73011197005.pdf

7/23/2019 73011197005.pdf

1/18

e-Gnosis

E-ISSN: 1665-5745

[email protected]

Universidad de Guadalajara

Mxico

Martn del Campo M., Cstulo I.; Gmez H., Hctor E.; Alanz de la O., Ricardo

Bacterias cido lcticas con capacidad antagnica y actividad bacteriocinognica aisladas de quesos

frescos

e-Gnosis, vol. 6, 2008, pp. 1-17

Universidad de Guadalajara

Guadalajara, Mxico

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=73011197005

Cmo citar el artculo

Nmero completo

Ms informacin del artculo

Pgina de la revista en redalyc.org

Sistema de Informacin Cientfica

Red de Revistas Cientficas de Amrica Latina, el Caribe, Espaa y Portugal

Proyecto acadmico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto
http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=73011197005http://www.redalyc.org/comocitar.oa?id=73011197005http://www.redalyc.org/fasciculo.oa?id=730&numero=11197http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=73011197005http://www.redalyc.org/revista.oa?id=730http://www.redalyc.org/http://www.redalyc.org/revista.oa?id=730http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=73011197005http://www.redalyc.org/fasciculo.oa?id=730&numero=11197http://www.redalyc.org/comocitar.oa?id=73011197005http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=73011197005http://www.redalyc.org/revista.oa?id=730

7/23/2019 73011197005.pdf

2/18

2008,e-Gnosis [online] Vol. 6, Art. 5 Bacterias cido lcticas con capacidad antagnica... Martn del Campo C.I.. et

ISSN: 1665-5745 - 1/17 - www.e-gnosis.udg.mx/vol6

BACTERIAS CIDO LCTICAS CON CAPACIDAD ANTAGNICAACTIVIDAD BACTERIOCINOGNICA AISLADAS DE QUESOS

FRESCOS.

Cstulo I. Martn del Campo M1., Hctor E. Gmez H2.Ricardo Alanz de la [email protected]/ [email protected]

Recibido:septiembre10,2007/Aceptado:marzo28,2008/Publicado:enero11,2008

RESUMEN. Se aislaron 350 cepas de bacterias cido lcticas (BAL), a partir de 35 muestras de quesos frescos, fueron probadcontra de cuatro microorganismos patgenos, tres Gram+ (Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Streptocpyogenes) y un Gram- (Salmonella agona).Slo 25 cepas mostraron capacidad antagnica, el mayor efecto inhibidor fue deal pH, por la produccin de cidos orgnicos. 8 de ellas, mostraron un efecto inhibidor diferente al pH, Todas las cepas mostactividad antagnica en contra de bacterias Gram+. S. agona, no fue inhibida en su desarrollo, por ninguna de las cep

bacterias cido lcticas. Tres cepas que mostraron inhibicin con el sobrenadante, se trataron con enzimas proteolticas,determin que el factor inhibidor es de origen proteico. 16 cepas mostraron que es necesaria la presencia de las BAL para ina los patgenos, al probar el sobrenadante libre de BAL, el efecto inhibidor no se manifest.

PALABRAS CLAVE.Antibacteriano, Pptidos, Inocuidad, Sobrenadante.

___________________________________1-2. Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenieras, Blvd. Marcelino Garca Barragn y Calzada Olmpica, S.R.Guadalajara, Jalisco, Mxico.3. Carretera a Nogales, Km. 15.5. Las Agujas, Nextipac, Zapopan, Jal. www.cucba.udg.mx

7/23/2019 73011197005.pdf

3/18



Introduccin

Las bacterias cido lcticas (BAL) estn presentes en la alimentacin del hombre desde hace mucho tiemy es posible encontrarlas en diferentes productos de leche fermentada como jocoque y yogurt, tambiencuentran en quesos frescos y madurados, en diferentes carnes y sus productos y en algunas hortalMetchnikoff, investigador del siglo XIX, relacion desde hace ms de un siglo el efecto benfico sobrsalud humana, con el consumo de leche fermentada que contena cierto tipo de bacilos (1).

Desde hace mucho tiempo, se ha reconocido la importancia de las (BAL) como microorganismos benfen los alimentos y en la salud, mejora el tracto gastrointestinal de los seres humanos, evitando el desarrde microorganismos patgenos capaces de producir enfermedades, por la estimulacin del sistinmunolgico y por consiguiente, la produccin de anticuerpos.

Con la denominacin de bacterias cido lcticas (BAL) se generaliza a un grupo de bacterias fermentan azcares como glucosa y lactosa para producir cido lctico. Dentro de este grupo se reconocexistencia de microorganismos aerobios, anaerobios y anaerobios facultativos.Los gneros representatde las BAL se denominan:Lactobacillus,Leuconostoc, Streptococcus, BifidobacteriumyPediococcus. excepcin deBifidobacterium,todos son aerbicos (2).

Estos microorganismos se pueden clasificar adems por su metabolismo, en homofermentativoheterofermentativos, los primeros producen exclusivamente cido lctico, mientras que los segunproducen adems cido actico, etanol y dixido de carbono (2) op.cit.

La actividad antimicrobiana de las bacterias cido lcticas ha sido atribuida a la acumulacin deproductos finales de los procesos de fermentacin, como cido lctico, dixido de carbono, perxidhidrgeno, etc. o a la produccin de bacteriocinas (3).

Las bacterias cido lcticas tienen una amplia aplicacin como cultivos iniciadores en una variedadalimentos fermentados. Los cidos orgnicos producidos, con una reduccin en el pH, se considera comprincipal agente inhibidor del crecimiento de microorganismos contaminantes en los alimentos ferment(4).

Las BAL se han utilizado desde hace algunas dcadas en la industria de alimentos como bioconservaddebido a la produccin de sustancias que ejercen accin antibacteriana, que contribuyen a la prevencila descomposicin de los alimentos y evitan el desarrollo de microorganismos patgenos. Ocaractersticas deseables de las BAL, son que pueden mejorar el sabor y la textura y en algunos c

aumentan el valor nutricional, por sus efectos sobre la digestibilidad (5), (6).Debido a que las bacterias cido lcticas pueden ser destruidas en el tracto intestinal, son termo resistenactivas en pH bajos, inocuas para los consumidores y estables en los alimentos, se han utilizado comobioconservador natural en los alimentos (7).

Se han obtenido numerosas bacteriocinas producidas por las BAL, observando que cada una tiene especde inhibicin especficos en contra de algunos microorganismos, esta particularidad se aprovecha eindustria de los alimentos para su aplicacin en distintos procesos. En algunos casos, las bacteriocinaemplean para la inhibicin del crecimiento de bacterias indeseables especficas relacionadas con

7/23/2019 73011197005.pdf

4/18



productor de la bacteriocina; en otros casos, se aplican para inhibir el crecimiento de microorganisdegradadores de alimentos o de patgenos, como listerias y estafilococos (8).

Las bacteriocinas poseen un gran potencial para utilizarse en sistemas de alimentos para la inhibinatural de microorganismos patgenos. Esta biotecnologa puede ser implementada relativamente a costo para la conservacin de una amplia variedad de alimentos (9).

El aumento en el consumo de alimentos procesados que se elaboran con conservadores qumicosoriginado en los consumidores una demanda por alimentos con un mnimo procesamiento y que tiendser ms naturales. Como resultado de este patrn en el consumo, existe un gran inters en la utilizaciagentes antimicrobianos producidos naturalmente (10).

Considerando que las bacteriocinas son protenas naturales, existe un gran inters en su aplicacin commtodo alternativo para asegurar la inocuidad de alimentos refrigerados con un mnimo procesamieobjetivo que se ha buscado tambin empleando mtodos combinados o tecnologa de barreras (11), (12).

En la actualidad, la nisina es la nica bacteriocina aprobada por la FDA. para incluirse en alimentos, inhibir el crecimiento de microorganismos patgenos. Sin embargo, se han aislado otras bacteriocinas,potencial para utilizarse con el mismo fin.

La mayora de las bacteriocinas, tienen un espectro de accin ms bien reducido, preferentemente en code bacterias Gram+. Sin embargo, algunas bacteriocinas, pueden presentar un espectro ms ampliocontra de algunas bacterias Gram-, por lo que existe un marcado inters por estudiar ms cepas de Bpara encontrar stas caractersticas (13).

Las bacteriocinas se pueden definir como pptidos biolgicamente activos que tienen propiedbactericidas en contra de otras especies que pueden estar estrechamente relacionadas con las cproductoras. No obstante, este concepto se ha visto modificado, debido a que se han encontrado efebactericidas en contra de microorganismos distanciados filognicamente de las cepas de BAL productde bacteriocinas (14).

Las bacteriocinas se han clasificado considerando sus propiedades bioqumicas y a sus caracterstgenticas (15), (16), En 1996, Nes propuso la siguiente clasificacin:

Clase I. Lantibiticos: Son pptidos activos que actan sobre la membrana citoplasmtica, se caracterpor poseer algunos aminocidos poco frecuentes en las protenas, tales como dihidroalanina, -m

lantionina y lantionina, estos se forman por una modificacin posterior a la traduccin. La transformacidebida a la deshidratacin de los aminocidos treonina y serina, a los que posteriormente se les adiciotomos de azufre, procedentes de la cistena a los dobles enlaces de los deshidroaminocidos. La nisinuna bacteriocina tpica de esta clase (17), (18).

Clase II. No lantibiticos. Son bacteriocinas que se caracterizan por contener aminocidos queencuentran regularmente en las protenas, pueden ser de peso molecular variable, en este grupo se identificado tres subclases (19), (20) y (21).

7/23/2019 73011197005.pdf

5/18



Subclase IIa. Son pptidos que actan en contra deListeria, comparten la secuencia en la regin N-termTGNGVXC son caractersticos de este grupo la sakacina P y la pediocina PA-1 (22).

Subclase IIb: Son pptidos que forman poros en la membrana citoplasmtica, consisten de dos pptdiferentes. Los dos pptidos son necesarios para una efectiva actividad antimicrobiana. En este grupo secaracterizado a la lactococcina G y las plantaricinas EF y JK.

Subclase IIc: Son pptidos pequeos no modificados, presentan termoestabilidad, son transportadosmedio de pptidos lder. En esta subclase nicamente se han reportado a las bacteriocinas, divergicina acidocina B (23).

Clase III.- Las bacteriocinas caracterizadas en esta categora son, la acidofilicina A, las lacticinas A y las helveticinas J y V. Su peso molecular es mayor de 30 kDa.

Tabla 6. Clases de bacteriocinas representativas de diferentes bacterias cido lcticas.Bacteriocina Clase Microorganismo productor

Nisina I Lactococcus lactis subsp lactis

Pediocina PA-1 IIaPediococcus acidilactici y Lactobacillus

plantarum WHE92

Sakacina P IIa Lactobacillus sake LTH673

Plantaricina E/F IIb Lactobacillus plantarum C11

Lactococcina G IIb Lactococcus lactis subsp cremoris 9B4

Divergicina IIc Carnobacterium divergens LV13Helveticina III Lactobacillus helveticus

La Tabla 6presenta algunas bacteriocinas representativas de cada una de las clases y subclases en quesido identificadas de acuerdo a sus propiedades, tambin se presentan los microorganismos de los quhan aislado las diferentes bacteriocinas.

Ennhar y col. (1996), (24) aislaron 1962 cepas de 362 muestras, de queso Munster (francs). Estas cmostraron efectos antagnicos en contra de L. monocytogenes; en la mayora de los casos, el efantagnico fue debido a la disminucin en el pH, por la produccin de cidos orgnicos. Los autsealaron que slo seis de los sobrenadantes de cultivos, (tres Lactobacillus, dos Enterococcus y

Lactobacillus) presentaron actividad en contra de L. monocytogenes por la accin de sustanantibacterianas diferentes a los cidos orgnicos. El extracto del cultivo deLactobacillusfue seleccionpor mostrar una mayor actividad antagnica (Au/ml Unidad Arbitraria de actividad con 17unidades/ml). La capacidad antagnica del extracto no fue inactivado en presencia de catalasa, excluyeque la inhibicin fuera producida por la presencia de perxido de hidrgeno; sin embargo, el extractoinactivado por las enzimas proteolticas pepsina, tripsina, alfa quimiotripsina, determinando que la sustainhibidora es de naturaleza proteica y no fue inactivada en presencia de alfa amilasa y lipasa, determinaque la inhibicin no se debe a la accin de carbohidratos o lpidos. El sobrenadante se prob en contrdiferentes bacterias Gram+ (Lactobacillus sp, Enterococcus sp, Micrococcus sp, Staphylococcus

7/23/2019 73011197005.pdf

6/18



Bacillus sp)y Gram- (Salmonella sp, Pseudomona sp, y E. coli), inhibiendo el crecimiento de las Gramno a las Gram-. Ennhar y col. (1996) (24) reportaron adems, que la bacteriocina aislada corresponde

pediocina AcH, producida originalmente porP. acidolactici H, sealando que es el primer caso en quebacteriocina se produce naturalmente por bacterias de diferente gnero.

Carrasco y col. (2002) (2) op. cit. aislaron 27 cepas de BAL a partir de quesos artesanales y comercialeArgentina, probando su actividad antimicrobiana. Slo nueve cepas, presentaron actividad en contracontra bacterias indicadoras Gram+ y Gram- que deterioran la leche, el queso y otros alimentos. Los autseleccionaron nicamente tres cepas por presentar una mayor inhibicin en contra de las bacteindicadoras tanto Gram+ como Gram-. La sustancia inhibidora en el sobrenadante libre de BAL, destruida por la accin de las enzimas tripsina, pronasa E, pepsina y papana, con una concentracin esobrenadante de 0.5 l/ml, indicando la naturaleza proteica del compuesto activo.

Ennhar y col. (1998) (25) investigaron la efectividad deLactobacillus plantarumWHE 92, productor dbacteriocina denominada pediocina AcH, en contra de Listeria monocytogenes 4d. La cepa de BALaislada de muestras de quesos, lo que sugiri que la cepa no afecta el proceso de maduracin; as ctampoco altera las caractersticas sensoriales del alimento. Una suspensin de la bacteria lctica (1 Xufc.) fue rociada sobre la superficie del queso previamente inoculado con el patgeno (menos de 50 ufinhibiendo su desarrollo despus de 21 das.

Wan y col. (1997) (26) observaron los efectos de la pisicolina 126, una bacteriocina producida Carnobacterium pisicola JG 126, en contra del patgeno Listeria monocytogenes en la fabricacinquesos camembert. Utilizando leche pasteurizada, realizaron la inoculacin del patgeno (1X102 ufc mposteriormente se agreg la pisicolina 126 en una concentracin de 2048 AU ml-1, reportaron quviabilidad del patgeno disminuy en 3-4 log en comparacin con los que no se agreg la bacteriocina

embargo, reportaron la recuperacin de L. monocytogenes despus de 21 y 47 das posteriores elaboracin del queso, debido a la posible resistencia deL. monocytogenesa la bacteriocina.

Mc Auliffe y col. (1999) (27) aplicaron lacticina 3147 producida por la cepa de Lactococcus lactisD3147, como cultivo iniciador en la elaboracin de queso tipo cotagge. El microorganismo indicador dactividad bacteriocinognica, fue Listeria monocytogenes Scott A. La lacticina 3147 es una bacterioactiva en contra de microorganismos patgenos Gram+ como Listeria, Staphylococcus y Streptococcubacteriocina es activa en un amplio rango de pH, es termoestable, particularmente a pH bajos. La eficdel lctico redujo hasta en 99% el nmero de Listeria monocytogenes inoculada en un periodo de cinco y almacenada a 4 C.

En otra investigacin, Laukov and Czikkov. (1999) (28) estudiaron el efecto de la enterocina CCM 4caracterizada como una sustancia termoestable, hidrofbica con un amplio espectro de accin en contrmicroorganismos Gram+ y Gram-, producida por la cepa deEnterococcus faecium CCM 4231. El efectla enterocina CCM 4231, se investig en leche de soya en polvo contaminada experimentalmente

Listeria monocytogenes Ohio y Staphylococcus aureus SA1. Enterococcus faecium mostr bcrecimiento en la leche de soya en polvo y posteriormente la produccin de enterocina. Reportan qumonocytogenesfue inhibida completamente despus de 24 horas de cultivo en la muestra experimentatanto que S. aureustuvo un comportamiento diferente; a las seis horas, se observ su menor desarrollo, 24 horas mostr un ligero aumento, concluyendo que, en contra de L monocytogenes la enterocina 4

7/23/2019 73011197005.pdf

7/18



actu como un agente bactericida; en tanto que, en contra de S. aureusel efecto fue bacteriosttico. Seadems, que la adicin de la enterocina CCM 4231, no tuvo influencia sobre el pH. Los resultados de

trabajo indican que las enterocinas pueden ser ampliamente aplicadas en la industria de los alimentos cagentes para aumentar su seguridad higinica. Se seala tambin, que actualmente el nico problema paraplicacin en alimentos, es legislativo.

Objetivo General

Aislar bacterias cido lcticas y determinar su accin antagnica en contra de patgenos indicadseleccionados para este trabajo.

Objetivos Especficos

1.- Aislar bacterias cido lcticas a partir de quesos frescos de la zona metropolitana de Guadala

(tomando muestras de mercados, centros de acopio y distribucin de productos lcteos).

2.-Determinar la capacidad antagnica de las cepas de bacterias lcticas aisladas, en contra de los patgeListeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus hemoltico del grupo A y Salmonagona.3.-Determinar los mecanismos antagnicos de las bacterias lcticas en contra de los patgenos, incluyesu capacidad bacteriocinognica.

MATERIALES Y MTODOS

AISLAMIENTO DE BACTERIAS CIDO LCTICAS

Las bacterias cido lcticas (BAL), fueron aisladas a partir de muestras de quesos frescos que se expenen los mercados de la zona metropolitana de Guadalajara, incluyendo los municipios conurbanoZapopan, Tlaquepaque y Tonal.

Se determinaron los diferentes mecanismos antagnicos propios de las bacterias cido lcticas, comoproduccin de perxido de hidrgeno y la produccin de bacteriocinas.

El aislamiento de las BAL se realiz de 35 muestras de quesos frescos, 14 de adobera, 11 de panela, 6queso tipo ranchero y 4 de queso fresco, se pesaron 10 gramos de cada una colocndolas en bolsa

stomacher y se aadieron 90 ml. de diluyente de peptona para su homogenizacin. Se tom 1 mlhomogenizado, y se aadi consecutivamente a tubos conteniendo 9 ml de diluyente de peptona, halcanzar las diluciones 5, 6 y 7.

De cada una de las tres diluciones seleccionadas, se tom un ml y se sembraron por la tcnicainoculacin por superficie y extensin con varilla de vidrio en medio Actidiona-Polimixina-Nitrito (Anormal) (29) y se incubaron a 30 C durante 48 a 72 horas. Despus de este tiempo, se realiz el recuentunidades formadoras de colonias (ufc).

7/23/2019 73011197005.pdf

8/18



Se seleccionaron 10 diferentes colonias aisladas en el medio de APN, considerando algunas caracterstde las colonias como tamao, color forma, etc. sembrndose en placas de APN cc (conservacin

colonias) (29) op. cit. Al desarrollo de las cepas se someti a las pruebas de Gram, catalasa y moviliconfirmando su pertenencia al grupo de estos gneros. Las BAL son bacterias Gram positivas, catanegativas y son inmviles.

Se seleccionaron cuatro microorganismos patgenos, que son reconocidos como causantes de enfermedtransmitidas por alimentos (ETAs), Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella agoStreptococcushemoltico del grupo A. y fueron utilizados como indicadores de actividad antagnica dBAL,

Determinacin de la capacidad antagnica de las BAL en contra de los patgenos.

La conservacin de los microorganismos patgenos, se realiz en tubos en el medio de Agar Soya Tripti(AST), para las cepas de Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus y Salmonella agonaStreptococcushemoltico del grupo A,se conserv en agar sangre (ASTs). Tambin se utilizaron placaagar para la resiembra de los patgenos, asegurando que no existiera contaminacin con otras cepas.Cada uno de los microorganismos patgenos se inocularon en el medio APN mb en una concentraaproximada de 1 X 105 ufc/ml, en tubos conteniendo 14 ml del medio, se vaciaron en placas y se solidificar.La determinacin de la actividad antagnica de las BAL en contra de los patgenos utilizados cindicadores, se realiz con la tcnica de inoculacin por picadura reportada por Galliano y Hinsdill (19(30), en medio APN mb (modificado blando) (29) op. cit. Se consider como actividad antagnica posla observacin de un halo de inhibicin de 1 mm mayor alrededor de la picadura de las cepas de BAL

Las cepas de BAL que presentaron actividad antagnica, se conservaron en el medio de APN(conservacin de colonias) y en tubos de agar MRS.

Determinacin de los mecanismos antagnicos de cultivos de BAL en contra de patgenos.

La determinacin de los mecanismos antagnicos de las cepas de BAL, se inici con los cultivos de cepa de 24 horas en medio de agar MRS, posteriormente se inocularon en caldo MRS y se incubaron pohoras.

Los caldos se centrifugaron a 12,000 RPM. durante 30 minutos, el sobrenadante se extrajo con piPasteur cuidando de no tocar el paquete celular y colocndolo en un vaso de precipitado.

Por cada una de las cepa, se utilizaron ocho microtubos, el primero, se tom directamente del vasoprecipitado esterilizndolo por filtracin e identificndose como sobrenadante sin tratamiento (ST), al rdel contenido, se le determin el pH y se ajust a pH 6.5 para todos los sobrenadantes, con una soluciNaOH 1M, y fueron expuestos por 30 minutos a una solucin de catalasa (Sigma Chemical, C-100) conu/ml del sobrenadante a 25 C, llenando siete microtubos por cada cepa y esterilizando por filtracinresto del sobrenadante, se coloc en tubos estriles para su conservacin en congelacin.

7/23/2019 73011197005.pdf

9/18



Los patgenos se sembraron en AST Y ASTs, incubndose por 24 horas, estos cultivos nuevo

resembraron en caldo BHI en cultivos de 24 horas para la inoculacin del medio APN mb.El medio APN mb se inocul con cada uno de los patgenos con una concentracin aproximada de 1 Xufc/ml y se dej solidificar en placas. La tcnica utilizada, fue la de la gota sobre la superficie (spotlawn), que consiste en aplicar cinco microlitros del sobrenadante de los cultivos de BAL sobre la superfseca del medio semislido. Al medio de APN mb, previamente inoculado con cada una de las cindicadoras, se le aplic una gota del sobrenadante de las BAL realizando tres divisiones en las placidentificndolas como control (1), pH ajustado (2) y catalasa (3), incubndose a 30 C por 24 hofinalmente se busc la presencia de halos de inhibicin en las reas de aplicacin del sobrenadante.

Determinacin de la capacidad bacteriocinognica de cultivos de BAL en contra depatgenos.

Despus de seleccionar las cepas que presentaron inhibicin en contra de los patgenos indicadoposterior al ajuste del pH, y a la exposicin de catalasa, se repiti el procedimiento para obtenesobrenadante libre de BAL, utilizndose con pH original, pH ajustado a 6.5 en estos se expusieron duruna hora a 37 C, a la accin de las enzimas alfa quimiotripsina (pncreas de bovino, tipo II; SiChemical, C-4119), Proteinasa K (fngica, GIBCO, BRL, 25530-015) y proteasa (Streptomices grisSigma ChemicalP-5147), en forma individual, a una concentracin final de 0.1 mg/ml del sobrenadante

Todos los sobrenadantes se esterilizaron por filtracin, repitiendo la tcnica de spot-on lawn(Gratia, 1(31), aplicando cinco microlitros sobre las placas, previamente inoculadas con las cepas indicadoras incubaron a 30 C durante 24 horas, por ltimo se observaron las placas para encontrar zonas de inhibici

Resultados

Los resultados experimentales se muestran en el orden en que fueron obtenidos, iniciando con el tipmuestra, su identificacin, los recuentos de ufc/ml y la actividad antagnica en contra de los patgutilizados como indicadores. Asimismo, se describen los factores responsables de la actividad antagnide la capacidad bacteriocinognica.

De las 35 muestras de cuatro tipos de quesos frescos, los recuentos de ufc/ml, presentaron valores de 5106como el valor ms bajo, correspondiente a la muestra nmero 13 de queso adobera y el valor ms ase obtuvo en la muestra nmero 2 de panela con 6.1 X 10 8, los dems valores se encuentran dentro de elmites (Tabla1).

Tabla 1. Muestra de quesos y aislamiento de bacterias cido-lcticas con sus recuentos ufc/m

AdoberaNo de m.* ufc**

PanelaNo de m. ufc

ancheroo de m. ufc

FrescoNo de m. ufc

1 8.4107 2 6.1108 4 1.3107 5 1.81077 9.3107 3 1.1107 6 2.8108 23 1.31079 1.5108 8 1.1108 10 2.8108 27 2.0108

12 6.0107 11 3.8107 15 1.0108 33 1.1108

7/23/2019 73011197005.pdf

10/18



13 5.3106 14 1.1108 18 2.6x10717 1.3107 16 2.4108 24 2.2107

19 3.1108

22 1.3107

20 9.0107 26 1.610821 1.7108 30 3.610725 1.3108 31 7.510728 1.7108 34 1.610829 3.410732 7.510735 1.3108

14 quesos 11 quesos 6 quesos 4 quesos*No. de muestra. **ufc = Unidades formadoras de colonias/ml.

De las 350 cepas de BAL, que fueron aisladas y probadas mediante la tcnica de inoculacinpicadura, en contra de los cuatro microorganismos patgenos utilizados como indicadores: Lismonocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella agona y Streptococcushemoltico del grupo A,25 mostraron actividad antagnica en contra de alguno de los patgenos mencionados, mostrando haloinhibicin de 1 mm de dimetro mayores, los resultados se muestran en la Tabla 8.

Tabla 2. Inhibicin de cepas de BAL aisladas de diferentes quesos, probadas en contracuatro patgenos.

Muestra Cepas Listeriamonocytogenes

Staphylococcu

s aureus

Salmonella

agona

Streptococcus

-hemoltico

16 panela 151 + - - -17 adobera 162

163170

+-+

-+-

---

---

19 adobera 181183184190

+--+

----

----

-++-

20 adobera 195 + - - -21 adobera 206

210++

--

--

-+

25 adobera 245

248249

+

-+

-

--

-

--

-

+-

28 adobera 272277

++

--

--

++

30 panela 292293294299

++++

++++

----

----

31 panela 301 + - - +

7/23/2019 73011197005.pdf

11/18



303 + - - +32 adobera 316 - + - +

33 q. Fresco 324329 -+ +- -- -+TOTALES 25 19 7 0 9

+ = Con actividad antagnica. - = Sin actividad antagnica.

La cepa indicadora deListeria monocytogenes,fue la que mostr mayor inhibicin, con un total de 19 cde BAL que inhibieron su desarrollo, seguido por Streptococcus hemoltico grupo A con Staphylococcus aureuscon 7 cepas.

De las cepas probadas, ninguna mostr efectos antagnicos en contra de Salmonella agona, que fumicroorganismo Gram-, seleccionado para el presente estudio.

Ninguna de las cepas de BAL que presentaron actividad antagnica, mostraron inhibicin en contra de trcuatro de los patgenos utilizados como indicadores.Las cepas de BAL aisladas que mostraron inhibicin en contra de un slo patgeno fueron: nueve en code Listeria monocytogenes; tres en contra de Streptococcus hemoltico; y dos cepas en contraStaphylococcus aureus.

Once cepas mostraron inhibicin en contra de dos patgenos.

Seis cepas inhibieron aListeria monocytogenesy aStreptococcus hemoltico. Cuatro cepas, inhibierListeria monocytogenes y a Staphylococcus aureus. Una cepa, inhibi a Staphylococcus aureusStreptococcushemoltico.

Todas las cepas seleccionadas, se colocaron en tubos con medio APN cc sembradas por puncin y en plde agar MRS para su conservacin en refrigeracin.

La determinacin de los factores de antagonismo, se prob con los sobrenadantes libres de BAL, ajustael pH a 6.5, con objeto de poder excluir que la inhibicin fue debida a la produccin de cidos orgnicopor la exposicin de los sobrenadantes a la accin de la enzima catalasa, para descartar que la inhibifuera debida a la produccin de perxido de hidrgeno. El sobrenadante de cada una de las cepas, se coen un microtubo sin ajustar el pH, utilizndose como control, al resto se le determin su pH, como se puapreciar en la Tabla 3.

Tabla 3. Valor del pH del sobrenadante del cultivo de las cepas de BAL antes de ajustar ela 6.5 para todos los tratamientos.

Cepa pH Cepa pH Cepa pHBa-1 4.5 Ba-10 6.1 Ba-19 4.4Ba-2 5.8 Ba-11 4.5 Ba-20 4.4Ba-3 4.8 Ba-12 4.3 Ba-21 4.5Ba-4 5.5 Ba-13 4.3 Ba-22 4.4Ba-5 3.8 Ba-14 4.3 Ba-23 4.8

7/23/2019 73011197005.pdf

12/18



Ba-6 3.7 Ba-15 4.4 Ba-24 4.3Ba-7 3.7 Ba-16 4.5 Ba-25 4.5

Ba-8 3.7 Ba-17 4.4Ba-9 3.7 Ba-18 4.4

Como se puede apreciar en la Tabla 3, el pH de cada uno de los sobrenadantes obtenido a partir del culde las cepas de BAL aisladas, se encuentra entre 3.7 como el valor ms bajo, se apreci en las capas BBa-7, Ba-8 y Ba-9. En tanto que, el valor ms alto de 6.1 se observ en la capa Ba-10. Los datos del pHajustar, sugieren que la acidez por s misma podra ser la causa de la inhibicin microbiana.

Los patgenos fueron inoculados en APN mb y colocados en placas de Petri para su solidificacposteriormente ya solidificadas, se aplicaron cinco microlitos de los sobrenadantes. Los resultadomuestran en la Tabla 4.

De las 25 cepas que se probaron en contra de los patgenos indicadores que exhibieron activantagnica; slo se presentan las que exhibieron actividad antagnica, despus de haber ajustado el pque fueron expuestos a la actividad de la enzima catalasa.

Tabla 4. Determinacin de los mecanismos antagnicos de las bacterias cido-lcticas aislade quesos frescos de la zona metropolitana de Guadalajara.

1 = Sin tratamiento. 2 = pH ajustado. 3 = Catalasa.+ = Inhibicin. + = Inhibicin parcial. = Sin inhibicin.

Los nmeros 1, 2 y 3, de la Tabla 4, representan los tratamientos que se hicieron de cada uno de los calel nmero 1, se aplic sin ningn tratamiento y fue utilizado como control para la determinacinmecanismo antagnico. El nmero 2, se refiere al ajuste del pH a 6.5 del caldo probado contrapatgenos, y el nmero 3, muestra el comportamiento del caldo tratado con catalasa para eliminaperxido de hidrgeno.

CEPA BA-1 BA-11 BA-16 BA-17PATGENO ST1 pH2 Cat3 ST pH Cat ST pH Cat ST pH Cat

Listeria

monocytogenes + + + + + - - - - - - -Staphylococcusaureus

- - -+ - - -

- - -

Streptococcus.

hemoltico - - - + + + BA-18 BA-19 BA-20 BA-21

PATGENO ST pH Cat ST pH Cat ST pH Cat ST pH CatListeriamonocytogenes - - - - - + + + + + +Staphylococcus

aureus + - + - - - - - -Streptococcus.

hemoltico - - - - - - - - -

7/23/2019 73011197005.pdf

13/18



Se consider como inhibicin, cuando se observ un halo ntido de inhibicin en el lugar en donde se co

la gota del sobrenadante de los cultivos de las BAL sobre la superficie del medio. En la observacimicroscopio, no se apreci ningn desarrollo de colonias de las cepas indicadoras sobre el rea tratada.

Se determin como inhibicin parcial, cuando a la observacin macroscpica, la presencia del halontida. Sin embargo, en la observacin al microscopio, se apreci un desarrollo de colonias de las cindicadoras, en menor cantidad que en el resto del medio que no recibi tratamiento, sin inhcompletamente su desarrollo.

No se report alguna inhibicin, cuando no se encontr ningn halo en la superficie tratada y cuandocolonias de las cepas indicadoras, no mostraron cambios en su desarrollo.En todos los casos en donde no se apreci inhibicin en el control (No.1) en la etapa primaria de selecdel antagonismo, sugiere ampliamente que la presencia del lctico es necesaria para inhibir a los patgeel mecanismo de accin puede ser debido a la competencia por el sustrato, en donde los lctiprobablemente tienen una mayor capacidad de adaptacin al medio y no permiten el desarrollo de omicroorganismos.

Las cepas indicadoras, en todas las observaciones, fueronListeria monocytogenes, Staphilococcus aureStreptococcushemoltico.

Las cepas BA-1, BA-20 y BA-21, presentaron inhibicin positiva por el sobrenadante, nicamente en codeListeria monocytogenes, en el control, pH ajustado y en presencia de catalasa, sugiriendo que existe factor inhibidor, probablemente una bacteriocina.Staphylococcus aureusy Streptococcushemolticopresentaron inhibicin en ninguno de los tratamientos.

La cepa BA-11, Present inhibicin positiva en contra de Listeria monocytogenes, en el control yajustado, mostrando que el efecto inhibidor fue debido a la produccin del perxido de hidrgeno. Encepas indicadoras de Staphylococcus aureusy Streptococcusgrupo beta hemoltico, se observ inhibipositiva, slo en el control, en el pH y en presencia de catalasa, se observaron con inhibicin parindicando la probable presencia de otra sustancia responsable de la inhibicin.

Las cepas BA-16 y BA-17, mostraron un comportamiento similar, el antagonismo slo se manifestcontra de Streptococcusgrupo beta hemoltico, en el control, la cepa BA-16, present inhibicin positivatanto que en la cepa BA-17, se observ inhibicin parcial. En el ajuste de pH, y la inhibicin por perxde hidrgeno, en ambas cepas, fue inhibicin parcial, por lo que se considera que es posible que ex

alguna bacteriocina, que se demuestra por la persistencia de la inhibicin en contra de este patgeno.La cepa BA-18 present inhibicin apreciable en contra deListeria monocytogenessolamente e

control, por lo que se considera que los mecanismos de inhibicin fueron debidos al pH y a la producciperxido de hidrgeno. En el caso de Staphylococcus aureus,la inhibicin positiva se observ en el conen el pH ajustado la inhibicin fue apreciable, con el tratamiento de catalasa, no hubo inhibicconsiderndose que el factor inhibidor, fue el perxido de hidrgeno. En el Streptococcus grupo hemoltico, es probable la existencia de una bacteriocina, por la persistencia de la inhibicin.

7/23/2019 73011197005.pdf

14/18



La cepa BA-19 mostr actividad antagnica positiva slo en contra de Staphylococcus aureusen el conen el pH ajustado y en presencia de la enzima catalasa, para inhibir al perxido de hidrgeno, la inhibi

fue apreciable, se considera, que es probable la presencia de una bacteriocina.

De las cepas, de las que se obtuvo el sobrenadante y que mostraron una inhibicin positiva, an con el ajde pH y de la accin de la catalasa sobre el perxido de hidrgeno, nicamente se seleccionaron tres, debido a que presentaron una inhibicin ms definida que en las dems, correspondiendo a las cepas BABA-20 y BA-21 en contra de L. monocytogenes. stas se probaron nuevamente, ajustando el pexponiendo los sobrenadantes a la accin de enzimas proteolticas, resultando ser cepas bacteriocinognse pudo corroborar que su efecto antagnico despareci por la actividad enzimtica, al probarse en contrlos patgenos indicadores, como se puede observar en la tabla 5.

Tabla 5. Determinacin de la naturaleza proteica de la sustancia inhibidora en sobrenadantes de BAL en contra deL. monocytogenes.

Cepa Control pH Catalasa 1 2 3BA- 1 + + + - - -BA-20 + + + - - -BA-21 + + + - - -

1= Alfa quimiotripsina; 2= Proteinasa K; 3= Proteasa

Los resultados obtenidos del presente estudio, fueron debidos al efecto del pH sobre los patgeindicadores, como el principal inhibidor. La actividad antagnica, provocada an por los efectos delajustado y de la enzima catalasa, permiti observar que existi una sustancia inhibidora, diferente acumulacin de cido lctico, o a la presencia de perxido de hidrgeno respectivamente. Finalmente

demostr la presencia de las bacteriocinas al exponer el sobrenadante a la accin de las enziproteolticas, manifestndose por la desaparicin de la actividad antagnica.

DISCUSIN

Las BAL se han utilizado en la alimentacin desde hace mucho tiempo, es posible encontrarlas en diferealimentos, en la leche y sus derivados como en el jocoque y yogurt, en quesos frescos y maduratambin, es posible aislarlas de carnes y sus productos y en algunas hortalizas. Metchnikoff, investigdel siglo XIX, relacion el efecto benfico sobre la salud humana, con el consumo de leche fermentadacontena cierto tipo de bacilos (1) op. cit.

En el presente estudio, se aislaron BAL a partir de quesos frescos por considerar que es una fuimportante por el proceso de fermentacin de estos productos, como se pudo corroborar al aislar 350 cede 35 muestras de quesos.

Los factores de antagonismo probados en el presente estudio, fueron el pH, el perxido de hidrgeno produccin de bacteriocinas. Se considera que la reduccin en el pH es el principal efecto inhibidor debila produccin de cidos orgnicos de acuerdo a lo sealado por Carrasco y col. (2002) (4) op. cit. resultados obtenidos en este trabajo, coinciden con los autores mencionados, de las 25 cepas aisladas

7/23/2019 73011197005.pdf

15/18



presentaron actividad antagnica, slo ocho mostraron un efecto diferente, despus de ajustar el pH enpara todos los tratamientos.

La Inhibicin de microorganismos ha sido atribuida; adems, a la acumulacin de los productos finalela fermentacin, como son: el cido lctico, el dixido de carbono, el perxido de hidrgeno y produccin de bacteriocinas de acuerdo a lo sealado por Lindgren y Dobrogoz (1990) (3) op. cit. resultados de este trabajo muestran que despus de exponer los sobrenadantes a la enzima catalasa pinhibir el perxido de hidrgeno, permiti su identificacin como la causa de inhibicin demicroorganismos indicadores, encontrando slo tres de los sobrenadantes de las cepas de BAL continuaron mostrando actividad antagnica despus de ajustar el pH y exponer los sobrenadantes accin de la catalasa, sugiriendo ampliamente la presencia de otras sustancias responsables de la inhibicposiblemente bacteriocinas, las cuales fueron identificadas posteriormente al exponer los sobrenadantesaccin de enzimas proteolticas.

De acuerdo a los resultados observados, la actividad antagnica de las BAL, se manifest en contra debacterias Gram+Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureusy Streptococcusgrupo beta hemolticmicroorganismo Gram- fue Salmonella agona, no se observ inhibicin en su desarrollo, en donde se pcorroborar que las BAL actan preferentemente en contra de bacterias Gram+, como afirma Klaenha(1998) (13) op. cit.

Tambin se encontr, que la presencia de las BAL es necesaria para inhibir a los patgenos indicadoreeste estudio, al probar los sobrenadantes libres de BAL, el efecto antagnico no se manifest, este efectpuede atribuir a la capacidad de las BAL para adaptarse al medio y/o a la presencia de dixido de carbno permitiendo el desarrollo de otros microorganismos, como lo sealan Lindgren y Dobrogoz (1990)op. cit.

Las perspectivas para la aplicacin de las BAL o de la produccin de bacteriocinas en la industria dealimentos son prometedoras, debido al inters de utilizar conservadores biolgicos como lo demandanconsumidores y por el inters de los industriales de emplear estas sustancias como una biotecnolrelativamente econmica, factible de aplicarse a diversos alimentos que requieren de procesosfermentacin, al reconocer que es necesario apoyar ms investigaciones para superar los problemas de legal, para su aplicacin.

Ennhar y col. (1996), (24) op. cit. aislaron 1962 cepas de BAL a partir de 362 muestras de queso Munster, El sobrenadante se prob en contra de diferentes bacterias Gram+ (Listeria monocytoge

Lactobacillus sp, Enterococcus sp, Micrococcus sp, Staphylococcus sp y Bacillus sp)y Gram- (Salmon

sp, Pseudomona sp, y E. coli), inhibiendo el crecimiento de las Gram+ y no a las Gram-.Observando que los efectos antagnicos en contra de L. monocytogenes, en la mayora de los casosdebido a la disminucin en el pH, por la produccin de cidos orgnicos. Slo seis de los sobrenadantecultivos, (tres Lactobacillus, dos Enterococcus y un Lactobacillus) presentaron actividad en contra dmonocytogenespor la accin de sustancias antibacterianas diferentes a los cidos orgnicos.

La capacidad antagnica del extracto no fue inactivado en presencia de catalasa, excluyendo quinhibicin fuera producida por la presencia de perxido de hidrgeno; sin embargo, el extracto

7/23/2019 73011197005.pdf

16/18



inactivado por las enzimas proteolticas pepsina, tripsina, alfa quimiotripsina, determinando que la sustainhibidora es de naturaleza proteica y no fue inactivada en presencia de alfa amilasa y lipasa, determina

que la inhibicin no se debe a la accin de carbohidratos o lpidos.

Los resultados obtenidos en el presente estudio, son similares a los sealamientos de los obtenidos Ennhar y col. (1996), (24) op. cit. de las 25 cepas aisladas que mostraron actividad antagnica en contrlos microorganismos patgenos indicadores, slo ocho mostraron inhibicin diferente al pH y acumulacin de perxido de hidrgeno. Tambin en el presente estudio los sobrenadantes de las Bfueron inactivados por la accin de enzimas proteolticas, lo que permite considerar que el factor inhibies de naturaleza proteica.

7/23/2019 73011197005.pdf

17/18



Referencias

1.- Mateos, J.A. (2002). Aspectos Bsicos de la Tecnologa de las Leches Fermentadas. En AlimeFuncionales. Probiticos. [R.M. Ortega, A. Marcos, J. Aranceta, J.A. Mateos, A.M. Requejo, L. Serra.]Mdica Panamericana. Cap. 6.2.- Torres, V.R. (1999). Flora Intestinal, Probiticos y Salud. Ed. Grfica Nueva. Mxico.3.- Lindgren, S.E. and Dobrogoz, W.J. (1990). Antagonic activities of Lactic Acid Bacteria in Food Feed Fermentation. FEMS. Microbial. Rev. 87, 149-164.4.- Carrasco, M.S., Scarincini, H.E. and Simonetta, A.C. (2002). Antibacterial Activity of Lactic Abacteria Isolated from Argentinian Dairy Products. The Australian Journal of Dairy Technology. VolNo. 1, 15-19.5.- Campos, J.A. (2002). Cultivos Probiticos y Protectores, Propiedades Funcionales (Nutraceuticas

Valor Agregado en los Derivados Lcteos. Lcteos y Crnicos Mexicanos. Jun/Jul 26-37.6.- Nes. I.F. and Jhonsborg, O. (2004). Exploration of antimicrobial potential in LAB by genomics. COpin. Biotechnol. 15, 100-104.7.- Vanderbergh, P.A. (1993). BAL Their Metabolic Products and Interference with Microbial GroFEMS. Microbiol. Rev. 12: 221-237.8.- Stiles, M.E. (1996). Biopreservation by lactic acid bacteria. Antonie van Leeuwenhoeck. 70: 331-3459.- Hoover, D.G. and Stenson, L.R. (1993). Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria. Academic Press Inc. U10.- Cleveland, J. Montville, T.J., Nes, I.F., Chikindas, M.L. (2001). Bacteriocins: Safe, NatAntimicrobials for Food Preservation. International Journal of Food Microbiology. 71: 1-2011.- Luders, T., Birkemo, G.A., Fimland, G., Nissen-Meyer, J. and Nes, I.F. (2003). Strong synbetween a eukaryotic antimicrobial peptide and bacteriocins from lactic acid bacteria. Appl. EnvMicrobiol. 69, 1797-1799.

12.- Masschalck, B., Deckers, D. and Michiels, C.W. (2003). Sensitization of outer- membrane mutanSalmonella typhimurium and Pseudomona aeruginosa to antimicrobial peptides under high pressurFood Prot. 66, 1360-1367.13.- Klenhamer, T.R. (1988). Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria. Biochimic. 70: 337-349.14.- Sablon, E.B., Contreras and Vandame, E. (2000). Antimicrobial peptides of Lactic Acid Bacteria: mof action, Genetic and Biosynthesis. In advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. [Th. ScheSpringer-Verlag.15.- Klenhamer, T.R. (1993). Genetics of bacteriocin produced by lactic acid bacteria. FEMS. MicrobRev, 12: 39-86.16.- Nes. I.F., Diep, D.B., Havarstein, L.S., Brurberg, M.I., Eijsink, V. and Holo, H. (1996). Biosynthesibacteriocins in lactic acid bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek. 70 (2) 113-128.

17.- Xie, L. and van der Donk, W. A. (2004). Post-translational modifications during lantibbiosynthesis. Curr. Opin. Chem. Biol. 8, 498-507.18.- Pag, U. and Sahl, H.G. (2002). Multiple activities in lantibiotics models for design of nantibiotics? Curr. Pharm. Des. 8, 815-833.19.- Diep, D.B. and Nes, I.F. (2002). Ribosomally synthesized antibacterial peptides in Gram posbacteria. Curr. Drug Target. 3, 107-122.20.- van Belkum, M.J. and Stiles, M.E. (2000). Nonlantibiotic antibacterial peptides from lactic bacteria. Nat. Prod. Rep. 17, 323-335.

7/23/2019 73011197005.pdf

18/18



21.- Cox, C.R., Coburn, P.S. and Gilmore, M.S. (2005). Enterococcal cytolisyn: a novel two compopeptide system that serves as a bacterial defense against eukaryotic and prokaryotic cells. Curr. Protein P

Sci. 6, 77-84.22.- Ramnath, M., Arous, S., Gravesen, A., Hastings, J.W. and Hechard, Y. (2004). Expression of mptListeria monocytogenes induces sensitivity to class IIa bacteriocins in Lactococcus lactis. Microbiol150, 2663-2668.23.- Kawai, Y., Kemperman, R., Kok, J. and Saito, T. (2004). Structural and functional differences in cyclic bacteriocins whit the same sequences produced by lactobacilli. Appl. Environ. Microbiol. 70, 22911.24.- Ennhar, S., Aoude-Wermer, D., Sorokine, O., Van Dorseelaer, A., Bringel, F., Hubert, J.C. Haseselman, C. (1996). Production of Pediocin AcH by Lactobacillus plantarumWHE 92 Isolated FCheese. Applied and Enviromental Microbiology. Dec. P4381-4387. American Society for Micrbiology25.- Ennahar, S., Assobhel, S. and Hasselmann, C. (1998). Inhibition ofListeria monocytogenes in a SmSurface Soft Cheese by Lactobacillus plantarum WHE 92 a Pediocin AcH producer. Journal of FProtection. 61: 186-191.26.- Wan, J., Harmark, K., Davidson, B.E., Hillier, A.J., Gordon, J.B., Wilcock, A., Hickey, MCoventry, M. J. (1997). Inhibition ofListeria monocytogenes by piscicolin 126 in milk and Camemcheese manufactured with a thermophilic starter. Journal of Applied Microbiology. 82 (3) 273-280.27.- Mcauliffe, O., Hill, C., Ross, R.P. (1999). Inhibition of Listeria monocytogenes in cotagge chmanufactured with a lacticin 3147- producing starter culture. Journal of Applied Microbiology. 86 (2251-256.28.- Laukov, A., Czikkov, S. (1999). The use of enterocin CCM4231 in soy milk to control the growt

Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus.Journal of Applied Microbiology. 87 (1) pp 182-1829.- Davidson, CH.M. and Cronin, F. (1973). Medium for the Selective Enumeration of Lactic ABacteria from Foods. Applied Microbiology. American Society for Microbiology. Sept 1973. 439-440.

30.- Galliano, V.J. and Hinsdill. (1970). Characterization of a Staphylococcus aureus bacteriocinBacteriol. 104: 17-125.31.- Gratia, A. (1946). Techniques Selectives Pour la Reacherche Sistematique des Germes AntibiotiqC.R. Seances Soc. Biol. Pars. 140: 1053-1055.

Documents

73011197005.pdf