5. Aislamiento de Principios Activos de Drogas Vegetales 2013-2014

Universidad Central de VenezuelaFacultad de Farmacia

Farmacognosia y Medicamentos Herbarios

Prof Nery Margarita Prez Ibez2013-2014

Tema N 5. Aislamiento de Principios Activos de Drogas Vegetales

Drogas vegetales

Elaboracin de medicamentos

herbarios

Aislamiento de principios

activos

Elaboracin de medicamentos

alopticos

2

Artemisinina

Dihidroartemisinina

Artemisia annua L.

Semisintesis

DROGA VEGETAL

EXTRACTO

Extracto activo

FRACCIONES

Fracciones activas

COMPUESTOS

Compuestos activos

Compuestos inactivos

Bioensayo

Separacin, Purificacin

Fracciones inactivas

Bioensayo

Fraccionamiento

Extracto inactivo

Bioensayo

Extraccin

ESTUDIO BIOGUIADO

Elucidacin estructural

COMPUESTOS ACTIVOS ELUCIDADOS

3

Aislamiento de principios activos de drogas vegetales

4

PLANIFICACIN PREVIA 1. Seleccin del material vegetal

Seleccin etnomdica Seleccin quimiotaxonmica Seleccin ecolgica Seleccin al azar

2. Recoleccin, limpieza, secado y almacenamiento del material vegetal

3. Identificacin botnica 4. Revisin bibliogrfica

REVISIN BIBLIOGRFICA

Literatura secundaria Libros Revistas de ndices y resmenes, etc.

Index Medicus (Medline) Chemical Abstracts International Pharmaceutical Abstracts Medicinal and Aromatic Plant Abstracts Biological Abstracts Current Contents

Literatura primaria Revistas cientficas de investigacin

Planta Medica (Alemania) Journal of Ethnopharmacology (Irlanda) Phytotherapy Research (Inglaterra) Fitoterapia (Italia) Phytomedicine (Alemania) Journal of Natural Products (USA) Phytochemistry (Inglaterra) Internacional Journal of Pharmacognosy (Holanda) Journal of Herbs, Spices and Medicinal Plants (USA)


5


6

MTODOS o TCNICAS

Extraccin

Fraccionamiento

Separacin y purificacin

Elucidacin estructural

ENSAYOS BIOLGICOS

Mtodos de extraccin de drogas vegetales

Aislamiento de sustancia

activas:

TCNICAS:

Extraccin

Fraccionamiento

Separacin y

purificacin

Elucidacin

estructural

ENSAYOS BIOLGICOS

7

Procesos de extraccin

Discontinuo

Continuo

Mtodos de extraccin

Decoccin

Maceracin

Reflujo

Percolacin

Soxhlet

Destilacin

Fluidos supercrticos

Extraccin de drogas vegetales por decoccin

Races, semillas, corteza8

Ventajas ?Desventajas?

Extraccin de drogas vegetales por maceracin

9


10

http://lavraieverte.blogspot.com/2010/06/maceration-day-2.html

Artemisia sp.

Extraccin de drogas vegetales por reflujo o digestin

11


Extraccin de drogas vegetales por percolacin

12

EXTRACTO

SOLVENTE

PERCOLADOR


Extraccin de drogas vegetales por Soxhlet

13

El aparato de Soxhlet consta de tres partes: En A se dispone de un matraz

del disolvente, en contacto con una manta calentadora.

En B se dispone de un cartucho de papel de filtro o de tela que contiene un peso dado de la droga vegetal.

C es el refrigerante y en l condensa el disolvente que, por efecto de la gravedad, cae en el cartucho embebiendo el material vegetal.

Cuando el cuerpo intermedio (B) est lleno de lquido extractivo, mediante un sistema de sifn, cae de nuevo en A, inicindose de nuevo el proceso.

A

B

C


Soxhlet

Cartuchos (B)

Extraccin de drogas vegetales por destilacin(arrastre con vapor)

14

Obtencin de sustancias voltiles como aceites esenciales (esencias)

Agua

Vapor de agua

FloresAceite

esencial

Extraccin de drogas vegetales por fluidos supercrticos (FSC)

15

Propiedad Gas FSC LquidoDensidad (kg/m3) 1 100-800 1000Viscosidad (cP) 0.01 0.05-0.1 0.5-1.0

Difusividad(mm2/s)

1-10 0.01-0.1 0.001

Aum

ento

de

la p

resi

n y

tem

pera

tura

FSC

LquidoGas

Extraccin de drogas vegetales por fluidos supercrticos

16

El solvente a utilizar se deposita en (1). Luego el fluido pasa por el intercambiador de calor (2), en el cual se enfra para que entre sin problemas a la bomba (3), en la cual se eleva la presin sobre la presin crtica. Posteriormente en el intercambiador (4) se logra el estado supercrtico al subir la temperatura sobre la crtica. As se hace pasar el fluido supercrtico a travs de la droga vegetal en el extractor (5), disolviendo y arrastrando los compuestos de inters, dada las propiedades del fluido. En (6) y (7) se baja la presin y temperatura respectivamente, por lo que el fluido ya no es supercrtico y los compuestos no son solubles, lo que permite que en (8) el gas se extraiga por la parte superior y el extracto por la parte inferior. El gas se condensa en (9), lo que permite que sea totalmente reutilizable.

Ventajas del dixido de carbono (CO2) como fluido supercrtico

17

No genera contaminacin en el proceso.

Presenta baja toxicidad y es poco reactivo.

No es inflamable. Existe en abundancia. Es barato en grados de pureza

elevada. No son necesarios procesos de

limpieza subsecuentes. Es prcticamente inerte desde el

punto de vista qumico. Se separa fcilmente del producto

que se quiere extraer Posee condiciones crticas

fcilmente accesibles Puede ser reciclado de una parte

del proceso y ser utilizado nuevamente

Ventajas y desventajas de la Extraccin con FSC

Costo

Personal calificado

Equipos automatizados P y T

moderada

Selectividad

Extracciones eficaces

Extractos de calidad

Disolvente CO2

EFS

No txico No inflamable Inerte Costo moderable

Baja viscosidad y alta difusividad del FS

Poder disolvente ajustable por cambios de P y/o T

Separacin del FSC por despresurizacin

Ideal para compuestos termolbiles

Aplicados a sistemas de diferentes escalas: analtica, preparativa, piloto e industrial

Acoplamiento a cromatgrafos

Mantenimiento Operacin

Formas de extraccin de drogas vegetales

19

Extraccin total Se utiliza etanolSe obtiene un extracto etanlico

Extraccin fraccionadaSe utilizan solventes de polaridad crecienteSe obtienen extractos de polaridad diferente

EXTRACCIN SLIDO-LQUIDO

Extraccin total

20

DROGA VEGETAL

EXTRACTO ETANLICO(Compuestos polares, medianamente

polares y apolares)RESIDUO VEGETAL

ETANOL

Extraccin fraccionada

21

DROGA VEGETAL

EXTRACTO HEXANLICO(Compuestos apolares)

Residuo vegetal

EXTRACTO CLOROFRMICO(Compuestos medianamente polares)

Residuo vegetal

EXTRACTO ETANLICO (Compuestos polares)

Residuo vegetal

ETANOL

CLOROFORMO

HEXANO

Fraccionamiento de extractosAislamiento de

sustancia activas:

Tcnicas:

Extraccin

Fraccionamiento

Separacin y

purificacin

Elucidacin

estructural

Ensayos biolgicos

22

Lquido-lquido

cido-base

Cromatografa columna abierta

Fraccionamiento lquido-lquido

23

EXTRACTO ETANLICO

FRACCIN HEXANLICA(Compuestos apolares)

FRACCIN METANOL-AGUA (9:1)

FRACCIN CLOROFRMICA(Compuestos medianamente polares)

FRACCIN METANOL-AGUA (1:1)(Compuestos polares)

Ajustar con agua hasta proporcin 1:1 Particin con cloroformo

Concentracin a sequedad Disolucin en metanol-agua (9:1)

Particin con hexano

EXTRACTO VEGETAL

FASE ACUOSA(Glicsidos, aminas cuaternarias)

FASE ORGNICA

FASE ACUOSA (Aminas primarias, secundarias y terciarias)

FASE ORGNICA

FASE ACUOSA(cido carboxlico)

FASE ORGNICA

continua

NaHCO3 (5-10%)

HCl (5-10%)

S.O. /Agua

Fraccionamiento cido-base

24

S.O. = solvente orgnico inmiscible con agua

Fraccionamiento cido-base

25

FASE ORGNICA

FASE ACUOSA (cidos carboxlicos, fenoles

FASE ORGNICA

FASE ACUOSA (Aldehdos y cetonas)

FASE ORGNICA (Compuestos

neutros)

NaHSO3 (5-10%)

NaOH (5-10%)

Fraccionamiento de extractos vegetales


activas:

Tcnicas:

Extraccin

Fraccionamiento

Separacin y

purificacin

Elucidacin

estructural

Ensayos biolgicos

26

Evaluacin de las fracciones obtenidas por CCF

Fracciones

Cromatografa de columna abierta

Separacin y purificacin de las sustancias activas


activas:

Tcnicas:

Extraccin

Fraccionamiento

Separacin y

purificacin

Elucidacin

estructural

Ensayos biolgicos

28

CRISTALIZACIN

CROMATOGRAFA

Columna abierta

Lquida de alta resolucin

(CLAR o HPLC) preparativa

Capa fina preparativa

Cristalizacin Proceso por el cual a partir de una

disolucin los iones, tomos o molculas establecen enlaces hasta formar una red cristalina.

Mtodos: Evaporacin del disolvente Enfriamiento de una disolucin

concentrada Cambio de disolvente

Se repite el proceso de cristalizacin en una disolucin que ya se haba hecho dicho proceso. Las aguas que quedan an contienen soluto disuelto que puede cristalizarse.

Para un proceso de cristalizacin ms rpido, aplicar un ncleo de cristalizacin.

29

HPLC preparativo

30

Columnas para HPLC

Cromatografa de capa fina preparativa

31

Elucidacin estructural de sustancias activas


activas:

Tcnicas:

Extraccin

Fraccionamiento

Separacin y

purificacin

Elucidacin

estructural

Ensayos biolgicos

32

Tcnicas espectroscpicas (existe irradiacin electromagntica de la sustancia y se produce absorcin y emisin de dicha radiacin por grupos cromforos presentes en la molcula): Espectroscopia de Absorcin UV/VIS e IR

Espectroscopia de Resonancia Magntica Nuclear de 1D y 2D

Dicrosmo Circular

Cristalografa por Rayos X

Espectrometra de Masas

Espectroscopia UV-VIS

Determina la existencia de grupos cromforos conjugados (instauraciones mltiples: dieno, enona, aromtico).

Se fundamenta en la absorcin de energa UV VIS (380-780 nm) para las transiciones electrnicas desde un estado fundamental a un estado excitado.

Las seales del espectro son muy anchas debido a los cambios vibracionales y rotacionales que acompaan a las transiciones electrnicas.

33

ESPECTROSCOPIA IRDetermina grupos funcionales presentes en la molcula (OH, NH, CO, etc.), as como el carcter aliftico o aromtico del compuesto.

Se fundamenta en la absorcin de energa de la regin infrarroja (4000 200 cm-1) para las transiciones electrnicas causando los cambios vibracionales y rotacionales de los enlaces presentes en la molcula.

1350 y 900 cm-1 = la huella dactilar de la molcula porque las bandas de esa regin corresponde a las vibraciones y rotaciones del esqueleto carbonado.

34

Resonancia magntica nuclear (RMN)

35

Determina grupos funcionales, subestructuras, conectividades, estereoqumica, etc., a partir de datos de desplazamiento qumico, reas de los picos y constantes de acoplamiento observadas en los espectros.

La muestra es colocada en un campo magntico y bombardeada por ondas de radio (3 Hz -300 GHz), los ncleos pasan a un estado de mayor energa, se produce el fenmeno de resonancia. Al cesar el estmulo, los ncleos emiten la energa absorbida en forma de fotones que luego son detectados por equipos especiales.

RMN 1D: RMN-1H

36

IBUPROFENO

RMN 1D: RMN-13C

37

IBUPROFENO

RMN 2D: HMQC

38

El experimento HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Correlation) es usado para correlacionar protones resonantes a los carbonos directamente unidos a esos protones. Los espectros de protones y carbonos en 1D son mostrados en los ejes horizontal y vertical.

En el experimento 2D del ibuprofeno se observa que en el espectro de carbono el pico del carbono a 45 ppm se compone de las resonancias CH y CH2 en posiciones 2 y 9 con desplazamientos qumicos idnticos, pero en el espectro de protn presentan desplazamientos qumicos diferentes.

RMN 2D: HMBC

39

El experimento HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation) es usado para obtener las correlaciones proton-carbon a larga distancia, a dos hasta tres enlaces. Los espectros de protones y carbonos en 1D son mostrados en los ejes horizontal y vertical, respectivamente. Los picos en el espectro 2D indican cuales protones estn conectados a cuales carbonos va acoplamiento a larga distancia. Por ejemplo, en el espectro del ibuprofeno se observa acoplamientos claros de los protones en posicin 2 y 13 al carbn cuaternario en posicin 1.

Dicroismo circular Determina la

estereoqumica de las molculas con centros quirales que tienen un cromforo.

La muestra se irradia con luz polarizada (UV-VIS) y se registra la rotacin ptica.

Cristalografa por Rayos X Determina la estructura total de la

molcula incluida la estereoqumica de la misma a partir de las posiciones relativas de los tomos.

Los rayos X (10-0,01 nm) son difractados por los electrones que rodean los tomos por ser su longitud onda del mismo orden de magnitud que el radio atmico. El rayos X difractado contiene informacin sobre la posicin y tipo de tomos encontrados en su camino. Detectores especiales observan y miden la intensidad y posicin de los rayos X difractados, y su anlisis posterior por medios matemticos permite obtener una representacin a escala atmica de los tomos y molculas del material estudiado.

Se requiere cristales perfectos de sustancias puras

TIROSINA

42

Espectrometra de masas (MS)Permite determinar la masa molecular.

Consistente en el bombardeo de lamuestra (previamente vaporizadamediante el uso de alto vaco y una fuentede calor) con una corriente de electrones aalta velocidad. Ello produce que lasustancia pierda a su vez algunoselectrones y se fragmente dandodiferentes iones, radicales y molculasneutras. Los iones (molculas ofragmentos cargados), son conducidosmediante un acelerador de iones a un tuboanalizador curvado sobre el que existe unfuerte campo magntico y conducidos a uncolector/analizador sobre el que serecogen los impactos de dichos iones enfuncin de la relacin carga/masa de losmismos. Posteriormente dichos impactosson transformados en un espectro demasas.

No es una tcnica espectroscpica puesno existe irradiacin electromagntica dela sustancia y no se produce absorcin dedicha radiacin.

Ensayos biolgicos (Bioensayos)Aislamiento de

sustancia activas:

Tcnicas:

Extraccin

Fraccionamiento

Separacin y

purificacin

Elucidacin

estructural

Ensayos biolgicos

43

Son experimentos in vitro o in vivo que se

usan para detectar la actividad biolgica de

extractos o sustancias puras obtenidas de

drogas vegetales.

Sirven para monitorear el fraccionamiento de

una droga vegetal hasta el aislamiento de las

sustancias puras bioactivas, esto se conoce

como estudio bioguiado (aislamiento

biodirigido).

Ensayos biolgicos (Bioensayos)Aislamiento de

sustancia activas:

Tcnicas:

Extraccin

Fraccionamiento

Separacin y

purificacin

Elucidacin

estructural

Ensayos biolgicos

44

Los ensayos biolgicos, empleados en un

fraccionamiento bioguiado, deben ser sencillos,

rpidos, baratos, de alta capacidad y fcilmente

disponibles (que se pueda realizar utilizando

instalaciones simples, en un laboratorio de

fitoqumica)

CLASIFICACIN:

BIOENSAYOS GENERALES

BIOENSAYOS ESPECIALIZADOS

Bioensayos generales Se evalan muchos

efectos diferentes

Ejemplos: Mtodo Hipocrtico Motilidad del leon

aislado de cobayo Mortalidad de la

Artemia salina

45

Bioensayos especializados Dirigido a encontrar algn efecto contra

una enfermedad especfica Son ms sofisticados Requieren la habilidad de un equipo

multidisciplinario (bioqumicos o farmaclogos)

Se emplean: Organismos inferiores

(microorganismos, insectos, moluscos, protozoarios, helmintos).

Sistemas sub-celulares aislados (enzimas, receptores, orgnulos).

Clulas intactas aisladas de origen animal o humano

rganos aislados de animales Animal completo

46

Referencias bibliogrficas

47

Abreu G., Cullar A., 2008. Estrategias en la seleccin de las plantas medicinales ainvestigar. Rev Cubana Plant Med; 13(3). [citado 02-08-2014]. Disponible en:.

Castro M., M. Valcrcel, Valcrcel Cases, M., 1993. Extraccin con fluidos supercrticos enel proceso analtico. Publisher Reverte.

Colegate S. and Molyneux R., 2007. Bioactive natural products: detection, isolation andstructural determination. Second Edition. CRC Press Taylor & Francis Group. Boca Raton.Florida.

Duddeck H., Dietrich W., Tth G., 2000 Elucidacin estructural mediante RMN: ejercicios yproblemas. Publisher Springer Science & Business Media.

Nrnberg E. und Surmann P., 1991. Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis,Methode. Volume 2. Editor Franz von Bruchhausen. Publisher Springer-Verlag. Berlin-Heidelberg-New York.

Skoog D. Crouch S. and Holler F., 2008. Principios de anlisis instrumental / Principles ofInstrumental Analysis. Edition 6. Publisher Cengage Learning Latin America.

Tringalli C., 2001. Bioactive compounds from natural sources: isolation, characterization andbiological properties. Taylor& Francis Group. New Fetter Lane. London.

Tema N 5. Aislamiento de Principios Activos de Drogas VegetalesNmero de diapositiva 2Nmero de diapositiva 3Aislamiento de principios activos de drogas vegetalesAislamiento de principios activos de drogas vegetalesAislamiento de principios activos de drogas vegetalesMtodos de extraccin de drogas vegetalesExtraccin de drogas vegetales por decoccinExtraccin de drogas vegetales por maceracinNmero de diapositiva 10Extraccin de drogas vegetales por reflujo o digestinExtraccin de drogas vegetales por percolacin Extraccin de drogas vegetales por SoxhletExtraccin de drogas vegetales por destilacin (arrastre con vapor)Extraccin de drogas vegetales por fluidos supercrticos (FSC)Extraccin de drogas vegetales por fluidos supercrticosVentajas del dixido de carbono (CO2) como fluido supercrticoVentajas y desventajas de la Extraccin con FSCFormas de extraccin de drogas vegetalesExtraccin totalExtraccin fraccionadaFraccionamiento de extractosFraccionamiento lquido-lquidoFraccionamiento cido-baseFraccionamiento cido-baseFraccionamiento de extractos vegetalesNmero de diapositiva 27Separacin y purificacin de las sustancias activasCristalizacinHPLC preparativoCromatografa de capa fina preparativaElucidacin estructural de sustancias activasEspectroscopia UV-VISNmero de diapositiva 34Resonancia magntica nuclear (RMN)RMN 1D: RMN-1H RMN 1D: RMN-13CRMN 2D: HMQCRMN 2D: HMBCDicroismo circularCristalografa por Rayos XEspectrometra de masas (MS)Ensayos biolgicos (Bioensayos)Ensayos biolgicos (Bioensayos)Bioensayos generalesBioensayos especializadosReferencias bibliogrficas

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5. Aislamiento de Principios Activos de Drogas Vegetales 2013-2014