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Universidad Nacional Autónoma de MéxicoFacultad de Estudios Superiores Zaragoza
Equipo 8: Alatriste Solano Edgar, Colín Castro Julieta, Cruz Hernández
Carlos, Merino González Carlos Alberto
Características tintoriales de los hongos
HONGOS
Son heterótrofos (quimioorganotrofos), se alimentan de materia orgánica.
Son eucariotas, presentan núcleo diferenciadocon membrana bien organizada.Presentan una pared celular formada porpolisacáridos, polipéptidos y quitina.
Se tienen hongos pluricelulares y unicelularesLa estructura fúngica (pluricelular) consta de uncomplejo llamado talo o micelio, que a su vez estaconstituido por múltiples filamentos o hifas.
Los hongos (levaduras) son microscópicos,poseen forma redonda, estos se reproducen porgemación
Estructura de los Hongos
Las hifas son tubos de longitud variableformadas por una pared celular rígida, en laque fluye protoplasma.Las hifas no constan de células, sino decompartimientos
Estructura de la célula fúngica
Poseen:Núcleo con doble membranaNucléoloMitocondriasRetículo endoplásmicoVacuolasRibosomasAparato de GolgiInclusiones cristalinas (ergosterol)
Pared celular
La pared es un exoesqueleto rígido que protege ala célula y condiciona la nutrición absortiva yaque no permite la endocitosis. Algunos hongosunicelulares producen cápsulas constituidas porpolisacáridos mucilaginosos conapacidadinmunógena y acción antifagocitaria.
Composición de la pared celular
Esta formada por capas de polisacáridosGlucanos (polímeros β-1,6, ramificados de glucosa)Mananos(polímeros α –1,6, ramificados de manosa)Polímeros de glucosaminaProteínasLípidos (ergosterol)Quitina (polímero β-1,4 de N-acetilglucosamina)
Quitina
HO
HH
Ergosterol
Tinciones simples
SafraninaÚtil para el estudio de cultivos y productos biológicos líquidos.
Los elementos fúngicos se tiñen de color rojo intenso, y elresto del campo toma un tono incoloro o rosa pálido.
Rhizopuz sp.
Penicillium sp.
Aspergillussp.
Azul de algodón El azul de lactofenol tiene tres funciones importantes ala hora de observar hongos del tipo mohos obtenidos poraislamiento o de medios inoculados.
El fenol destruye la flora acompañante.
El acido láctico conserva las estructuras fungicas alprovocar un cambio de gradiente osmótico con relaciónal interior del fúngico generando una película por asíllamarlo protectora,
Es útil para realizar el examen directo de cultivos, ya que esuna técnica rápida que permite visualizar perfectamente lasestructuras fúngicas.
El colorante es fuertemente ácido y se usa para la tincióndirecta de micelio micólico, el cual toma un delicado colorazul claro.
Microsporiumcanis
Composición:• Alcohol metílico• Azul de algodón
acetico• Agua destilada
250 mL• Alcohol al 96%• Xilol
Rhizopus sp
Paracoccidioides
brasiliensis
Hongo dimórfico; Se
visualiza macroconidia en
forma de “timón de barco”
Scedosporiumapiospermum
Rhizopusstolonifer
Anaranjado de Acridina
Se utiliza para la detección de bacterias y hongosen muestras clínicasPuede utilizarse un microscopio con accesoriosfluorescentes como el de ReichertZetopan. Elmicroscopio ordinario puede equiparse con filtrospara filtración fluorescente (BG12, de 4mm deespesor). Se colocan filtros amarillos de modo debarreras filtrantes.
Fundamento:
El pigmento se intercala en el ácido nucleico(nativo y desnaturalizado). Con pH neutro, lasbacterias, los hongos y el material celular setiñen de naranja rojizo. Con pH ácido, lasbacterias y los hongos se mantienen de colornaranja rojizo, pero el material de fondo se tiñede amarillo verdoso
Tinción de ascosporas deSowerbyellarhenana en naranja deacridina
Composición:Alcohol absolutoÁcido acéticoAnaranjado de
acridinaBuffer de fosfatosCloruro de calcio
Mucor mucedo.Candidaalbicans
Tinción con Eritrocina.
Útil para la observación de gránulos causados por:
• Nocardia• Madurella grisea• M. mycetomatis
Tinción de Eritrocina en M. mycetomatis
Solución de eritrocina.
Reactivos utilizados:
• Eritrocina de Grübler 0.20g• Naranja G 1g• Agua destilada 100mL
Granos de micetoma por Nocardiasp. Grano teñido con
eritocina
Tinciones diferenciales:
Son técnicas que utilizan dos o máscolorantes y/o principios activos.
Tinción de Gram
Tinción diferencial
Se emplea para teñir:
Productos biológicos líquidosExudados de lesionesMacerados de biopsias
Todos los hongos son positivos a la coloración de Gram,excepto Cryptococcus neoformans.
El decolorante alcohol acetona disuelve a los lípidos de lapared impidiendo la retención del cristal violeta en losorganismos Gram negativos
Se forma un complejo: lugol-cristal-violeta-ribonucleato demagnesio
Esta técnica se basa en las diferencias en el puntoisoeléctrico
Blastomycesbraziliensis
Aspergillus fumigatus
Candidaalbicans
Pityrosporum folliculitis
Histoplasmafarciminosum
Tinción Ziehl-Neelsen (Ácido-Alcohol-Resistentes)
Es el procedimiento utilizado para colorear aquellosorganismos que son difíciles de colorear con colorantesbásicos, porque se muestran impermeables a la coloración
El contenido lipídico de estos organismos esta compuestoprincipalmente por ceras y fosfolípidos que alcanzan hasta un40 % de su peso seco total
La ácido-alcohol-resistencia es la capacidad de ciertosmateriales biológicos para formar complejos con algunoscolorantes y que luego de la exposición al alcohol-ácido noocurre decoloración
Se cree que el ácido micólico es responsable de ácido-alcohol-resistencia
Util en algunos microorganismos ácido resistentes comoN. Asteroides, N. Brasiliensis y otros actinomicetes.
El calentamiento ablanda ceras permitiendo la entrada delcolorante
El calentamiento es por emisión de vapores
La técnica de Kinyoun permite la tinción sin la necesidadde calentamiento
Adición de nigrosina
Rhodococcusequi
Actinomycesisraelii
Técnica de Schiff
La tinción PAS (periodicacid-Schiff) es uno de losmétodos químicos más empleados en histología.
En la tinción PAS se trata el material con ácidoperyódico, que oxida los 1,2-glicoles formándose gruposaldehído en los glucanos y mananos de las paredes celularesde los hongos
Con el reactivo de Schiff, los aldehídos reaccionan dandoun color rojo luminoso
Los filamentos fúngicos, conidias y esporas aparecen rojos o rosas intensos
El cemento de algunos granos en los micetomas adquiere un color amarillo naranja
El citoplasma que es verde en general adquiere un tinte rosa
Permite la detección de hongos en muestras de tejido
Mucor sp.
Candidiasis
Aspergillus sp.
Coccidioides immitis
Tinción de Giemsa y Wright
Utilizada para levaduras intracelulares, que generalmentese encuentran dentro de los macrófagos o monocitos
Forma un halo alrededor de la pared celular
Citoplasma se tiñe de azul celeste
Un polo se tiñe de azul oscuro (media luna)
Hystoplasmacapsulatum
Pneumocystisjiroveci
Tinciones especiales
Tinción negativa con tinta china
Fundamento: Este método es ideal para observar inclusiones refráctiles que no se tiñen fácilmente, tales como gránulos de azufre, ácido poli-B-hidroxibutirico, esporas o capsulas, debido a que las partículas de carbón empleadas están cargadas negativamente y son repelidas por la carga negativa de la pared y delimitan una silueta mayor que el tamaño real de la bacteria
Esta tinción especialpara visualizar aCryptococcusneoformansLa tinta china se empleaen una dilución de 1:2con agua destilada(suspensión de coloidal decarbón o nigrosina)La técnica consiste encolocar una gota delproducto biológico porexaminar y una gota detinta china separados por3 mm
La cápsula aparece como un halo claro y nítido en torno a unalevadura redonda, delimitado por las partículas de carbón ensuspensión coloidal de la tinta china, exhibiendo un nítido contraste.
Tinción con tinta china para observar la cápsula de C. neoformans.
Tinción de Esporas
Tinción de ascas y ascoposras de todos los hongos, y especialmente útil cuando, se trata de visualizar levaduras en los Hemiascomycetes, ya que con las tinciones habituales es muy difícil distinguir sus formas sexuales.ReactivosVerde de malaquita se tiñe la esporaSafranina se tiñe la célula vegetativaLas ascas y ascasporas se tiñen de color verde, en tanto que las levaduras toman coloración roja
Tinción de Gomori-Grocott(Metenamina de plata)
Fundamento: Entre las coloraciones especialespara hongos, la plata-metenaminas de Gomori.La reacción tintorial esta basada en quepresencia de acido crómico, los grupos hidroxilode lo polisacáridos de la pared celular de loshongos son oxidados a aldehídos; estos a su vez,reducen el complejo nitrato- plata metenaminaproduciendo la coloración café a negra, debido dela plata reducida en los lugares de localizaciónde los aldehídos
Imagen histológica, tinción con Gomori-Grocott (tinción con plata) mostrando esférulas en diferentes estados de maduración.
Tinción de Gomori-GrocottCon esta técnica los hongos se tiñen de color negro al igual que una bacterias; la mucina adquiere un color gris oscuro; las partes internas del micelio, rosa oro; el fondo aparece de color verde claroReactivosÁcido crómico.- Oxidación de grupos hidroxilo de los polisacáridos de pared celularBisulfito de sodio.- BufferMetamina-nitrato de plata.- Producción de color café a negro en la paredCloruro de oro.- Colorante de contraste en la pared Verde brillante.- Colorante de fondo en la preparación
Blanco de carcoflour
Fundamento: El calcofloúr es un flourocromo que se unea polisacáridos con los enlaces beta 1-3 y beta 1-4 presentesen polímeros tales como celulosa y la quitina. El colorantefluorece cuando se expone a una fuente de luz ultravioletade onda corta o capaz de producir la luz azul (longitud deonda 410-450 nm). Es un método de alta sensibilidad paradefinir claramente los elementos micoticos conmicroscopio de fluorescenciaReactivosCalcoflour blanco M2R (polysciences)Azul de Evans
Negro de clorazol E
Fundamento: Es un colorante que permite visualizarrápidamente y nítidamente las estructuras micoticasuniéndose especialmente a la quitina. Tiene la desventajade degradarse con la luz, por lo requiere mantenerse enoscuridad. Además debe prepararse mensualmente. Laspreparaciones con la muestra deben leerse al mismo día dela realización, ya que el colorante se precipita con eltiempo y al secarse.Clorazol EDMSOKOH al 7%
Procedimientos
Azul algodón-lactofenol (colonias de Hongos)
Poner en un portaobjetos limpio sobre una superficie iluminada y transparente o en su defecto sobre una hoja blanca
Poner una gota pequeña de azul de algodón lactofenol en el centro del portaobjetos
Tomar un fragmento de la colonia mediante una asaMontar la preparación depositando suavemente un
cubreobjetos sobre el portaobjetosSellar con esmalte incoloro
Tinción con eritrosina
Fijar con alcohol metílico por 10 minCubrir con eritrosina por 15 minLavar ligeramente con agua de la llaveHacer pasar rápidamente alcohol al 70 % y se deja secarPasar por alcohol absoluto durante 5 minutos y dejar secarPoner xilol por 15 min y dejar secarMontar en bálsamo de Canadá
Tinción con azul algodón acético
Fijar con alcohol metílico, cubriendo el portaobjetos y sedeja evaporarCubrir la preparación con azul de algodón acético por 20min, calentando hasta la emisión de vaporesLavar rápidamente con aguaPasar por alcohol al 96 % y secarPasar por Xilol hasta que transparente la preparaciónMontar en bálsamo de Canadá
Tinción de ZiehlNeelsen para Actinomyces
La preparación se llena con fucsina fenificada a emisión de vapores por 3 minutos
Decolorar con alcohol-ácido y se lava con aguaCubrir la preparación con azul de metileno durante 1 min y
se deja escurrirSe deja secar y se observa a 10X y 40X
Tinción ZiehlNeelsen modificada
La preparación se llena con fucsina fenificada a emisión de vapores por 5 minutos
Decolorar con alcohol-ácido y se lava con aguaCubrir la preparación con azul de metileno durante 2 min y
se deja escurrirColocar una gota de nigrosina en el extremo del
portaobjetos y se extiende como si fuera un frotis sanguíneo en capa fina, se deja secar y se observa a 10X y 40X
Tinción Gram
Tinción de Wright
No es necesario fijar el frotisColoque el portaobjetos completamente horizontal sobre una
superficie adecuada que deje libre la mayoría de sus bordes ycúbralo con el colorante
Después de 3 min agregue solución buffer de fosfatos oagua destilada en la misma cantidad que la del colorante,mezcle la solución, aplique una corriente de aire sobre lamezcla mediante una pipeta
Después de 5 min enjuague con agua de la llaveDeje secar y lea al microscopio en seco débil, seco fuerte y a
inmersión
Referencias bibliográficas.Guzman Arenas Roberto, “Micología médica”., EditorialMcGraw-Hill, 2ª. Edición; México, 2004. Capitulo 34 pag 299-305RubenLopezMartinez, Micología Médica Procedimiento para eldiagnostico de laboratorio, Ed. Trillas, México 2006 Capitulo 10Pag.149-158F.J. Baker, Manual de Técnicas de Micología MédicaEditorial Acribia, S.A Zaragoza España 1998 pag. 18-20; 40-41Dr. Norman F. Connan; Micología; Editorial Interamericana S.A de C.V 3ra Edición México 1972 pag. 557-569 Lynch, M; Raphael, S. Métodos de Laboratorio. Editorial Interamericana. 2º edición. México. 1987. Tomo II pag. 523-530MURRAY, G. Microbiología Médica. Edit. El Manual Moderno. 3º edición México D.F. 1997 pag 175-182
![Tincion Gram y Morfologia Bacteriana LESP [PQCMAOG]](https://img.pdfslide.es/doc/110x75/5571f19949795947648b641d/tincion-gram-y-morfologia-bacteriana-lesp-pqcmaog.jpg)
