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Agar kirby
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Las cepas de referencia en las pruebas de susceptibilidad a antibiticos de uso clnico por el mtodo de Kirby-Bauer y Concentraciones Mnimas InhibitoriasP R E S E N T AM. en C. SARA ARIADNA OCHOA PREZ INSTITUTO POLITCNICO NACIONALESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BILOGICAS
Antecedentes1961, OMS, regularizar mtodos empleados por los laboratorios para determinacin de susceptibilidad
1971, FDA acept Kirby Bauer.
1979, CLSI (antes NCCLS) mtodos establecidos como patrn de referencia para efectuar las pruebas en discos de papel filtro. ltima actualizacin: 2007
Instituto de estndares de laboratorio clnico (Clinical and Laboratory Standards Institute=CLSI)Organizacin internacional, interdisciplinaria, educacional, no lucrativa que promueve el desarrollo y uso de estndares y directrices dentro del rea de la salud
Finalidad de la susceptibilidad a antimicrobianos (CLSI) Desarrollar mtodos de referenciaEstablecer parmetros de control de calidadEstablecer criterios de interpretacin de resultadosEstrategias para ensayos y reportes con relevancia clnica en efectividad y costoDeteccin de mecanismos de : nuevos mtodos, revisin de los actuales, criterios de interpretacin y parmetros de control de calidadComunicacin con el usuario
Estndares de susceptibilidad publicados por CLSIMtodos de referenciaEvaluar ensayos de susceptibilidad de rutina para aislados clnicosEvaluar dispositivos comerciales de uso en el laboratorio clnicoEnsayar nuevos agentes antimicrobianosProcesos de aprobacin o certificacin (autoridades reguladoras)CLSI documento M23: Desarrollo de E.S. a antimicrobianos in vitro, criterios y parmetros de control de calidad
Estndares para Ensayos de Susceptibilidad a AntimicrobianosDocumento informativo M100-S17. Enero-2007 (ISBN 1-56238-625-5)M2A9 Estndares para ensayos de susceptibilidad a antimicrobianos por la tcnica de difusin en disco (9a.ed.)M7A7 Estndares para ensayos de susceptibilidad a antimcrobianos por la tcnica de dilucin, para bacterias de crecimiento aerobio (7a.ed.)
OBJETIVODeterminar la resistencia sensibilidad in vitro, a determinados antimicrobianos en bacterias de crecimiento rpido. Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus spp. Enterococcus spp. Acinetobacter spp. Burkholderia cepacia Stenotrophomonas maltophiliaPracticar la determinacin de -lactamasas.
Objetivos en la prctica mdica:Susceptibilidad del microorganismo in vitroRelacin de susceptibilidad entre el microorganismo y bacterias de la misma especiePropiedades farmacolgicasExperiencia clnica previa de la eficacia del antimicrobiano Historia natural del proceso patolgicoEstado inmune del husped
Mtodo a elegir:No. De pruebas que se procesen en laboratorio
Tipo de microorganismo
Cultivos puros de bacteria : sitios estriles
Mecanismo de patogenicidad
FUNDAMENTODISCOS DE PAPEL
CONCENTRACIN DEL ANTIMICROBIANO
FORMACIN DE HALOS DE INHIBICIN
SE MIDEN EN mm
PROPORCIONALES A LA CMI
Cepas de referencia en Kirby-BauerBacterias de crecimiento no exigente Escherichia coli ATCC 25922 Escherichia coli ATCC 35218 (combinacin de -lactmico/ Inhibidor de -lactamasas) Staphylococcus aureus ATCC 25923 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Cepas de referencia en Kirby-BauerBacterias de crecimiento exigente Haemophilus influenzae ATCC
49247 Haemophilus influenzae ATCC
49766 Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 Streptococcus pneumoniae ATCC
49619
Cepas de referencia especiales S. aureus ATCC BAA-977 (resistencia inducible a clindamicina mediada-ermA) S. aureus ATCC BAA-976 (resistencia a macrlidos-Efflux mediado-msrA) Enterococcus faecalis ATCC 29212 (HLAR con Discos de gentamicina 120 g y estreptomicina 300 g) Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 (ensayos de -lactamasas de espectro extendido)
PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD DE KIRBY-BAUER.Indicaciones Microorganismos con espectro no predecible Pacientes alrgicos a penicilina pero con cepas sensiblesInvestigacin para susceptibilidad de neumococo a penicilina Determinar MRSA en Staphylococcus y SCN Determinar resistencia a vancomicina en S. aureus, SCN, Enteroccocus Resistencia a carbapenemas y SBL en BGN
PRUEBA DE SUSCPTIBILIDAD DE KIRBY-BAUER.Casos invasivosStaphylococcus aureusStreptococcus pneumoniaePseudomonas aeruginosaHaemophilus influenzaeProteus spp.Providencia spp.Hafnia spp.Citrobacter spp.Acinetobacter spp.Enterococcus spp.
INDICACIONES
PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD DE KIRBY-BAUER.Neisseria meningitidisNeisseria gonorrhoeaeClostridium perfringensBacillus anthracisCorynebacterium diphtheriaeActinomyces israeliBordetella pertussis Brucella melitensisCasos especiales pero no se requiereNO SE REQUIEREStreptococcus pyogenes
INTERPRETACINSENSIBLE, INERMEDIO, RESISTENTE Depende del antibitico y bacteria Dimetro de zona mnima y mxima Seleccionar antibitico
Condiciones para KIRBY-BAUER.Condiciones ptimas Medio: agar Mueller-Hinton Inculo: Crecimiento en caldo o suspensin directa de la colonia, equivalente a la escala 0.5 del Nefelmetro de McFarland Incubacin: 35 +/- 20C en ambiente aerobio de 16-18 hAcinetobacter spp., B. cepacia, S. maltophilia: 20-24 h
Condiciones para KIRBY-BAUER en H. influenzae y H. parainfluenzae Medio: HTM Mueller Hinton con sangre de caballo al 10%, Isovitalex (BBL) o polienriquecimiento 1% (Difco, Bioxon) o extracto de Fildes al 10% Inculo: Suspensin directa de la colonia, equivalente a la escala 0.5 del Nefelmetro de McFarland Incubacin: 35 +/- 20C, 5% CO2, 16-18 h
Condiciones para KIRBY-BAUER en Neisseria gonorrhoeae Medio: Base GC suplementado con 1% de polienriquecimiento o IsovitalexSuplemento: L-cistena, guanina, tiamina, PABA, B12, NAD, adenina, L-glutamina, glucosa, nitrato frrico Inculo: Suspensin directa de la colonia, equivalente a la escala 0.5 de McFarland Incubacin: 36 +/- 10C (no exceder de 370C), 5% CO2, 20-24 h
Condiciones para KIRBY-BAUER en S. pneumoniae y Enterococcus spp. Medio: agar Mueller Hinton con 5% sangre de carnero Inculo: Suspensin directa de la colonia, equivalente 0.5 de McFarland Incubacin: 35 +/- 20C, 5% CO2, 20-24 h
PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD DE KIRBY-BAUER.Control de calidadEvaluar el antimicrobiano (uno de cada grupo, dentro de la caducidad)La FDA recomienda discos de papel filtro, grosor diametro, concentracin de antimicrobiano determinado.Medio de Mueller Hinton pH 7.2-7.4, grosor de placa de 0.5 mm, no ms de 7d de preparacin
LIMITACIONES DEL METODOMicroorganismos de crecimiento rapidoCultivos puros
PRUEBA DE SUSCPTIBILIDAD DE KIRBY-BAUER. Staphylococcus a penicilina:
- Probar discos de oxacilina de 1g/mL- e intermedios en medio suplementado con NaCl al 2% o medio Mueller-Hinton con NaCl al 4% y 6g/mL de oxacilina (pba de escrutinio).
Enterococcus:
- Sensibilidad a vancomicina por el metodo de dilucin en placas de agar.- Prueba de escrutinio en placas de (BHI) 6g/mL vancomicina, 500 g/mL gentamicina y 2000 g/mL estreptomicina
Mtodo de difusin en discos de papel filtro KIRBY-BAUERMaterial Cajas de Petri de 15 cm (10cm) de dimetro con medio Mueller HintonTubos 13 x100 T/R con 4 mL de caldo Mueller-Hinton (ajustar inculo) Hisopos de al algodn estriles Pinzas Tubo 0.5 del Nefelmetro de McFarland Sensidiscos individuales para Gram positivos y Gram negativos seleccionados segn el microorganismo problema) Cepa de referencia Regla
FORMACION DE HALOKirby- BauerKirby- BauerTira- E
Tincin Plata
CONCENTRACIN MNIMA INHIBITORIA (CMI MIC) : Es la concentracin del antibitico que se necesita para inhibir el crecimiento de una bacteriaSe mide en g/mL y es diferente para cada especie bacterianaSe realiza en caldo agar a travs de la inhibicin de crecimiento
CONCENTRACIN MNIMA INHIBITORIASe realiza en Hospitales
Replicador de Steers
Mtodo de dilucin seriada en placas de agar o tubos de caldo
Gelosa Mueller Hinton Microscan
CONCENTRACIN MNIMA INHIBITORIAMaterialTubos 16x150 TR con agar MH mantenido a 450C.Tubos con sol diluyente (agua desionizada, PBS pH 6.0, DMSO, c. Actico glacial, c. Hidroclorhdrico)Placas de Petri estriles vaciasTubos con caldo MH para inculoHisoposSales de antibiticos (Stock=5120 g/mL)Replicador de SteersCepas de referencia
Cepas de referencia en CMIS. aureus ATCC 29213 E. faecalis ATCC 29212, 51219E. coli ATCC 25922E. coli ATCC 35218 P. aeruginosa ATCC 27853H. influenzae ATCC 49247, 49766S. pneumoniae ATCC 49619Helicobacter pylori ATCC 43504
-700CDescongelarGelosa Casman-10% SCbMicroaeroflia 370C/3-5 dConfirmaron: UR (+), Gram (-)Catalasa (+), oxidasa (+)c. Nalidxico (R ), Cefalotina (S)Dilucin seriada en placa con Replicador de Steers Tira -E (AB Biodisk,Sweder 2001)Escala 2.0 MFEscala 3.0 MFCaldo Brucella-10% SCCaldo Brucella-10% SCReplicar con SteersMueller Hinto-10% SCbConc. 0.015-512 g/mlPor duplicado.250 L250 LAbsorber 10-15 minDeterminar MICsVALORES (NCCLS. 9th Ed 2002)CMI por dilucin seriada en placa de agar con replicador de Steers. (NCCLS. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard- 9th Edition 2002) y Ensayo de tira-E (Ensayo de Epsilmetro; AB Biodisk, Solna, Sweden 2001).
CepaValores de Am(g/ml)Valores de Tt(g/ml)Valores de CH(g/ml)H.pyloriATCC 435040.015 --0.1250.125 1.00.015 0.125S.aureusATCC292130.125 0.50.125 1.00.125 0.5
VALOR DE CORTE 4.0 2.0 1.0
Mtodo: Dilucin seriadaEn agar con replicadorDe SteersAntimicrobiano: MetronidazolConc. de la placa:32 g/mlPozo No. 1 Cepa de referenciaH.pylori ATCC 43504Pozo No. 2-26 Cepas clnicasDe H.pyloriHelicobacter pyloriATCC 43504
CMI 0.125 gLmlE-test para H.pyloriCMI 32 gLml
DETERMINACIN DE -LACTAMASASINHIBEN LA SNTESIS DE PARED BACTERIANA
EFECTO BACTERIOSTTICO Y BACTERICIDA
EXISTEN B-LACTAMASAS, SE DETECTAN POR PRODUCCIN DE CIDO PENICILOICO
DETECCIN DE CIDO PENICILOICOACIDOMTRICOYODOMTRICOCEFALOSPORINA COLORIDA: Cefinase
B-LACTAMASAS: ESPACIO PERIPLSMICO DE GRAM NEGATIVAS
CLASIFICACIN BUSH:
1CEP-NHidrolisan cefalosp no inhibidas por ac clavulan2aPEN-YHidrolisan penis. Inhibidas por ac clavulan2bBDS-YAmplio espectro inhib por ac clav2bEBS-YAmplico espectro.inhib ac clav2cCAR-YHidrolisan carbencilina, inhib por ac clav2dCLX-YHidrolisan cloxacilina, inhib ac clav2eCEP-YHidrolisan cefalosp, inhib por ac clav3MET-YMetalobetalactamasas no inhib por ac clav5PEN-NHidrolisan por penicilina, no inhib por ac clav
DETERMINACIN DE B-LACTAMASAS MTODO DE CEFINASE S. aureus y/o E. coli, Pseudomonas, Haemophilus, S. pneumoniae que haya dado resistencia a penicilina, ampicilina Oxacilina a veces BETA LACTAMASAS Utiliza discos de papel filtro impregnados con el reactivo Cefalosporina colorida
GRACIAS