Consejos para el mantenimiento de su equipo de HPLC

Resolucin de Problemas en HPLC:TroubleshootingTcnicas, Consejos , y Trucos

Agilent Technologies

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Pasos en la Resolucin de Problemas Una vez que has detectado que hay un problema! Cmo lo solucionas?1st Fall el sistema o la calibracin de la muestra? Hacer Blancos 2nd R i 2 d Revisar el cumplimiento del mtodo l li i d l d Se ha seguido el procedimiento adecuadamente? Son correctos los parmetros en el instrumento?

3rd Hgase ms preguntas! Cundo funcion correctamente el sistema por ltima vez? Se ha cambiado alguna cosa?

4th Revise TODOS los parmetros! Lo obvio no es siempre la causa Hubo ms de un cambio? Page 2

Componentes del Sistema HPLCBomba Inyector /Automuestreador yecto / uto uest eado Columna Detector Sistema de datos/Integrador

Los problemas p p pueden estar relacionados con todos los componentes del sistema

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Encuesta a usuarios en LC-GC sobre Problemas de Columnas Column ProblemAlta presin, fritas obstruidas Pobre reproducibilidad (formas de pico, retencin) Recuperacin de muestra Perdida de resolucin Inestabilidad Volumenes muertos Fugas, conexiones Rango de pH Bajo numero de platos Saturacin de la columna Cost Miscellaneous

Percentage of Respondents24%16% 14% 13% 11% 8.1% 4.8% 2.0% % 2.0% 2.0% 2 0% 1.7% 15%Page 4

Tipos de problemas del Sistema y la Columna

A. Presin B. Forma del Pico C. Retencin

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Problemas de PresinSintomas de la columna Alta columna - Obstruccin en el empaquetamiento Baja presin - Fuga - Flujo incorrecto Posibles causas - Frita obstruida - Contaminacin de la

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Correccin de la sobrepresinDeterminacin de la causa y correccin de una presin altaMuchos problemas de presin estn relacionados con obstrucciones en el sistema sistema. Comprobar la presin del sistema con y sin columna. Si la presin con columna es alta: Hacer un Back flush a la columna (con cuidado para el rendimiento futuro) Limpiar la frita bloquead (flujo reverso con un solvente fuerte)

Lavar la columna Eliminar la contaminacin en la column y limpiar el empaquetado bloqueado Retirar compuestos adsorbidos de alto peso molecular Limpiar precipitados introducidos de la muestra o del tampn

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Obstruccin del empaquetadoTamao de partcula 5.0 3.5 3.0 30 2.7 1.8 1.7 Area (um2) 2.7 1.3 1.0 10 0.7 0.4 04 0.3 Diam intersticial Porosidad de medio (um) la frita(um) 0.9 0.6 0.6 06 0.5 0.4 0.3 2.0 2.0 2.0 20 2.0 0.5 05 0.5

Cuidado C id d con las fases mviles tamponadas l f il t d Los tampones contienen material insoluble filtrar La solubilidad del tampn decrece con el aumento del % de orgnico* - evitar 100%B con tampones salinos *Schellinger,A.P. and Carr,P.W., LC-GC North America, 22, 6, 544-548 (2004)Page 8

Solubilidad del tampn

La Tabla I p ese ta u a est ac de la co ce t at o a ab a presenta una estimacin a concentration soluble del tampn menos soluble (fosfato potsico a pH 7.0) en tres solventes orgnicosPage 9

Solubilidad de 5 tampones en mezclas con (a) metanol (b) acetonitrilo y (c) tetrahidrofurano metanol, acetonitrilo,

metanolacetonitrilo

THF

El trazo representa acetato amnico a pH 5.0, representa fosfato amnico a pH 3 0 --- representa fosfato potsico a pH 3 0 representa fosfato 3.0, 3.0, amnico a pH 7.0, y representa fosfato potsico a pH 7.0.

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Cambiar la frita puede no ser buena ideaPuede que no sea posible con columnas de nueva generacin Puede daar columnas de alto rendimientoColumn Inlet Frit Compression FerruleWear gloves Do not allow bed to dry y Do not touch the column body heat will extrude packing

Column Body

Do not overtighten

Female End Fitting Male End Fitting g

Consejo: Prevenir es mucho mejor!Page 11

El Truco: Tecnicas de Prevencin- La mejor eleccin! Usar proteccin de la columna - Filtros en linea - Salva columnas Filtrar las muestras Filtrar fases mviles tamponadas Extraccin de la muestra(i.e. SPE) Lavado apropiado de la columna

Fcil

No tan fcil

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Limpieza de la columna Limpiar con solventes ms fuertes que la fase mvilOpciones de Solventes de Fase Reversaen orden de fuerza creciente

Use al menos 25mL de cada solvente para columnas analticas Fase Mvil sin sales de tampn p 100% Metanol 100% Acetonitrilo 75% Acetonitrilo:25% Isopropanol 100% Isopropanol 100% Cloruro de Metileno* 100% Hexano* Hexano

Esto lleva tiempo, amenudo se realiza Offline

Debe revertirse para Re-Equilibrar

*Consejo: Cuando use Hexano o Cloruro de Metileno debe lavar la columna con Isopropanol antes de volver a la fase mvil de fase reversa reversa.Page 13

Limpieza de l columna f Li i d la l fase normal lUse al menos 50mL o 20 30 volumenes de columna para las columnas analticas 2030 Opciones tpicas de solventes en Fase Normal en orden de fuerza creciente:

SolventMethanol:Chloroform Ethyl Acetate

Composition50:50% 100%

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Cules son los problemas ms comunes de la forma de pico?

1.

Picos dividos

2. Colas en los picos (simetra