POLIMORFISMO GENTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE DIFERENTES HOSPEDEROS DE REAS ENDMICAS DEL PER

POLIMORFISMO GENTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE DIFERENTES HOSPEDEROS DE REAS ENDMICAS DEL PER

TITULO DE LA INVESTIGACINPOLIMORFISMO GENTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE DIFERENTES HOSPEDEROS DE REAS ENDMICAS DEL PER

NOMBRES Y APELLIDOS COMPLETOS DE LOS INVESTIGADORES (Mencionar afiliacin institucional, telfono, direccin y correo electrnico de cada uno).Autores

M.Sc.: Elizabeth Snchez Roman

Laboratorio de Biotecnologa y Biologa Molecular del Centro Nacional en Salud Pblica- INS. Telf. 4719920 anexo 129. Capac Yupanqui 1400 Jess Mara

esanchez@ins.gob.peBlgo.: Omar Cceres Rey

Laboratorio de Biotecnologa y Biologa Molecular del Centro Nacional en Salud Pblica- INS. Telf. 4719920 anexo 129. Capac Yupanqui 1400 Jess Mara

ocaceres@ins.gob.peCoautores

Dr. : Csar Nquira Velarde

Laboratorio de Zoonosis Parasitaria del Centro Nacional en Salud Pblica- INS. Telf. 4719920 anexo 137. Capac Yupanqui 1400 Jess Mara

cnaquira@ins.gob.peApoyo Tcnico

Tec. Lab. David Garca Neyra

Divisin de Biotecnologa y Biologa Molecular del Centro Nacional en Salud Pblica- INS

Telf. 4719920 anexo 129. Cpac Yupanqui 1400 Jess Mara

leongarcia2000@yahoo.com.mxDIVISIN EN LA CUAL SE VA A TRABAJARDivisin de Biologa Molecular y Divisin de Parasitologa del Centro Nacional en Salud Pblica del Instituto Nacional de Salud

RESUMEN ESTRUCTURADO Introduccin: Echinococcus granulosus es un pequeo platelminto parsito, que causa la hidatidosis qustica en el hombre y en animales domsticos. Esta zoonosis constituye un importante problema de Salud Pblica principalmente en la regin sierra del Per, donde existen reas hiperendmicas. Existen evidencias que en muchas reas endmicas del mundo circulan un complejo de variantes intraespecficas o cepas de Echinococcus granulosus los cuales pueden tener implicancia en la patogenicidad, infectividad a humanos y patrones de desarrollo diferentes que en conjunto afectan la epidemiologa del parsito. Objetivos: Conocer los genotipos, que circulan en el pas, de la poblacin de Echinococcus granulosus de hospederos domsticos (ovino, vacuno, caprino y porcino) provenientes de diferentes reas endmicas del Per. Metodologa: Protoescolices de Echinococcus granulosus sern colectados de los hospederos domsticos, a los cuales se les aislar el ADN. Se realizara PCR para amplificar los genes de la Citocromo Oxidasa I (COI) y NAD deshidrogenasa I (NDI), los productos de amplificacin de ambos genes sern sometidos a la tcnicas de SSCP para determinar si existe o no variaciones en estos genes los cuales son indicadores de la existencia de polimorfismo gentico. Se comprobara el polimorfismo secuenciando los productos de PCR y realizando la tcnica de RAPD para determinar con exactitud las variantes genticas de este cstode.Cabe mencionar que para este proyecto se tiene colectado el material biolgico de algunas reas endmicas del Per (Cuzco, Puno, Arequipa, Junn y Huancavelica) faltando colectar material de los departamentos de Ayacucho, Cajamarca, Ica y Ucayali.

El monto solicitado ser de 40,000 nuevos soles

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMALa enfermedad hidatdica unilocular causada por el estado qustico de Echinococcus granulosus (Batsch 1786), es una de las ms importantes zoonosis parasitarias, que constituye un problema de Salud Pblica en varias zonas del mundo.

E. granulosus es el cstode ms pequeo que se conoce, tiene un ciclo de vida complejo que envuelve dos hospederos (Thompson, R.C.A. et al. 1995, Thompson, R.C.A. 1986): La forma adulta del parsito infecta un hospedero definitivo que siempre es un carnvoro como el perro domstico y otros cnidos; Mientras que la forma qustica o larvaria (metacstode) se desenvuelve en hospederos intermediarios que son principalmente ungulados (ganado ovino, vacuno, caprino y porcino entre otros).

A nivel mundial se ha reportado que existen varias cepas de Echinococcus granulosus en distintas reas endmicas y en diferentes hospedadores intermediarios (McManus, D.P. & Smyth, J.D. 1986) estas cepas fueron caracterizadas utilizando en criterios morfolgicos, biolgicos, bioqumicos y caractersticas epidemiolgicas (Eckert, J. & Thompson, R.C.A 1997, Lymbery, J. et. al 1990, Thompson, R.C.A & Lymbery, A. J. 1988, McManus, D.P & MacPherson, C.N.L 1984), que sugieren que algunas variantes son ms infectivas que otras para el hombre. Estudios basados principalmente en estos criterios indican diferencias de Echinococcus entre ganado vacuno/perro; cerdo/perro; reno/perro en Europa (Eckert, J. & Thompson, R.C.A.1988).

Por otro lado estudios bioqumicos realizados en cepas de Echinococcus granulosus aislados de hospederos intermediaros como oveja, ganado vacuno, cabra y humanos difieren ligeramente en sus perfiles isoenzimticos, composicin bioqumica bsica y metabolismo, mientras que las cepas aisladas de camello y cabra muestran diferencias considerables (McManus, D.P 1981, MacPherson, & McManus, D.P. 1982).

Las tcnicas moleculares tambin permitieron comprobar la existencia de las cepas o variantes genticas de Echinococcus granulosus, inicialmente se utiliz hibridacin con sondas de ADN marcadas con istopos radioactivos (McManus, D.P and Rishi, A.K. 1989) hasta tcnicas ms modernas tales como el PCR y su anlisis utilizando enzimas de restriccin PCR-RFLP (Zhang, L. et. al. 1998, Bowles, J. et. al. 1994, Bowles, J. and McManus, D.P 1993a), Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) (Scout, J.C. and McManus, D.P. 1994), Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) (Zhang, L. et. al 1999, Passer, R.B. et. al 1998) y secuenciamiento de ADN (Bowles, J. & McManus, D.P. 1993b, Bowles, J. et.al. 1992). Estas tcnicas han sido ampliamente utilizados para caracterizar variantes dentro de la especie de Echinococcus granulosus a los cuales se les conoce como G, actualmente existen ocho genotipos descritos G1-G8 (Kamenetzky, L. et.al 2002)

En las reas endmicas del Per existen un amplio rango de hospedadores intermediarios de Echinococcus granulosus (ovejas, ganado vacuno, cabras, porcinos y auqunidos) incluyendo el hombre, en los cuales probablemente existan variantes genticas. Por lo que nuestro estudio estar dirigido a la determinacin de estas variantes utilizando protoesclices obtenidos de los diferentes hospedadores intermediarios procedentes de las distintas reas endmicas del Per, utilizando para ello tcnicas moleculares.JUSTIFICACIN Y USO DE LOS RESULTADOS (Mencionar la importancia del estudio y los beneficios que se obtendrn de sus resultados para la poblacin) (Mximo 1 pgina):

La identificacin de las diferentes cepas de Echinococcus granulosus es un punto de estudio muy importante ya que existe evidencias que en muchos reas endmicas del mundo, existen un complejo de variantes intraespecficos o cepas de Echinococcus granulosus los cuales pueden tener diferencias en lo que respecta a infectividad, antigenecidad susceptibilidad a quimioterapia, patognesis y caractersticas epidemiolgicas del parsito en relacin con su hospedero intermediario y al hombre (Thompson, R.C.A et. al. 1995)

Como resultado del trabajo contaremos con la informacin del polimorfismo gentico de las poblaciones de Echinococcus granulosus que circulan en las reas endmicas del Per, datos que son importantes tomar en cuenta para estudios epidemiolgicos dirigidos a un posterior establecimiento de programas efectivos para el control de la hidatidosisFUNDAMENTO TERICO (describir las teoras que sustentan la investigacin o antecedentes de otros estudios similares ya publicados) (Mximo media pgina):

Ocho genotipos de Echinococcus granulosus han sido descritas: la de ciervo, de oveja, de oveja de Tasmania, de caballo, de bovino, de puerco, bfalo y de camello (Thompsom, R.C.A. and McManus, D.P. 2002). El genotipo est relacionado al hospedero intermediario en la cual una mayor proporcin de quistes con determinada variantes gentica fue identificada, esto no significa que una cepa infecte solamente el hospedero intermediario que le dio su nombre. Por ejemplo el genotipo de oveja infecta adems de oveja, buey, cabra, puerco, caballo y es la principal causa de infeccin en humanos ( Schantz, et. al., 1995).

Los ocho genotipos descritos para Echinococcus granulosus presentan diferencias en su distribucin geogrfica, en el grado de infectividad para diferentes hospederos intermediarios (Schantz, et.al., 1995) en sus sistemas metablicos (McManus, D.P. and Bryant, C. 1995) y en las secuencias de genes mitocondriales COI (citocromo C oxidasa I) y NDI (NAD deshidrogenasa I) (Bowles, et. al. 1995, 1992).

Las diferencias entre los genotipos de Echinococcus granulosus representan una de los puntos principales a ser considerados en cualquier estudio epidemiolgico dirigido al establecimiento del programa de control de la hidatidosis. Estas diferencias no solo reflejan distintas caractersticas biolgicas, con importantes implicaciones en el estudio serolgico a nivel poblacional y en el desarrollo futuro de estrategias para quimioterapia y vacunacin, sino tambin refleja el potencial infectivo de estos diferentes genotipos para el hombre.

Existen pocos trabajos sobre la distribucin de Echinococcus granulosus en los diferentes pases de Amrica Latina, con excepcin de Argentina (Kamenetzky, L. et.al 2002, Rosenzvit, M. et.al. 1999), ningn otro pas ha reportado como estn distribuidos los diferentes genotipos de este parsito en sus respectivos pases.

En el Per existen varios estudios con respecto a este cstode pero todos ellos son solo estudios de seroprevalencia y diagnostico de campo, por lo que este proyecto seria el primero en iniciar estudios de Epidemiologa Molecular de Echinococcus granulosus en el pas.

OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIN (Incluir sujetos, tiempo y lugar):

Objetivo General:

Determinar la variabilidad gentica o polimorfismo gentico de Echinococcus granulosus circulantes en las diferentes reas endmicas del Per.Objetivos Especficos:

Estandarizacin de los procedimientos para la extraccin de ADN a partir de protoesclices de Echinococcus granulosus.

Determinacin del Polimorfismo gentico del parsito utilizando PCR-SSCP de los genes COI y NDI

Confirmacin del polimorfismo por secuenciamiento de los genes COI y NDI y aplicacin de la tcnica de RAPD.

Anlisis y distribucin de los genotipos de Echinococcus granulosus en las diferentes reas endmicas del pas

HIPTESIS :

Echinococcus granulosus presenta variantes genticas o polimorfismo gentico distribuidos en las diferentes reas endmicas del Per.METODOLOGA

Tipo de estudio

Es un estudio Descriptivo y Analtico cuya duracin es de un ao

rea de estudio (Describir las caractersticas del rea relevantes para el estudio)

La zona Sierra del Per es considerada rea endmica a Hidatidosis sobre todo aquellas donde existe crianza de ganado ovino, bovinos entre otros. Por esta razn se visitaran los camales en donde se beneficia al ganado para colectar el lquido hidatdico de los departamentos de Ica, Ayacucho, Cajamarca y Ucayali.

Sujetos (Mencionar el tamao de la poblacin y el nmero de sujetos en la poblacin con la condicin a estudiar en el centro de salud u hospital donde se realizar el estudio)

Se obtendr liquido hidatdico de por lo menos 10 animales de cada especie (ovino, vacuno, etc.) sacrificados e infectados con el parsito en cada camal de un rea endmica del Per.

Los datos de las muestras obtenidas sern registradas en una ficha epidemiolgica elaborada para tal fin ( anexo I ).

Se procurara obtener, en todo momento, las capas germinativas de cada quiste elegido.

Criterios de Inclusin y Exclusin

Criterios de Inclusin: Se obtendrn muestras de lquido hidatdico transparente de pulmn y/o hgado de ganado ovino, bovino, caprino y camlidos.

Criterios de Exclusin: No se tomaran en cuenta lquido hidatdico contaminado (color amarillo) ni quistes calcificados.Diseo Muestral (Determinar el tamao mnimo muestral y el tipo de muestreo empleado)

Se trabajara con 10 animales de cada especie que presente quistes hidatdicos y que lleguen al camal para ser sacrificados, por lo tanto el muestreo es al azar pues depender de la existencia de animales infectados del total de animales sacrificados en el camal.

DESCRIPCIN DE LA INTERVENCIN PROPUESTA

Material biolgico

Para la obtencin del material biolgico se acudirn a los camales o mataderos de ganados de las reas endmicas de hidatidosis (Ayacucho, Cajamarca, Ica y Ucayali). El lquido hidatdico de Echinococcus granulosus sern colectados por aspiracin de los quistes de pulmn y/o hgado de ovejas, ganado vacuno, cabras y cerdos infectados.

las muestras colectadas en esta oportunidad as como las muestras previamente colectadas (Cuzco, Arequipa, Puno, Junn y Huancavelica) sern centrifugados a 5000 r.p.m por 10 minutos con la finalidad de colectar los protoesclices, los cuales sern lavados con solucin salina isotnica para luego ser fijados en alcohol al 95% y mantenidos a -20C hasta su procesamiento.

Aislamiento y purificacin de ADN.

En el laboratorio, los protoesclices sern descongelados y lavados por una vez con PBS 1X por centrifugacin a 5000 r.p.m por 5 minutos, el pellet obtenido ser resuspendido en buffer de lisis (100 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl) al cual se le aadir SDS al 1% y Proteinasa K 1 mg/ml (concentracin final) e incubado a 55C por al menos 2 horas o hasta cuando la solucin este transparente, esto es con la finalidad de lisar a los parsitos (Maizels, R.M et. al. 1990)

El ADN ser extrado con fenol/cloroformo/alcohol isoamlico (25:24:1) por 2 veces y una vez con cloroformo/alcohol isoamlico, luego el ADN ser precipitado con acetato de Sodio 3M y alcohol absoluto en fro. Finalmente el ADN ser lavado con alcohol al 70%, secado, resuspendido en buffer TE estril y guardado a 4C. Alternativamente se utilizara el mtodo de extraccin de ADN utilizando sales de guanidina.

Se utilizar tambin el kit Genomic Prep (QIAGEN) para extraer el ADN genmico de los parsitos los cuales sern utilizados para realizar la tcnica de RAPD.

PCR de protoesclises E. granulosus.

Regiones del ADN mitocondrial sern amplificados utilizando primers reportados para tal fin; en ese sentido, regiones del gen de la NADH deshidrogenasa I (NDI) y del Citocromo C oxidasa subunidad I (COI) sern amplificados por PCR segn el procedimiento seguido por Zhang, L. y cols. (1999). Los productos de amplificacin sern visualizados en un gel de agarosa al 1.5% al teirlos con bromuro de etidio.

SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism)

Para realizar sta tcnica, 10 ul. del producto de PCR ser mezclado con 10 ul. de buffer SSCP (10 mM NaOH, 95% formamida, 0.05% azul de bromofenol y 0.05% xylene cyanole), denaturado a 95C por 5 minutos e inmediatamente colocado a -20C por 10 minutos.

Un volumen de 3.5 ul. de cada muestra sern colocados en los pocillos de un gel de poliacrilamida no denaturante tipo secuenciamiento (0.6X MDE: Mutation Detection Enhancement) y sometido a una electroforesis convencional a 7 W por 20 horas y a 20C.

Las diferencias de corrida sern visualizadas al teir el gel con nitrato de plata segn el procedimiento descrito por Bassam, B. J. y cols. (1991).

Secuenciamiento de los fragmentos genticos NDI y COI

Para confirmar las diferentes variantes de Echinococcus granulosus detectados por SSCP, los productos amplificados por PCR de los genes NDI (525 pb) y COI (460 pb) sern secuenciados y analizados utilizando un secuenciador automtico de ADN (ALF Express, Amersham Biosciences) para observar las mutaciones presentes en cada variante.

RAPD-PCR de protoesclices de Echinococcus granulosus.

Para evidenciar y confirmar las variantes de Echinococcus granulosus, se utilizar la tcnica de RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA-Polymerase Chain Reaction), en este caso DNA genmico e intacto extrado de E. granulosus ser sometido a un PCR utilizando 4 primers aleatorios reportados (Scott J.C. and McManus D.P 1994).

Los patrones obtenidos sern visualizados en un gel de agarosa al 1.5% teido con bromuro de etidio. Los diversos productos de amplificacin sern analizados utilizando software informticos especializados (Gel Compar II) para determinar las variantes de Echinococcus granulosus.

Finalmente los resultados de las tcnicas de SSCP y de RAPD-PCR sern confrontados y analizados simultneamente para determinar cuales son las variantes genticas de Echinococcus granulosus presentes en las diferentes reas endmicas del pas.

DEFINICIONES OPERACIONALES DE LAS VARIABLES

Polimorfismo Gentico: Variacin a nivel de un gen o regin de ADN que presentan los individuos de una misma especie, esta variacin ocurre en la secuencia de los nucletidos de la regin de ADN elegida para el anlisis y que es producto de mutaciones que suceden a lo largo del tiempo.

SSCP: Tcnica molecular muy utilizada para evidenciar mutaciones en una regin pequea de ADN, se basa en la movilidad electrofortica diferente de las molculas de ADN de simple hebra, la diferencia en la movilidad es resultado de las diferentes estructuras secundarias adoptadas por las simples hebras de ADN.

RAPD: Tcnica molecular muy til para determinar polimorfismo gentico en los organismos, esta basada en la tcnica de PCR cuya diferencia es que utiliza primers o iniciadores pequeos (10 bases) cuya secuencia es al azar. Se emplean 2 o 3 pares de primers los cuales originan un patrn de bandas de amplificacin el cual es especfico para cada especie o variante gentica.INDICADORES PARA EL MONITOREO (Describir los indicadores que servirn para supervisar y monitorear al estudio, este tem necesariamente debe ser llenado)

Numero de muestras de protoescolices obtenidos

Numero de muestras ADN extrados

Numero de PCR realizados

Numero de anlisis de polimorfismo (SSCP. RAPD) realizados

CONTROL DE CALIDAD (Describir los procedimientos que asegurarn la calidad de la recoleccin de datos, de las actividades (p. ej.: lectura de lminas) u otros pertinentes)

Todas las muestras de protoesclices sern corroboradas de que son Echinococcus granulosus al realizarse las mediciones morfomtricas de los ganchos del rostelo; los anlisis moleculares sern realizados utilizando controles positivos de los diferentes genotipos reportados para Echinococcus granulosus de otros pases.

ANLISIS DE LOS DATOS (Mencionar las variables dependientes e independientes, las pruebas estadsticas a utilizar, y el software)

Se utilizar el programa LabWorks 4.0 (UVP) para capturar las imgenes de los geles producto del SSCP y del RAPD, luego se usar el programa Gel Compar II (Applied Maths) para determinar exactamente la variabilidad de las cepas y el programa MEGA 2 para analizar las relaciones filogenticas entre los genotipos de Echinococcus granulosus.ASPECTOS TICOS (Mencionar si habr consentimiento informado en estudios que impliquen humanos y explique. Mencionar si solicitar aprobacin de algn Comit de tica)

El presente estudio no implica trabajo con muestras humanas

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Bassam, B. J; Caetano-Anolls, G y Gresshoff, P. M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. 1991. Anal. Biochem. 196: 80-83.

Bowles, J.; Blair, D. & Mc Manus, D.P. A molecular phylogeny of the genus Echinococcus. 1995. Parasitology. 110: 317-328.

Bowles, J.; Blair, D. & Mc Manus, D.P. Molecular genetic characterization of the cervid strain (Northern form) of Echinococcus granulosus. 1994. Parasitology 109: 215-221

Bowles, J.; Blair, D. & Mc Manus, D.P Genetic variants within the genus Echinococcus identified by mitochondrial DNA sequencing. 1992. Molecular and Biochemical Parasitology 54: 165-174

Bowles, J and Mc Manus, D.P. Rapid discrimination of Echinococcus species and strains using a polymerase chain reaction-based RFLP method. 1993a. Molecular and Biochemical Parasitology 57: 231-240

Bowles, J and Mc Manus, D.P. NADH dehydrogenase 1 gene sequences compared for species and strains of the genus Echinococcus. 1993b. Int. J. Parasitol. 23(7): 969-972

Eckert, J. & Thompson R.C.A. Echinococcus strains in Europa. 1988. Tropical Medicine and Parasitology. 39: 1-8.

Eckert, J. & Thompson R.C.A Intraspecific variation of Echinococcus granulosus and related species with emphasis on their infectivity to humans. 1997 Acta Tropica. 64: 19-34.

Gasser R. B; Zhu X. and McManus D. P. Display of sequence variation in PCR-amplified mitochondrial DNA regions of Echinococcus by single-strand conformation polymorphism. 1998. Acta Tropica 71: 107-115

Kamenetzky, L; Gutierrez, A. M; Canova S. G; Haag K. L; Guarnera, E. A; Parra, A; Garcia, G. E and Rosenzvit, M. C. Several strains of Echinococcus granulosus infect livestock and humans in Argentina. 2002. Infection, Genetics and Evolution 2: 129-136 Lymbery A. J, Thompson R. C. A and Hobbs R.P Genetic diversity and genetic differentiation in Echinococcus granulosus (Batsch, 1786) from domestic and sylvatic host on the mainland of Australia. Parasitology 1990, 101: 283-289

Macpherson, C.N.L. & Mc Manus, D.P. A comparative estudy of Echinococcus granulosus from human and animal host in Kenya using isoelectric focusing and isoenzyme analisis. 1982. Internacional Journal for Parasitology. 12: 515-521.

Mc Manus, D.P. A biochemical study of adult and cytic stages of Echinococcus granulosus of human and animal origen from Kenya. 1981. Journal of Helmintology. 55: 21-27.

Mc Manus, D.P. & Bryant, C. Biochemestry physiology and molecular biology of Echinococcus. In: Echinococcus and Hydatid disease. 1995. CAB International. Willingford.

Mc Manus, D.P. & Smyth, J.D. Hydatidosis: Changing concepts in epidemiology and speciation. 1986. Parasitology Today 2: 163-168.

Mc Manus, D.P. and McPherson C. N. L. Strain characterization in the hydatid organism, Echinococcus granulosus: Current status and new perspectives. 1984 Annals Trop. Med. Parasit. 78(3): 193-198

Mc Manus, D.P. and Rishi A. K. Genetic heterogeneity within Echinococcus granulosus: Isolates from different hosts and geographical areas characterized with DNA probes. 1989 Parasitology 99: 17-29

Maizels, R. M; Blaxter, M. L; Robertson, B. D y Selkirk, M. E. Parasite antigens, Parasite genes: A laboratory manual for molecular parasitology. 1990. Cambridge University Press.

Rosenzvit, M. C; Zhang, L. H; Kamenetzky, L; Canova S. G; Guarnera, E. A and McManus D. P. Genetic variation and epidemiology of Echinococcus granulosus in Argentina. 1999. Parasitology 118: 523-530.

Schantz, P. M. ; Chai, J.; Craing, P.S.; Eckert, J..; Jenkings, D.I.; Macpherson, C.N.L. & Thakur, A. Epidemiology and Control of Hydatid disease Echinococcus and Hydadtid disease. 1995. CAB International, Willingford.

Scott, J. C and McManus, D. P. The Random amplification of polymorphic DNA can discriminate species and strains of Echinococcus. 1994. Trop. Med. Parasitol. 45(1):1-4.

Thompson R.C.A. Biology and systematic of Echinococcus: in The Biology of Echinococcus granulosus and Hydatid Disease. 1986. (Ed Thompson R.C.A.) p 5-43. London :Allen Unwin.

Thompson R.C.A. & Lymbery, A.J. The nature extent and significance of variation within the gens Echinococcus. 1988. Advances in Parasitology. 27:210-263.

Thompson, R.C.A.; Lymbery, A.J. and Constantine, C.C. Variation in Echinococcus. 1995. Advances in Parasitology. 35: 145-175.

Thompson R.C.A. and McManus D. P Towards a taxonomic revision of the genus Echinococcus. 2002. Trends in Parasitology 18(10): 452-457 Zhang, L; Gasser, R. B; Zhu, X. y McManus, D. P Screening for different genotypes of Echinococcus granulosus within China and Argentina by single-strand conformation polymorphism (SSCP) analysis. 1999. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 93: 329-334.

Zhang, L; Eslami A; Hosseini S. H and McManus, D. P Indication of the presence of two distinct strains of Echinococcus granulosus in Iran by mitochondrial DNA markers. 1998 Am. J. Trop. Med. Hyg. 59(1): 171-174

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

ACTIVIDAD/MES123456789101112

Obtencin de material biolgico:

Icax

Ayacuchox

Cajamarcax

Ucayalix

Extraccin de DNA de protoesclices de E. granulosusxxxx

Estandarizacin de tcnicas molecularesxxx

Procesamiento de muestras utilizando tcnicas moleculares.xxxxx

Anlisis de datosxx

Elaboracin de informex

PRESUPUESTO

PRESUPUESTO DETALLADO

RUBROCOSTO UNITARIONMERO DE UNIDADESTOTAL

Recursos humanos03 Bilogos

01 Mdico

01 Tec. Lab.

MATERIALES E INSUMOS

Insumos:

Marcador de DNA 100 pb800.0002 viales1600.00

MDE (Mutation Detection Enhancement) gel de poliacrilamida x 250 mL1500.0001 Frasco1500.00

Enzima DNA polimerasa de alta fidelidad, termoactivable 5U/ul x 500 U1800.0002 viales3600.00

Kit de secuenciamiento TermoSequenase Cy5 Dye terminador kit x 100 Rxns6800.001 kit6800.00

Enzima DNA polimerasa termoactivable 5U/ul x 1000U3600.001 kit3600.00

Tiosulfato de Sodio pentahidratado x 1kg110.0001 frasco110.00

Nitrato de plata x 100 g500.0001 frasco500.00

Kit purificacin Qiaquick para productos de PCR x 250 rxns3500.0001 Kit3500.00

Materiales de laboratorio:

Software LabWorks 4.08000.0001 unidad8000.00

Tubos para PCR de 0.2ml (caja x 1000)700.0001 caja700.00

Tubos de microcentrifuga x 1,5 ml (caja x 500 unidades)

400.0003 cajas1200.00

Fotografias instantneas Polaroid 665 caja x 10 fotos150.0004 cajas600.00

Tips con filtro de 200 ul (caja x 1000)500.0001 caja500.00

Tips con filtro de 20 ul (caja x 1000)600.0001 caja600.00

Tips con filtro 0,5-10 ul (caja x 1000)500.0001 caja500.00

Sub Total33310.00

PRESUPUESTO MENSUALIZADO

RUBRO/MES123456789101112TOTAL

RECURSOS HUMANOSxxxxxxxxxxxx

MATERIALES E INSUMOSxxx33310.00

Pasajes terrestres ida y vuelta a Icax20 soles x 2 personas = 80.00

Pasajes areos ida y vuelta a Ayacucho, Cajamarca y Ucayali xxx480soles x 2 personas x 3 dptos = 2880.00

Viticos por 6 dasxxxx110soles x 2 personas x 6 dias x 4 dptos = 5280.00

TOTAL

41550.00

ANEXO I

FICHA EPIDEMIOLOGICA DE MUESTRAS DE PROTOESCOLICES PARA ESTUDIO DE POLIMORFISMO GENETICO

Tipo de muestra:

Cdigo de la muestra:

Fecha de obtencin de la muestra:...

Tipo de hospedero intermediario:Ovino ( ), Vacuno ( ), Caprino ( ), Otros ( )..

Lugar de procedencia del hospedero intermediario:

Departamento:

Localidad:...

Matadero:

rgano de procedencia de la muestra:Hgado ( ) Pulmn ( )

Medio de transporte de la muestra:

Alcohol al 96 % ( )

Solucin de formol al 10% ( )

MINISTERIO DE SALUD

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

CENTRO DE INFORMACIN Y DOCUMENTACIN CIENTFICA

SERIE INFORMES TCNICOS N62

POLIMORFISMO GENTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE DIFERENTES HOSPEDEROS DE REAS ENDMICAS DEL PER

M.SC.: ELIZABETH SNCHEZ ROMAN BLGO. OMAR CCERES REY Y

DR. CSAR NQUIRA VELARDE

[2002]