et al., 1992.

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biliar. En la actualidad se recomienda reducir la in-gestin de colesterol a menos de 300 mg diarios.

La cantidad de colesterol de un alimento se puede cuantificar mediante tcnicas de espec-trofotometra UV-visible, tras generar un com-puesto coloreado que absorba radiacin visible a partir del colesterol de la grasa extrada del ali-mento. Estas tcnicas son rpidas de aplicar, pero con ellas es imposible distinguir entre colesterol y fitosteroles. Si se quiere diferenciar entre ambos es necesario utilizar tcnicas de cromatografa de gas-lquido, que son ms laboriosas pero ms pre-cisas (Ulberth et al. 1992).

4.2.2.4. Productos derivados de la oxidacin lipdica

Los cambios que tienen lugar en los aceites y grasas durante las reacciones de oxidacin, fun-damentalmente producidas por el calentamien-to al que se ven sometidos durante el proceso de fritura en profundidad, incluyen un modelo complejo de reacciones termolticas, oxidativas y polimricas. Las diferentes tcnicas empleadas para el estudio de la oxidacin lipdica estn ba-sadas en dos tipos de cambios, primarios y se-cundarios, que dan lugar a la formacin de una serie de compuestos de descomposicin volti-les y no voltiles.

Entre los productos de descomposicin vol-tiles se incluyen hidrocarburos, aldehdos, ceto-nas, furanos y cidos carboxlicos. Estos compues-tos son interesantes porque son inhalados por los operarios de las freiduras; algunos permanecen en el aceite y, al penetrar en el producto frito, son in-geridos por el consumidor. Adems, tienen olores caractersticos que influyen en la aceptabilidad or-ganolptica del alimento frito.

Los productos de descomposicin no voltiles son polares y no polares. Obviamente, permane-cen en el aceite y son absorbidos por el alimen-to frito e ingeridos por el consumidor. Son indica-dores fiables del abuso en la utilizacin de la grasa, porque su acumulacin es constante al no ser vo-ltiles. Se debe prestar mucha atencin a los com-puestos o sustancias polares, que incluyen cidos grasos libres, mono y diglicridos, monmeros, d-meros, polmeros, cidos grasos oxidados, jabones, y productos de las reacciones de pardeamiento, que pueden aumentar hasta ms de un 25% duran-te los procesos de fritura.

Un mtodo clsico para valorar el grado de oxidacin de una grasa es el ndice de perxi-dos, llamado inicialmente ndice de Lea (1931), que se define como la cantidad de yoduro que es oxidado a yodo elemental por los perxidos, y se expresa como el nmero de g de oxgeno acti-vo contenidos en un gramo de grasa. Este mtodo yodomtrico no es totalmente especfico, pues a medida que se va liberando el yodo, ste puede fi-jarse a los dobles enlaces de los cidos grasos in-saturados, escapando as a la cuantificacin. Ade-ms, es de poca utilidad en el estudio de las grasas de fritura, ya que los perxidos se descomponen durante la fritura.

Los mtodos de referencia adoptados para va-lorar la oxidacin de las grasas incluyen la valora-cin de:

a) Compuestos polares, mediante cromatogra-fa en columna; se trata de un mtodo simple, exac-to y reproducible (AOAC, IUPAC, AOCS).

b) cidos dienoicos conjugados, mediante absor-cin en el rango de ultravioleta (AOAC, IUPAC).

c) Anlisis de cidos grasos y cociente 18:2 n-6/16:0, mediante cromatografa de gas-lquido (AOCS).

d) Triglicridos polimerizados, mediante filtra-cin en gel, HPLC (IUPAC, AOCS).

La gran mayora de estos mtodos, aunque muy precisos, son de larga ejecucin, por lo que se han desarrollado varias pruebas rpidas dis-ponibles comercialmente. Entre estas ltimas se incluyen:

a) Constante dielctrica medida por el Food Oils Sensor (FOS), que cuantifica las molculas polares.

b) Oxifrit, antiguamente denominado RAU-Test (colorimtrico), para valorar los compuestos oxi-dados.

c) Fritest (colorimtrico), empleado para medir los compuestos carbonilos.

d) Spot Test (colorimtrico), cuantifica los cidos grasos libres.

e) Materiales alcalinos contaminantes (colori-mtrico), para cuantificar los jabones.

f) Veri-fry, para valorar los compuestos polares totales, los cidos grasos libres y los compuestos alcalinos totales.

g) Test RANCIMAT, versin automatizada del test de Swift, que permite determinar la resistencia a la oxidacin de aceites y grasas.

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4.2.3. Azcares y almidones

La fraccin digestible de los hidratos de carbono se compone de los azcares simples (monosacri-dos y disacridos) de rpida absorcin, y de los poli-sacridos, (almidones, dextrinas y fculas) de absor-cin lenta en el intestino, formados por molculas de glucosa unidas por enlaces , capaces de ser hi-drolizados por las enzimas digestivas humanas.

La valoracin del contenido total en hidratos de carbono digestibles se realiza tras una hidrli-sis qumica controlada, que transforma el conjunto en azcares simples, y stos se determinan por su poder reductor.

Se dispone, asimismo, de tcnicas que permiten la cuantificacin del contenido de azcares simples, to-tales e individuales, basadas en sus propiedades cro-matogrficas o en su accin sobre la luz polarizada.

Inicialmente, para la identificacin y cuantifica-cin de los azcares se utilizaba la cromatografa en capa fina; sin embargo, en la actualidad, sta ha sido sustituida por otras tcnicas de mayor pre-cisin, aunque tambin ms complejas y costosas, como la cromatografa de gases y la cromatogra-fa lquida de alta resolucin, que permiten la iden-tificacin y cuantificacin simultnea de pentosas, hexosas, disacridos, trisacridos y oligosacridos. Por otro lado, existen los mtodos enzimticos, muy sensibles y de gran precisin, aunque slo se pueden aplicar de forma individual para la cuantifi-cacin de un tipo de azcar.

La cuantificacin polarimtrica de los azca-res es un mtodo sencillo, rpido y reproducible, que se utiliza habitualmente para la determinacin del contenido en sacarosa en la industria agroali-mentaria (azucarera, lctea, de conservas vegeta-les, etc.).

El mtodo ms apropiado para la cuantificacin de los almidones es mediante la hidrlisis enzim-tica con -amilasa, que slo hidroliza los enlaces de los polisacridos digestibles. Tras la hidrlisis, se cuantifica el contenido en glucosa por el mtodo enzimtico glucosa oxidasa-peroxidasa.

4.2.4. Fibra alimentaria

Un mtodo ms fiable que el ya comentado de Wende es el de Van Soest (1967), denomina-do tambin de la fibra neutro-detergente, que

permite determinar ms exactamente el conteni-do total de celulosa, hemicelulosa y lignina, com-ponentes mayoritarios de los hidratos de carbono no digestibles. Esta tcnica proporciona resultados muy similares a los obtenidos por mtodos biol-gicos, y ha sido normalizada por la AFNOR (Asso-ciation Franaise de Normalisation) y adoptada co-mo mtodo oficial de anlisis por la AOAC. Otro mtodo alternativo es el de la fibra cido-deter-gente, que es una variante del anterior.

Asimismo, se dispone de tcnicas especficas pa-ra la valoracin de los contenidos individuales de cada uno de los tres componentes, celulosa, hemi-celulosa y lignina.

4.2.5. Minerales

La determinacin del contenido de un determi-nado mineral en el alimento requiere, como paso previo, la mineralizacin de la muestra. El proceso se puede llevar a cabo por va seca, como ya ha si-do descrito en la determinacin de las cenizas tota-les (ver apartado 4.1.2). Asimismo, la destruccin de la materia orgnica se puede realizar por ebullicin en un medio cido fuerte, como cido ntrico con-centrado, cido sulfrico o cido perclrico (minera-lizacin por va hmeda), o mediante la aplicacin de microondas (radiacin energtica electromagntica de alta frecuencia).

Actualmente siguen vigentes los mtodos qumi-cos tradicionales para la determinacin de minera-les, rpidos, simples y de bajo costo, basados en la formacin y cuantificacin de complejos coloreados especficos. Sin embargo, cuando se presentan inter-ferencias en el anlisis qumico, o bien si ste no pre-senta la suficiente sensibilidad, como en el caso de la determinacin de los elementos traza, se recurre a mtodos electroqumicos, espectromtricos o cro-matogrficos. En la actualidad, se dispone de una ex-traordinaria variedad de tcnicas de elevada preci-sin, con capacidades de deteccin del orden de ng/kg [partes por billn (10-12), o ppb], para la valora-cin del contenido de los minerales en los produc-tos agroalimentarios.

Entre los mtodos electroqumicos se encuentra la polarometra, que permite la identificacin y cuan-tificacin de los minerales en disolucin sin necesi-dad de separacin previa. No obstante, sigue siendo la espectrometra de absorcin atmica la tcnica

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ms frecuentemente empleada en este tipo de de-terminaciones, basada en el anlisis de un elemen-to mineral dado a partir de la medida de la energa absorbida por los electrones de la capa externa de los tomos durante su excitacin; puede ser de lla-ma, con generador de hidruros, con horno de grafi-to o electrotrmica.

4.2.6. Vitaminas

Las primeras tcnicas desarrolladas para la deter-minacin de vitaminas fueron las colorimtricas. Sin embargo, han sido la cromatografa de gases y, so-bre todo, la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), las que han permitido determinaciones mu-cho ms precisas, y, ms recientemente, se han dise-ado mtodos basados en el empleo de anticuerpos, molculas capaces de reaccionar de forma especfica y rpida con determinados compuestos, dando lugar a un complejo que puede ser identificado y cuantificado. Son las denominadas tcnicas de enzimo-inmunoan-lisis o ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay).

Las vitaminas no se encuentran aisladas, sino uni-das por enlaces a otros componentes del alimento; generalmente se encuentran fosforiladas y unidas a protenas (enzimas). Dichos enlaces debern ser hi-drolizados sin daar la estructura de la vitamina. Por ello, e independientemente del mtodo seleccionado para la determinacin del contenido en vitaminas, se-r necesario someter a la muestra de alimento a un proceso de extraccin, especfico para cada vitamina. Se trata de una etapa previa muy delicada y de crucial importancia para obtener resultados satisfactorios.

El mtodo biolgico, al igual que para otros com-ponentes alimentarios, tambin es empleado en la cuantificacin de vitaminas, como se describir ms adelante. De hecho, es el mtodo de referencia pa-ra la determinacin de vitaminas D y B1 (AOAC). Asimismo, se utilizan tcnicas microbiolgicas como mtodo de referencia para la mayora de las vitami-nas del grupo B.

5. Valoracin biolgicade los alimentos

El mtodo biolgico implica el empleo de orga-nismos vivos en los ensayos, lo cual puede ser una

desventaja adems del coste que supone, de la ma-yor duracin del tiempo requerido para el estudio y de la necesidad de habitaciones y cmaras meta-blicas individuales apropiadas. Sin embargo, per-mite conocer la biodisponibilidad de los nutrientes y, por tanto, es el de mayor inters desde un punto de vista nutricional y alimentario.

Aunque se puede realizar en humanos, lo habi-tual es que se recurra a animales de experimen-tacin, tales como cerdos, rumiantes, peces y ms frecuentemente roedores, especialmente la rata al-bina de la raza Wistar, utilizada en los estudios es-tandarizados de digestibilidad de protenas y ba-lance de nitrgeno de Thomas y Mitchell, como se describir ms adelante. En cualquier caso, la elec-cin de la especie animal depender del objetivo planteado en el estudio.

Para una ms clara comprensin del desarrollo del mtodo biolgico y del significado y utilidad de los ndices biolgicos de calidad nutritiva derivados del mismo, se hace necesaria una breve descripcin de un experimento biolgico tpico.

5.1. Diseo de un experimento biolgico

El experimento biolgico que se describe a con-tinuacin corresponde al mtodo diseado por Thomas y Mitchell para estudios de digestibilidad y balance. La utilidad de este mtodo no es la mis-ma para todos los nutrientes: es til slo para es-tudios de utilizacin digestiva de energa, protena, fibra, grasa, minerales y vitaminas, y de utilizacin metablica de energa, protena, minerales y de al-gunas vitaminas.

En cada ensayo se utiliza un lote de 10 animales, ratas de la raza Wistar al destete, cinco hembras y cinco machos, de 21 das de edad (etapa de mxi-mo crecimiento), seleccionadas al azar entre las de peso ms homogneo.

Los animales son alojados en cmaras indivi-duales de metabolismo, que permiten el control del alimento ingerido y del agua de bebida, as co-mo la recogida por separado de heces y orina. Un ejemplo de este tipo de jaulas se muestra en la Figura 3. Las cmaras se encuentran dispuestas en una habitacin acondicionada, con temperatu-ra (23 1 C), humedad (50%) y fotoperiodo (luz:oscuridad = 12:12) constantes.

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El ensayo tiene una duracin total de 24 das y consta de dos periodos: el periodo inicial de adapta-cin, de 3 das, durante el cual los animales se adap-tan a la dieta experimental, a la cmara metablica y a las condiciones medioambientales de la habitacin, y el periodo experimental, de 21 das, en el que se controla la cantidad de alimento ingerido y se reco-gen heces y orinas por separado, para su posterior anlisis. Los animales son pesados en condiciones de ayuno (12 horas) al principio y al final del periodo experimental, para el clculo de la ganancia de peso.

La dieta experimental tiene unas caractersticas bien definidas; se trata de una dieta sinttica y de composicin fija, ajustada en sustancia seca, elabo-rada con las siguientes materias primas: protena (casena + 5% metionina), grasa (aceite de girasol), sacarosa, fibra (celulosa), un complemento mineral, un complemento vitamnico y almidn, este ltimo en cantidad suficiente para conseguir el 100% de la dieta en sustancia seca. Las materias primas a em-plear dependern, lgicamente, del objetivo del es-tudio, sustituyndose slo aquel componente que sea objeto del estudio, y manteniendo los restantes componentes constantes.

Los estudios biolgicos se han visto notablemente mejorados en los ltimos aos, al disponer de la for-mulacin de dietas sintticas estandarizadas que cu-bren adecuadamente todos los requerimientos de

energa y nutrientes de roedores. El Comit de Ex-pertos del American Institute of Nutrition (AIN), publi-c en 1993 una actualizacin de dos dietas semisin-tticas especialmente diseadas para experimentos estandarizados con roedores (rata y ratn), deno-minadas AIN-93G y AIN-93M. La dieta AIN-93G es-t formulada para las etapas de crecimiento, preez y lactancia, y la dieta AIN-93M para el mantenimiento de estos animales en su etapa adulta. Las composicio-nes de estas dietas se muestran en la Tabla 6. Asi-mismo, en esta misma publicacin se describe la com-posicin de los complementos mineral y vitamnico, cuya formulacin tambin ha sido estandarizada.

El mtodo biolgico permite abordar el estudio del aprovechamiento que el organismo hace de los nutrientes a dos niveles, digestivo (ensayos de di-gestibilidad) y metablico (ensayos de balance). Pa-ra el primero se requiere el anlisis del contenido del nutriente en estudio en la dieta y en las heces, y para el segundo es necesario, adems, el anlisis del contenido en la orina.

5.2. Estudios de utilizacin digestiva

El trmino digestibilidad se define como la frac-cin ingerida del componente alimentario (nutrien-te) que no es recuperada en las heces, e incluye, por tanto, los procesos de digestin y de absorcin. Es equivalente al concepto de absorbido (I - H).

Digestibilidad = cantidad ingerida (I) - cantidad en heces (H)

Para conocer la cantidad del componente ali-mentario que es ingerida (I), se calcula la canti-dad de dieta ingerida por el organismo y se anali-za la concentracin del componente en la misma; de igual forma, para conocer la cantidad del com-ponente excretado en heces (H), se determina la cantidad total de heces excretadas por el organis-mo y se analiza en ellas la concentracin del com-ponente en estudio.

La digestibilidad de un determinado nutriente ofrece una informacin limitada, pues depende-r de la cantidad ingerida de dicho nutriente, y no permite, por s sola, estudios comparativos de cali-dad entre alimentos. Por ello, se utiliza el ndice de-nominado coeficiente de digestibilidad (CD), que

Figura 3. Clulas de metabolismo para estudios de diges-tibilidad y balance.

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se define como la relacin porcentual entre lo ab-sorbido (I - H) y lo ingerido (I).

AbsorbidoCD = _____________ x 100 Ingerido

I - HCD = _____________ x 100 I

En el siguiente ejemplo numrico se puede com-probar cmo dos alimentos (A y B) pueden con-tener protenas con la misma digestibilidad pero con diferente coeficiente de digestibilidad (CD): La cantidad de protena ingerida del alimento A es de 30 g y la del alimento B es de 20 g, y la cantidad de protena (nitrgeno x 6,25) excretada en heces del alimento A es de 15 g y la del alimento B es de 5 g. La digestibilidad es la misma (15 g), pero el CD en el alimento A es del 50%, mientras que en el B es del 75%. La protena del alimento B es de mayor calidad que la del alimento A.

Sin embargo, hasta este momento se ha asumido aqu que la fraccin del nutriente encontrada por anlisis en las heces procede en su totalidad del ali-mento no absorbido (origen exgeno), y esto es fal-so, pues una pequea parte de ese mismo nutriente encontrada en las heces, que es variable dependien-

do del nutriente, procede del propio organismo (origen endgeno). Por ello, es ms apropiado hablar de digestibilidad aparente o de coeficiente de diges-tibilidad aparente. Es el caso del nitrgeno (prote-na), y de los lpidos, vitaminas y minerales.

Para el caso particular de la protena, como se describe ms adelante, el mtodo de Thomas y Mitchell permite la determinacin de la digestibili-dad verdadera y del coeficiente de digestibilidad ver-dadero, pues ofrece la posibilidad de valorar la can-tidad de nitrgeno excretado en heces que es de origen endgeno.

La situacin se puede complicar ms si se conside-ra que una parte de ciertos nutrientes no absorbidos en el tubo digestivo tampoco es recuperada en las heces, pues son utilizados como alimento por la mi-croflora intestinal. No obstante, y a pesar de la enor-me complejidad de los procesos de digestin y de ab-sorcin, el mtodo biolgico ofrece una informacin fiable y til sobre la utilizacin digestiva de los nu-trientes y, por ende, de la calidad nutritiva de los ali-mentos que los contienen.

5.3. Estudios de utilizacin metablica

La retencin o utilizacin metablica se deter-mina mediante el estudio del balance, que se define

Tabla 6. FORMULACIN DE DIETAS SINTTICAS PARA ESTUDIOS ESTANDARIZADOS EN ROEDORES

Componentes Dieta AIN-93G Dieta AIN-93M (g/kg de dieta) (g/kg de dieta)

Almidn de maz 397,486 465,692 Casena 200,000 140,000 Almidn dextrinizado 132,000 155,000 Sacarosa 100,000 100,000 Aceite de soja 70,000 40,000 Fibra 50,000 50,000 Mezcla mineral 35,000 35,000 Mezcla vitamnica 10,000 10,000 L-cistina 3,000 1,800 Bitartrato de colina 2,500 2,500 Terbutilhidroquinona 0,014 0,008

Fuente: Reeves et al., 1993.

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como la fraccin ingerida del componente alimen-tario (nutriente) que no es recuperada ni en las he-ces ni en la orina, y es equivalente al concepto de retenido (I - H - O).

Balance = cantidad ingerida (I) - canti-dad en heces (H) - cantidad en orina (O)

Los estudios de balance nos permiten conocer la fraccin del componente alimentario que es re-tenida en los tejidos por el organismo tras los pro-cesos metablicos.

Al igual que en el apartado anterior, para reali-zar estudios comparativos de calidad nutritiva en-tre alimentos se utiliza un ndice, en este caso de-nominado retencin porcentual (RP), que se define como la relacin porcentual entre lo reteni-do y lo absorbido.

Para conocer la cantidad del componente alimen-tario que es excretado en orina (O), es necesario recoger la orina durante todo el periodo experi-mental, y determinar la concentracin del nutrien-te en estudio en la misma, adems de determinar la cantidad de nutriente ingerida (I) y la excretada en las heces (H). Y tambin, de forma similar a lo des-crito para la digestibilidad y el coeficiente de diges-tibilidad, se puede hablar de dos situaciones, reten-cin porcentual aparente o verdadera, dependiendo de si se tiene o no en cuenta la fraccin de nutrien-te de origen endgeno, y que por tanto no procede del alimento ingerido (origen exgeno).

RetenidoRP = _____________ x 100 Absorbido

I - H - ORP = _____________ x 100 I - H

5.4. Estudios biolgicos especficos de la protena

Todo lo anteriormente descrito sobre el m-todo biolgico es aplicable directamente a la pro-tena; bastara con sustituir la fuente proteica de la dieta experimental (casena + metionina al 5%) por aquella protena que se desee investigar. Pe-ro, adems, este macronutriente ha sido objeto de

un estudio especfico, mediante el desarrollo de un mtodo estandarizado diseado por Thomas y Mitchell, que permite el clculo de los ndices bio-lgicos verdaderos.

En el caso particular de la protena, la fraccin nitrogenada excretada en heces y orina que no procede del alimento, es decir, que es de origen endgeno, puede llegar a ser considerable; en la excrecin fecal especialmente, donde se eliminan restos celulares de la mucosa intestinal, restos en-zimticos y restos de la microflora intestinal. El ni-trgeno fecal de origen endgeno depende de la cantidad de alimento ingerido, mientras que el ni-trgeno urinario de origen endgeno es depen-diente del tamao del animal.

Para la valoracin del nitrgeno de origen end-geno excretado en heces y orina, fue necesario el diseo de una dieta sinttica, denominada dieta en-dgena, que tiene la importante propiedad de que la protena es utilizada en su totalidad para el man-tenimiento del organismo, y nada de ella es excre-tado ni en heces ni en orina. Para su elaboracin se utiliza una fuente proteica de mxima calidad (ca-sena + metionina al 5%), adicionada a la dieta exac-tamente en una concentracin del 4% en sustan-cia seca.

Esta dieta endgena ha sido especialmente dise-ada para la rata Wistar, capaz, en estas condicio-nes, de absorber la protena al 100% y de que to-da ella sea retenida en los tejidos, dada su mxima calidad y, como es sabido, la utilizacin metablica del nitrgeno depende de la presencia y conteni-do de todos los aminocidos esenciales en la pro-tena. De esta forma, el nitrgeno que se excreta es slo de origen endgeno, tanto en las heces co-mo en la orina.

El animal recibe esta dieta con anterioridad al pe-riodo experimental, durante el denominado perio-do endgeno, de 6 das de duracin; los tres prime-ros das son de adaptacin, para que los animales se adapten a la dieta, y en los tres das siguientes se controla la ingesta y se recogen por separado heces y orina, para su posterior anlisis de nitrgeno.

Finalmente, para el clculo de los ndices biolgi-cos verdaderos de calidad proteica, se necesitar co-nocer los siguientes parmetros: cantidad de nitr-geno excretado de origen endgeno en heces (He) y orina (Oe), cantidad de nitrgeno ingerido duran-te el periodo experimental (I), cantidad de nitrgeno excretado durante el periodo experimental en heces

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y orina, en este ltimo caso el origen del nitrgeno eliminado en heces (Ht) y orina (Ot) es doble, end-geno (animal) y exgeno (alimento).

Adems del coeficiente de digestibilidad verda-dero (CDV), el mtodo permite el clculo del va-lor biolgico de la protena (VB), definido como la relacin porcentual entre lo retenido y lo absorbi-do, y el coeficiente de utilizacin neta de la prote-na (NPU), que es la relacin porcentual entre lo re-tenido y lo ingerido.

I - (Ht - He)CDV = ______________ x 100 I

I - (Ht - He) - (Ot - Oe)VB = __________________________ x 100 I - (Ht - He)

5.5. Estudios biolgicos especficos de vitaminas

Se han desarrollado diversos mtodos biolgi-cos especficos para valorar la eficacia de las vita-minas, tanto hidrosolubles como liposolubles. Son bsicamente tres las estrategias en las que se ba-san los mtodos biolgicos para el estudio de las vitaminas:

a) Anlisis de la excrecin urinaria, aplicado a la valoracin de vitaminas C y del grupo B.

b) Medidas basadas en las propiedades fisiolgi-cas de las vitaminas, utilizadas para estudios de las vitaminas A, D, E y C.

c) Determinaciones de la concentracin de vi-taminas en rganos o tejidos diana, que son de uti-lidad para aquellas vitaminas que se almacenan en el organismo.

En el caso concreto de los estudios de vitami-na C, ser necesario utilizar cobayas o primates, pues slo en estos animales la vitamina C es esen-cial. A continuacin se describen brevemente algu-nos ejemplos de estas tres estrategias.

a) Anlisis de la excrecin urinaria de vitaminas. Las medidas se pueden realizar di-rectamente sobre las propias vitaminas hidroso-lubles, o bien sobre determinados compuestos in-termediarios del metabolismo de las vitaminas. Las vitaminas hidrosolubles, cuando se ingieren en ex-ceso en la dieta, se excretan por va urinaria en

cantidades relativamente elevadas, ya que su capa-cidad de acumulacin en los tejidos es muy limi-tada. Esta caracterstica puede ser utilizada tanto para conocer el estado nutricional del individuo como para valorar la eficacia del suplemento vita-mnico en estudio. Los resultados de eliminacin urinaria se comparan con los obtenidos en una poblacin de referencia, en la que se ha compro-bado que las necesidades de la vitamina en estu-dio estn cubiertas.

Por otro lado, en una situacin de dficit vitam-nico, algunos compuestos intermediarios del me-tabolismo de las vitaminas tienden a acumularse y, consecuentemente, aumentan su concentracin en orina. Un ejemplo de esto es el estudio de la ca-rencia de vitamina B12. Esta vitamina participa en la reaccin de transformacin del cido metilmalni-co, formado en el catabolismo proteico y lipdico, en cido succnico en la mitocondria. La carencia de vitamina B12 ocasiona un aumento de la elimina-cin urinaria de este metabolito en orina, siendo su concentracin proporcional a la deficiencia de vi-tamina y, por tanto, es un ndice til para valorar la eficacia de un suplemento de vitamina B12.

b) Medidas basadas en las propieda-des fisiolgicas de las vitaminas. Los avan-ces en los conocimientos cada vez ms extensos de las propiedades fisiolgicas de las vitaminas y de los procesos metablicos en los que stas partici-pan han permitido el desarrollo de diversas tcni-cas biolgicas de utilidad en la valoracin de la efi-cacia nutritiva de estos micronutrientes.

Un ejemplo es el mtodo biolgico disea-do para el estudio de la eficacia de los tocofero-les. La carencia de vitamina E ocasiona, entre otros sntomas carenciales, distrofia muscular. El mto-do biolgico se basa en suministrar a los animales, generalmente roedores, una dieta carente de vita-mina E durante un periodo de cuatro semanas, al trmino del cual se le administra el alimento o el suplemento con la citada vitamina y se valora, co-mo medida de eficacia vitamnica, el grado de re-cuperacin que el animal experimenta. En relacin con la distrofia muscular, la eficacia se puede va-lorar mediante un simple anlisis bioqumico, por medidas de la creatinuria o de la actividad de la pi-ruvato quinasa en sangre.

c) Determinacin de vitaminas en r-ganos o tejidos diana. En las primeras fases de una situacin de dficit vitamnico, el anlisis

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de la concentracin sangunea de vitamina es de poca precisin y utilidad, pues sta se movilizar de los tejidos de almacenamiento para compen-sar el dficit; este es el caso, por ejemplo, de la ca-rencia de vitamina A, cuyos valores se mantienen relativamente constantes en sangre hasta que las reservas hepticas de retinol se encuentran prc-ticamente agotadas. Por ello, un mtodo ms pre-ciso es el anlisis de la concentracin de vitaminas directamente en el propio tejido u rgano diana.

Para cada ensayo se utilizan treinta animales de peso homogneo y de ambos sexos, distribuidos al azar en tres lotes de 10 animales. Los tres lo-tes se someten a un primer periodo de 15 das, en el que se suministra a todos los animales una dieta carente de vitamina A. Al trmino de es-te primer periodo, se sacrifica un lote y se mide en el mismo la concentracin heptica de vitami-na, que se expresa por gramo de tejido, y el valor medio obtenido de los 10 animales se considera como valor 0 de la medida. Los otros dos lotes son sometidos a un segundo periodo de 15 das de duracin. A un lote se le administra una dieta con un contenido conocido de vitamina pura (lo-te control), y al otro lote se le suministra el ali-mento o complemento de la vitamina en estudio. Al trmino de este segundo periodo, se sacrifican los animales y se mide la concentracin hepti-ca, por gramo de tejido, en ambos lotes, y se ex-presa la eficacia vitamnica del alimento o suple-mento en estudio en porcentaje con respecto a la del lote control.

5.6. Otros ndices biolgicos

Las medidas del peso corporal al inicio y al fi-nal del periodo experimental permiten determi-nar la ganancia de peso corporal que experimenta el animal durante el tiempo que recibe la dieta en estudio. A partir de esta ganancia de peso se pue-den calcular dos ndices biolgicos. El primero es el ndice de eficacia alimentaria (IEA), que apor-ta informacin sobre la calidad general del alimen-to o dieta total, expresada sta en sustancia seca, y el segundo, denominado coeficiente de eficacia en crecimiento (CEC), es la ganancia de peso que ex-perimenta el animal por cada gramo de protena ingerida; por tanto, informa sobre la calidad de la protena en funcin del crecimiento del animal.

Incremento de pesoIEA = __________________________

Alimento ingerido (ss)

Incremento de pesoCEC = __________________________

Protena ingerida

Otro mtodo posible para valorar la calidad proteica es la tcnica de Cremer, de la que se ob-tiene un ndice biolgico que aporta una informa-cin equivalente al coeficiente de utilizacin neta de la protena (NPU). En este caso, en vez de me-dir indirectamente la cantidad de protena reteni-da, por diferencia entre la ingesta y la eliminacin fecal y urinaria, se valora la retencin de forma di-recta, mediante el ndice denominado valor pro-ductivo de la protena (PPV), cuyo clculo se hace de la siguiente forma:

Se parte de dos lotes muy similares de animales; uno de ellos se sacrifica al inicio del estudio y se determina en l la concentracin de protena cor-poral; al otro lote se le somete al periodo experi-mental durante el cual se suministra la dieta con la protena en estudio. Al final del periodo se sacrifi-can los animales de este lote y en ellos tambin se determina la concentracin de protena corporal. La ganancia de protena corporal se calcula por di-ferencia entre ambos lotes y se calcula su relacin con la protena ingerida.

Incremento de protena corporalPPV = _______________________________

Protena ingerida

Esta tcnica es de gran utilidad cuando los anima-les en los que se realiza el estudio ofrecen dificulta-des en la recogida de las heces y orina por separa-do, como es el caso, por ejemplo, en los peces.

6. Valoracin microbiolgica de los alimentos

A partir de la dcada de los 70, la preocupa-cin por el posible papel que ciertos alimentos o componentes alimentarios podan tener en la in-duccin del cncer llev al desarrollo de mtodos

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rpidos, econmicos y precisos, basados en el cul-tivo de determinadas cepas de bacterias, para valo-rar la capacidad de mutagnesis de ciertas sustan-cias qumicas que pueden estar presentes de forma natural, accidental o voluntaria en los alimentos. Asimismo, estos mtodos tambin son de gran uti-lidad en el desarrollo de nuevos frmacos.

Los microorganismos ofrecen algunas ventajas frente a los organismos pluricelulares complejos; por ejemplo, permiten realizar estudios a corto plazo, ya que sus ciclos de vida son extremadamen-te cortos, comparados con los de los animales de experimentacin: en cada ensayo de genotoxicidad, una amplia poblacin con caractersticas homog-neas puede ser expuesta al posible agente muta-gnico y, adems, el coste econmico de este ti-po de ensayos es muy inferior al de los realizados en animales de experimentacin. Sin embargo, es-tos ensayos tambin presentan algunas desventajas, como es el problema de la extrapolacin de resul-tados obtenidos en microorganismos y lo que en realidad puede suceder en organismos eucariti-cos pluricelulares.

En 1971, Bruce N. Ames desarroll y public una tcnica microbiolgica denominada test de Ames (Salmonella/mammalian-microsome mutage-nicity test), para la valoracin de la capacidad de mutagenicidad de sustancias qumicas. Muy po-co tiempo despus, este mtodo fue comerciali-zado usando un sistema internacional estandari-zado para la ejecucin de ensayos certificados de laboratorios, denominado Good Laboratory Prac-tices (GLP).

El test de Ames se utiliza para valorar el efecto potencialmente mutagnico de sustancias qumicas a travs de la deteccin de cambios o alteracio-nes en el genoma de diferentes cepas bacterianas (Salmonella typhimurium y Escherichia coli). La tcni-ca tambin incluye ensayos en microsomas hepti-cos de rata, cuyas actividades enzimticas son muy similares a las de la especie humana.

La alta correlacin encontrada entre los resulta-dos del test de Ames y la aparicin de cncer indu-cido ha hecho que el citado test se haya converti-do, actualmente, en el mtodo ms utilizado en la valoracin del riesgo de mutagnesis y de cncer inducido por sustancias qumicas, y que sea con-siderado como una herramienta biotecnolgica extremadamente valiosa tanto para las industrias agroalimentarias y farmacuticas como para los

Ministerios de Sanidad, Agricultura y Medio Am-biente de los pases desarrollados.

7. Valoracin de sustancias antinutritivas en los alimentos

Como ya se ha comentado en la Introduccin de este Captulo, en los alimentos se pueden en-contrar, de forma natural, toda una serie de sus-tancias que disminuyen la calidad nutritiva de los mismos, bien de forma directa, por destruccin de nutrientes, o bien indirecta, inhibiendo o re-duciendo su absorcin y/o utilizacin metablica. stas son las denominadas sustancias antinutriti-vas. Dado que estos compuestos son en su mayo-ra termolbiles y, por tanto, se destruyen tras la aplicacin de calor (tratamientos tecnolgicos o procesos culinarios), sus efectos negativos no son demasiado importantes en la alimentacin humana, pero s pueden llegar a serlo en produccin animal (ver Captulo 2.19).

Prcticamente, todos los nutrientes se pueden ver afectados por la presencia de sustancias antinu-tritivas. La identificacin y cuantificacin de este tipo de sustancias es de inters para las industrias agroa-limentarias, y por ello, desde el conocimiento de su existencia en los alimentos y hasta la actualidad, se ha venido desarrollando para su estudio una gran di-versidad de tcnicas, incluidas las qumicas, cromato-grficas, enzimticas, inmunolgicas, etc.

7.1. Sustancias antinutritivas que afectan a las protenas

Entre las sustancias antinutritivas que afectan a las protenas se encuentran las denominadas anti-proteasas. Su efecto de reduccin o inhibicin de la digestibilidad de protenas se debe a la alta afinidad que tienen por estas enzimas, quimotripsina, papana, peptidasas, y sobre todo tripsina (antitripsinas); se unen a ellas formando un complejo que inhibe su ac-tividad. Se han encontrado en las leguminosas, tam-bin en algunos cereales, en la clara de huevo y en el calostro de mamferos. La soja, en particular, contie-ne una gran variedad de estas sustancias, antitripsi-nas, antiquimotripsinas, antipapanas y lectinas.

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La cuantificacin de antiproteasas se puede lle-var a cabo mediante diversas tcnicas, por ejemplo las inmunolgicas y cromatogrficas, pero las ms sencillas y utilizadas son las enzimticas. Tras los procesos de extraccin y purificacin, el extrac-to se pone en contacto con la enzima en las con-diciones ptimas de actividad, y despus del proce-so de protelisis se mide la cantidad de producto hidrolizado frente al valor control o valor del pro-ducto hidrolizado obtenido en ausencia de la sus-tancia antinutritiva.

7.2. Sustancias antinutritivas que afectan a los hidratos de carbono

Asimismo, en los cereales se han encontrado antiamilasas, otro tipo de sustancias antinutritivas, que de forma similar a las antiproteasas, bloquean las enzimas digestivas. En este caso su efecto inhi-bitorio es sobre la hidrlisis del almidn. Los m-todos de extraccin y cuantificacin de este tipo de sustancias antinutritivas se basan en los mismos principios empleados para las antiproteasas.

7.3. Sustancias antinutritivas que afectan a los lpidos

Los productos derivados de la oxidacin lipdi-ca (hidroperxidos, perxidos, maln-dialdehdo, etc.) tambin pueden tener actividad antinutritiva, por su interaccin especfica con los cidos grasos poliinsaturados, entre los que se encuentran los dos esenciales para la especie humana (linoleico y -linolnico). Para la identificacin y cuantificacin de dichos productos derivados de la oxidacin, se dispone actualmente de un elevado nmero de tcnicas, especficas para cada producto derivado, como ya se ha comentado anteriormente en este Captulo (ver apartado 4.2.2).

7.4. Sustancias antinutritivas que afectan a las vitaminas

Son numerosas las sustancias antinutritivas co-nocidas que afectan a las vitaminas. Las hay que destruyen las vitaminas (tiaminasas, sulfitos, cido ascrbico oxidasa), otras que forman complejos

insolubles y, por tanto, disminuyen su biodisponi-bilidad (avidina, fitatos, oxalatos), e incluso algunas que presentan una estructura qumica muy simi-lar, compitiendo con la vitamina en el entorno di-gestivo o metablico (antagonistas del cido flico, oxitiamina, piritiamina). La tcnica de cuantificacin depender de la naturaleza de la propia sustancia antinutritiva.

En el caso de la avidina, un polipptido de 65 kDa presente en la clara de huevo cruda, que forma un complejo insoluble con la biotina, la determinacin se lleva a cabo mediante la cuantificacin de esta vi-tamina tras la incubacin con clara de huevo cruda. A partir de la cantidad inicial de biotina aadida y la encontrada tras el periodo de incubacin, se deter-mina la cantidad de vitamina ligada a avidina y se cal-culan las unidades de avidina, correspondiendo una unidad a cada g de biotina bloqueada.

7.5. Sustancias antinutritivas que afectan a los minerales

Los fitatos y oxalatos, adems de afectar a vita-minas y protenas, tambin tienen actividad anti-nutritiva frente a determinados elementos mine-rales, tales como hierro, calcio, zinc o magnesio, con los que forman compl

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2.18 Calidad Nutritiva de Los Alimentos