Clase 1Ingenierade EnzimasJoo Ricardo Cerqueira Pinto(2007)Clase
2Programa I UNIDAD: Introduccin Propiedades, actividad y
nomenclatura II UNIDAD: Produccin de enzimas Produccin, extraccin y
purificacin III UNIDAD: Inmovilizacin de enzimas Sistemas de
inmovilizacin, suportes y evaluacinPrograma IV UNIDAD: Biosensores
Tipos y aplicaciones V UNIDAD: Cintica enzimtica Variables, cintica
y efectos VI UNIDAD: Reactores enzimticos Diseo y reactores
idealesClase 3Evaluacin Certamen I - 40% Certamen II - 40% Tareas -
20%Si promedio>5.5 pueden optar por no hacer examen Nota
Presentacin Examen - 60% Examen - 40%Bibliografa BIBLIOGRAFA BSICA:
TECNOLOGA DE ENZIMAS, Gacesa, P. (1990). MANUAL DE BIOTECNOLOGA DE
ENZIMAS, Wiseman, A. (1991) BIBLIOGRAFA COMPLEMENTARIA: BIOQUMICA,
Mathews, C. K. (2002).Clase 4IntroduccinRESEA HISTORICA1850.
Estudios de Pasteur: Fermentaciones de azcar por una fuerza vital
en las clulas que llam de fermentos1897. Buchner: Fermentaciones
ocurran cuando se usaban clulas muertas descubierta de las enzimas
como entidades independientes de la clula1926. Summer cristaliza la
ureasa: se mostr que las enzimas son protenasSegunda mitad del
siglo XX: se purifican y caracterizan millares de enzimas, lo que
ha permitido conocer su mecanismo de accinClase 5Importancia de los
enzimas La medida de la actividad enzimtica en fluidos biolgicos o
tejidos es importante para el diagnstico de muchas enfermedades.
Muchas frmacos son inhibidores de la actividad enzimtica
Importancia en la industria de alimentacin y agricultura.Estructura
de las Enzimas Estructura Primaria Estructura Secundaria Estructura
Terciaria Estructura Cuaternaria Definida por la secuencia de
aminocidos en la cadena peptdica. En la naturaleza son usados 20
aminocidos en la construccin proteica Todos presentan la
conformacin del tipo L. Pueden ser divididos en no-polares,
polares, cargados y no-cargados. La distribucin de estos aminocidos
en la cadena define las propiedades funcionales de la enzimaClase
6Estructura de las EnzimasLigacin entre los aminocidosTabla con los
aminocidos y sus principales caractersticasAminocidos 3-Letras
1-LetraPolaridadde la cadena lateralCarga de la cadena lateral
Aminocidos 3-Letras 1-LetraPolaridadde la cadena lateralCarga de la
cadena lateralcido asprtico Asp D polar acido Isoleucina Ile I no
polar neutrocido glutmico Glu E polar acido Leucina Leu L no polar
neutroAlanina Ala A no polar neutro Lisina Lys K polar
basicoArginina Arg R polar base fuerte Metionina Met M no polar
neutroAsparagina Asn N polar neutro Prolina Pro P no polar
neutroCisteina Cys C polar neutro Serina Ser S polar
neutroFenilalanina Phe F no polar neutro Tirosina Tyr Y polar
neutroGlicina Gly G no polar neutro Treonina Thr T polar
neutroGlutamina Gln Q polar neutro Triptfano Trp W no polar
neutroHistidina His H polar base flaca Valina Val V no polar neutro
Estructura Primaria Estructura Secundaria Estructura Terciaria
Estructura CuaternariaEstructura de las Enzimas Estructura Primaria
Estructura Secundaria Estructura Terciaria Estructura
Cuaternariao-hlice Laminas-|Clase 7Estructura de las Enzimas
Estructura Primaria Estructura Secundaria Estructura Terciaria
Estructura CuaternariaEstructura terciaria de una cutinase de
Fusarium solani pisise muestran los aminocidos del centro activo
(Ser120-His188-Asp175)o-hliceLaminas-|Estructura de las Enzimas
Estructura Primaria Estructura Secundaria Estructura Terciaria
Estructura CuaternariaEstructura cuaternaria de la hemoglobina, que
es formada por cuatro cadenas polipeptdicas iguales (2 a rojo y 2 a
amarillo).Clase 8Propiedades de las Enzimas Estructura 3ariao
4ariaFuncin biolgica Intervienen en una gran cantidad de reacciones
del metabolismo de clulas, tejidos y rganos Catalizan reacciones
qumicas necesarias para la sobrevivencia celular: metabolismo de
los hidratos de carbono, protenas, aa, lpidos, cidos nucleicos,
etc. Las enzimas pueden actuar dentro de la clula , fuera de sta y
en el tubo de ensayoPropiedades de las Enzimas Las enzimas son
CATALIZADORES ORGANICOS Un catalizador aumenta la velocidad de
reaccin qumica Las reacciones qumicas requieren de energa externa
para ocurrir Esta energa externa se llama ENERGIA DE ACTIVACINClase
9Propiedades de las Enzimas La Ea de la hidrlisis de la urea baja
de 30 a 11 kcal/mol con la accin de las enzimas, acelerando la
reaccin 1014 x El aumento de temperatura necesario para producir la
reaccin no catalizada seria de 529CTiempo de la reaccinE + SE +
PSin enzimaCon enzimaAlgunos aumentos de actividad producidos por
el uso de enzimasPropiedades de las EnzimasClase 10Enzima vs
Catalizador Tanto la enzima como el catalizador aceleran la
velocidad de una reaccin qumica. Una enzima puede transformar 1000
molculas de sustrato/ segundo Las enzimas tienen 3 propiedades que
los catalizadores NO tienen: Especificidad por el sustrato Se
inactivan por desnaturacin Pueden ser reguladasActividad Enzimtica
Las enzimas se unen a los reactivos (sustratos) Cada enzima tiene
una forma nica con un sitio o centro activo en el que se une al
sustrato Despus de la reaccin, enzimas y productos se separan. Las
molculas enzimticas no han cambiado despus de participar en la
reaccinClase 11 Las enzimas cumplen su papel cataltico gracias a:
Fijacin estereoqumicamente complementaria del substrato
Transformacin cataltica del mismo En ambas funciones participan
algunos aminocidos de la cadena peptdica y, en algunas enzimas,
tambin los llamados cofactores (iones metlicos grupos
prostticos/coenzimas)Actividad EnzimticaEn la catlisis qumica se
distingue entre:- Catlisis homognea, cuando catalizador y
reactivosestn en la misma fase fsicoqumica: Por ejemplo,
lahidrlisis cida de la sacarosa.- Catlisis heterognea, cuando
catalizador y reactivosestn en distinta fase fsicoqumica: por
ejemplo, lareaccin en fase gaseosa entre N2y H2para formar
amonaco(proceso Haber), que es catalizada por metales (slidos)La
catlisis enzimtica tiene caractersticas de ambasActividad
EnzimticaClase 12Los siguientes hechos:- Especificidad de la
reaccin enzimtica- Carcter heterogneo de la catlisis
enzimticaLlevan a postular la existencia de un Centro Activo enla
molcula de enzima, capaz de:- Fijar especficamente al substrato-
Transformarlo catalticamente.Actividad EnzimticaEnzimaSitio
activoSustratoActividad EnzimticaClase 13
Complementariedadgeomtrica Complementariedad de cargas, uniones
inicas Modelos:Llave cerradura.Encaje inducidoLa unin del sustrato
es muy especfica:Actividad EnzimticaModelo de Llave y Cerradura
(Emil Fischer)Substrato y enzima se acoplan de forma
estereospecfica,de la misma manera que una llave se ajusta a su
cerradura.Modelo aceptado durante mucho tiempo; hoy se
considerainsuficiente al no explicar algunos fenmenos de la
inhibi-cin enzimticaActividad EnzimticaSubstratoEnzima Complejo
Substrato+EnzimaClase 14Modelo de Ajuste Inducido (Koshland)Tanto
la enzima como el substrato sufren una alteracinen su estructura
por el hecho fsico de la unin.Est mucho ms de acuerdo con todos los
datos experimen-tales conocidos hasta el momento.SubstratoEnzima
Complejo Substrato+EnzimaActividad EnzimticaUna enzima puede unir
mas de un sustrato en su sitio activo (ej. cofactor)ADP + PEP ATP +
PIRUVATOCOMPLEJOENZIMA-SUSTRATOEnzima + sustratosEnzima +
productosActividad EnzimticaClase 15Una enzima puede unir dos
sustratos en su sitio activoActividad EnzimticaCmo ocurre la
catlisis enzimtica?: proteasa, rompe enlaces
peptdicosENZIMASUSTRATOQuimotripsinaActividad EnzimticaClase 16El
perfecto plegamiento de la enzima permite la catlisisSitio activo
de la QuimotripsinaActividad EnzimticaEC 2.7.1.1Nmero Enzyme
Commission:EnzymeComissionGrupoSubgrupoNombre comn (sustrato+asa):
HexokinasaClasificacin y nomenclaturaATP: hexosa
fosfotransferasaNombre sistemtico: Donador AceptorGrupo
transferidoTipo de reaccin catalizadaGrupos qumicosEnzimasClase
17EC 1.x OxidorreductasasEC 2.x TransferasasEC 3.x HidrolasasEC 4.x
LiasasEC 5.x IsomerasasEC 6.x LigasasClasificacin de enzimas por
GruposClasificacin y nomenclaturaGrupo 1: OxidorreductasasCatalizan
reacciones de oxidorreduccin, en que tomos de oxigeno hidrogeno son
trasladados entre molculas:En las reacciones redox, siempre tienen
que estar presentes a la vez el aceptor y el dador electrnico.AH2+
B A + BH2Clasificacin y nomenclaturaAred+ BoxAox+ BredClase
18Nombre:Dador:Aceptor oxidorreductasaNombre comn:Glucosa
oxidasa|-D-Glucosa : O21-oxidorreductasaDador AceptorEC
1.1.3.4Clasificacin y nomenclaturaGrupo 1:
OxidorreductasasTNomenclatura del subgrupo en oxidorreductasas:EC
1.1.x - DeshidrogenasasEC 1.2.x - OxidasasEC 1.3.x - PeroxidasasEC
1.4.x - OxigenasasEC 1.5.x - HidroxilasasEC 1.6.x -
Reductasasetc.Clasificacin y nomenclaturaGrupo 1:
OxidorreductasasAplicaciones: Ensayos de diagnostico clnico
(glucosa oxidase y colesterol oxidaseDeslignificacin
BioblanqueamientoClase 19Grupo 2: TransferasasCatalizan reacciones
de transferencia de tomos grupo de tomos entre molculas:A-X + BA +
B-XDador: Aceptor Grupo transferido - transferasaATP: D-Hexosa
Fosfotransferasa EC 2.7.1.1Nombre comn: hexokinasaClasificacin y
nomenclaturaClasificacin de subgrupo de las transferasas:EC 2.1.x-
Grupos monocarbonadosEC 2.2.x- Grupos aldehido o cetoEC 2.3.x-
AciltransferasasEC 2.4.x- GlicosiltransferasasEC 2.5.x- Alquil- o
AriltransferasasEC 2.6.x- Grupos nitrogenadosEC 2.7.x- Grupos
fosfatoEC 2.8.x- Grupos sulfatoEC 2.9.x- Grupos selenioClasificacin
y nomenclaturaGrupo 2: TransferasasAplicaciones: Sntesis de
oligosacridosClase 20Grupo 3: HidrolasasCatalizan reacciones de
hidrlisis y tambin su reverso. Son las ms comunes en el dominio de
la tecnologa enzimtica:A-B + H2O A-OH + H-BNo se suelen utilizar
nombres sistemticos en lashidrolasas. Muchas de ellas conservan el
nombreprimitivo: Quimosina EC 3.4.23.4.Clasificacin y
nomenclaturaClasificacin de las hidrolasas:3.1.-.- Esterasas
(carboxilesterasas, fosfoesterasas, sulfoesterasas)3.2.-.-
Glicosidasas3.3.-.- ter hidrolasas3.4.-.- Pptido hidrolasas3.5.-.-
Acil anhdrido hidrolasasetc. Grupo 3: HidrolasasClasificacin y
nomenclaturaAplicaciones: Lipasas Sntesis de tensioactivosProteasas
Fabrico de quesosGlicosidasas Clarificacin de jugos; liberacin de
aromas en los vinos; aplicaciones textilesClase 21Caso particular
Pptido hidrolasas: clasificacin comn (no sistemtica)I. Segn la
situacin del enlace atacado:- Exopeptidasas (extremos de la cadena)
(Peptidasas)- Endopeptidasas (interior de la cadena)
(Proteinasas)II. Segn el mecanismo cataltico:- Serin proteinasas-
Tiol proteinasas- Aspartil proteinasas- MetaloproteinasasGrupo 3:
HidrolasasClasificacin y nomenclaturaGrupo 4: LiasasCatalizan
reacciones reversibles de remocin de grupo de tomos del sustrato
(este grupo no incluye las hidrolasas): A-B A + BClasificacin y
nomenclaturaEjemploNombre sistemtico:Histidina amonio-liasa (EC
4.3.1.3)Nombre comn:HistidaseClase 22Clasificacin de las
liasas:4.1.x- Actan sobre enlaces C-C4.2.x- Actan sobre enlaces
C-O4.3.x- Actan sobre enlaces C-N4.4.x- Actan sobre enlaces
C-S4.5.x- Actan sobre enlaces C-Halide (S-, Cl-, Br-, I-At-)4.6.x-
Actan sobre enlaces P-O4.99.x - Otras liasesClasificacin y
nomenclaturaAplicaciones: Pectato liasa Remueve los compuestos
indeseables (ceras, pectinas, protenas) en fibras en la industria
textil bioscouringGrupo 4: LiasasGrupo 5: IsomerasasCatalizan
reacciones de isomerizacin molecularesClasificacin y nomenclaturaA
BEjemplo:Glucosa isomerasa (EC 5.3.1.5)Clase 235.1.x- Rasemasas y
Epimerasas5.2.x- cis-Trans-Isomerasas5.3.x- Oxidoreductasas
Intramolecular5.4.x- Transferasas Intramoleculares (mutases)5.5.x-
Liasas Intramoleculares5.99.x- Otras IsomerasasGrupo 5:
IsomerasasClasificacin y nomenclaturaClasificacin de las
isomerasas:Grupo 6: LigasasCatalizan la unin de dos grupos qumicos
a expensasde la hidrlisis de un nucletido trifosfato (ATP, GTP,
etc.).A + B + ATP A-B + ADP + PiClasificacin y nomenclaturaEjemplo:
Glutationa sintasa (EC 6.2.2.3)Nombre
sistmico:G-L-glutamilo-L--cisteina:glicina ligaseClase 24Grupo 6:
LigasasClasificacin y nomenclaturaClasificacin de las
ligasas:6.1.x- Forman enlaces C-O6.2.x- Forman enlaces C-S6.3.x-
Forman enlaces C-N6.4.x- Forman enlaces C-C6.5.x- Forman enlaces
steres fosfricos6.6.x- Actan sobre enlaces N-metalClasificacin y
nomenclaturaPara ms informacin sobre la clasificacin, acceder
a:http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/Clase 25Produccin de
enzimasProduccin de EnzimasUn preparado enzimtico comercial
contiene: Enzima de inters Otras protenas (contaminantes)
Excipientes PreservantesEl criterio tradicional de produccin ha
sido obtener la mnima pureza en el preparado, de acuerdo a la
utilizacin del preparado Menor costo de operacinClase 26Esto tiende
a cambiar debido, por un lado, al elevado desarrollo de la
industria, por otro, a una mayor demanda de pureza en los
preparados enzimticosEn aplicaciones mdicas y analticas el criterio
es distinto, debido a la naturaleza de las aplicaciones de eses
mismos preparados, que tienen de poseer una elevada pureza.Las
enzimas son producidas a partir de clulas (animales, vegetales
microorganismos), sendo estas el nico recurso para su
obtencin.Produccin de EnzimasProduccin de EnzimasEsquema general de
produccin de enzimas:Inculo NutrientesTejidoResiduo
SlidoEstabilizantesPreservantesExcipientesProducto LiquidoProducto
Slido123456a 6b 6c78 8Leyenda1 Reactor2,4 Separacin slido-liquido3
Extraccin5 Concentracin 7 Secado6 Purificacin 8 Mezclado25Enzima
Extracelular234 Enzima IntracelularClase 27Produccin de EnzimasDel
esquema se pueden observar 4 etapas:1) Generacin produccin: por
fermentado, en el caso de enzimas microbianas, produccin
agropecuaria cultivo in vitro en lo caso de enzimas de tejidos2)
Recuperacin: separacin, concentracin y extraccin3) Purificacin:
varia segn el tipo de catalizador enzimtico y puede incluir varias
etapas4) Formulacin: acabado y normalizacin del producto
enzimticoProduccin de EnzimasAlgunas enzimas de origen animal aun
son producidas, debido a que las tentativas para reemplazarlas por
enzimas microbianas han sido hasta hoyinfructferas. Ej. Renina,
para la produccin de quesos.Las enzimas vegetales son en gran parte
producidas como subproductos de la actividad agrcola. Ej. Papaina,
extrada del ltex del papayo.Vamos a hablar solamente de enzimas
microbianas debido a su mayor importancia biotecnolgica.Clase
28Produccin de EnzimasLa tecnologa de propagacin de clulas
microbianas, bajo condiciones controladas, se encuentra en un alto
grado de desarrollo.Esta es una rea fundamental de la ingeniera de
bioprocesos.De una perspectiva comercial, las bacterias, hongos
filamentosos y las levaduras son los microorganismos ms usados en
la produccin de enzimas comercialesCrecimiento microbianoLa clula
es una compleja maquinaria que transforma nutrientes en: Masa
celular Productos extracelulares (ej. protenas) Metabolitos
terminales (CO2y H2O en metabolismo aerobio)Las enzimas comerciales
son producto del metabolismo aerobio y, por general, cumplen una
funcin catablica.Clase 29Crecimiento microbianoCurva tpica de
crecimiento: Fase latenciaFase de crecimiento rpidoFase
estacionariaFase Latencia:Adaptacin del microorganismo al medio de
cultivo, involucra la induccin o represin de enzimasFase de
crecimiento rpido:El microorganismo se reproduce a la velocidad
mximaFase estacionaria:La replicacin celular se detiene, debido a
que las velocidades de crecimiento y muerte se equilibran. Se
produce por agotamiento de un nutriente, acumulacin de un metablico
toxicoCrecimiento microbiano En la fase de crecimiento el
microorganismo se reproduce por una cintica que depende del
mecanismo de replicacin celular Las bacterias, con reproduccin por
fisin binaria, o las levaduras, con reproduccin asexuada por
yemacin, de una clula origina dos, crecimiento que puede ser
descrito por las siguientes expresiones:2 ln te X XX dtdXDt 0= =
=LeyendaX concentracin celularT tiempo velocidad especifica de
crecimientotD tiempo de duplicacin celularClase 30Crecimiento
microbianoComo el crecimiento es exponencial, se llama tambin a la
fase de crecimiento rpido como crecimiento exponencialLos
microorganismo filamentosos, por se replicaren por crecimiento
apical, no necesariamente siguen un crecimiento exponencial, sendo
ms frecuente las cinticas de tipo parablico e incluso lineal. Pero
se podrn ocupar y tDcomo una aproximacin.En la fase estacionaria,
las velocidades de replicacin y muerte alcanzan un equilibrio
dinmico. Esta ocurre por agotamiento de un nutriente acumulacin de
un metabolito txico.Produccin de metabolitosLos productos del
metabolismo microbiano se pueden calificar como: Metabolitos
primarios relacionados con el crecimiento celular Metabolitos
secundarios no se encuentran vinculados con la replicacin
celularClulasMetabolito primarioMetabolito secundarioClase
31Produccin de metabolitosLas enzimas, como agentes metablicos,
sern metabolitos primarios secundarios dependiendo de su funcin
metablica.La mayora de las enzimas comerciales son degradativas,
asociadas al catabolismo, luego tienen un carcter de metabolito
primario. Pero con cambios de la composicin del medio de cultivo,
pueden producirse enzimas catalticas total parcialmente disociadas
del crecimiento.Produccin de metabolitosExisten varios modelos que
describen la cintica de produccin de metabolitos por fermentacin,
pero por su simplicidad y validez se destaca la siguiente:X
BdtdXAdtdp + =Produccin asociada al crecimiento, metabolito
primarioProduccin no asociada al crecimiento, metabolito secundario
Metabolito Primario:B0 Metabolito secundario: A 0 Situacin ms
frecuente en la practica: A0 y B 0 (ej. o-amilasa de Bacillus
subtilis)Clase 32Controles sobre sntesis enzimticaLa clula
microbiana es una eficiente fabrica de produccin de compuestos, que
logra por control, al nivel enzimtico, sobre las reacciones
bioqumicas del metabolismo.Existen dos tipos principales de control
en la produccin de enzimas comerciales: Induccin Represin
catablicaControles sobre sntesis enzimticaEnzimas, denominadas
inducibles, son solo sintetiza-das en respuesta a un estimulo
ambiental (inductor).El inductor ligase a la protena represora,
imposibili-tando que ella se acople a los genes que codifican la
enzima, luego permitiendo su sntesis.Norma general: la induccin
permite el ajuste rpido para el uso de sustratos
metabolizables.Ejemplo: la produccin de |-galactosidasa es
inducible en la presencia de un azcar de tipo |-galactsido (ej.,
lactosa) InduccinClase 33Controles sobre sntesis enzimticaLa
presencia de un sustrato en el medio, reprime la ruta
catablica/sinttica de su metabolismo.Regla general: a represin
permite el ajuste para la sntesis de una sustancia que interviene
como intermediario metablico.Ejemplo: la E. coli crece en la
ausencia de triptfano (lo sintetiza), pero su presencia en el medio
inhibe su biosntesis.Represin CatablicaControles sobre sntesis
enzimticaEstos controles son usados por las clulas para hacer un
uso eficiente de sus recursos, evitando la acumulacin de
metabolitos especficos.Como el objetivo es sobreproducir una/varias
enzima(s), es necesario alterar estos controles.Esto se logra por
manipulaciones ambientales (ej. medio de cultivo) genticas.Clase
34Controles sobre sntesis enzimticaPor manipulacin gentica se
pueden obtener cepas que: no produzcan la protena represora, luego
no necesiten del inductor para producir la enzima pretendida; sean
insensibles a la presencia de determinados sustratos, produciendo
la enzima sin su represin; tengan una permeabilidad alterada, lo
que permitir la excrecin al medio de enzimas normalmente
intracelulares; tengan varias copias de un mismo gene que codifica
la enzima pretendida, permitiendo as su sobreexpresin.Diseo de
medios de cultivoEl medio de cultivo es la principal manipulacin
ambiental que se puede efectuar.Este debe proporcionar los
nutrientes necesarios al crecimiento del microorganismo y produccin
de la enzima deseada.Como base inicial del diseo se puede
considerar la composicin elemental del microorganismo a
utilizar.Clase 35Diseo de medios de cultivoBacterias
LevadurasHongos filamentososCarbono 45-52 45-52 45-5Nitrgeno 10-14
6-9 4-7Hidrgeno 10 10 10Oxgeno 20 20 20Azufre 0.2-1 0.05-0.3
0.1-0.5Fsforo 2-3 0.8-2.5 0.5-4.5Magnesio 0.1-0.5 0.1-0.5
0.1-0.7Composicin elemental de los microorganismos (%)Diseo de
medios de cultivoAs, las cantidades estarn relacionadas con la
cantidad de clulas final pero tambin con la cantidad de metabolitos
extracelulares (enzimas) que se desean producir.Adems, es adecuado
considerar el rendimiento de nutriente en clulas (YX/S), que es
definido como la cantidad de biomasa producida (X) por unidad de
masa de sustrato consumido (S).Clase 36Diseo de medios de cultivo
El tpico es considerar el sustrato como siendo la fuente de
carbono, pues este normalmente usase como el factor nutricional
limitante, estando los restantes elementos en exceso. IMPORTANTE:
no todo el carbono ser utilizado para produccin de biomasaDiseo de
medios de cultivo En fermentaciones parte ser libertado como CO2,
donde entre un 50 a 60% del carbono suministrado a una fermentacin
aerbica ser convertido a biomasa.preferible utilizar valores
experimentales de YX/S, del microorganismo a utilizar En el caso de
produccin de enzimas extracelulares, es necesario disponer de datos
del coeficiente de rendimiento de nutrientes en producto (YP/S).
Estos valores se pueden obtener experimentalmente , tericamente,
por balances de materia (menos precisos).Clase 37Diseo de medios de
cultivo Los nutrientes normalmente utilizados son: Carbono: usar un
carbohidratos que ingrese a las vas metablicas centrales,
generalmente es la glucosa Nitrgeno: usualmente administrado como
un sal de amonio Elementos de menor importancia cuantitativa:
proporcionados como sales inorgnicos Algunos de estos elementos
pueden ser de especial relevancia, como sean cofactores (Ca++,
Co++) de las enzimas a producir Puede ser necesario, dependiendo
del microorganismo, suministrar ciertos compuestos especficos (ej.
vitaminas, aminocidos, etc.) Hidrgeno: suministrado por en agua y
la fuente de carbono. Oxigeno: igual que el hidrgeno pero tambin
por el burbujeo de aire en el medio de cultivo.Diseo de medios de
cultivo En procesos industriales es normal el empleo de sustancias
complejas naturales (melaza, suero de leche, etc.), por ser ms
econmico, al revs de compuestos qumicos definidos. Esto agrega un
factor de incertidumbre al proceso, pero el principio bsico del
diseo se mantiene. En el caso de fermentaciones aerbicas, usual en
produccin de enzimas, el suministro de oxigeno es de gran
importancia, pudiendo tornarse en el factor limitante,
especialmente en situaciones industriales de gran escala.Clase
38Diseo de medios de cultivo El oxigeno es transferido hacia la
clula por aireacin y agitacin del cultivo. Es utilizado un difusor
para que sean producidas pequeas burbujas que son adems
fragmentadas y dispersadas por un agitador de elevado esfuerzo de
corte, para si obtenerse una elevada rea de transferencia entre el
gas y el liquido. La demanda de oxigeno de un cultivo es dada
por:XOAYXN2= Diseo de medios de cultivo La transferencia de oxigeno
en el liquido es dada por:( )L L AC C a K N =* Igualando,( )L LXOC
C a KYX =*2Clase 39Diseo de medios de cultivo La capacidad de
transferencia de oxgeno en fermentadores es por lo general baja,
debido a al bajo gradiente de la concentracin de oxigeno (C*-CL),
por consecuencia de la baja solubilidad del O2en agua (7-9 mg/mL)
El valor de kLa est determinado por el diseo y condiciones de
operacin del fermentador. Existen numerosas correlaciones empricas,
la mayora son de la forma:I |.|
\| = N VVPgK a kS L|oDiseo de medios de cultivo Estas ecuaciones
permiten estimar cual la mxima concentracin de clulas que se puede
tener, hasta que se produzca limitacin por oxigeno.Clase 40Sistemas
de cultivo La produccin de enzimas puede realizarse en una
modalidad de: Fermentacin superficial Fermentacin
sumergidaEsencialmente por lotesPor lotesPor lotes alimentadosEn
forma continuaSistemas de cultivo El cultivo superficial presenta
dificultades de control operacional y, en ocasiones, severos
problemas de contaminacin. Pero ofrece importantes ventajas: mejor
transferencia de oxigeno y recuperacin del producto. La principal
tecnologa es la fermentacin en estado slido. Se aplica para
producir a escala comercial celulasa, amilasa fngica, pectinasa,
proteasa fngica y lipasa.Clase 41Sistemas de cultivo El cultivo
sumergido por lotes es an el sistema ms empleado en la produccin de
enzimas. Como la cintica puede ser asociada no al crecimiento
microbiano, es fundamental conocerla para cosechar el cultivo en el
punto de mayor actividad. Adems, algunas enzimas son inestables
despus de su etapa de produccin, lo que implica su colecta luego
despus de su produccin.Sistemas de cultivo Es frecuente tener que
hacer un compromiso de las variables T y pH entre crecimiento y
produccin ptimos. Esto debido a que los valores no son
coincidentes. La produccin de celulasa de Trichoderma reesei en
medio de cultivo celulsico, tiene un pH ptimo de crecimiento de
4.8, y un ptimo de produccin a pH 3.5. Esto se resuelve trabajando
en condiciones intermedias (pH 4.0 a 4.5 en este caso), haciendo
alteraciones programadas (permiti incrementos importantes en la
productividad).Clase 42Sistemas de cultivo En enzimas no asociadas,
es posible hacer el cultivo en dos etapas: una de crecimiento y
otra de produccin, ajustando las variables a los ptimos de cada
etapa. El nivel de oxigeno disuelto tambin puede afectar la
produccin de enzimas, adems de la velocidad de crecimiento del
cultivo. En algunos casos, una moderada limitacin de oxigeno
favorece la produccin de enzimas (ej. penicilina acilasa de E.
coli).Sistemas de cultivo Una variante del cultivo por lotes es el
sistema por lotes alimentados:1 Etapa: por lotes2 Etapa: con
alimentacin continua hasta el volumen final deseado Esta
modalidades la de mayor uso a nivel de produccin industrial de
metabolitos.Clase 43Sistemas de cultivo Esta modalidad presenta
ventajas claras, con relacin al por lotes, en trminos de ejercer
algn control sobre la velocidad especfica de crecimiento del m.o.
Esto se logra manipulando la alimentacin, lo que permite controlar
la disponibilidad de nutrientes en el reactor. La modalidad resulta
adecuada para la produccin de metabolitos: secundarios (ej.
penicilina) primarios por cepas auxotrficas (ej. lisina) sujetos a
inhibicin por alta concentracin de sustrato (ej. etanol) sujetos a
represin catablica por sustratos altamente metabolizables
:ImportanteSistemas de cultivo El cultivo continuo es un sistema en
el cual se mantiene la poblacin microbiana en etapas de crecimiento
por periodos prolongados. Cuando operado en estado estacionario, el
cultivo se mantendr en un estado fisiolgico definido, que puede ser
aquel de mxima productividad, con respecto al metabolito de inters.
En particular, se puede manipular la velocidad de crecimiento del
cultivo variando la velocidad de alimentacin.Clase 44Sistemas de
cultivo Haciendo un balance de clulas (X) en estado estacionario en
un fermentador de tanque agitado continuo:00= + = X XVFXVFdtdX Para
medio estril, tendremos X0=0: = = DVF As la velocidad de
crecimiento es igual a la taja de dilucin (D).Sistemas de cultivo
Ahora, un balance de sustrato (s), en las mismas condiciones, da:(
)( ) s s Y XX s s Y DYXsVFsVFdtdsSXSXSX = = =+ =0000 Clase
45Sistemas de cultivo Tambin es funcin de s. Segn el modelo de
Monod:1 max== + =Dk kss ksmxs ssmx Cuando D=mx, s tendr a s0(el
mximo posible) y X a cero, situacin conocida como lavado de
cultivo. Desta forma, la estabilidad del cultivo es muy precaria
para valores de D cercanos a mx .Sistemas de cultivo A pesar de su
uso como una importante herramienta para la investigacin bsica, su
aplicacin a nivel industrial es reducida, debido a: mayor
complejidad del equipo y su operacin, baja concentracin del
producto obtenido mayores costos de recuperacin, mayores peligros
de contaminacin, desarrollo de mutaciones, debido a los largos
periodos de operacin.Clase 46Sistemas de cultivo Resulta
interesante comparar la productividad del sistema (cantidad de
producto por unidad de tiempo y por unidad de volumen del
fermentador). As para el caso de clulas/metabolitos primarios,
asumiendo una cintica exponencial:Cultivo por Lotes:000000
0ln1ln1tXXs YtXXX XtX XPmxSXmxB+||.|
\|=+||.|
\|== Sistemas de cultivoCultivo Continuo:m m Cm CX D P X D P = =
;( ) X s s Y DSX = 01 =Dksmxs||||.|
\| = 10Dks Y D X DmxsSX Para obtener Dm,0) (=dDX D dClase
47Sistemas de cultivoCultivo Continuo:(((
||.|
\|+ =2101s kkDssmx m( ) s s Y XSX =01 =Dksmxs( ) | | ( )( ) |
|(((
+ + =+ + =021000210 0221ss k ksks Y Ps k k k s Y Xs s smxSX Cms
s sSX mSistemas de cultivoCultivo Continuo: Como es frecuente Ks
-O-> -NH2> -COO-> -OH >> -NH3+ La reacciones qumicas
que se pueden utilizar incluyen la acilacin, la alquilacin, la
diazotacin, la disulfuracin y la activacin a travs de sales de
metales de transicin.Sistemas de inmovilizacin Enlace
CovalenteInmovilizacin de enzimas Ejemplo de qumicos son la
carbodiimida y el glutaraldedo. Este ultimo es ampliamente
utilizado para, adems de inmovilizar enzimas a soportes, hacer el
entrecruzamiento entre las enzimas mezcladas con otras protenas
inertes, hasta se producir agregados insolubles de tamao
considerable. Se puede combinar la adsorcin con la formacin de
enlaces covalente, con lo que se obtiene un aumento sustancial de
la estabilidad del catalizador.Clase 78Sistemas de inmovilizacin
Enlace CovalenteInmovilizacin de enzimas Como ejemplo tenemos la
inmovilizacin de invertasa en quitina de camarn:Actividad
Inmobil.%Actividad Soluble Residual %Actividad perdida%Tiempo de
vida medio a 53C (dias)Adsorcin sin glutaraldehido (Glu)30 51 19
0.5Adsorcin despus del contacto entre Glu y la enzima.53 31 16
5.7Adsorcin despus del contacto entre Glu y el soporte71 21 8
26Sistemas de inmovilizacin Inclusin en matricesInmovilizacin de
enzimas En este mtodo, la enzima es contenida entre las cadenas de
una red polimrica, lo suficientemente compacta para retener la
enzima, pero capaz de permitir el libre flujo de reactantes. Esto
tiene la implicacin que solo es til este tipo de inmovilizacin
cuando se pretende procesar sustratos y productos de muy bajo peso
molecular.Clase 79Sistemas de inmovilizacin Inclusin en
matricesInmovilizacin de enzimas Este mtodo es ms adecuado para
inmovilizar clulas, donde el alginato de calcio es ampliamente
utilizado. Otros ejemplos de matrices son los geles de
poliacrilamida y el almidn. Estos presentan las desventajas de: ser
no regenerables, una baja estabilidad, tener pobres propiedades
mecnicas y severas restricciones difusionales.Sistemas de
inmovilizacin Retencin por membranasInmovilizacin de enzimas En
este tipo de sistemas la enzimas permanece libre el solucin,
separada del medio de reaccin por una membrana protectora que solo
permite el libre paso de los reactantes (sustrato/producto). Como
ejemplo, tenemos las membranas de ultrafiltracin y dilisis. Otro
mtodo consiste en la microencapsulacin, en la cual se produce una
reaccin de polimerizacin en la superficie de las gotas de solucin
enzimtica, dispersas en un solvente inmiscibles con agua, que
produce una delgada pelcula (nylon), casi sin restricciones
difusionales.Clase 80Carateristicas AdsorcinEnlace
covalenteInclusin en matricesRetencin por membranasPreparacin
Simples dificil dificil SimplesCosto bajo elevado moderado
elevadoFuerza de ligacin variable fuerte flaca fuerteLiberacin de
enzima si no si noAplicabilidad amplia selectiva amplia Muy
ampliaProblemas en la utilizacin elevados bajos elevados
elevadosEfectos de la matriz si si si NoRestricciones difucionales
no no si siProteccin microbiana no no si siInmovilizacin de enzimas
Principales caractersticas de los mtodos presentados:Parmetros de
inmovilizacinInmovilizacin de enzimas Hay dos parmetros a
considerar en la inmovilizacin: el rendimiento de inmovilizacin y
la capacidad de carga del soporte. El rendimiento de inmovilizacin
(RI) es dada por: Algunos autores usan:% 100 + +=EP ER EIEIRI%
100*+=EP EIEIRIEI Actividad inmovilizadaER Actividad residualEP
Actividad perdidaClase 81Parmetros de inmovilizacinInmovilizacin de
enzimas Ejemplo del rendimiento de inmovilizacin (%) de
glucoamilasa:Soporte Mtodo EI ER EP PRCelita Adsorcin 5 85 10
87Carbn ActivoAdsorcin 48 - 52 6Quitina Enlace covalente 22 55 23
47DEAE-celulosaEnlace inico 60 6 34 23PR Protena residual en
solucin despus de la inmovilizacinParmetros de
inmovilizacinInmovilizacin de enzimas La capacidad de carga (CC)
del soporte se define como la actividad cargada expresada en el
catalizador por unidad de peso seco del soporte (W), lo que viene
dada por: Ambos los parmetros, RI y CC, estn frecuentemente en
compromiso, es decir, para aumentar la CC se tiene que sacrificar
el RI y viceversa.WEICC =Clase 82Inmovilizacin de
clulasInmovilizacin de enzimas Este es un caso particular, en que
al contrario de se ocuparen las enzimas libres, se utilizan las
clulas para realizar las reacciones de catalice. En esto se
engloban distintos tipos de catalizadores, desde aquellos en que
las clulas retienen total parcialmente su funcionalidad metablica,
hasta aquellos en que las clulas han sido inactivadas reteniendo
slo la actividad residual de algunas enzimas. Esto evita la
extraccin y purificacin de la enzima intracelular, resultando en
catalizadores de bajo costo.Inmovilizacin de clulasInmovilizacin de
enzimas Como desventajas tenemos la perdida de especificidad de la
reaccin (mayores gastos en purificacin) y los problemas de
restricciones difusionales pueden tornarse severos. Los mtodos de
inmovilizacin son idnticos a los de las enzimas, tomando especial
relevancia los de inclusin en geles (alginato, poliacrilamida y K
carragenano).Clase 83BiosensoresIntroduccinBiosensores Que es un
biosensor? Es un aparato analtico que convierte respuestas
biolgicas en sgnales elctricos.Referenciaa) Biocatalizadorb)
Transductorc) Amplificadord) Procesadore) MonitorClase
84IntroduccinBiosensores Esta definicin sirve tanto para sensores
producidos utilizando enzimas o clulas, pero el enfoque que ser
dado ser con los biosensores empleando enzimas. Ellos representan
una campo en rpida expansin, con una estimacin de crecimiento anual
alrededor del 60%, debido principalmente a la industria de salud
(ej., diabetes biosensores para glucosa), pero tambin de la
industria alimentar (control de calidad) y monitoreo ambiental. El
campo de investigacin es amplio, involucrando la bioqumica,
bioreactores, qumica-fsica, electroqumica, electrnica y ingeniera
de software.IntroduccinBiosensores Un biosensor debe poseer al
menos algunas de las siguientes caractersticas:i. El biocatalizador
debe ser altamente especfico para el anlisis que se pretende, ser
estable a las condiciones normales de almacenamiento y presentar
una buena estabilidad al largo de varios ensayos.ii. La reaccin
debe de ser independiente de parmetros fsicos como agitacin, pH y
temperatura tanto cuanto sea manejable (mnimo de pre-tratamientos).
Si la reaccin involucra cofactores o coenzimas, estos deben estar
co-inmovilizados con la enzima.iii. La respuesta debe ser precisa,
reproducible y linear en un rango analtico til, sin necesidad de
dilucin o concentracin. Debe ser libre de interferencias
elctricas.Clase 85IntroduccinBiosensores Un biosensor debe poseer
al menos algunas de las siguientes caractersticas:iv. Si el
biosensor es para ser usado: en tcnicas invasoras en situaciones
clnicas: este debe ser minsculo y biocompatible, sin efectos txicos
o alrgicos. en fermentadores: deben ser esterilizables.v. El
biosensor completo debe ser barato, pequeo, porttil y capaz de ser
usado por operadores con solo alguna formacin tcnica.vi. Debe
existir mercado para el biosensorIntroduccinBiosensores La
respuesta biolgica es determinada por la membrana biocataltica que
produce la conversin del sustrato en producto. Las enzimas
inmovilizadas poseen una serie de ventajas que las hacen optimas
para los biosensores: pueden ser reutilizables, ms estables que las
libres y la inactivacin puede ser predicha y modelada por
mediciones regulares de estndares (permite re-utilizar un sensor
hasta 10.000 veces!!) Cuando la reaccin es limitada por la difusin
externa del sustrato, la velocidad de reaccin es independiente del
pH, temperatura, fuerza inica o inhibidores. Esto evita las
complicaciones de la utilizacin de muestras reales (ej. Medio de
fermentacin, sangre o urea). Esta limitacin puede ser estimulada
con la utilizacin de membranas permeables entre las enzimas y la
solucin a medir.Clase 86Tipos de biosensoresBiosensores El elemento
crtico en un biosensor es el transductor, que hace la conversin de
algn cambio fsico producido por la reaccin: Calor liberado (o
absorbido) por la reaccin (biosensores calorimtricos)
Modificaciones en la distribucin de cargas, produciendo un
potencial elctrico (biosensores potenciomtricos) Movimiento de
electrones produciendo una reaccin redox (biosensores
amperimtricos) Emisin de luz durante la reaccin o absorcin de luz
entre los reactantes y productos (biosensores pticos) Efectos
devido a la masa de los reactantes o productos (biosensores
piezo-electricos)Biosensores calorimtricosBiosensores Muchas
enzimas catalizan reacciones que son exotrmicas, sea, generan
calor. Algunos ejemplos de estas enzimas son:Sustrato EnzimaCalor
liberado,-AH (kJ.mole-1) ColesterolColesterol oxidasa 53
EsteresChemotripsina 4 - 16 GlucosaGlucosa oxidasa 80 Perxido de
hidrogeno Catalasa 100Penicilina G Penicilinasa 67Pptidos Tripsina
10 - 30Sacarosa Invertasa 20Urea Ureasa 61Acido Ureico Uricasa
49Clase 87Biosensores calorimtricosBiosensores Los cambios de
temperatura son normalmente determinados por termistores en la
entrada y salida de una pequea columna empacada contiendo enzimas
inmovilizadas, en un ambiente con temperatura constante. Los
termistores funcionan por cambio de su resistencia elctrica con la
temperatura. Este cambio se puede modelar segn Luego, una
disminucin en la resistencia elctrica (AR/R) es proporcional al
aumento de la temperatura (AT) multiplicado por una constante de
proporcionalidad (tpicamente -4%/C). TTBRRA ||.|
\| =A21Biosensores calorimtricosBiosensores La correlacin entre
la respuesta y la actividad enzimtica no es lineal. La sensibilidad
de estos sensores es, por el general, baja. Pero puede ser
incrementada acoplando varias reacciones que, individualmente,
agregan calor a la solucin. La principal ventaja de estos sensores
es su posible aplicacin a soluciones turbas o de color
intensa.Clase 88Biosensores potenciomtricosBiosensores Estos
sensores utilizan electrodos especficos para determinados iones, de
forma a traducir una reaccin biolgicaen un seal elctrico. Lo ms
simples consiste en enzimas inmovilizadas por retencin por una
membrana alrededor de un medidor de pH, donde la catlisis produce
absorbe iones de hidrogeno.Biosensores potenciomtricosBiosensores
Existen 3 tipos de electrodos que son usados en biosensores:
Electrodos de vidrio para cationes (ej. medidores de pH). Ejemplos:
glucosa oxidasa sobre D-glucosa, lipasa sobre lpidos neutros.
Electrodos pH de vidrio cubiertos con una membrana permeable
selectiva para CO2, NH3o H2S. La difusin de estos gases provoca un
cambio en el pH de una solucin entre la membrana y el electrodo.
Ejemplos: L-aminoacido oxidasa sobre L-aminoacido y ureasa (pH 7.5)
sobre urea (producen NH4+). Electrodos de estado slido, donde el
vidrio es sustituido por una membrana de un conductor de iones
especifico, hecha de una mescla de sulfito de plata y halido de
plata. til en la determinacin de I-en reacciones con peroxidasa
(consume H+).Clase 89Biosensores amperomtricosBiosensores Funcionan
por la produccin de una corriente cuando un potencial es aplicado
entre dos electrodos. El sensor ms simples en un ctodo de platina
en lo cual el oxigeno es reducido y un electrodo de referencia de
plata/cloruro de plata. Cuando un potencial de -0.6V, relativamente
al electrodo de Ag/AgCl, es aplicado al ctodo de platina, es
producida una corriente proporcional a la concentracin de oxigeno.
Una aplicacin tpica es la determinacin de la concentracin de
glucosa utilizando una membrana con glucosa oxidasa inmovilizada.La
reaccin resulta en una reduccin de la concentracin de oxigeno, que
es detectada por una reduccin de la corriente entre los
electrodos.Biosensores amperomtricosBiosensores La
corrienteproducida(i) es dada por:donde n son los electrones
transferidos, A la rea del electrodo , F es el Faraday y vAla
velocidad de reaccin. La velocidad de reaccin es tornada controlada
por la difusin por utilizacin de membranas externas. As la
corriente elctrica producida es proporcional a la concentracin del
analtico e independiente de ambas las cinticas enzimtica y
electroqumica.Av A F n i =Clase 90Biosensores pticosBiosensores El
cambio de la absorcin de luzentre los sustratos y productos de una
reaccinest ampliamente utilizada en tiras de test colorimtrico.
Estas son tiras de celulosa, no reciclables, impregnadas con
enzimas y sustratos. La ms comn es el control de diabetes en
monitoreo de sangre. Son incluidas la glucosa oxidasa, una
peroxidasa y un colorante (o-toluidina o tetrametilbenzidina). El
perxido de hidrgeno (resultante de la oxidacin de la glucosa) oxida
a su vez el colorante produciendo una color intensa. La color es
comparada conuna tabla de colores, donde se obtieneentonces una
concentracin de glucosa.Biosensores piezoelctricosBiosensores Los
cristales piezo-electricos (ej. quartz) vibran por la influencia de
un campo elctrico . Esta frecuencia de resonancia cambia con la
absorcin/desorcin de molculas de la superficie de cristales. Una
utilizacin simples de este tipo de transductor es un biosensor de
formaldehido, utilizando cristales de quartz con formaldehido
deshidrogenasa inmovilizada y que es sensible a formaldehido
gaseoso. Las principales desventajas son la interferencia que
produce la humedad atmosfrica y su aplicacin para la deteccin de
materiales en solucin.Clase 91Cintica EnzimticaIntroducinCintica
Enzimtica La cintica enzimtica es el anlisis cuantitativo del
efecto de cada uno de los factores que intervienen en la actividad
enzimtica, que se evala a travs de la velocidad de la reaccin
catalizada. Las variables ms importantes son: Concentracin de
enzima, sustratos y productos (incluyendoinhibidores y/o
activadores) pH Temperatura El estudio de la cintica enzimtica
presenta inters tanto del punto de vista: Bsico establecimiento de
modelos moleculares de la accinenzimtica Aplicado desarrollo de
expresiones matemticas para el diseo y operacin de reactores
enzimticosClase 92Actividad EnzimticaCintica Enzimtica Ella est
basada en la medicin de la velocidad de reaccin. As en la reaccin:
Se tendr: Como se observa en la figura, la velocidad de reaccin
(pendiente) disminuye continuamente a partir de un valor mximo
inicial. Esto se puede deber a: Desaturacin de la enzima con
sustrato, por disminucin de la concentracin del sustrato
Inactivacin de la enzima por su inherente inestabilidad Inhibicin
por el producto Desplazamiento del equilibrio, si la reaccin es
reversibledtdsdtdpv = =tPESPCintica EnzimticaActividad Enzimtica A
fin de normalizar la medicin de la actividad, se ocupa el valor de
la velocidad inicial de reaccin, donde eses factores son
despreciables. As, Esta velocidad inicial no se espera que sea
observada en un proceso enzimtico donde, debido a los elevados
tiempos de operacin, es razonable suponer que esos factores
ejercern su influencia.0 00 |.|
\| =|.|
\|= =t ttdtdsdtdpv aClase 93Cintica EnzimticaActividad Enzimtica
As esta actividad corresponde al mximo potencial catalticoque las
enzimas poseen para un determinado conjunto de condiciones
ambientales. Luego, estas deben ser consideradas en las expresiones
matemticas representativas del proceso enzimtico. Existen
situaciones (sustratos heterogneos) donde la velocidad inicial de
reaccin no es representativa del real potencial cataltico de la
enzima. Se asume que la velocidad inicial de reaccin es
proporcional a la concentracin de protena enzimtica. Cintica
EnzimticaMedicin de la Actividad Enzimatica Si el P o S son
fcilmente cuantificados analticamente, se puede ocupar la ecuacin
anterior. Si la enzima requiere de cofactores disociables,
entonces: Estos son generalmente fciles de cuantificar, por lo que
esta ecuacin es til en el caso de tales enzimas.dtdcodtdcov'=
=SPECoE CoEClase 94Cintica EnzimticaMedicin de la Actividad
Enzimatica Si ni el P ni el S son fcilmente detectables, se puede
recorrer a reacciones (enzimticas no) en serie que resultan en un
compuesto Z, fcilmente detectable: Luego: Esto solo es vlido si la
reaccin limitante es la que corresponde a la conversin de S en P,
siendo que las sustancias A y B (enzimas no) deben ser agregadas en
exceso al medio de reaccin.dtdzdtdpv = =SPX Z EABCintica
EnzimticaMedicin de la Actividad Enzimatica Un aspecto fundamental
del anlisis de la actividad enzimtica es el empleo de un blanco o
testigo adecuado, que tiene por objetivo descartar la generacin de
producto por causas distintas a de la actividad enzimtica. Si se
reemplaza el sustrato, se determina la posible contaminacin de la
enzima con producto. Si se reemplaza la enzima, se determina la
contaminacin del sustrato con producto y/o la generacin qumica de
producto. As, es critico la definicin y empleo de blanco, para no
se sub- o sobre-estimar la actividad enzimtica.Clase 95Cintica
EnzimticaMedicin de la Actividad Enzimatica De los mtodos analticos
disponibles, la espectrofotometra es la tcnica de mayor importancia
(simplicidad, versatilidad, sensibilidad y bajo costo). Por lo
general, el P y/ S (incluyendo los cofactores) poseen espectros de
absorcin distintos. Tambin se pueden emplear reacciones en serie
que resultan en un compuesto con un espectro d absorcin bien
definido. Otras alternativas son: Fluorometria: reactantes que
emiten luz cuando excitados a determinados comprimentos de onda.
Manometria: reacciones involucrando consumo produccin de gases
Polarmetria: reacciones con reactantes pticamente activos.Cintica
EnzimticaMedicin de la Actividad Enzimatica La actividad enzimtica
es expresa en unidades de actividad. A pesar de la definicin ser
muy arbitraria, la Unin Internacional de Bioqumica propuso la
unidad internacional (u.i.), que viene definida como la cantidad de
enzima que cataliza 1 mol de sustrato por minuto, en condiciones
ambientales bien definidas ([S], pH y temperatura). Una alternativa
a las u.i. es el katal (kat) que se define como la cantidad de
enzima que cataliza 1 mol de sustrato por segundo. Tiene el
inconveniente de resultar en valores muy chicos, lo que obliga a
expresarla en microkat o nanokat. La actividad especifica es la
actividad por unidad de masa de enzima.Clase 96Cintica
EnzimticaMedicin de la Actividad Enzimatica Ejemplo de informacin
comercial para la enzima Lisozima:Product Number:
L6876(http://www.sigmaaldrich.com)Product Name: Lysozyme chicken
egg white Synonyms: Lysozyme from hen egg white; Mucopeptide
N-acetylmuramoylhydrolase; MuramidaseEnzyme Commission (EC) Number:
3.2.1.17MDL number: MFCD00131557CAS Number: 12650-88-3MDL Number:
MFCD00131557EC Number: 2326204Merck Index: Merck 13, 5660Storage
Temp: -20CUnit Definition: One unit will produce a DA450of 0.001
per min at pH 6.24 at 25C, using a suspension of Micrococcus
lysodeikticus as substrate, in a 2.6 ml reaction mixture (1 cm
light path).Literature References: Kristiansen, A., et al., Eur. J.
Biochem. 251, 335 (1998) Matsumura, I., et al., Biochemistry 35,
1890 (1996) Thanassi, D.G., et al., Role of outer membrane barrier
in efflux-mediated tetracycline resistance of Escherichia coli.J.
Bacteriol. 177, 998-1007 (1995) Cull, M. ,and McHenry, C.S,
Preparation of extracts from prokaryotes Meth. Enzymol. 182,
147-153 (1990)Comments: Lyophilized powder, approx. 50,000 units/mg
protein (E1%/282); Protein approx. 95%; mol wt approx. 14.3
kDaPhysical form: Dialyzed and lyophilized, containing buffer salts
as sodium acetate and sodium chloride 3 crystallizedCintica
EnzimticaHiptesis de equilibrio rpido y estado estacionario El
mecanismo de accin enzimtica se puede explicar segn dos hiptesis
principales: Michaelis-Menten (equilibrio rpido): Este modelo dice
que se establece un equilibrio entre E, S y ES, o sea, las
velocidades de formacin de ES y descomposicin en E y S son mucho
mayores que la de descomposicin en E y P. Esta hiptesis es una
simplificacin pues no se puede establecer un estado de equilibrio
E, S y ES bajo condiciones de formacin del producto.E + S ES E +
PK+1K-1K+2Clase 97Cintica EnzimticaHiptesis de equilibrio rpido y
estado estacionario Michaelis-Menten (equilibrio rpido):| | | || |
ESS EkkKeq= =+11.Como [E]0=[E]+[ES] y [S]0=[S]+[ES][S]
([S]>>>[ES],| | | | ( ) | || || || | | || |00 00 0. S KS
EESESS ES EKeqeq+= =Cintica EnzimticaHiptesis de equilibrio rpido y
estado estacionario Michaelis-Menten (equilibrio rpido):Adems: | |
ES kdtdPv = =+2Sustituyendo atrs,| || || || | += =+ 00 02
S KS EkvESeq| || || || || |00 max00 0 2S KS vS KS E kveq eq+=+ =
+ Parmetros cinticos: vmax velocidad mxima de reaccin, o sea,
cuando la enzima se encuentra saturada con sustrato ([ES]=[E]0) Keq
constante del equilibrio de disociacin del complejo ES en E y
SClase 98Cintica EnzimticaHiptesis de equilibrio rpido y estado
estacionario El mecanismo de accin enzimtica se puede explicar segn
dos hiptesis principales: Briggs-Haldane (estado estacionario):
Este modelo asume que la velocidad neta de cambio en la
concentracin del complejo ES es cero su velocidad de formacin es
igual a su velocidad de descomposicin (estado estacionario). La
hiptesis asume que, luego de un estado transiente muy breve
(microsegundos), se alcanza un estado estacionario, donde la
variacin de la [ES] en el tiempo es despreciable frente a la
variacin de [S] y [P].E + S ES E + PK+1K-1K+2Cintica
EnzimticaHiptesis de equilibrio rpido y estado estacionario
Briggs-Haldane (estado estacionario):| | | |( ) | | 02 1 1= + = +ES
k k S E kdtdESComo [E]0=[E]+[ES] y [S]0=[S]+[ES][S]
([S]>>>[ES],| | | | ( ) | | ( ) | || || || |012 10 02 1 0
0 1] [0Skk kS EESES k k S ES E k++= = + ++ +Clase 99Cintica
EnzimticaHiptesis de equilibrio rpido y estado estacionario
Briggs-Haldane (estado estacionario):Nuevamente: | | ES kdtdPv =
=+2Sustituyendo atrs,| || || | ++= =++ +012 10 02] [Skk kS EkvES|
|| || || || |00 max012 10 0 2S KS vSkk kS E kvm +=++ = ++ +Podemos
verificar que la ecuacin de Michaelis-Menten es un caso particular
de la de Briggs-Haldane, donde si k-1>>>k+2y
k+1>>>k+2, luego Km=Keq Km constante de Michaelis de
sustrato que fsicamente representa la afinidad de la enzima por su
sustrato mayor afinidad, menor Km.Cintica EnzimticaHiptesis de
equilibrio rpido y estado estacionario El vmaxno es una propiedad
fundamental de la enzima (opuesto al Km), porque depende de su
concentracin (vmax=k+2.[E]0). Los presupuestos de estos modelos no
suelen verificarse en la mayora de los casos reales (equilibrio de
formacin de ES, estado estacionario, [S]>>>[E], sin
inhibicin, solo una especie intermedia,). Pero la ecuacin es
ampliamente aplicada, en una amplia gama de condiciones
experimentales. Se suele cambiar k+2por kcat, numero de rotacin,
que representa el nmero mximo de molculas de sustrato que la enzima
convierte en producto por unidad de tiempo. Como ejemplo tenemos
o-amilasa, glucoamilasa y la glucosa isomerasa con kcatde 500, 160
y 3 s-1, respectivamente.Clase 100Cintica EnzimticaCalculo de los
parmetros cinticos Ellos pueden ser calculados por linealizacin de
la ecuacin cintica entre la velocidad inicial de reaccin (v) y la
concentracin de sustrato (S): Lineweaver-Burke (es el mtodo ms
empleado, pero no el mejor)| |max 0 max1 1 1v S vKvm+ =v1|
|01Sabmax1va =mKb1 =Cintica EnzimticaCalculo de los parmetros
cinticos Eadie-Hofstee Hanes-Woolf | |max0vSvK vm+ =v| |0Svabmaxv a
=mKvbmax=| || |max0max01vKSv vSm+ =| |vS0| |0SabmaxvKam=mK b =Clase
101Cintica EnzimticaCalculo de los parmetros cinticos El ms
correcto es hacer una regresin no linear de la ecuacin original (se
minimiza la multiplicacin de los errores debido a la linealizacin)
o bien de su ecuacin integrada:| | ( )max max01 lnvX KvS Xtm =| | |
|| || | | || |0000SP SSS SX==XtdtdSdtdPv = =Cintica
EnzimticaInhibicin Enzimtica La mayora de las reacciones enzimticas
de inters industrial involucran un solo sustrato, que o es
degradado a productos ms simples o su configuracin qumica es
alterada. Ahora es muy tpico ocurrir fenmenos de inhibicin
(reversible) por los productos o por altas concentraciones del
sustrato. La inhibicin puede ser de tipo competitivo (afecta la
afinidad pero no la reactividad), no competitivo (afecta la
reactividad pero no la afinidad) o mixto (afecta la reactividad y
afinidad).Clase 102Cintica Enzimtica Considerando una reaccin
irreversible, el mecanismo de Michaelis-Menten y el inhibidor I:
Donde los complejos EI y ESI son especies no productivas.| | | || |
EII Eki=| | | || | ESII ESki='Inhibicin EnzimticaCintica Enzimtica
Considerando que el k+2es chico: Luego| | | || | ESS EkkKm= =+11|
|| |0 maxEESvv= | | | || || || | ESI ES EI E E + + + =0| || || ||
|| | ESI ES EI EESvv+ + +=max| || || || |||.|
\|+ +||.|
\|+ ='max1 1i imkISkIKS vvInhibicin EnzimticaClase 103Cintica
Enzimtica Si [E]0> Vmax/Km(transporte de masa ms eficiente que
la catlisis) la reaccin est en control cintico, siendo tan
eficiente como la enzima libre: Cuando kL
