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3. Técnicas de microscopíacon luz visible
y sus aplicaciones
Técnicas de microscopía con luz visible
● Microscopías de campo claro y campo oscuro
● Microscopía de polarización
● Microscopía de contraste de fases
● Microscopía de contraste interferencial (Nomarski)
Microscopía de campo claro
Se contrasta el objeto que se observa del medio que
le rodea o las diferentes partes del mismo objeto
gracias a que la luz que lo atraviesa con respecto a
la que no lo atraviesa presenta diferencias
en su longitud de onda (diferencias de color)
y/o de amplitud (diferencias de intensidad)
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de campo claro
Int. del fondo – Int. de la muestra% contraste = x 100
Int. del fondo
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de campo oscuro
La imagen se forma sólo con los rayos difractados por
el objeto.(Es el mismo principio que nos permite ver las estrellas de noche o las partículas de polvo en un rayo de luz cuando entramos en una sala oscura.)
Especialmente indicada para muestras con poco
contraste.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de campo oscuro3. Técnicas de microscopía con luz visible
objetivo
muestra
condensadora
diafragma
Microscopía de campo oscuro
La luz se hace incidir muy oblicuamente sobre la preparación.Los rayos que la atraviesan o no, pero que siguen más o menos la trayectoria inicial no son recogidos por el objetivo.Sólo la luz que es difractada por el objeto, o que el objeto refleja casualmente, llega al objetivo.
De esta manera la imagen del objeto aparece clara sobre un fondo oscuro.
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de campo oscuro3. Técnicas de microscopía con luz visible
Esta iluminación está especialmente indicada para preparaciones delgadas y sin teñir.
Glóbulos rojos
Microscopía de campo oscuro3. Técnicas de microscopía con luz visible
Montaje de organismos vivos del agua
Microscopía de campo oscuro3. Técnicas de microscopía con luz visible
Es especialmente útil para observar células en suspensión.
Permite encontrar fácilmente el plano focal correcto a bajos aumentos en muestras pequeñas y con poco contraste.
Microscopía de campo oscuro3. Técnicas de microscopía con luz visible
Es necesario emplear un objetivo con una A.N. algo inferior a la A.N. que ilumina la condensadora de campo oscuro para evitar que luz directa entre en la imagen.
La eficacia de este sistema también depende de que el haz luminoso sea intenso y no dispersado, ya que sólo se va a utilizar parte de la luz.Para ello se usa una fuente luminosa homogénea y brillante como un filamento incandescente.
Microscopía de polarización3. Técnicas de microscopía con luz visible
LUZ POLARIZADA:Las ondas electromagnéticas son de naturaleza transversal, es decir, el vector de vibración es perpendicular a la dirección del desplazamiento.
Microscopía de polarización3. Técnicas de microscopía con luz visible
LUZ POLARIZADA:Si se restringe la vibración de los vectores eléctricos a un solo plano mediante un filtro se obtiene luz linealmente polarizada respecto a un solo plano de vibración.
Microscopía de polarización3. Técnicas de microscopía con luz visible
LUZ POLARIZADA:Los polarizadores son filtros que contienen moléculas poliméricas de cadena larga orientadas en una única dirección.
Microscopía de polarización3. Técnicas de microscopía con luz visible
LUZ POLARIZADA:Si ahora un rayo polarizado incide sobre una segunda lámina polarizadora, la intensidad y la amplitud de la onda que atraviese la segunda lámina dependerán del ángulo de incidencia respecto a la dirección de polarización.
● Si las dos láminas son paralelas en sus direcciones de polarización, se transmite toda la luz.
● Si las dos láminas son perpendiculares, el rayo no consigue atravesar la segunda.
Microscopía de polarización3. Técnicas de microscopía con luz visible
Polarización cruzadaLa base de la microscopía de polarización.
Microscopía de polarización3. Técnicas de microscopía con luz visible
Birrefringencia:
Existen materiales que poseen doble refringencia.
Esta propiedad es indicativa de anisotropía óptica, es decir, que el comportamiento de la luz al atravesarlos no es el mismo independientemente de la dirección en la que incide.
La calcita, CaCO3, es un material birrefringente.
Microscopía de polarización3. Técnicas de microscopía con luz visible
Birrefringencia:
La luz que entra en un material birrefringente se descompone en dos rayos.
Cada uno está determinado por un índice de refracción y cada uno vibra sólo en una dirección (polarizados) pero a ángulos rectos uno del otro.
Originalmente los polarizadores se hacían de calcita y se conocen como “Prismas de Nicol”.
Microscopía de polarización3. Técnicas de microscopía con luz visible
La técnica explota las propiedades ópticas de la anisotropía para revelar información detallada acerca de la estructura y composición de los materiales.
La finalidad es conseguir contrastar las diferentes estructuras observadas aprovechando que entre ellas pueda haber alguna que sea capaz de cambiar el plano de polarización de la luz, es decir, que haya alguna sustancia birrefringente ella misma.
Microscopía de polarización3. Técnicas de microscopía con luz visible
Los microscopios de polarización incorporan dos láminas polarizadoras. La primera llamada polarizador se sitúa después de la fuente luminosa, generalmente en el soporte de filtros de la subplatina. La segunda, denominada analizador, se dispone entre el objetivo y el ocular. Ambas tienen que girar fácilmente y ser capaces de fijación. También conviene que estén graduadas para que se pueda apreciar el ángulo que se giran.
Microscopía de polarización3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de polarización3. Técnicas de microscopía con luz visible
● Cuando el polarizador se dispone de forma que su dirección de polarización es perpendicular a la del analizador el campo aparece totalmente oscuro en ausencia de la preparación.
● Al colocar la muestra aquellas zonas de la preparación que no sean capaces de variar el plano de polarización de la luz que las atraviesa aparecerán completamente oscuras.Mientras que las que sí sean capaces aparecerán más o menos claras según la magnitud de la variación en el plano de polarización que sufra la luz al atravesarlas.
Microscopía de polarización3. Técnicas de microscopía con luz visible
Dominios de nucleaciónde cristal líquido ferroeléctrico
Coke de petróleo
Microscopía de polarización3. Técnicas de microscopía con luz visible
Almidón de maíz Diatomeas
Microscopía de contraste de fases3. Técnicas de microscopía con luz visible
● La mayoría de los detalles de las células vivas son
indetectables mediante la microscopía de campo
claro porque hay muy poco contraste entre las
estructuras ya que tienen similar transparencia y
son incoloras.
● A no ser que el medio de montaje sea
extremadamente fino, el modo de campo oscuro
puede distorsionar los detalles.
Microscopía de contraste de fases3. Técnicas de microscopía con luz visible
● Es una técnica de aumento de contraste
especialmente indicada para la observación de
muestras transparentes o sin teñir.
Permite observar muestras vivas sin que
previamente haya que matarlas, fijarlas y teñirlas.
● Así, la dinámica de los procesos biológicos se
puede observar y grabar con elevado contraste y
los pequeños detalles de la muestra se ven con
gran claridad.
Microscopía de contraste de fases3. Técnicas de microscopía con luz visible
● Se basa en el hecho de que cuando interfieren
ondas que tienen un determinado desfase se
produce una interferencia constructiva (con mayor
amplitud) o destructiva (con menor amplitud).
Microscopía de contraste de fases3. Técnicas de microscopía con luz visible
+ =
+ =
Interferenciaconstructiva
Interferenciadestructiva
Microscopía de contraste de fases3. Técnicas de microscopía con luz visible
● El objetivo es manipular el desfase de dos haces
de luz para trasladar esas pequeñas variaciones de
fase a los correspondientes cambios de amplitud
que se visualizan como diferencias de contraste.
● Pequeñas diferencias de fase se convierten en
cambios de intensidad.
Microscopía de contraste de fases3. Técnicas de microscopía con luz visible
Luz incidente
Desfase
Microscopía de contraste de fases3. Técnicas de microscopía con luz visible
● El contraste de fases básicamente es un método de
iluminación que trata una determinada porción de la
luz (la que ha sufrido difracción al atravesar el
objeto) de forma diferente al resto (la que no ha
sufrido ninguna alteración) para, a continuación,
provocar que la primera porción de la luz interfiera
con el resto, de manera que resulte una imagen
visible de una muestra transparente.
Microscopía de contraste de fases3. Técnicas de microscopía con luz visible
La formación de la imagen es un resultado de la
interferencia de la luz directa y la luz difractada.
La luz directa (sin desviar) se proyecta por el
objetivo y se extiende de forma homogénea en el
plano imagen en el diafragma del ocular. Allí la luz
difractada causa interferencia y reduce la
intensidad dando lugar a áreas más o menos
oscuras.
Microscopía de contraste de fases3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste de fases3. Técnicas de microscopía con luz visible
Luz de la fuenteAnillo anular
Lente condensadora
Muestra
Lente objetivo
Placa de fase
Plano focal posterior
Microscopía de contraste de fases3. Técnicas de microscopía con luz visible
● El primer paso es separar la luz directa de la luz
difractada. Para ello se coloca, en el plano focal de
la condensadora, un diafragma anular que proyecta
en el infinito la imagen de un haz anular.
Este cono de luz hueco pasa a través de la muestra
sin desviarse y la débil luz difractada por la muestra
se extiende en todo el plano focal posterior del
objetivo.
Microscopía de contraste de fases3. Técnicas de microscopía con luz visible
Luz de la fuenteAnillo anular
Lente condensadora
Muestra
Lente objetivo
Placa de fase
Plano focal posterior
Microscopía de contraste de fases3. Técnicas de microscopía con luz visible
● Después se acelera la luz que no se ha desviado
mediante una lámina colocada en el plano focal
posterior del objetivo, que contiene un anillo,
llamado anillo de fase.
Este anillo es más fino que el resto de la lámina de
forma que la luz que pase a través de él (la luz no
difractada) viaja una distancia más corta al
atravesar el objetivo que la luz difractada.
Microscopía de contraste de fases3. Técnicas de microscopía con luz visible
Luz de la fuenteAnillo anular
Lente condensadora
Muestra
Lente objetivo
Placa de fase
Plano focal posterior
Microscopía de contraste de fases3. Técnicas de microscopía con luz visible
● Así, cuando la luz directa y la luz difractada llegan
al plano imagen están desfasadas en ½ λ y cuando
interfieren lo hacen destructivamente y los detalles
de la muestra aparecen oscuros sobre un fondo
más claro.
● El efecto final es la imagen de una muestra que
tuviera variaciones de densidad en lugar de
variaciones de índice de refracción.
Microscopía de contraste de fases3. Técnicas de microscopía con luz visible
AJUSTE DEL MICROSCOPIO:
● La correspondencia entre las placas de fase de los
objetivos y los diafragmas anulares de la
condensadora ha de ser exacta. A cada placa le
corresponde un diafragma anular y el centrado de
ambos ha de ser exacto.
● El centrado se realiza con una lente de Bertrand
que permite enfocar el diafragma anular del
condensador.
Microscopía de contraste de fases3. Técnicas de microscopía con luz visible
AJUSTE DEL MICROSCOPIO:
● La iluminación de Köhler debe estar ajustada y el
diafragma de apertura completamente abierto para
trabajar en modo contraste de fases.
Microscopía de contraste de fases3. Técnicas de microscopía con luz visible
AJUSTE DEL MICROSCOPIO:● Para centrar las placas con el diafragma anular se
inserta la lente de Bertrand y se enfoca. Se gira el disco de la condensadora para insertar el diafragma anular que corresponda y se hacen coincidir con unos tornillos de ajuste
Microscopía de contraste de fases3. Técnicas de microscopía con luz visible
Limitaciones:
● Las imágenes presentan “halos” alrededor de los
detalles.
● Puede empeorar la resolución.
● No funciona bien con muestras gruesas porque los
desplazamientos de fase ocurren en áreas ligeramente
por debajo o por encima del plano de foco.
Estos desplazamientos pueden confundir y distorsionar
los detalles de la imagen.
Microscopía de contraste de fases3. Técnicas de microscopía con luz visible
Pescado cteonide(teleosteo)
Células ováricasde hamster
Glóbulos rojoshumanos
Microscopía de contraste interferencial
Nomarski
DIC
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste interferencial 3. Técnicas de microscopía con luz visible
El principio es el mismo que en el caso de una placa de
fases:
La interacción de los rayos difractados por el objeto con
rayos que no lo hayan atravesado de manera que se
puedan apreciar diferencias de amplitud derivadas de
esta interacción.
● Pequeñas diferencias de fase se convierten en
cambios de intensidad entre las zonas adyacentes.
Microscopía de contraste interferencial 3. Técnicas de microscopía con luz visible
● El dispositivo consiste en la separación de los rayos
provenientes del condensador en dos haces que viajan
en direcciones ligeramente diferentes.
● Después de atravesar el objeto los dos haces son
recombinados.
● El diferente desfase causado por el objeto en los haces
se transforma en un contraste de amplitud al sumarse o
restarse las fases de éstos.
Microscopía de contraste interferencial 3. Técnicas de microscopía con luz visible
● Si la iluminación es monocromática la imagen
presentará un contraste de intensidad con el fondo.
● Si la iluminación es policromática, como la variación de
fase introducida por el objeto depende de la longitud de
onda, el resultado será una imagen de colores sobre un
fondo elegible (mediante el ajuste de la diferencia de
camino entre los haces).
● Esta técnica elimina los efectos de halo de la
microscopía de contraste de fases.
Microscopía de contraste interferencial3. Técnicas de microscopía con luz visible
● Los sistemas de contraste diferencial interferencial desarrollados por Nomarski emplean un filtro de polarización para producir luz vibrando sólo en un plano perpendicular a la dirección del haz de luz.
● Este haz pasa a través de un prisma de Wollaston modificado que separa el haz de luz en dos rayos perpendiculares el uno al otro (de modo que no pueden causar interferencia).
● Los dos rayos pasan a través de la lente condensadora y emergen como dos haces paralelos que están extremadamente juntos, pero que tienen una ligera diferencia de caminos.
Microscopía de contraste interferencial3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste interferencial3. Técnicas de microscopía con luz visible
● El haz separado entra en la muestra y ambos haces son desviados de acuerdo con su interacción con las características de la muestra (grosor, forma e índice de refracción).
● Los dos haces de luz alterados individualmente por sus interacciones con la muestra pasan a través del objetivo y se recombinan por el prisma combinador de haces de Wollaston modificado, después de atravesar el objetivo.
● Esto elimina el corte o distancia y la diferencia de caminos original entre el par de haces.
Microscopía de contraste interferencial3. Técnicas de microscopía con luz visible
● Como resultado de haber atravesado la muestra, los caminos de los dos haces paralelos no son de la misma longitud (hay una diferencia de camino óptico) para las diferentes áreas de la muestra.
● Para que ambos haces puedan interferir, las vibraciones de los haces de diferente longitud de caminos se deben llevar al mismo plano y eje.
● Para ello se coloca un segundo polarizador (el analizador) a continuación del prisma de Wollaston recombinador.
Microscopía de contraste interferencial3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste interferencial3. Técnicas de microscopía con luz visible
● El haz de luz pasa a través del analizador cruzado con el primer polarizador que los lleva al mismo plano y eje.
● Así ocurre una diferencia interferencial entre los dos haces originalmente independientes que se observan como diferencias en intensidad y color.
● Las diferencias en la intensidad de la luz o el color observado dependen de variaciones en los índices de refracción y/o grosor de las muestras.
Microscopía de contraste interferencial3. Técnicas de microscopía con luz visible
● Cuando el segundo prisma se coloca de forma que produzca la imagen más gris se produce la visión tridimensional más evidente de la muestra.Rotando la muestra 180º se consigue que las zonas que aparecían elevadas aparezcan hundidas y viceversa.
● Con una fuente de luz blanca, la luz de diferentes colores tiene diferentes longitudes de camino después de atravesar la muestra.Algunas áreas generan interferencia constructiva para un color y destructiva para otros.
Microscopía de contraste interferencial 3. Técnicas de microscopía con luz visible
Contraste de fases Contraste interferencial
Alga spirulina
Microscopía de contraste interferencial 3. Técnicas de microscopía con luz visible
Contraste de fases Contraste interferencial
Cianobacteria
Microscopía de contraste interferencial 3. Técnicas de microscopía con luz visible
Contraste de fases Contraste interferencial
Glóbulos rojos
Aplicaciones3. Técnicas de microscopía con luz visible
Según la configuración del microscopio:● Microscopios derechos:
● Preparaciones de cortes histológicos y cortes semifinos, frotis, células vivas, muestras microbiológicas, láminas geológicas delgadas, probetas de ciencia de materiales de tamaño reducido, …
● Microscopios invertidos:● Preparaciones de cortes histológicos y cortes semifinos,
frotis, células cultivadas dentro de cámara de cultivo, plancton y microorganismos en suspensión, microorganismos cultivados en placa de Petri, micromanipulación de células y embriones, probetas de ciencia de materiales, trabajo con subplatinas especiales, ...
Aplicaciones3. Técnicas de microscopía con luz visible
Según el tipo de iluminación:● Microscopía de campo oscuro:
● Está especialmente indicada para muestras con poco contraste:espiroquetas, flagelatos, suspensiones celulares, técnicas de flujo celular, parásitos, conteo de granos de autorradiografía, ...
Aplicaciones3. Técnicas de microscopía con luz visible
Según el tipo de iluminación:● Microscopía de luz polarizada:
● Estudio de todas aquellas estructuras en las que se prevé una cierta ordenación que las hará, probablemente, anisótropas, tales como las paredes de celulosa de las células vegetales, las fibras musculares, etc.
● Casos de interés clínico como la detección de diferentes sustancias minerales en los tejidos: sílice y asbestos en los tejidos pulmonares, mica y almidón en granulomas postoperatorios, etc.
Aplicaciones3. Técnicas de microscopía con luz visible
Según el tipo de iluminación:● Microscopía de luz polarizada:
● Estudio de moléculas biológicas altamente ordenadas como DNA, almidón, madera y urea.
● Numerosos cristales, estructuras fibrosas (naturales y artificiales), pigmentos, lípidos, proteínas, huesos y depósitos de amiloide exhiben birrefringencia y por tanto ofrecen información bajo luz polarizada.
Aplicaciones3. Técnicas de microscopía con luz visible
Según el tipo de iluminación:● Microscopía de luz polarizada:
● Aplicaciones geológicas, principalmente para el estudio de minerales en secciones rocosas delgadas.
● Minerales naturales e industriales, materiales compuestos tales como cementos, cerámicas, fibras minerales y polímeros.
● Identificación de fibras de asbestos, estudio de la formación rocosa, polímeros naturales y sintéticos, fibras de nylon, etc.
Aplicaciones3. Técnicas de microscopía con luz visible
Según el tipo de iluminación:● Microscopía de contraste de fases:
● Obtención de imágenes de elevado contraste de muestras transparentes:Células vivas (generalmente en cultivo) microorganismos, secciones finas de tejido, patrones de litografía, fibras, dispersiones de látex, fragmentos de vidrio y partículas subcelulares (incluyendo el núcleo y otros orgánulos).
● Secciones en parafina o resina sin teñir y muestras congeladas.
Aplicaciones3. Técnicas de microscopía con luz visible
Según el tipo de iluminación:● Microscopía de contraste de fases:
● En investigación médica y biológica especialmente en los campos de citología e histología:
● Visualización de componentes celulares internos como las membranas, núcleo, mitocondrias, cromosomas, aparato de Golgi y gránulos del citoplasma en células animales y vegetales.
● Diagnóstico de células tumorales y para ver el crecimiento, dinámica y comportamiento de una gran variedad de células vivas en cultivo.
● Hematología, virología, bacteriología, parasitología, paleontología y biología marina.
Aplicaciones3. Técnicas de microscopía con luz visible
Según el tipo de iluminación:● Microscopía de contraste de fases:
● Aplicaciones químicas e industriales: mineralogía, cristalografía y morfología de polímeros. Microcristales sin color, polvo, partículas sólidas y polímeros cristalinos que tienen un índice de refracción que difiere sólo ligeramente del medio de inmersión.
● Productos comerciales como arcillas, grasas, aceites, jabones, pinturas, pigmentos, alimentos, drogas, tejidos y otras fibras.
● Examen de superficies: circuitos integrados, dislocaciones cristalinas, defectos y litografía.