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7. Captación de la imagenen microscopía confocal

La mayor aplicación de la microscopía confocal es la

captación mejorada de imágenes de muestras

gruesas en una gran variedad de tipos de muestras.

La ventaja del sistema confocal resulta de la

capacidad de obtener imágenes de secciones

ópticas individuales a elevada resolución en

secuencia a través de la muestra.

Hay varios modos de captación de imagen y todos

se basan en la sección óptica como unidad básica

7. Captación de la imagen en microscopía confocal


La sección óptica es la unidad de imagen básica en

los métodos de microscopía confocal.

Los datos se recogen de muestras fijadas y teñidas

en uno o varios modos de iluminación (con

diferentes longitudes de onda).


Secciones ópticas sencillas

Las muestras con múltiple marcaje se recogen en

múltiples imágenes cada una de un marcador.







● La mayoría de los microscopios láser confocal

tardan aproximadamente 1 segundo en adquirir una

sección óptica sencilla aunque, a veces, se recogen

varias y se promedian mediante software para

mejorar la relación señal/ruido.



● Se pueden recoger secciones ópticas sencillas a

diferentes intervalos de tiempo seleccionados.

● La obtención de buenas imágenes de células vivas

requiere extremo cuidado durante todo el proceso de

toma de imágenes en mantener condiciones

tolerables en la platina del microscopio.

● Se deben cuidar los requisitos específicos de cada

tipo de célula tales como temperatura ambiente,

atmósfera, etc.


Lapsos de tiempo y células vivas

● Hay antioxidantes como el ácido ascórbico que se

añaden al medio de cultivo para reducir el oxígeno

que se puede liberar en la excitación de moléculas

fluorescentes y que causaría la aparición de

radicales libres que matan a las células.

● El daño por la luz del láser es acumulativo después

de múltiples barridos por eso la exposición al haz

debe mantenerse en el mínimo necesario para

adquirir la imagen.



● Se debe utilizar la menor potencia de láser que

permita obtener una imagen y recoger las imágenes

tan rápido como sea posible.





● Una serie-z es una secuencia de secciones ópticas

recogidas a diferentes niveles perpendiculares al eje

óptico (el eje z) dentro de la muestra. Se recogen

coordinando paso a paso cambios en el foco fino del

microscopio con adquisición secuencial de imágenes

a cada paso.


Series-z e imágenes tridimensionales

● A partir de una serie-z se pueden extraer varias

imágenes de una región de interés y mezclarlas con

un procesador de imágenes.

● Una vez recogida la serie-z es ideal para procesarla

en una representación tridimensional de la muestra

usando técnicas de visualización de volumen.







Las preparaciones vivas u otras muestras que

exhiben fenómenos dinámicos presentan la

posibilidad de utilizar el microscopio confocal para

recoger secuencias en lapsos de tiempo de datos

tridimensionales presentados con el tiempo como

una cuarta dimensión.


Imágenes en 4 dimensiones

Si se necesita una vista perfil de una muestra se

puede obtener una sección x-z de dos formas:

● Barriendo una línea sencilla a través de la muestra

(en el eje x) a diferentes profundidades de z

cambiando el foco y mostrando la serie superpuesta

en una imagen

● Cortando un plano en una reconstrucción

tridimensional para extraer el perfil de una serie-z ya

existente.


Imágenes x-z


Imágenes x-z


Imágenes x-z

Cualquiera de los modos de imagen comúnmente

empleados en microscopía se puede utilizar en el

microscopio confocal, incluyendo contraste de fases,

contraste diferencial interferencial, campo oscuro o

luz polarizada.

Un detector de luz transmitida se utiliza para recoger

la luz que pasa a través de la muestra y una fibra

óptica transmite la señal a uno de los

fotomultiplicadores.


Imágenes luz reflejada, transmitida...

● Una estrategia en algunos estudios es combinar la

imagen de luz transmitida no confocal de la muestra

con una o más imágenes fluorescentes de la misma

muestra.







Cada corte óptico, es decir, cada imagen individual,

muestra la información de un solo plano de la

muestra.

Las estructuras que se extienden por toda la

muestra se recogen de forma parcial en las

diferentes imágenes.


Series: Proyecciones





Para hacer visibles estas estructuras de forma global

se precisan las proyecciones.

Con los algoritmos de las proyecciones es posible

seleccionar los fragmentos de información

relevantes repartidos en varias imágenes

individuales y hacerla visible en una sola imagen de

dos dimensiones.





Tipo de proyección:

● Proyección de valor máximo

● Proyección de valor medio

● Proyección transparente



Proyección de valor máximo

Se parte de la premisa de que los valores de

intensidad máximos son información relevante para

la reconstrucción de una estructura.

Por ello, en esta proyección se busca el punto de

exploración con el valor máximo de cada columna y

se representa en la proyección bidimensional como

representante de toda la columna.



Proyección de valor máximo



Proyección de valor medio

Se considera que todos los valores de intensidad

influyen en la proyección en igual medida.

Por ello se calcula la media aritmética de todos los

valores de intensidad de cada columna y se

representa en la proyección bidimensional como

representante de toda la columna.



Proyección de valor medio



Proyección transparente

También influyen todos los valores de intensidad,

pero se valoran de forma diferente. Los valores de

las imágenes inferiores del lote tienen menor

influencia que los de las imágenes superiores.

Por ello, en esta proyección se calcula la media

ponderada de todos los valores de intensidad de

cada columna .



Proyección transparente





Máxima Media Transparente

Desde un punto de vista físico una imagen puede

considerarse como un objeto plano cuya intensidad

luminosa y color puede variar de un punto a otro.

Si se trata de imágenes monocromas (blanco y

negro), se pueden representar como una función

continua f(x,y) donde (x,y) son sus coordenadas y el

valor de f es proporcional a la intensidad luminosa

(nivel de gris) en ese punto.


Imágenes digitales

Para obtener una imagen que pueda ser tratada por

el ordenador es preciso someter la función f(x,y) a

un proceso de discretización tanto en las

coordenadas como en la intensidad.

A este proceso se le denomina digitalización.


Imágenes digitales

La digitalización consiste en la descomposición de la

imagen en una matriz de M x M puntos donde cada

uno tiene un valor proporcional a su nivel de gris.

Dado que este valor puede ser cualquiera dentro de

un rango continuo, es preciso dividir dicho rango en

una serie de intervalos, de forma que el nivel de gris

de cada punto sea asignado a uno de los valores

que representa dicho intervalo.


Imágenes digitales

Los sistemas de proceso digital de imágenes suelen

ser capaces de discriminar 256 niveles de gris.


Imágenes digitales

x

y f(x,y)

Cada elemento en que se divide la imagen recibe el

nombre de "pixel" (picture element).

El número de niveles de gris y las dimensiones de la

matriz (numero de filas por nº de columnas)

condicionan la capacidad de resolución de la imagen

digital.


Imágenes digitales


Imágenes digitales

16 x 16

512 x 512 256 x 256 128 x 128

64 x 64 32 x 32


Imágenes digitalesZoom:

En la microscopía confocal la ampliación de una

imagen se determina, por una parte, mediante el

objetivo y, por otra, mediante el zoom electrónico.

El objetivo genera una imagen intermedia cuya

ampliación depende del factor de ampliación del

objetivo.

El zoom electrónico permite esa ampliación

adicional.



Con el factor de zoom 1 se explora el tamaño de

barrido máximo con un determinado número de

puntos.

Si se ajusta el factor a 2, con el mismo número de

puntos en el campo de barrido se explora la mitad

de la longitud lateral del campo máximo de barrido

(1/4 del campo de barrido original).



Zoom = 1

Zoom = 2



También se obtiene una gran ampliación y, de esta

forma, también una mejor resolución de la imagen,

ya que se explora un campo de menor tamaño con

la misma frecuencia, lo que proporciona una mayor

densidad de información.



Es posible ajustar factores de zoom entre 1 y 32. No

obstante, el zoom electrónico no permite una

ampliación ilimitada.

El límite se alcanza con la distancia óptica más

pequeña aún resoluble determinada mediante el

poder resolutivo del objetivo.



Esta distancia óptica aún resoluble se visualiza, de

acuerdo con el teorema de Nyquist, sin pérdida de

información cuando se explora con 2 ó 3 puntos de

trama.



Si se sobrepasa la frecuencia de exploración debido

a un factor de zoom relativamente alto y un formato

de barrido determinado, no tiene sentido una

ampliación mayor ya que no pueden apreciarse más

detalles ópticos, ampliación vacía.



Con el formato de barrido se selecciona también la

trama utilizada para la captura de la imagen.

Junto con la apertura numérica del objetivo y la

longitud de onda de excitación, el formato de barrido

determina, además del zoom electrónico, la

resolución espacial de los datos capturados.


Imágenes digitalesTeorema de Nyquist:

Resolución lateral = 0,61λ / A.N.

Si se utiliza una longitud de onda de 488 nm y un objetivo con una apertura numérica de 1,4Resolución lateral = 0,61 x 488 / 1,4 = 212 nm

La distancia entre los puntos de trama estará entre 212 / 2 = 106 nm y 212 / 3 = 71 nm


Imágenes digitalesTeorema de Nyquist:212 / 2 = 106 nm y 212 / 3 = 71 nm

Si se selecciona un formato de barrido de 1024 x 1024 con un objetivo cuya máximo tamaño de campo de barrido es de 150 µm, la distancia de los puntos de trama será

150 / 1024 = 0,146 µm = 146 nmEste formato no recogería toda la información disponible.


Imágenes digitales

150 µm 1024

1024

La distancia de los puntos de trama será150 / 1024 = 0,146 µm = 146 nm


Imágenes digitalesTeorema de Nyquist:Habría que incrementar el formato, por ejemplo a 2048 x 2048 para alcanzar la distancia necesaria entre 106 y 71 nm

150 / 2048 = 0,073 µm = 73 nm


Imágenes digitales

150 µm 2048

2048



Imágenes digitalesTeorema de Nyquist:O bien reducir el tamaño del campo de barrido con la ayuda del zoom electrónico, por ejemplo zoom=2

150 / 2 = 75 → 75 / 1024 = 0,073 µm = 73 nm


Imágenes digitales

75 µm1024

1024


Zoom = 2


Imágenes digitalesTeorema de Nyquist:

Si se utiliza un zoom mayor, por ejemplo 3, sólo se estaría aumentando en vacío porque no se estaría barriendo entre la distancia 106 y 71 nm

150 / 3 = 50 → 50 / 1024 = 0,049 µm = 49 nm


Imágenes digitalesFactores de zoom (marcados en rojo) con los que el preparado se explora sin pérdida de información


Imágenes digitalesFormato:

Existen una serie de formatos de imágenes que son

legibles por la mayoría de los equipos de análisis de

imagen y por los programas de manipulación de

imágenes más conocidos.


Imágenes digitalesFormato

● TIFF: Tagged Image File Format.Es probablemente el formato de imagen más universal. Soporta imágenes de 24-bits por pixel, pudiendo ser comprimidas o no. El formato comprimido utiliza algoritmos de compresión sin pérdida de información con relación al fichero original.

● GIF: Graphics Interchange Format.Es un formato comprimido muy utilizado para guardar iconos, gráficos e imágenes con pocos colores o en niveles de gris. Sólo soporta imágenes de 8-bits por píxel (256 colores). Se utiliza para intercambio por internet.



● PCX: Es un formato del sistema operativo DOS. Soporta imágenes de hasta 24-bits y no está comprimido.

● PSD: Photoshop Document.Son ficheros utilizados sólo por Adobe Photoshop pero conservan todas las capas y canales de la imagen para una edición posterior.

● EPS: Encapsulated PostScript.Ficheros leídos por impresoras Postscript.



● BMP: Bit Mapped.Son los mapas de bits estándares utilizados en el entorno de Microsoft Windows. Soporta imágenes de 24-bits sin comprimir por lo que su tamaño suele ser grande.

● PICT: Considerado el formato estándar de imágenes para Macintosh. Soporta 24-bits por píxel.



● JPEG: Joint Photographic Experts Group.Es el formato comprimido más popular, compatible con gran número de plataformas, muy usado para páginas web o e-mail. Los datos son comprimidos para eliminar información no detectable por el ojo humano. La eficiencia de la compresión es excelente pudiendo llegar a 1/20 ó 1/30 del original. La compresión es “lossy”, al descomprimirlos esa información se ha perdido. Soporta imágenes en color real de 24-bits por píxel.

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