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8. Instrumentacióndel microscopio
confocal espectral
8. Instrumentación del microscopio confocal
Parámetros importantes del microscopio confocal:● Fuente de iluminación: Láser● Pinhole● Detector: Fotomultiplicador
¡! Microscopio óptico
8. Instrumentación del microscopio confocalMicroscopio óptico
La primera visualización de la muestra se hace con el microscopio óptico:
1) Seleccionar el área de interés2) Seleccionar los aumentos adecuados3) Enfocar4) Ajustar la iluminación de Köhler
5) Pasar al modo confocal
8. Instrumentación del microscopio confocalMicroscopio confocal
Sistema de láseres
8. Instrumentación del microscopio confocalMicroscopio confocal
Fuente de iluminación: LÁSER
Propiedades:● Elevado grado de monocromatismo● Divergencia pequeña● Brillo elevado● Elevado grado de coherencia espacial y
temporal
8. Instrumentación del microscopio confocalLáser
Láseres de onda continua: láser de gas● Ión de argon (Ar):
458 nm476 nm488 nm514 nm
● Helio-neon (He/Ne)-Verde: 543 nm● Helio-neon (He/Ne)-Rojo: 633 nm
● Diodo UV: 405 nm
8. Instrumentación del microscopio confocalLáser
405UV
458Ar
476Ar
488Ar
514Ar
543He/Neverde
633He/Ne
rojo
8. Instrumentación del microscopio confocalLáser
Configuración predeterminada
8. Instrumentación del microscopio confocalLáser
Elección del láser
8. Instrumentación del microscopio confocalLáser
Potencia:
A mayor potencia, mayor intensidad de la señal, pero mayor fotoblanqueado del fluorocromo.
≈ 50 %
8. Instrumentación del microscopio confocalPinhole
Los microscopios de barrido confocal son
particularmente atractivos en virtud a su resolución
lateral aumentada y el seccionado óptico.
La última propiedad es la más útil y da lugar a la
posibilidad de obtener imágenes de muestras
gruesas en tres dimensiones.
8. Instrumentación del microscopio confocalPinhole
Esto es posible porque el sistema óptico detecta
información sólo de una región delgada en la
vecindad del plano focal lo que permite almacenar
muchas secciones de imágenes en un ordenador
para obtener un conjunto de datos tridimensionales
que describan al objeto.
Hoy en día existen muchos sistemas de software
que muestran estos datos de muchas maneras.
8. Instrumentación del microscopio confocalPinhole
La única diferencia entre un microscopio de barrido
confocal y un microscopio de barrido convencional
es que el confocal utiliza un detector puntual en
lugar de un área grande.
Todas las considerables ventajas de la microscopía
confocal derivan del pequeño tamaño de este
detector, el PINHOLE.
8. Instrumentación del microscopio confocalPinhole
El éxito o fracaso en alcanzar una verdadera
operación de microscopía confocal depende de la
correcta elección de la forma y tamaño del pinhole
que se aproxime tanto como sea posible a las del
detector puntual ideal.
8. Instrumentación del microscopio confocalMicroscopio confocal
8. Instrumentación del microscopio confocalPinhole
El pinhole está presente para evitar que llegue al
detector luz que se origina en un plano que no sea
el plano de foco.
Se monta en un plano imagen y si su tamaño se
reduce más de lo que corresponde a un spot
limitado por la difracción en la muestra, entonces
reducirá severamente el número de fotones que
alcanzan el detector mientras que se producirá sólo
una mejora marginal en la resolución xy o z.
8. Instrumentación del microscopio confocalPinhole
Haciendo el pinhole mayor que el spot limitado por
difracción permite que se detecten más fotones
pero como casi todos los que se originan en el
plano de foco ya se recogen, la mayoría de la señal
adicional viene de planos adyacentes, reduciendo
la resolución z.
8. Instrumentación del microscopio confocalPinhole
Detector
Objetivo
Divisordel haz
Luz láser Diafragma(PINHOLE)
Muestra
8. Instrumentación del microscopio confocalPinhole
El valor óptimo del pinhole es el que corresponde a
Airy 1.
8. Instrumentación del microscopio confocalPinhole
Patrón de difracción de Airy:
La imagen de un punto de luz tiene un tamaño finito
y una forma característica determinada por los
efectos de difracción del llamado “Patrón de
difracción de Airy”.
Es un patrón con un disco central muy intenso
rodeado de una serie de pequeños anillos de
difracción.
8. Instrumentación del microscopio confocalPinhole
Disco de Airy:
Disco de Airy
8. Instrumentación del microscopio confocalPinhole
En la microscopía confocal el tamaño del pinhole
debe ser el mismo que el del disco de Airy porque
de este modo se permite el paso de la mayor
cantidad de luz (95 %) manteniendo las
condiciones de confocalidad.
8. Instrumentación del microscopio confocalPinhole
El diámetro del disco de Airy es aproximadamente
igual a 1,22 veces la longitud de onda dividido por
la apertura numérica del objetivo:
diámetro = 1,22 λ / A.N.
Depende por tanto delobjetivo que se esté usando.
d
8. Instrumentación del microscopio confocalPinhole
El criterio de Rayleigh para la resolución:
Dos puntos se pueden resolver, cuando sus discos
de Airy están separados.
La mínima distancia resoluble entre dos puntos se
da cuando el máximo de uno de los patrones de
difracción de Airy coincide con el primer mínimo del
otro, es decir, cuando la distancia centro a centro
entre los máximos es mayor que la anchura de los
máximos.
8. Instrumentación del microscopio confocalPinhole
El criterio de Rayleigh para la resolución:
Resueltos Límite de resolución No resuelto
8. Instrumentación del microscopio confocalPinhole
El criterio de Rayleigh para la resolución:
La mínima distancia resoluble entre dos puntos
corresponde al radio de un disco de Airy:
diámetro = 1,22 λ / A.N.
radio = 0,61 λ / A.N.
El valor óptimo del pinhole es el de Airy 1
8. Instrumentación del microscopio confocalDetector
El sistema de detección del microscopio separa la
señal emitida por la muestra en bandas: sistema
espectral.
Recoge la señal mediante detectores
fotomultiplicadores (PMT).
8. Instrumentación del microscopio confocalDetector
8. Instrumentación del microscopio confocalDetector
Fotomultiplicador:
Un dispositivo que convierte la energía de la luz
incidente en fotoelectrones emitidos al vacío, los
cuales son multiplicados en un proceso de emisión
secundaria.
El tubo fotomultiplicador tiene una alta sensibilidad
y un bajo ruido.
8. Instrumentación del microscopio confocalDetector
Puede ajustarse un valor Gain y un valor Offset
para cada detector.
El valor Gain permite modificar el refuerzo de la
señal detectada y, de esta forma, también la
luminosidad y el contraste de la imagen.
El valor Offset permite determinar el valor umbral.
Sólo se detectan y muestran en la imagen las
señales que están por encima de este valor umbral.
8. Instrumentación del microscopio confocalDetector
8. Instrumentación del microscopio confocalDetector
Un valor elevado de Gain aumenta la entrada de
ruido y puede dar una señal saturada.
8. Instrumentación del microscopio confocalDetector
Se ajusta ayudándose de una paleta de colores
“Glow over-under”
"Glow (O&U)" visualiza el valor
máximo azul y el valor mínimo
verde.
Por ello, está especialmente
indicada para la optimización de la
calidad de imagen.
8. Instrumentación del microscopio confocalDetector
8. Instrumentación del microscopio confocalAjustes de instrumentación
Equilibrio entre:
● Potencia del láser
● Tamaño del pinhole
● Ganancia del fotomultiplicador
![Microscopia Confocal Tem [Recuperado]](https://img.pdfslide.es/doc/110x75/563dbbbb550346aa9aafc610/microscopia-confocal-tem-recuperado.jpg)
