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11. Enfermedad de Lafora: epilepsia y regulacindel metabolismo de glucgeno por laforina y malina

DAVID VLCHEZ, SANTIAGO RODRGUEZ DE CRDOBAY

JOAN J. GUINOVART

RESUMEN

Normalmente las neuronas no almacenan glucgeno. Sin embargo, en deter-minadas patologas acumulan unas inclusiones formadas principalmente por pol-meros de glucosa poco ramificados que podran ser considerados molculas de glu-

cgeno aberrantes. El caso ms impactante es el de la enfermedad de Lafora, unapatologa neurodegenerativa y con dramticas consecuencias. La enfermedad seasocia con alteraciones en dos protenas, laforina y malina. Por este motivo anali-zamos la capacidad de las neuronas para sintetizar glucgeno, las consecuenciasde su acumulacin en estas clulas y la funcin de laforina y malina. Mostramosque las neuronas poseen la maquinaria para sintetizar glucgeno ya que expresanla isoforma muscular de la glucgeno sintasa (MGS). Sin embargo, esta enzima seencuentra altamente fosforilada, por lo que se mantiene inactiva. No obstante, elincremento de los niveles de PTG, una subunidad reguladora de la protena fosfa-tasa 1 que le permite interaccionar con MGS y estimular su desfosforilacin, in-duce la sntesis de glucgeno en neuronas. Sorprendentemente, estas clulas entranen apoptosis cuando acumulan glucgeno. Por otra parte, la formacin de un com-plejo entre laforina y malina, estimula la degradacin a travs del sistema ubiqui-tina-proteasoma de MGS y PTG lo que contribuye a asegurar el silenciamiento dela sntesis de glucgeno. Nuestros resultados ofrecen una explicacin a la acumu-lacin de polmeros de glucosa en la enfermedad de Lafora al demostrar una fun-cin crucial de laforina y malina en la regulacin de la sntesis de glucgeno.

Palabras clave: Neurodegeneracin. Apoptosis. Cuerpos de poliglucosano.Glucgeno sintasa. Proteasoma.

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ABSTRACT

Lafora disease: epilepsy and glycogen metabolism control by laforinand malin

Glycogen deposition is normally absent in neurons. However, inclusion bo-dies resembling abnormal glycogen accumulate in several neurological diseases,particularly in Lafora disease, a neurodegenerative disorder that results in pro-gressive myoclonus epilepsy and death. Lafora disease is caused by mutationsin either malin or laforin. On the basis of this observation, we analyzed the ca-pacity of neurons to synthesize glycogen, the consequences of glycogen accu-

mulation for these cells and the role of laforin and malin. Here we show thatmouse neurons have the enzymatic machinery for synthesizing glycogen but thatit is suppressed by retention of muscle glycogen synthase (MGS) in the phos-phorylated, inactive state. However, overexpression of PTG, which brings pro-tein phosphatase 1 to MGS for activation, markedly increases glycogen accu-mulation. Surprisingly, glycogen accumulation induces apoptosis in neurons.This suppression is further ensured by a complex of laforin and malin. The la-forin-malin complex causes proteasome-dependent degradation of both PTG andMGS, thereby ensuring a blockade of neuronal glycogen synthesis even underintense glycogenic conditions. Here we explain the formation of polyglucosaninclusions in Lafora disease by demonstrating a crucial role for laforin and ma-lin in glycogen synthesis.

Keywords: Neurodegeneration. Apoptosis. Polyglucosan bodies. Glycogensynthase. Proteasome.

DAVID VLCHEZ, SANTIAGO RODRGUEZ DE CRDOBA Y JOAN J. GUINOVART

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Abreviaturas: MGS, Glucgeno sintasa muscular; PTG, Protein targeting to glycogen;ATP, Adenosina 5-trifosfato; PAS,Periodic-acid Schiff; PGBs, Cuerpos de poliglucosano (Poly-glucosan Bodies); EPM2A, Epilepsy of progressive myoclonus type2 gene A; EPM2B, Epilepsyof progressive myoclonus type2 gene B; GS, Glucgeno sintasa; RT-PCR, Transcripcin Rever-sa - Reaccin en Cadena de la Polimerasa; LGS, Glucgeno sintasa heptica; GFAP, Protena fi-brilar acdica de la gla; GP, Glucgeno fosforilasa; G6P, Glucosa 6-fosfato; GK, Glucoquinasa;HKI, Hexoquinasa I; GSK3, Glucgeno sintasa quinasa 3; AMPK, Quinasa estimulada por AMP;PP1, Protena fosfatasa de tipo 1; N2a, Neuro2a; siRNA, Oligonuclotidos de RNA de interfe-rencia; GFP, Protena verde fluorescente (Green Fluorescent Protein); AdCMV-GK, Adenovirusrecombinante que codifica para la GK; AdCMV-HKI, Adenovirus recombinante que codifica parala HKI de rata; MOI, Multiplicidad de infeccin; AdCMV-MGS, Adenovirus recombinante quecodifica para la MGS humana; AdCMV-GFP-MGS, Adenovirus recombinante que codifica parala MGS humana fusionada a GFP; AdCMV-PTG, Adenovirus recombinante que codifica para la

PTG de ratn fusionada a GFP; AdCMV-GFP, Adenovirus recombinante que codifica para GFP;AdCMV-laf, Adenovirus recombinante que codifica para la laforina humana; AdCMV-malina,

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El cerebro de los mamferos contiene glucgeno pero a unas concentracio-nes muy inferiores a las que se encuentran en otros tejidos como el hgado o el

msculo esqueltico. De hecho, la proporcin de glucgeno entre hgado/ms-culo esqueltico/cerebro es de 100:10:1 (1). Adems, el glucgeno cerebral sehalla casi exclusivamente en los astrocitos, mientras que las neuronas no lo acu-mulan (2-4).

Se acepta generalmente que el sistema nervioso central es dependiente dela glucosa como sustrato energtico y que se encuentra a merced de la circula-cin sistmica para obtener una entrega de glucosa constante e interrumpida (5-7) ya que el glucgeno contenido en el cerebro bastara slo para unos pocosminutos. Aunque la funcin fisiolgica de este glucgeno no ha sido del todoaclarada, se le han asignado dos importantes funciones como suministrador desustratos energticos en el cerebro: 1) bajo condiciones hipoglucmicas cuandoel suministro de glucosa es insuficiente para afrontar los requerimientos inme-diatos de energa (2, 3, 8, 9), y 2) durante periodos de incremento transitorio dela demanda energtica, en los que la glucosa que llega por la circulacin sist-mica es insuficiente (2, 3, 8). Se acepta que, en estas condiciones, el glucge-no de los astrocitos suministrara a las neuronas un sustrato energtico suple-mentario a la glucosa. Toda una serie de observaciones han permitido llegar a

esta conclusin: el contenido de glucgeno en el cerebro incrementa durante elsueo (10, 11) y la anestesia (1, 12, 13), con la consiguiente movilizacin deeste polisacrido al despertar o volver a estar consciente. Tambin se ha obser-vado que la estimulacin del cerebro induce glucogenolisis, hecho que relacio-na la actividad fisiolgica neuronal con la utilizacin de glucgeno (14, 15).Esta glucogenolisis tiene lugar durante perodos de incrementada demanda ener-gtica del cerebro incluso en condiciones de normoglicemia (8).

El metabolismo del glucgeno cerebral es un claro ejemplo del acoplamientoentre neuronas y gla. Los neurotransmisores y neuromoduladores movilizan lasreservas del polisacrido de los astrocitos (2, 8, 16, 17). Varias observacionescontribuyen a pensar que ste da lugar a lactato que es exportado al espacio ex-tracelular de donde es captado por las neuronas para ser utilizado como com-bustible aerbico durante perodos de incrementada actividad axonal (2, 18, 19).As, las neuronas son capaces de funcionar si la glucosa es substituida por el

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ENFERMEDAD DE LAFORA: EPILEPSIA Y REGULACIN DEL METABOLISMO DE GLUCGENO...

Adenovirus recombinante que codifica para la malina humana de tipo salvaje fusionada al epto-po de hemaglutinina (HA); AdCMV-malina-D146N, Adenovirus recombinante que codifica para

la malina humana mutante D146N fusionada HA; GAPDH, Gliceraldehdo 3-fosfato deshidro-genasa; SP, Estaurosporina.

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lactato como combustible (20, 21) y el glucgeno de los astrocitos se movilizarpidamente durante la hipoglucemia y aparece principalmente como lactato ex-

tracelular (18). Adems, el bloqueo de la degradacin del glucgeno de los as-trocitos o del transporte de lactato de estas clulas a los axones reduce de ma-nera acelerada la actividad neuronal (22).

Por lo tanto, a pesar de que las neuronas no acumulan glucgeno, s se be-nefician de las reservas almacenadas en los astrocitos. Esta caracterstica hacean ms intrigante el hecho de que en determinadas patologas neurolgicas seacumulen polmeros de glucosa en las neuronas. Tal es el caso de la enfermedadde Lafora, que fue descrita en 1911 por el espaol Gonzalo Rodrguez Lafora(23-25), discpulo de Santiago Ramn y Cajal. La enfermedad se caracteriza porla presencia de unas inclusiones en el soma neuronal, en dendritas y en las neu-ritas corticales que han sido denominadas cuerpos de Lafora. Estos agregados setien intensamente con la tcnica PAS, lo que indica un contenido importante decarbohidratos. Estudios bioqumicos han mostrado que los cuerpos de Lafora secomponen principalmente de polmeros de glucosa pobremente ramificados(PGBs), es decir, que podran ser considerados glucgeno aberrante ya que nopresentan el patrn de ramificacin caracterstico de este polisacrido (26-29).Los cuerpos de Lafora tambin contienen hasta un 6% de protena no caracteri-

zada (26, 29). Estas inclusiones son un signo patognmico de la enfermedad ypodran ser su causa. Adems, tambin se ha detectado la presencia de los cuer-pos de Lafora en otros rganos como el hgado, msculo, corazn, retina y piel(30, 39), siendo ms abundantes en los rganos con un mayor metabolismo dela glucosa, es decir, en el cerebro, corazn, hgado y msculo esqueltico (39).

La enfermedad de Lafora es una patologa neurodegenerativa fatal y es lacausa ms frecuente de epilepsia progresiva mioclnica en los pases del sur deEuropa. La enfermedad se inicia, en la mayora de los casos, entre los 10 y 17aos de edad, tpicamente con crisis generalizadas tnico-clnicas o crisis vi-

suales que suelen describirse como visin de luces o estrellas (35, 37, 39, 40).Poco despus el paciente presenta crisis mioclnicas, rasgo fundamental de laenfermedad.

La enfermedad de Lafora presenta un proceso de neurodegeneracin pro-gresiva. En la autopsia se observa una abundante prdida de neuronas sin des-mielinizacin ni inflamacin. Todas las regiones del sistema nervioso central seven involucradas en este proceso, aunque en diferentes grados. stas incluyenla corteza cerebral y cerebelosa, los ganglios basales, los ncleos del cerebelo,

el tlamo y el hipocampo. Adems, tambin se observa neurodegeneracin enla retina (39, 41, 42). Como consecuencia aparece una demencia rpidamente


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progresiva poco tiempo despus del comienzo de las crisis tnico-clnicas y lasmioclonas. Otras manifestaciones neurolgicas que el paciente presenta a lo lar-

go del curso de la enfermedad son ataxia, y neuropata y miopata perifricas(39, 43). A medida que la enfermedad avanza, la mayora de los pacientes aca-ban presentando mioclonas continuas y evolucionan a un estado vegetativo ter-minal en el que deben ser alimentados por sonda. La mayora de los enfermosfallecen antes de 10 aos despus del comienzo de la enfermedad, normalmen-te por complicaciones debidas a la degeneracin del sistema nervioso y al esta-do epilptico (35, 39, 40).

La enfermedad de Lafora se hereda siguiendo un patrn autosmico rece-

sivo y muestra heterogeneidad gentica. Al menos dos loci son responsables deesta enfermedad: EPM2A (epilepsy of progressive myoclonus type2 gene A) yEPM2B (epilepsy of progressive myoclonus type2 gene B). Mutaciones enEPM2A son responsables de aproximadamente el 48% de los casos mientras queotro 40% se debe a mutaciones en EPM2B. Adems, la enfermedad se caracte-riza por una elevada heterogeneidad allica ya que se han identificado un grannmero de mutaciones, en ambos genes, que dan lugar a la enfermedad. A pe-sar de ello, tanto los pacientes con mutaciones en EPM2A como en EPM2B pre-sentan manifestaciones clnicas similares (44-46), aunque estos ltimos tienden

a vivir ms tiempo que aquellos con defectos en EPM2A (45). Se ha postuladoque un tercer gen, todava desconocido, sera responsable de un pequeo por-centaje de los pacientes de Lafora (47).

EPM2A fue el primer gen identificado como responsable de la enfermedadde Lafora (48, 49). El gen EPM2A est organizado en 4 exones y codifica unaprotena de 331 aminocidos, denominada laforina, que presenta en la regin C-terminal un dominio proten-fosfatasa dual (HCXXGXXRS/T). Por consiguien-te, la laforina recombinante puede hidrolizar in vitro sustratos de fosfo-tirosina yfosfo-serina/treonina (50, 51). La regin N-terminal de laforina contiene un do-minio de unin a carbohidratos (35, 52), que promueve su unin a glucgenotanto in vitro (43) como in vivo (51). Recientemente, se ha descrito la capacidadde laforina para desfosforilar carbohidratos tales como la amilopectina o el glu-cgeno (53, 54). Adems, se ha demostrado mediante ensayos de doble hbridoen levaduras que laforina interacciona con ella misma y con PTG (55). Todos es-tos datos situaban a laforina en el contexto de un complejo multiproteico aso-ciado con las partculas de glucgeno intracelulares junto con las protenas cl-sicas del metabolismo de este polisacrido y sugera que la laforina podra estar

implicada en la regulacin del metabolismo del glucgeno, quizs promoviendouna adecuada sntesis de este polisacrido o eliminando el glucgeno aberrante.

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El segundo gen asociado a la enfermedad identificado fue EPM2B (56, 57).El gen EPM2B, que posee un slo exn, codifica una protena de 395 amino-

cidos, denominada malina. Esta protena tiene un dominio de dedos de zinc deltipo RING-HC (58). La presencia de dedos de zinc RING es caracterstica deuna clase de E3 ubiquitin-ligasas (58, 59). La modificacin de protenas por ubi-quitina ocurre mediante un proceso de tres pasos en el cual la ubiquitina es ac-tivada y transferida desde la enzima activadora (E1) a la enzima conjugadora(E2) y, finalmente, a un sustrato con la implicacin de una ubiquitina ligasa (E3)(60). Lo ms frecuente es que la ubiquitinizacin de una protena la lleve a sudegradacin por el proteasoma, pero alternativamente, la ubiquitinizacin pue-de cambiar su actividad, capacidad de interaccin o su localizacin (59, 61). La

actividad E3 ubiquitina ligasa de malina fue confirmada en varios trabajos pu-blicados posteriormente a la secuenciacin del gen (62, 63). Adems, se identi-ficaron seis dominios repetidos NHL (57). Estos dominios estn implicados enla interaccin protena-protena.

Uno de los descubrimientos clave fue que los dominios NHL de malinale permiten interaccionar con laforina (62). La interaccin de malina con la-forina estimula la ubiquitinizacin de esta ltima, conducindola a su degra-dacin (62). Por lo tanto, una de las funciones crticas de malina consiste en

regular los niveles intracelulares de laforina a travs de su degradacin por elsistema ubiquitina-proteasoma. Aunque estos resultados mostraban, por pri-mera vez, una relacin e interaccin entre dos de las protenas cuyas altera-ciones dan lugar a la patologa, la degradacin de laforina por la formacinde un complejo con malina pareca estar en conflicto con la gentica de la en-fermedad de Lafora, dado que mutaciones recesivas tanto en un gen como enel otro causan la patologa.

A pesar de todos estos avances, se desconocan los mecanismos molecula-res por los que mutaciones en estos genes dan lugar a la enfermedad de Laforay la funcin celular que desempean ambas protenas. Adems, desde la des-cripcin original de la enfermedad, en el ya lejano 1911, continuaba siendo unreto el origen de los cuerpos de Lafora. El que estn formados principalmentepor polmeros de glucosa sugera que podan originarse por un defecto en el me-tabolismo del glucgeno, porque no hay otra fuente de polmeros de glucosa enlos tejidos animales. La presencia de los cuerpos de Lafora sugera la existen-cia de una va bioqumica, relacionada con el metabolismo del glucgeno, cuyadesregulacin resultara en la produccin de acumulaciones celulares de pol-

meros de glucosa poco ramificados. En esta va podran estar implicadas lafo-rina y malina. Tal como hemos comentado anteriormente, las neuronas evitan la


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acumulacin intracelular de este polisacrido, a pesar de que a simple vista po-dra reportarles grandes beneficios, aunque s se detecta en determinadas enfer-

medades neurolgicas.La nica protena capaz de formar polmeros de glucosa en mamferos es

la glucgeno sintasa (GS), enzima sometida a complejos mecanismos de regu-lacin. Por lo tanto, el primer objetivo era estudiar su expresin y regulacin enneuronas.

Primero, mediante la tcnica cualitativa RT-PCR, pusimos de manifiesto queen cerebro se expresa la isoforma muscular de GS (MGS) pero no la isoformaheptica (LGS) (Figura 1a). Mediante la tcnica de western blot, usando anti-

cuerpos especficos, pudimos detectar MGS pero no LGS (Figura 1b). Estos da-tos muestran que en el sistema nervioso central se expresa GS, concretamente,la isoforma muscular. Sin embargo, para conocer si las neuronas expresan MGS,era necesario realizar un estudio ms especfico en cultivos que slo contuvieranestas clulas. Preparamos cultivos que no mostraban expresin de la protena fi-brilar acdica de la gla (GFAP), protena especfica de este tipo celular, por loque estaban libres de contaminacin por astrocitos. Mediante RT-PCR y westernblot, observbamos que las neuronas expresaban MGS (Figura 1c, d). Tambinpudimos comprobar que las neuronas no expresan la glucgeno fosoforilasa (GP),

la enzima responsable de la degradacin del glucgeno (Figura 1d).

A pesar de expresar MGS, las neuronas no acumulaban glucgeno, ni tansolo cuando eran cultivadas en presencia de altas concentraciones de glucosa(30 mM) (Figura 1e). En cambio, los cultivos primarios de astrocitos cultivadosen las mismas condiciones, acumulaban cantidades significativas del polisac-rido (Figura 1e).

La incapacidad de las neuronas para acumular glucgeno podra explicarsepor unos niveles insuficientes de glucosa-6-fosfato (G6P) intracelular. Este meta-bolito no es tan solo un precursor de la UDP-Glucosa, sustrato de la GS, sino quees clave en el proceso de activacin de esta enzima. Adems de causar la activa-cin alostrica de GS, promueve tambin su activacin covalente al incrementarla susceptibilidad de la enzima a su desfosforilacin por fosfatasas (64-67). La so-breexpresin de glucoquinasa (hexoquinasa IV (GK)) y hexoquinasa I (HKI) enneuronas, utilizando adenovirus recombinantes, nos permiti incrementar los ni-veles intracelulares de G6P. No obstante, un incremento de 5 veces en los nive-les del metabolito (Figura 2a) no consegua incrementar los niveles de glucgeno

(Figura 2a) en estas clulas. Estos resultados indican que la falta de acumulacinde glucgeno en neuronas no es debida a un bajo contenido de G6P.

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FIGURA 1. Las neuronas expresan MGS, pero no acumulan glucgeno. (a) Anlisis medianteRT-PCR de la expresin de MGS y LGS en cerebro (C), hgado (H) y msculo (M) de ratn. (b)Anlisis mediante western blot de la expresin de MGS y LGS en cerebro (C), hgado (H) y

msculo (M) de ratn. (c)Anlisis mediante RT-PCR de la expresin de MGS y LGS en cultivosprimarios de neuronas (N) y astrocitos (A) de ratn. Utilizamos GFAP como marcador deastrocitos. (d) Anlisis mediante western blot de la expresin de MGS en homogenizados decultivos primarios de neuronas y astrocitos. La seal de GP y GFAP era prcticamenteindetectable en cultivos de neuronas. Utilizbamos actina como control de carga. (e) Anlisismediante inmunofluorescencia, en cultivos primarios de astrocitos y de neuronas, de laacumulacin de glucgeno utilizando un anticuerpo contra este polisacrido (GLG). Comomarcadores de astrocitos y neuronas utilizamos GFAP y -III-tubulina (TUJ1), respectivamente.

Otra posible explicacin sera que los niveles de MGS no fueran suficien-

tes. Por ese motivo, sobreexpresamos dicha enzima en estas clulas medianteadenovirus recombinantes. A pesar de aumentar drsticamente (ms de 12 ve-

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ces) el contenido de MGS, no observbamos ningn cambio en la sntesis deglucgeno (Figura 2b). En otros tipos celulares, aumentos menores de los nive-

les de MGS suponen un incremento en la acumulacin de glucgeno (65).La actividad de la GS se regula mediante fosforilacin y desfosforilacin.

La fosforilacin en mltiples residuos de serina (Ser) cerca de los extremos N-y C-terminales (68) genera formas menos activas. Varias quinasas estn impli-cadas en este proceso entre las que destacan GSK3 que fosforila las Ser640,Ser644, Ser448 y Ser652 o AMPK que fosforila la Ser7. El anlisis por westernblotmostr que la MGS en neuronas est altamente fosforilada en los residuosSer640 y Ser7/10, precisamente los sitios cuya fosforilacin desempea un pa-

pel ms importante en la actividad de la enzima (68) (Figura 2c, d). Ello man-tena a la enzima inactivada y, por lo tanto, silenciado el proceso de sntesis deglucgeno.

La MGS expresada en neuronas se encontraba principalmente localizada enel ncleo (Figura 2e, panel de arriba). Dicha situacin slo se observa en otrostipos celulares cuando se encuentran completamente deplecionados de reservasde glucgeno. Sorprendentemente, en neuronas la MGS muestra esta distribu-cin incluso cuando cultivamos estas clulas en presencia de altas concentra-ciones de glucosa (30 mM). En cambio, la mayora de astrocitos no presenta-ban tincin nuclear de MGS. Ah, la enzima se agrupaba en puntos discretos enel citoplasma, distribucin caracterstica de esta protena bajo condiciones desntesis activa de glucgeno (Figura 2e, panel de abajo).

A pesar de estar altamente inactivada, mediante el tratamiento de las neu-ronas con LiCl, un inhibidor de GSK3 (69), se consigui la activacin de la en-zima. En estas condiciones las neuronas acumulaban glucgeno (Figura 2e, pa-nel central) y se observaba un desfosforilacin moderada de la Ser640 (Figura2d). La MGS alteraba su localizacin subcelular y se acumulaba en sitios espe-

cficos del citoplasma, coincidiendo con las partculas de glucgeno crecientes(Figura 2e, panel central).

Un mecanismo ms efectivo para lograr la activacin de MGS requiere sudesfosforilacin intensiva mediante la protena fosfatasa 1 (PP1) (70). Esta fos-fatasa est implicada en la regulacin de diversos procesos celulares. Por estemotivo, juegan un importante papel sus subunidades reguladoras, que le con-fieren especificidad de sustrato (70). Se ha descrito una familia de protenas quedirigen PP1 hacia la molcula de glucgeno. Una de ellas es la PTG (71) que

se expresa en cerebro (72). PTG forma complejos entre PP1 y sus sustratos yacta como un andamio molecular ensamblando PP1 con sus sustratos en las

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FIGURA 2. Efecto del incremento de los niveles intracelulares de G6P en neuronas. Inactivacinde MGS por fosforilacin. (a)Los grficos muestran los niveles intracelulares de G6P (izquierda)

y el contenido de glucgeno (derecha) de neuronas que sobreexpresan glucoquinasa (N + GK) ohexoquinasa I (N + HK) y neuronas sin infectar (N). Un incremento de 5 veces en los nivelesintracelulares de G6P no incrementaba la acumulacin de glucgeno. Los niveles de G6P

representan la media s.e.m. (n= 5-7) de tres experimentos independientes. *P

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partculas de glucgeno. De esta manera, PTG estimula la desfosforilacin deGS y, en consecuencia, incrementa la acumulacin de glucgeno (71).

Para estudiar los efectos de la PTG en neuronas, utilizamos adenovirus re-combinantes que expresan esta protena fusionada a GFP, lo que nos permitaestudiar su localizacin intracelular y controlar sus niveles de expresin. El in-cremento en los niveles intracelulares de PTG supuso un gran estmulo en laacumulacin de glucgeno. El contenido de este polisacrido incrementaba demanera dramtica en las clulas neuronales, que pasaban de no acumular glu-cgeno a contener elevadas cantidades (Figura 3). El glucgeno acumulado de-penda de los niveles de PTG (Figura 3a) e incrementaba progresivamente con

el tiempo (Figura 3b). Mediante inmunofluorescencia pudimos observar que elglucgeno sintetizado se distribua por todo el soma celular pero tambin enneuritas y axones (Figura 3c).

La actividad de MGS incrementaba drsticamente con la PTG y se acerca-ba a valores prximos a la plena activacin (Figura 3d), tal como observbamosal determinar la relacin de actividades (G6P/+G6P), que es una medida no li-neal del estado de activacin del enzima. La activacin de MGS estimulada porPTG se corresponda con una desfosforilacin de la enzima en Ser640 y Ser7/10(Figura 3e), tal como observbamos por western blot. Adems, la enzima mos-traba una movilidad electrofortica incrementada, caracterstica del estado des-fosforilado (73).

Es importante resaltar que los niveles endgenos de la protena PTG en neu-ronas son bajos en comparacin con otras clulas. Adems, la relacin dePTG/MGS es muy baja en comparacin a lo que ocurre en msculo o astroci-tos (Figura 3f), lo que podra sugerir que en neuronas es ms difcil que la PP1acte sobre MGS.

Debido a que los cuerpos de Lafora estn formados principalmente por po-

lmeros de glucosa pobremente ramificados, analizamos el estado de ramifica-cin del glucgeno acumulado por las neuronas. Para ello aplicamos el mtodode Schlamowitz (74), consistente en determinar el espectro de absorcin delcomplejo del polisacrido con yodo. Para el glucgeno sintetizado en neuronasen respuesta a PTG el pico del complejo se daba a 511 nm, indicando que es-taba pobremente ramificado.

Para determinar el papel de laforina y malina en la generacin de los cuer-pos de Lafora, analizamos su capacidad para modular la acumulacin de gluc-

geno inducida por PTG. La estrategia consista en sobreexpresar laforina o mali-na junto con PTG. Dado que queramos sobreexpresar simultneamente de manera

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FIGURA 3. El incremento de los niveles de PTG en neuronas estimula la desfosforilacin de MGSy activa la acumulacin de glucgeno en estas clulas. (a) Contenido de glucgeno en neuronastratadas con AdCMV-PTG a baja (PTG50) y alta (PTG100) MOI. La sobreexpresin de PTG tena unmarcado efecto en la estimulacin de glucgeno en neuronas. El contenido de glucgeno representala media s.e.m. (n= 6-10) de tres experimentos independientes. (b) Contenido de glucgeno enneuronas tratadas con AdCMV-PTG a baja MOI (PTG50) despus de 2 y 3 das de expresin de la

protena recombinante. La acumulacin de glucgeno incrementaba progresivamente con el tiempodespus de la infeccin con el adenovirus. El contenido de glucgeno representa la media s.e.m.(n= 6-9) de tres experimentos independientes. (c) Inmunocitoqumica, utilizando un anticuerpo

contra glucgeno (GLG), de cultivos primarios de neuronas tratados con AdCMV-PTG (MOI 50).Utilizamos TUJ1 y Hoechst 33342 como marcadores de neuronas y ncleos, respectivamente. Comocontrol de la infeccin con adenovirus, las neuronas fueron tratadas con AdCMV-GFP (MOI 50).

El glucgeno se acumula en el soma celular y en las neuritas. (d)Relacin de actividades de MGS(G6P/+G6P) en neuronas tratadas con AdCMV-PTG a baja (PTG50) y alta (PTG100) MOI. Lasobreexpresin de PTG tena un marcado efecto en la estimulacin de la actividad de MGS. Larelacin de actividades de MGS representa la media s.e.m., n=6-12, de tres experimentosindependientes. (e) Western blot de neuronas tratadas (+) con AdCMV-PTG (MOI 100) o sin infectar(). Utilizamos anticuerpos que reconocan la MGS total o la MGS fosforilada en la Ser640 o enla Ser7/10. La sobreexpresin de PTG estimulaba la desfosforilacin de MGS en estos sitios. (f)

Anlisis mediante Real-Time PCR de la expresin de PTG y MGS. Los niveles de transcritos deMGS y PTG en msculo o astrocitos fueron comparados con los valores obtenidos en cultivos deprimarios de neuronas, a los que les fue asignado un valor de 1. La relacin entre los transcritosde PTG respecto a los de MGS (PTG/MGS) en neuronas era ms baja que en msculo o astrocitos.

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controlada varias protenas y que el nmero de condiciones experimentales eraelevado, trabajamos inicialmente en clulas Neuro2a diferenciadas (N2a), lnea

celular obtenida a partir de un neuroblastoma espontneo de un ratn albino y quehabamos mostrado que, por lo que respecta al metabolismo del glucgeno, ten-an un comportamiento similar a los cultivos primarios de neuronas (75). En lascondiciones en que laforina o malina eran expresadas cada una por separado jun-to con PTG, no observbamos ningn efecto en la acumulacin de glucgeno (Fi-gura 4a). No obstante, al sobreexpresar laforina y malina simultneamente juntoa PTG los resultados obtenidos fueron espectaculares, ya que se bloqueaba com-pletamente la sntesis del polisacrido (Figura 4a). Estos resultados demuestranque laforina y malina participan en el control del metabolismo del glucgeno.

Dado que malina tiene actividad E3 ubiquitina ligasa, pudiendo as estimu-lar la degradacin de protenas va proteasoma, decidimos estudiar si se produ-can variaciones en los niveles de las protenas implicadas en la sntesis del glu-cgeno. Mediante western blot, observbamos que en condiciones desobreexpresin conjunta de laforina y malina, se produca una reduccin drs-tica en los niveles de MGS y PTG (Figura 4b), tanto en N2a como en neuro-nas. Adems, los niveles de laforina tambin disminuan en presencia de mali-na (Figura 4b), aunque en menor medida. En cambio, los niveles intracelulares

de malina aumentaban sustancialmente cuando sta era coexpresada junto a la-forina (Figura 4b), sugiriendo que laforina estabiliza los niveles de malina. Porlo tanto, los niveles de malina estaban inversamente correlacionados con los deMGS, PTG y laforina. La reduccin en los niveles de MGS observada por wes-tern blot en las clulas que expresaban conjuntamente laforina y malina corre-lacionaba con una reduccin de la actividad total de esta enzima, que llegaba aser prcticamente indetectable (Figura 4c). Los efectos observados eran espec-ficos, ya que los niveles de otras protenas implicadas en el metabolismo delglucgeno, como hexoquinasa I o GSK3, no variaban (75). Para analizar la pro-

bable participacin del sistema ubiquitina-proteasoma en este proceso, utiliza-mos dos inhibidores del proteasoma: MG-132 y lactacistina (76). Ambos blo-queaban la reduccin de MGS, PTG y laforina inducida por la accin conjuntade laforina y malina (Figura 4d). Adems, medianteReal-Time PCR, confirma-mos que los niveles de transcripcin de MGS, PTG y laforina no estaban afec-tados, indicando que los cambios observados no eran causados por alteracionesen los niveles de transcripcin (75). Hay que hacer notar que la cantidad de ma-lina expresada en ausencia de laforina era ms elevada cuando las clulas eranincubadas con los inhibidores de proteasoma (Figura 4d). Esta observacin su-

giere que malina tambin es degradada por el sistema ubiquitina-proteasoma.En cultivos primarios de neuronas obtuvimos resultados similares (75).

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FIGURA 4. Bloqueo de la sntesis de glucgeno por laforina y malina. (a) Contenido de glucgenoen clulas N2a (media s.e.m., n= 14-23, de seis experimentos independientes) incubadas conlos adenovirus indicados en la figura, utilizados a una MOI de 20, con la excepcin del AdCMV-

PTG, el cual fue utilizado a una MOI de 5. La coexpresin de laforina y malina bloqueaba laacumulacin de glucgeno inducida por PTG. (b) Anlisis por western blot de clulas N2atratadas con adenovirus recombinantes en las mismas condiciones que se han descrito en a.MGS,

PTG y laforina experimentaban una marcada reduccin cuando coexpresbamos laforina ymalina. (c)Medida de la actividad total de MGS (+G6P) de clulas N2a (media s.e.m., n= 6-8, de tres experimentos independientes) despus de su infeccin con AdCMV-PTG, AdCMV-laf,

AdCMV-malina y AdCMV-GFP en las mismas condiciones que se han descrito ena

. Lacoexpresin de laforina y malina reduca la actividad total de MGS. (d) Western blot de clulasN2a incubadas con los adenovirus recombinantes indicados en la figura y tratadas durante 18 hcon los inhibidores del proteasoma MG-132 (M) a una concentracin de 1 M o lactacistina (L)a 5 M. Los inhibidores de proteasoma fueron aadidos 4 h despus de la incubacin con losadenovirus. Las clulas fueron procesadas para western blot 22 h despus de la infeccin. Todoslos virus fueron utilizados a una MOI de 10, excepto el AdCMV-PTG que fue utilizado a una MOIde 2. El tratamiento con los inhibidores de proteasoma bloqueaba la degradacin de MGS, PTG

y laforina observada en clulas que coexpresaban laforina y malina. Adems, incrementaba losniveles de malina bloqueando la marcada degradacin de esta protena que se produca cuando

no era coexpresada conjuntamente con laforina.

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Los dominios NHL de malina le permiten interactuar con laforina (62). Enalgunos enfermos de Lafora, se ha identificado la mutacin D146N que, sin al-

terar su actividad enzimtica, afecta a su capacidad para interaccionar con lafo-rina (62, 77). Al sustituir la malina de tipo salvaje por el mutante D146N no seproduca el bloqueo de la acumulacin de glucgeno (Figura 5a) y, en contras-te a la malina de tipo salvaje, el mutante no induca la degradacin de PTG,MGS o laforina (Figura 5b). Adems, los niveles del mutante D146N no pod-an ser estabilizados por laforina tal como ocurre con la malina de tipo salvaje(Figura 5b). El conjunto de estos resultados nos mostraba que la interaccin en-tre laforina y malina es crucial para su accin.

Si el complejo laforina -malina es capaz de reducir los niveles de MGS yPTG, la ausencia de cualquiera de los dos componentes del complejo debera re-sultar en unos niveles de MGS y PTG incrementados. As, conseguimos el si-lenciamiento de laforina en N2a usando oligonuclotidos de ARN de interferen-cia (siRNA) (Figura 5c). En esas clulas knockdown de laforina observbamos unmarcado incremento de los niveles de MGS y PTG en comparacin con aque-llas clulas transfectadas con los siRNA control (Figura 5d, e). Adems, estas c-lulas acumulaban ms glucgeno bajo condiciones glucognicas (Figura 5f).

Estos resultados desvelan un nuevo mecanismo de regulacin de la sntesis de

glucgeno en el que juegan un importante papel las dos protenas cuyas mutacio-nes causan la enfermedad de Lafora y ofrece una explicacin a la formacin de loscaractersticos cuerpos de Lafora. Estos datos, en conjunto, establecen la implica-cin del sistema laforina-malina en el control de la estabilidad de MGS y PTG y,por consiguiente, en la sntesis de glucgeno. Sin embargo, estos resultados hacenan ms intrigante el hecho de que las neuronas no acumulen glucgeno en con-diciones normales. La pregunta que surge a partir de esta informacin es porqulas neuronas han conservado la capacidad de sintetizar glucgeno, aunque mantie-nen la maquinaria inactivada con la participacin de un complicado proceso de de-gradacin de protenas que probablemente les supone consumir energa.

Existen varios ejemplos en que la acumulacin de inclusiones intracelula-res en neuronas tiene efectos devastadores para estas clulas. Tal es el caso delAlzheimer o la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob. Por lo tanto, era interesanteestudiar si las neuronas evitan a toda costa formar glucgeno por resultarles per-

judicial la acumulacin de polmeros de glucosa.

La apoptosis es un proceso de suicidio celular y es uno de los principales

tipos de muerte celular programada. Se trata de un conjunto de reacciones bio-qumicas que tienen lugar en una clula de un organismo pluricelular, encami-

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FIGURA 5. La interaccin entre laforina y malina es clave para ejercer su regulacin sobre elmetabolismo del glucgeno. (a) Contenido de glucgeno en clulas N2a (media s.e.m., n= 6-8,de tres experimentos independientes) incubadas con los adenovirus recombinantes indicados en la

figura, utilizados a una MOI de 5, con la excepcin del AdCMV-PTG, el cual fue utilizado a unaMOI de 3. El mutante D146N de malina no era efectivo en la inhibicin de la acumulacin deglucgeno. *p

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nadas, a diferencia de la necrosis, a producir la muerte de manera controlada.La membrana celular no se destruye durante el proceso de apoptosis, impidien-

do de esta manera que se libere su contenido intracelular al espacio extracelu-lar. Durante la apoptosis se producen dos eventos claves, la activacin de enzi-mas proteolticas (caspasas) y la condensacin y fragmentacin de la cromatina.Por este motivo, utilizamos dos pruebas que nos permitieran valorar si la acu-mulacin de glucgeno generaba apoptosis: la tcnica de TUNEL, que permiteteir los residuos de uridina de los fragmentos nucleares de DNA caractersti-cos de la apoptosis, y la activacin de caspasa-3, una de las principales protea-sas involucradas en el proceso de apoptosis. Sorprendentemente, si mantena-mos a las neuronas acumulando glucgeno durante perodos prolongados, se

produca un gran incremento en el porcentaje de clulas apoptticas, tal comoobservbamos con la tcnica TUNEL (Figura 6a) y en el porcentaje de neuro-nas que eran positivas para la caspasa-3 activada (Figura 6b). La activacin dela apoptosis dependa del tiempo que transcurra desde el inicio de la acumula-cin de glucgeno (Figura 6b).

El siguiente paso fue estudiar que ocurra en los astrocitos, que normal-mente acumulan glucgeno, cuando los forzbamos a acumular ms cantidad deeste polisacrido por sobreexpresin de PTG. En estas clulas no se produca

activacin de caspasa-3 (Figura 6c, d) a pesar de que acumulaban 20 veces msglucgeno que las neuronas en las mismas condiciones (Figura 6e) y, adems,sobreexpresaban niveles de PTG ms elevados (Figura 6c).

En base a estos resultados, parece lgico concluir que las neuronas evitenacumular glucgeno a toda costa ya que el polisacrido desencadena, en estasclulas, mecanismos de muerte. La induccin de la apoptosis por la acumula-cin de glucgeno abre un nuevo campo de investigacin ya que, hasta la fe-cha, era un proceso desconocido cuyo estudio nos puede deparar interesantesresultados. En cambio, los astrocitos, clulas que normalmente acumulan glu-

cgeno en gran parte para satisfacer las demandas energticas de las neuronas,no mueren cuando son forzados a acumular ms cantidad de glucgeno.

Nuestros resultados muestran que las neuronas tienen la capacidad de sin-tetizar glucgeno pero, en cambio, al no poseer GP, no pueden degradarlo. Noobstante, a pesar de expresar MGS, las neuronas normalmente no almacenaneste polisacrido ya que se ponen en funcionamiento toda una serie de meca-nismos con el objetivo de silenciar la actividad de MGS y, de esta manera, evi-tar la sntesis de glucgeno. Un gran nmero de datos apoyan esta conclusin.

De entrada, la relacin de actividades (G6P/+G6P) de la MGS es muy baja enneuronas y la enzima est fosforilada en los sitios ms importantes que regulan

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FIGURA 6. La acumulacin de glucgeno induce la apoptosis en cultivos primarios de neuronas. (a)

El porcentaje de clulas TUNEL-positivas (media s.e.m.) fue estimado en 8-14 campos (550-600 clulasen total) por cubre, tres cubres por cada condicin experimental correspondientes a tres experimentosdiferentes. La acumulacin de glucgeno fue inducida por expresin de PTG durante 4 das (AdCMV-

PTG, MOI 50). En la figura, GFP indica las clulas incubadas con AdCMV-GFP (MOI 50). Comocontrol positivo de apoptosis tratbamos las neuronas durante 24 h con estaurosporina a unaconcentracin de 0,1 M (SP). El glucgeno incrementa el nmero de neuronas TUNEL-positivas. (b)

Porcentaje de neuronas con caspasa-3 calculado mediante inmunofluorescencia utilizando un anticuerpocontra caspasa-3 activada y Hoechst 33342 como marcador de ncleos. Las clulas fueron tratadas enlas mismas condiciones que se han indicado en a. La acumulacin de glucgeno fue inducida porexpresin de PTG durante 1, 2, 3 y 4 das (AdCMV-PTG, MOI 50). El porcentaje de clulas que presentanactivacin de la caspasa-3 representa la media s.e.m. de 8-14 campos (550-600 clulas en total) porcada cubre, tres cubres por tratamiento correspondientes a tres experimentos diferentes (c) Anlisis

mediante western blot de la activacin de caspasa-3 en cultivos primarios de neuronas y astrocitos. Laacumulacin de glucgeno fue estimulada mediante la expresin de PTG durante 96 h (AdCMV-PTG,

MOI 50 en neuronas, MOI 10 en astrocitos). Como control de infeccin utilizamos el AdCMV-GFP (MOI50 en neuronas, MOI 10 en astrocitos). El asterisco indica la seal correspondiente a la caspasa-3activada. El panel inferior muestra un western blot utilizando el anticuerpo contra GFP. (d)Porcentajede astrocitos con caspasa-3 activada (media s.e.m., 9-14 campos (550-600 clulas en total) por cadacubre, tres cubres por tratamiento correspondientes a tres experimentos diferentes). La acumulacin deglucgeno fue inducida por expresin de PTG durante 1, 3 y 4 das (AdCMV-PTG, MOI 10). En la

figura, GFP indica las clulas incubadas con AdCMV-GFP (MOI 10). Como control positivo de apoptosistratbamos los astrocitos durante 24 h con estaurosporina a una concentracin de 0,1 M (SP). (e)

Diferencias entre los niveles intracelulares de glucgeno en neuronas y astrocitos. Contenido deglucgeno en clulas tratadas con AdCMV-PTG durante 72 h (AdCMV-PTG, MOI 50 en neuronas, MOI10 en astrocitos). El contenido de glucgeno representa la media s.e.m. (n= 4-6) de tres experimentosindependientes. PTG induce una mayor acumulacin de glucgeno en astrocitos que en neuronas.

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su activacin, lo que indica que se encuentra altamente inactivada. Adems, todauna serie de estmulos que normalmente logran activar la sntesis de glucgeno

resultan infructuosos en neuronas. En la mayora de tipos celulares un aumen-to de los niveles de G6P conlleva una activacin de GS y un incremento en elcontenido de glucgeno (64, 65). Sin embargo, este no es el caso de las neuro-nas, lo que indica que la concentracin de G6P no es una seal para desenca-denar la sntesis de glucgeno en estas clulas. Esta insensibilidad de MGSa la activacin por G6P podra ser una consecuencia de su estado hiperfosfori-lado, que reduce la afinidad de MGS por G6P (66, 78, 79). La insensibilidada G6P podra tener una explicacin fisiolgica ya que en condiciones de eleva-da actividad neuronal y, por lo tanto, de elevada demanda energtica, los nive-

les de G6P podran incrementar debido a una mayor entrada de glucosa. EstaG6P debe de ser dirigida a la va de la gluclisis para satisfacer las demandasenergticas y asegurar el correcto funcionamiento del sistema nervioso, por loque las neuronas se muestran prevenidas para evitar la acumulacin de gluc-geno inducida por G6P ya que necesitan este metabolito para obtener energa.Adems, los efectos pro-apotticos de la acumulacin de glucgeno en neuro-nas podran ser tambin una buena razn para bloquear la estimulacin de MGSpor G6P, cuyo incremento se puede producir en situaciones fisiolgicas.

Otro evidencia de la gran capacidad que tienen las neuronas para inactivarMGS es el hecho de que pueden llegar a silenciar niveles muy incrementadosde esta enzima. La sobreexpresin de MGS en neuronas no conduce a la acu-mulacin de glucgeno ya que la enzima es fosforilada en los sitios ms im-portantes implicados en su regulacin. No obstante, estas clulas sintetizan glu-cgeno si bloqueamos mediante litio la accin inactivadora de GSK3 sobre laMGS. Por lo tanto, las neuronas pueden sintetizar glucgeno si se consigue dis-minuir la fosforilacin de MGS. La prueba ms evidente de esta capacidad laobtuvimos al incrementar los niveles intracelulares de PTG. La sobreexpresin

de esta protena conduce a la sntesis masiva de glucgeno como consecuenciade la activacin prcticamente total de la MGS por desfosforilacin. Por lo tan-to, la PTG podra jugar un fundamental en el metabolismo del glucgeno neu-ronal. Sin embargo, los niveles endgenos de PTG en neuronas son bajos encomparacin con otras clulas que normalmente sintetizan glucgeno. Adems,el hecho de que la relacin entre los transcritos de PTG respecto a los de MGSsea tan baja en comparacin con el msculo o los astrocitos, indica que la ac-tivacin de la MGS por PTG no est favorecida en neuronas. Estos datos su-gieren que la facilidad de las neuronas para inactivar a la MGS por fosforila-

cin, unida a su poca capacidad para revertir este proceso, puede ser fundamentalpara mantener la sntesis de glucgeno a cero. A este bien coordinado proceso

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de regulacin de la sntesis de glucgeno se suma la accin de las dos prote-nas cuya alteracin da lugar a la enfermedad de Lafora, es decir, laforina y ma-lina. Estas protenas, a travs de la formacin de un complejo entre ambas, soncapaces de regular los niveles intracelulares de MGS y PTG mediante el siste-ma ubiquitina-proteasoma (Figura 7) ejerciendo as un papel clave en la regu-lacin de la sntesis de glucgeno. De hecho, se trata de un mecanismo muy po-tente de regulacin ya que es capaz de inducir la degradacin de las dos protenas

claves para sintetizar glucgeno, es decir, la enzima capaz de formar polmerosde glucosa y la protena que permite su activacin. Por lo tanto, los datos mos-trados proporcionan un enlace molecular entre el fallo en la funcin de lafori-na o malina y la acumulacin anmala de glucgeno en neuronas en pacientescon enfermedad de Lafora.

Este mecanismo era completamente desconocido hasta ahora y puede serfundamental no tan solo para entender la enfermedad de Lafora y otras enfer-medades que cursen con acumulacin de poliglucosanos en neuronas, sino que

establecen el papel de estos dos nuevos jugadores en el metabolismo del glu-cgeno. La accin del complejo laforina-malina se suma a los bien conocidos

FIGURA 7. Esquema general de la funcin del complejo laforina-malina en la regulacin

del metabolismo del glucgeno en neuronas.

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de activacin alostrica y regulacin por fosforilacin/desfosforilacin, con elque est estrechamente relacionado ya que tambin regula los niveles intrace-

lulares de PTG. As, el complejo laforina-malina ejerce un control adicional su-perpuesto a los mecanismos de regulacin previamente conocidos y aade unnuevo nivel de complejidad al control global de la sntesis de glucgeno. Aun-que pudiera ser predominante en neuronas, este mecanismo est probablemen-te implicado en la regulacin de la sntesis de glucgeno de manera ms gene-ral, ya que la expresin de laforina y malina no est restringida a neuronas.Probablemente, funcione para prevenir el exceso de sntesis de glucgeno enciertos tejidos o detener su sntesis bajo condiciones fisiolgicas especficas.

Una de las caractersticas ms intrigantes del sistema es que malina, ademsde interaccionar con laforina, promueve su degradacin. Y es intrigante porque pa-rece estar en conflicto con una de las caractersticas de la enfermedad, es decir, elhecho de que mutaciones recesivas tanto en una protena como en la otra dan lu-gar a la patologa. Nosotros proponemos que la degradacin de laforina podra serun interruptor de seguridad. Es decir, cuando los niveles de laforina son bajos nose forma el complejo laforina-malina y entonces la degradacin de MGS y PTGse detiene. Cuando malina est unida a laforina, se activa la degradacin de staltima junto con la de MGS y PTG. As llega un momento en que los niveles de

laforina son insuficientes con lo que se detiene la degradacin de MGS y PTG. Porlo tanto, la degradacin de laforina permitira a malina autorregularse. Adems, losniveles de malina tambin se ven reducidos en ausencia de laforina, a travs delsistema ubiquitina-proteasoma. Este hecho nos sugiere que cuando los niveles delaforina son reducidos la malina se degrada; lo que contribuira a detener su accinsobre sus protenas diana. Esta doble regulacin debera asegurar que MGS y PTGno se degradan ms all de lo necesario. Siguiendo esta lnea, la autorregulacindel sistema no acaba aqu porque tambin funciona en sentido inverso. A medidaque los niveles de malina van reducindose, llegar el momento en que los nive-

les de laforina vuelvan a aumentar al no ser degradada. De esta manera, laforinavuelve a interaccionar con malina y, de nuevo, se estabilizan los niveles de la ubi-quitina ligasa. El control de la degradacin de ambas protenas podra ser muy im-portante en clulas que normalmente sintetizan glucgeno.

Nuestros resultados muestran adems que la acumulacin de glucgeno de-riva en problemas para las neuronas. Un fallo en el mecanismo que mantiene aMGS bajo control puede tener efectos letales para estas clulas debido a que al-macenar glucgeno conlleva su entrada en apoptosis. Sin duda, este es uno de

los resultados ms sorprendentes de nuestro trabajo y puede dar un nuevo en-foque al estudio del metabolismo del glucgeno en cerebro. Los efectos apop-

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tticos del glucgeno parecen ser especficos de neuronas ya que, por ejemplo,no tiene este efecto en astrocitos, clulas que normalmente acumulan este poli-

sacrido. El hecho de que el glucgeno induzca la apoptosis en neuronas nospermite responder a la pregunta de porqu las neuronas, a pesar de tener la ma-quinaria, ponen en funcionamiento toda esta serie de sistemas bien coordinadoscon el objetivo de evitar la sntesis de glucgeno. Por lo tanto, parece que es-tas clulas tienen una relacin ambivalente con el glucgeno ya que, por un lado,se benefician de su acumulacin en los astrocitos mientras que, por el otro, silo almacenan en su interior se activa la apoptosis. En relacin a los beneficiosque tiene para las neuronas la acumulacin de glucgeno en astrocitos, se hadescrito que el incremento de este polisacrido en la gla tiene un efecto neu-

roprotector (2, 80). Una de las definiciones que resume a la perfeccin el pro-ceso es que el glucgeno acta como un caballo de Troya en neuronas (81). Esprobable que estos efectos sean el motivo por el cual estas clulas mantenganactivos una serie de procesos bien coordinados que impidan la acumulacin deglucgeno a pesar de ser muy complejos y de que probablemente consumanenerga (interacciones protena-protena, degradacin de protenas,).

Hay que hacer notar que la activacin de MGS en neuronas da lugar a un glu-cgeno pobremente ramificado que adems tendr problemas para ser degradado ya

que no encontramos cantidades detectables de GP. Todos estos factores reflejan lanecesidad de mantener bajo control la sntesis de glucgeno y, probablemente, elcomplejo laforina-malina tenga un papel importante para prevenir la acumulacinde una molcula potencialmente peligrosa para las neuronas. La alteracin de estesistema explicara la acumulacin en la enfermedad de cuerpos de inclusin de com-posicin similar al glucgeno. De momento, desconocemos el alcance que tiene estefenmeno en las manifestaciones clnicas de la enfermedad de Lafora. Aunque nues-tros resultados son consistentes con la hiptesis de que en esta enfermedad el glu-cgeno da lugar a alteraciones en la funcin neuronal, no podemos excluir la posi-

bilidad de que existan otras dianas potenciales del complejo laforina-malina quetambin estn implicadas en la patognesis de la enfermedad de Lafora.

Aunque hemos ofrecido nuevas respuestas y aclaraciones a la enfermedad deLafora y a la regulacin del glucgeno en cerebro, este trabajo plantea algunascuestiones sobre las que podra ser muy interesante profundizar en un futuro. Porejemplo, a travs de qu mecanismos la acumulacin de glucgeno desencade-na la apoptosis en neuronas? Por qu los astrocitos y otras clulas son inmunesa los efectos proapotticos de la acumulacin de glucgeno? Existen otras clu-

las sensibles de esta manera a la acumulacin de glucgeno? Adems, todavaqueda por elucidar el enlace real entre la acumulacin de glucgeno y el fenoti-


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po clnico de la enfermedad de Lafora por qu los sntomas empiezan a partir deuna determinada edad? Por ejemplo, los niveles de expresin de PTG tambin po-

dran variar en funcin del estado hormonal. De hecho, ya se han descrito cam-bios de su expresin en cerebro en funcin de varias hormonas y neuromodula-dores (72), por lo que podran tener lugar determinadas situaciones en las que elcomplejo laforina-malina deba funcionar al mximo para controlar a PTG. Qui-zs, exista un estmulo que desencadene la activacin de MGS en neuronas enuna determinada edad y que necesite al complejo laforina-malina a pleno rendi-miento. O quizs el hecho de que laforina o malina fallen desde el inicio provo-que que se vaya acumulando glucgeno poco a poco hasta llegar a un punto enel que sea neurotxico. Otras aspectos que permanecen desconocidos son, por

ejemplo, el sustrato de la actividad fosfatasa de laforina, la importancia y la fun-cin de su actividad como fosfatasa de carbohidratos, la bsqueda de otras posi-bles dianas del complejo laforina-malina y la profundizacin en la regulacin deeste complejo. Otro de los misterios de la enfermedad de Lafora es la identidaddel tercer gen implicado que se postula est afectado en aproximadamente un 10%de los pacientes Tendr un papel en el metabolismo del glucgeno?

Sin duda, una de las preguntas ms interesantes es por qu las neuronas es-tn dotadas con el potencial para sintetizar glucgeno, si deben activar sistemas

complejos para mantenerlo inactivo. Una posibilidad es que la estructura gen-mica del gen que codifica para la MGS (gys1) no permita el silenciamiento dela expresin de esta enzima sin interferir con la expresin de otros genes rele-vantes para la correcta funcin neuronal o que, simplemente, debido a su im-portancia para el funcionamiento del organismo este gen est programado ini-cialmente para expresarse de manera ubicua. Aunque la hiptesis ms interesantees que MGS pueda tener un papel independiente de la capacidad de sintetizarglucgeno y que pueda tener una funcin importante en neuronas. El hecho deque se acumule en el ncleo podra ser relevante para esta hipottica funcin

alternativa.La enfermedad de Lafora podra ser considerada el paradigma de las en-

fermedades neurolgicas que acumulan glucgeno por la edad en que se ma-nifiestan sus sntomas, su rpida progresin y sus dramticas consecuencias.Sin embargo, la acumulacin de polmeros de glucosa tambin tiene lugar enotras enfermedades neurolgicas o neurodegenerativas y en aquellas asociadascon el envejecimiento. Una vez demostrados los efectos deletreos de la acu-mulacin de glucgeno en neuronas, no podemos dejar de formular la teora

de que la acumulacin de glucgeno aberrante pueda estar implicada en la neu-rodegeneracin o contribuir a los sntomas de algunas de estas enfermedades.

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Es decir, que los efectos neurotxicos del glucgeno sean un fenmeno msgeneralizado y no especfico de la enfermedad de Lafora. Nosotros planteamos

que esta enfermedad sea uno de los casos ms extremos donde la acumulacinde glucgeno tiene unos efectos ms claros y graves. En este caso, al fallar di-rectamente los guardianes del metabolismo del glucgeno se dispara su acu-mulacin y los efectos neurotxicos se observan rpidamente y de manera drs-tica. Quizs, en otras enfermedades, los cambios sobre el metabolismo delglucgeno son ms sutiles y el polisacrido se acumula de forma ralentizadarespecto a la enfermedad de Lafora. La posibilidad de que la acumulacin deglucgeno est implicada en varias enfermedades neurodegenerativas podraabrir un nuevo campo de investigacin hacia la bsqueda de estrategias tera-

puticas preventivas que permitan controlar el metabolismo del glucgeno. Talvez, estos resultados sean la punta de lanza que le den una nueva dimensin alestudio de la formacin de depsitos de polmeros de glucosa en neuronas ysirvan para dar relevancia a este proceso. La lista de enfermedades neurolgi-cas que cursan con acumulacin de glucgeno es extensa. En algunas de ellas,los efectos pueden parecer ms obvios mientras que en otros probablemente re-presenten un papel menor ya que la deposicin de otras molculas parece te-ner mucha ms importancia relativa. Existe una amplia variacin en el nme-ro de PGBs hallados que depende de la edad y de la enfermedad neurolgica.

Entre estas enfermedades, podemos encontrar las clsicas donde la acumula-cin de glucgeno anmalo se ha descrito como una caracterstica inseparable:La enfermedad de Bielschowsky, la enfermedad de los cuerpos de poligluco-sano del adulto y la enfermedad de Anderson. No hay que dejar de lado loscuerpos amilceos, cuyo estudio se ha descuidado durante mucho tiempo de-bido a su aparente irrelevancia en enfermedades neurolgicas. Estos depsitosestn formados principalmente por polisacridos, y presentan una composicinmuy similar a los cuerpos de Lafora con una estructura ms similar al almidnque al glucgeno. La cantidad y dimensiones de estos cuerpos de inclusin sonextraordinariamente bajas en jvenes. Sin embargo, a partir de los 30-40 aosse vuelven mucho ms grandes y su nmero incrementa drsticamente. Su ta-mao y nmero crecen de manera constante despus de los 50 aos, siendo mu-cho ms numerosos en casos como el Parkinson. Por este motivo se asocian alenvejecimiento y existe una opinin general basada en evidencias anecdticasde que enfermedades neurolgicas crnicas estn asociadas con un incremen-to en su nmero, como el Alzheimer y la esclerosis mltiple (82). Por ejem-plo, en la corteza cerebral de enfermos de Alzheimer se ha descrito la acumu-lacin de PGBs (83). Tambin se ha visto en estudios post-mortem que sucantidad incrementa en enfermos con encefalopatas vasculares (84). Existen


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trabajos que sugieren que los cuerpos amilceos podran ser un indicador deneurodegeneracin (85). En otras situaciones patolgicas, tambin se ha en-

contrado una acumulacin masiva de estos cuerpos amilceos, como en epi-lepsias del lbulo temporal (86-88). La cuantificacin del contenido de gluc-geno en cerebro de pacientes con epilepsia del lbulo temporal, muestra unincremento de su contenido en cerebro (89). Otras situaciones patolgicasmuestran tambin una deposicin de glucgeno en determinadas neuronas. Porejemplo, la administracin de drogas psicotrpicas (como la clorpromazina), laisquemia y la hipoxia. Tambin se han observado acumulaciones de glucge-no en las neuronas adyacentes a tumores cerebrales. Adems, se han observa-do depsitos de glucgeno en neuronas de pacientes diabticos que muestran

neuropata y en ratas diabticas crnicas.Esperamos que este trabajo d lugar a un renovado inters sobre el meta-

bolismo del glucgeno en cerebro, un campo que se ha desarrollado de maneradiscreta aunque constante durante los ltimos 25 aos. Adems, confiamos quecontribuya a encontrar nuevas terapias que ayuden a combatir la enfermedad deLafora, que resulta tan terrible tanto para los pacientes como para los familia-res. Quizs, los efectos neurotxicos del glucgeno puedan ser extrapolados aotras enfermedades con lo que se podran desarrollar nuevas terapias que ten-

gan en cuenta la acumulacin de este polisacrido como un factor clave.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a Susana Ros, Daniel Cifuentes, Llus Pujadas, Jordi Valls, Be-ln Garca-Fojeda, Olga Criado-Garca, Elena Fernndez-Snchez, Iria Medrao-Fer-nndez, Jorge Domnguez, Mar Garca-Rocha y Eduardo Soriano su contribucin aeste trabajo. Agradecemos a Emma Veza y Anna Adrover su ayuda tcnica y a Jos

Mara Serratosa y Pascual Sanz su asesoramiento. Este estudio fue financiado me-diante subvenciones deFundaci La Caixa,Fundaci la Marat de TV3, FundacinMarcelino Botn, por el Ministerio de Educacin y Ciencia (SAF2005-00913;BFU2005-02253), por el Instituto de Salud Carlos III (CIBER-ER y CIBERDEM)y por la Generalitat de Catalunya (2005-SGR-00570).

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