Material de apoyo para ElectroQuímica Analítica y Cromatografía

II. CROMATOGRAFIA PLANA

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL (PC)

La cromatografía en papel (1944, Consden, Gordon y Martin) es una técnica analítica importante y de gran aplicación para la separación e identificación de microcantidades de substancias. Las especies separadas aparecen como manchas después de rociar el papel con algún reactivo formador de color apropiado para el caso.

Existen varias formas de realizar cromatografía en papel. El método clásico es como sigue (figura 16):

a) Se satura un trozo de papel filtro con agua.b) Se coloca una gota de la mezcla a analizar sobre el papel.c) El papel se sumerge en una cuba que contiene un solvente orgánico.d) A medida que el solvente se mueve, va arrastrando y separando los componentes de la mezcla. A esta operación se le conoce como desarrollo.e) Si es necesario, el papel se rocía con un reactivo formador de color que haga aparecer a los distintos componentes de la mezcla. A esto se le llama revelado.

Figura 16. Cromatografía en papel.

El solvente orgánico en la cuba es la fase móvil, mientras que el agua con la que se saturó el papel es la fase estacionaria. El solvente orgánico asciende por el papel. Cada componente de la mezcla XYZ tiene un coeficiente de reparto diferente entre la fase orgánica y la fase acuosa, por lo que X, Y y Z se separan a medida que el solvente se desplaza por el papel.

TAREA 1.

Investigar las variaciones en el desarrollo de las técnicas en papel (ascendente,

descendente, sándwich, etc.)

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (CCF)

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(E) Afinidad

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Ismailov y Scraiber utilizaron láminas de vidrio para colocar capas muy delgadas de alúmina y luego aplicaron extractos vegetales, dando así la primera forma de Cromatografía de Capa Fina. Egon Stanl (1956) dió el nombre de Cromatografía de Capa Fina (TLC, CCF).

Este tipo de cromatografía planar, es una técnica relacionada con la HPLC, pero con su propia especificidad. Aunque estas dos técnicas son experimentalmente diferentes, el principio de separación y la naturaleza de las fases es la misma. Debido a la reproducibilidad de las películas y las medidas de concentración, la CCF es ahora un método cuantitativo de análisis que puede efectuarse en instrumentos modernos. El desarrollo de aplicadores automáticos y densitómetros ha llevado a la nano –CCF a ser una técnica simple con alta capacidad

Las placas, se recubren con una delgada capa (100-200 µm) de fase estacionaria, la cohesión de la fase y su enlazamiento al soporte se asegura introduciendo un ligando orgánico o un mineral cuando se deposita la película. El volumen de la muestra debe ser pequeño (unos pocos nL o µL) y se colocan en pequeños puntos de 1-3 mm de diámetro. La muestra puede aplicarse manualmente o usando un capilar de extremo plano (fig. 17). La aplicación puede hacerse también a manera de una banda horizontal de unos cuantos milímetros depositada por rociado automático de la muestra. La placa se coloca en una cámara cubierta, que contiene una pequeña cantidad de fase móvil, la cual esta en contacto con la placa con la parte donde se colocó la muestra sumergida a una profundidad de unas cuantos milímetros. La fase móvil migra por capilaridad a través de la fase estacionaria, induciendo a los componentes de la muestra a migrar de manera diferencial. Una vez que el solvente ha recorrido la distancia adecuada (unos cuantos centímetros) la placa se retira de la cámara y la fase móvil se evapora.

Figura 17 Aplicación automática empleada en CCF analítica. Aplicador programable ATS-3

Fundamentos.

17

Comúnmente los ensayos en TLC se usan como prueba preliminar antes de emplear otros tipos de cromatografía más complicados, tales como HPLC (Cromatografía líquida

de alta resolución).

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La separación de mezclas de moléculas mediante CCF se basa en el principio del reparto entre dos fases. En general, se realiza permitiendo que la mezcla de moléculas que se desea separar (muestra) interaccione con un medio de soporte que se denomina fase estacionaria. Un segundo medio (la fase móvil) que es inmiscible con la fase estacionaria se hace fluir a través de ésta para "lavar" (eluír) a las moléculas en la muestra. Debido a que las distintas moléculas en la muestra presentan diferente coeficiente de reparto, la fase móvil "lavará" a los componentes con diferente eficiencia, de modo que aquellos que "prefieren disolverse" en la fase móvil serán eluídos más rápido que los que sean preferencialmente solubles en la fase estacionaria.

Proceso de Adsorción

La muestra aplicada en la capa es adsorbida en la superficie del material por la acción de fuerzas electrostáticas (fuerzas de Van der Waals, puentes de Hidrógeno, efectos inductivos, etc). Luego, cuando la capa es expuesta a un flujo por acción capilar, se inicia una competencia de enlaces entre los sitios activos del adsorbente y la sustancia con el solvente. Las características del adsorbente que definen las propiedades de la fase estacionaria son: tamaño de partícula, volumen de poro, diámetro de poro, área superficial, homogeneidad y pureza.

La distancia entre los grupos silanol y siloxano determinan el carácter hidrofilico de la fase. Como en HPLC, pueden enlazarse varias cadenas a los grupos silanol superficiales de las fases de silica. Algunas fases incorporan cadenas de alquilos simples (RP-2, RP-8, RP-18) mientras otras incluyen grupos funcionales orgánicos (nitrilos, aminas, o alcoholes) permitiendo que estas fases puedan usarse con cualquier tipo de fase móvil.

Los adsorbentes más utilizados en la CCF son: Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones) Óxido de Aluminio ó Alúmina (ácida, neutra ó básica) Tierra Silícea ó Kieselguhr Celulosa (Nativa o micro-cristalina) Poliamidas

PROCEDIMIENTO COMUN PARA CCF

1. Preparación de la Placa Cromatográfica

Se usan como soporte del adsorbente láminas de: Vidrio, Plástico ó Metálicos (ej: Aluminio). Los tamaños de la placa para TLC convencional son: 20 x 20; 10 x 20 y 5 x 2. Hay placas que contienen un indicador de Fluorescencia : F254 ó F366. El número que aparece como subíndice nos indica la longitud de onda de excitación del indicador utilizado.

2. Aplicación de la muestra

La muestra se aplica en la placa según el objetivo: Analítico ó Preparativa en: banda o puntos. La técnica de aplicación en banda, tiene la ventaja de presentar una alta reproducibilidad para la cuantificación de la muestra depositada, esencial en el análisis cuantitativo.

3. Desarrollo de la Placa

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En cromatografía de capa fina la fase estacionaria está hidratada, por lo que se le considera como la fase polar.

Para nano - CCF las partículas son del orden de 4 µm y los poros son de 6 nm.

RP = reversed

phase = Fase

reversa

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Es un proceso mediante el cual son transportados a través de la fase estacionaria por la fase móvil. Este proceso se efectúa en el interior de una cámara de desarrollo. Existen varios tipos de cámaras, Normal, Doble Compartimiento, Sándwich, Horizontal, entre otras.

4. Detección ó Visualización

Si la muestra (mancha) no es coloreada se requiere de métodos que nos permitan visualizar el(los) componente(s) presentes. Estos métodos pueden ser químicos o físicos En los Químicos ya sea por inmersión o rociado se obtienen derivados coloreados o fluorescentes. Los métodos Físicos (ópticos).generalmente utilizan radiación UV.

Como ejemplos de estos métodos, los fabricantes, ofrecen placas con una sal fluorescente de cinc, adicionada a la fase estacionaria. Cuando la placa se irradia con una lámpara de mercurio, aparecen puntos negros sobre un fondo fluorescente, indicando la posición de los compuestos. Otro método universal de revelado, consiste en calentar la placa después de rociarla con ácido sulfúrico, carbonizando los compuestos y haciéndolos visibles. También pueden usarse reactivos como el ácido fosfomolíbdico (general) o la ninhidrina en alcohol, (específico para aminoácidos).

Figura 18. Cámara vertical y placa de CCF. Apariencia típica de una placa de CCF después del desarrollo.

CROMATOGRAFÍA EN DOS DIMENSIONES.

El uso de placas de CCF o de papel de geometría cuadrada permite desarrollar cromatografía bidimensional, usando dos fases móviles distintas. La segunda migración se realiza después de rotar la placa (o el papel) un cuarto de vuelta (fig. 19) Una aplicación típica de esta técnica, es en la separación de aminoácidos, aunque no se acostumbra usarlo para el análisis cuantitativo.

19

El uso de diferentes fases móviles se recomienda para una mejor separación.

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Figura 19. Principio de CCF bidimensional. A) aplicación de 3 estándares (a, b y c) y una muestra (x). B) migración con el primer solvente. C)

secado y rotación del la placa. D) Migración con el segundo solvente.

PARÁMETROS DE RETENCIÓN Y SEPARACIÓN

En CCF y en cromatografía en papel, cada componente es definido por su valor de R f (factor de retardo) el cual corresponde a la migración relativa en comparación al solvente:

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Conclusión: x es probablemente a, pero la impureza no es b, o c.

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Rf = distancia recorrida por el soluto = x

distancia recorrida por el solvente x0

Figura 20. Definición del factor de retardo.

Análisis Cualitativo

Existen diferentes criterios para identificar compuestos separados por las técnicas de cromatografía planar, siendo algunos de ellos:

Medida de Rf

Comparación Visual de Color/Intensidad

Propiedades UV/IR/MS/NMR

Análisis Cuantitativo

Semi-cuantitativo: Consiste en la comparación visual del diámetro y la intensidad del color de la mancha contra una serie de manchas patrones de concentración conocida

Cuantitativo: puede hacerse de manera indirecta ó directa (densitometría, espectrofotometría)

Densitometría

El densitómetro es un instrumento que determina de manera indirecta la luz absorbida por una superficie. La luz absorbida es la diferencia entre la luz reflejada y la luz incidente.

El densitómetro no mide densidades de manera directa; mide la luz reflejada y la compara con la luz incidente.

Medida de Transmisión. Medida de luz transmitida a través de la sustancia.

Medida de Emisión. Medida de luz reflejada desde la sustancia.

El densitómetro produce un pseudo-cromatograma, que contiene picos con áreas que pueden ser medidas.

Espectrofotometría

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Fluorescencia

Desactivación de la Fluorescencia

Aplicaciones generales:

Determinar el grado de pureza de un compuesto

Comparar muestras

Realizar el seguimiento de una reacción

Controlar el contenido de las fracciones obtenidas en cromatografía de columna.

TAREA 2.

Buscar ejemplos de aplicaciones particulares de cromatografía en papel y en capa fina.

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