Upload
natividad-acosta-botella
View
217
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Actividad de los antimicrobianos frente a las biocapas bacterianas
Isabel García LuqueDepartamento de Microbiología
Universidad de Sevilla
Infecciones asociadas a dispositivos médicos
Aumento considerable de dispositivos médicos. Alta incidencia de infecciones.
Infecciones persistentes que responden poco/mal a tratamientos convencionales.
Resistencia/ tolerancia a los antimicrobianos.
Infecciones asociadas a dispositivos médicos.
Implante nº /año Infecciones Mortalidad
Catéter intravascular 200.000.000 <0,1-7% 15-20%
Sonda uretral 5.000.000 5-10%
Shunts LCR 80.000 10-15%
Marcapasos 60.000 0-3% 2%
Válvulas protésicas 100.000 1-5% 34%
Prótesis articulares 350.000 <1-2% 2,5%
Implantes dentales 436.000 15%
Infecciones asociadas a dispositivos médicos
DevicePrevalent causative pathogens
Principal Secondary
Central venous catheters CoNS S. aureus, enterococci, Candida spp., K. pneumoniae, P. aeruginosa.
Urethral catheters E. coli Candida spp., CoNS, E. faecalis, P. mirabilis.
Mecanical heart valves CoNS S. aureus, Streptococcus spp., GNB, enterococci, diptheroids.
Ventricular assist devices CoNS S. aureus, Candida spp., P. aeruginosa.
Coronary stents S. aureus CoNS, P. aeruginosa, Candida spp.
Neurosurgical ventriclar shunts Staphylococci Streptococcus spp., Corynebacterium, GNB.
Peritoneal dialysis catheters S. aureus P. aeruginosa, other Gram-negative spp., Candida spp.,
Orthopedic prostheses Staphylococci S. pneumoniae, Streptococcus spp., P. acnes.
Fracture-fixation devices CoNS S. aureus, Propionibacterium spp., Corynebacterium,
Endotracheal tubes Enteric GNB P. aeruginosa, Streptococcus spp., Staphylococcus spp.
Inflatable penils implants CoNS S. aureus, enteric GNB, P. aeruginosa, Serratia spp., fungi.
Breast implants Staphylococci E. coli, peptostreptococci, C. perfringens, P. acnes.
Cochlear implants S. aureus P. aeruginosa, Streptococcus spp., N. meningitidis, fungi.
¿Cómo actuar?: Retirada/cambio del dispositivo. Tratamiento antimicrobiano prolongado
a altas dosis.
Reintervención difícil. Única opción: tratamiento
antimicrobiano.
Costes elevados
Actividad antimicrobiana –biocapas bacterianas
Huésped Microorganismo. Antimicrobiano.
DISPOSITIVO MÉDICO
Comunidad de microorganismos, incluidos dentro de una matriz extracelular, que se encuentran adheridos a una superficie o en una interfase y que poseen un estado metabólico diferente del de las bacterias de vida libre.
J.W.Costerton. The Biofilm Primer
Biocapas bacterianas:
Fase inicial: inespecífica, reversible. Interaccionesa larga distancia (>150 nm).
− Fuerzas de Van der Waals− Gravitación− Interacciones electrostáticas− Hidrofobicidad
Formación de las Biocapas. Adherencia
− Enlaces de hidrógeno− Enlaces covalentes− Interacciones iónicas− Hidrofobicidad− Moléculas bacterianas
(adhesinas, GPS) Fase secundaria: específica, irreversible. Interacciones
a corta distancia (<3 nm).
Una vez adheridas, las bacterias comienzan a multiplicarse hasta que se desarrolla la biocapa madura.
Formación de las Biocapas.
La estructura de la biocapa no es homogénea.
“Mecanismo bacteriano de comunicación intercelular controlando la expresión génica en función de la densidad celular”.
En el proceso de desarrollo de la biocapa, se establece una comunicación entre las bacterias (quorum sensing).
Eficacia de los antimicrobianos frente a las biocapas bacterianas.
Penetrar a través de la densa matriz de la biocapa.
Mantener su actividad bactericida: En las diferentes condiciones
microambientales. Frente a bacterias de crecimiento lento.
Presentar baja tasa de desarrollo de resistencias
Resistencia de las biocapas bacterianasa los antimicrobianos
Resistencia innata. Mecanismos adicionales, diferentes a los de las
bacterias planctónicas. CMB biocapas >> CMB planctónicas. Las bacterias recuperan rápidamente su
sensibilidad cuando se liberan de la biocapa.
Mecanismos de resistencia a los antimicrobianos en las biocapas bacterianas:
Inadecuada exposición al antimicrobiano (permeabilidad reducida).
Alteraciones en el metabolismo bacteriano: Baja tasa de crecimiento Heterogeneidad fenotípica
Resistencia inducida por los biomateriales
Mecanismos de resistencia a los antimicrobianos en las biocapas bacterianas:
Inadecuada exposición al antimicrobiano (permeabilidad reducida). Pseudomonas aeruginosa: alginato- imipenem y
tobramicina. Staphylococcus aureus: slime - glicopéptidos.
Actividad dependiente de la estructura /composición química de la biocapa y tamaño/composición química del antimicrobiano.
Estudios de Permeabilidad
1 1 MH agar. 2,4 Membranas de policarbonato. 3 Biocapas. 5 Disco de antimicrobiano
1
5
43 21
5
43 2
Permeabilidad de CIP, AMC, FOS y SXT en biocapas de P. aeruginosa y E. coli
FOSFOMICINA
0,025,050,0
75,0100,0125,0150,0
175,0200,0
1 3 6
Tiempo en horas
µg
de
anti
mic
rob
ian
o
E. coli E. coli BLEE+ P. aeruginosa
50%
AMOXICILINA-CLAVULANICO
0,05,0
10,015,0
20,025,030,0
1 3 6
Tiempo en horas
µg
de
a
nti
mic
rob
ian
o
E. coli E. coli BLEE+ P. aeruginosa
50%
COTRIMOXAZOL
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
1 3 6
Tiempo en horas
µg
de
anti
mic
rob
ian
o E. coli E. coli BLEE+ P. aeruginosa
50%
CIPROFLOXACINO
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
1 3 6
Tiempo en horas
µg
de
anti
mic
rob
ian
o E. coli E. coli BLEE+ P. aeruginosa
50%
Mecanismos de resistencia a los antimicrobianos en las biocapas bacterianas:
Alteraciones en el metabolismo bacteriano: Tasa de crecimiento reducida:
• Pseudomonas aeruginosa /betalactámicos.
• Staphylococcus epidermidis/ ciprofloxacino.
• Diferentes condiciones microambientales: ácido/básicas, aeróbicas/anaeróbicas• P. aeruginosa / tobramicina.
Mecanismos convencionales de resistencia a los antimicrobianos.
Mecanismo de resistencia Especies bacterianas Antimicrobianos
Impermeabilidad de las biocapas a los agentes antimicrobianos
P. aeruginosaAminoglucósidos,
Betalactámicos
S. epidermidisS. aureus
Vancomicina, Teicoplanina
Tasa alterada de crecimiento
P. aeruginosaE. coli
Betalactámicos
S. epidermidisS. aureus
Fluoroquinolonas
El microambiente de las biocapas afecta a la actividad antibacteriana
Característica general de las biocapas
Aminoglucósidos, Macrolidos, Tetraciclinas
Mecanismos de resistencia expresados en bacterias
planctónicasP. aeruginosa
Azitromicina, Betalactámicos,
Tobramicina
Elementos genéticos de transferencia horizontal
EnterobacteriaceaeBetalactámicos,
Aminoglucósidos
Mecanismos de resistencia de las biocapas bacterianas:
Resistencia inducida por biomateriales:P. aeruginosa y látex siliconizado:
La actividad de las carbapenemas disminuye en presencia de este biomaterial.
(J Med Microbiol 1997).
Relacionado con las OMPs (pérdida de oprD2).(Antimicrob Agents Chemother. 1999)
Inducida por el Zn liberado al medio. (Antimicrob Agents Chemother. 2003)
OMPs de P. aeruginosa: Efecto del zinc
MC. Conejo et al.; Antimicrob Agents Chemother. 2003
CzcCBA: Bomba de expulsión responsable de la co-resistencia a carbapenemas y metales pesados.
Perron K. et al. J Biol Chem 2004; 279: 8761-8768.
“Comparison of biofilm-associated cell survival following in vitro exposure of meticillin-resistant Staphylococcus aureus biofilms to the antibiotics clindamycin, daptomycin, linezolid, tigecycline and vancomycin”. Smith et al. Smith et al. Int J Antimicrob Agents. 2009
Limitaciones estudios in vitro:
Formación proceso complejo: Muchos factores. Difícil reproducir in vitro.
Resultados controvertidos. Cautela a extrapolar in vivo.
Métodos de estudio in vitro
Modelos estáticos: Formación de las biocapas:
Placas de microdilución. Incubación de segmentos.
Exposición de la biocapa al antimicrobiano
Ventajas: Muchos antimicrobianos, diferentes concentraciones.
Inconvenientes: Modelo estático, tiempos cortos, poliestireno
Efecto de daptomicina sobre la formación de biocapas
MRSAMRSA MSSAMSSA
VISAVISA
MSSEMSSEMRSEMRSE
>75%>75%>70%>70%
>90%>90%
70-90%70-90%
80%80%
Roveta et al. Roveta et al. Int J Antimicrob Agents 2008
Adherencia bacteriana a biomateriales plásticos
Catéter S. aureus S. epidermidis E. coli P. aeruginosa
Latex siliconizado 27 ±3 18 ±2 19 ±2 24 ±3
PVC 42 ±5 23 ±3 18 ±2 41 ±4
Teflon 11 ±1 7 ±0,4 3 ±0,1 10 ±1
Poliuretano 15 ±1 4 ±0,6 9 ±0,1 13 ±1
Vialon 7 ±1 5 ±0,3 4 ±0,2 11 ±1
López et al. J. Med Microbiol. 1991.
Bacterias adheridas x 105/cm2
Cultivo continuo. Sistema de flujo laminar.Cultivo continuo. Sistema de flujo laminar.
Dispositivo de Robbins
Métodos de estudio in vitroModelos dinámicos
Modelo dinámico
Sevilla device Cultivo continuo. Sistema de flujo laminar. Utilizar segmentos de catéteres.
Poliuretano. Biocapas de 24 h
Acero inoxidable. Biocapas de 96h.
Actividad de antimicrobianos frente a microorganismos Gram positivos resistentes
Daptomicina / Biometales
Cepas: Staphylococcus epidermidis ATCC 35984 (ica +: productora de
slime). CMI:
Daptomicina 0.5 mg/LVancomicina 2.0 mg/L
Biomateriales: Segmentos de catéteres de poliuretano (3 cm; 7 french). Discos de acero inoxidable 316L (diámetro: 8 mm).
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
1,00E+09
0 24 48
Tiempo (h)
ufc
/cm
2
Control 20mg/L Daptomicina 20mg/L Vancomicina
Poliuretano. Biocapas de 24 h
* p<0.05 comparada con vancomicina
*
*
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
1,00E+09
0 24 48 72
Tiempo (h)
ufc
/cm
2
Control 20mg/L Daptomicina 20mg/L Vancomicina
Acero inoxidable. Biocapas de 96h.
* p<0.05 comparada con Vancomicina
* *
*
Figura 2. Microscopía electrónica de barrido de las biocapas de 72 horas de S. epidermidis sobre catéteres de poliuretano usando el dispositivo diseñado por nuestro grupo sin antimicrobiano (a) y expuesto a 7.5mg/L de daptomicina (b)
a) b)
Linezolid / Biometales
Actividad comparativa de linezolid y vancomicina frente biocapas bacterianas de 96 horas sobre acero inoxidable a distintos tiempos.
ufc
/cm
2
1,00E+02
1,00E+04
1,00E+06
1,00E+08
1,00E+10
0 1 2 3 7Tiempo (días)
Control Linezolid+Rifampicina Vancomicina+Rifampicina
1,00E+02
1,00E+04
1,00E+06
1,00E+08
1,00E+10
0 1 2 3 7Tiempo (días)
Control Linezolid+Rifampicina Vancomicina+Rifampicina
*
**
*
ufc
/cm
2
1,00E+02
1,00E+04
1,00E+06
1,00E+08
1,00E+10
0 1 2 3 7Tiempo (días)
Control Linezolid+Rifampicina Vancomicina+Rifampicina
1,00E+02
1,00E+04
1,00E+06
1,00E+08
1,00E+10
0 1 2 3 7Tiempo (días)
Control Linezolid+Rifampicina Vancomicina+Rifampicina
*
**
*
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
1,00E+09
1,00E+10
0 1 2 3 7Tiempo (días)
Control Linezolid Vancomicina
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
1,00E+09
1,00E+10
0 1 2 3 7Tiempo (días)
Control Linezolid Vancomicina
ufc
/cm
2
Tiempo (días)
**
***
*
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
1,00E+09
1,00E+10
0 1 2 3 7Tiempo (días)
Control Linezolid Vancomicina
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
1,00E+09
1,00E+10
0 1 2 3 7Tiempo (días)
Control Linezolid Vancomicina
ufc
/cm
2
Tiempo (días)
**
***
*1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
1,00E+09
1,00E+10
0 1 2 3 7Tiempo (días)
Control Linezolid Vancomicina
ufc
/cm
2
Tiempo (días)
**
***
***
***
*
Linezolid / Biometales
Actividad de linezolid y vancomicina asociados a rifampicina frente biocapas bacterianas de 96 horas sobre acero inoxidable a distintos tiempos.
Nuevas estrategias frente a las biocapas bacterianas
Impedir la formación de la biocapa: Bloqueando la adherencia:
Biomateriales impregnados con biocidas o antimicrobianos. Moléculas antisentido que silencien los genes involucrados en la
adherencia Inhibidores del quorum
sensing.
Adhesión inicial Adherencia Colonización
Tra
nsp
ort
e d
e m
asas
Inte
racc
ion
es e
lect
rost
átic
as
Van
der
Waa
ls
Ad
hes
ina-
rece
pto
r
Inte
racc
ion
es
hid
rofó
bic
as
Fo
rmac
ión
d
e B
ioca
pa
BIOMATERIAL
Quorum
Sensing
Nuevas estrategias terapéuticas frente a las biocapas bacterianas
Eliminar la biocapa formada: Métodos físicos: corriente eléctrica de baja intensidad,
ultrasonidos Terapia fotodinámica (PDT)
Efecto del tiempo de incubación con hipericina en la actividad fotodinámica antimicrobiana frente a biocapas estafilocócicas.Sofía Ballesta1, Isabel García1, Yolanda Gilaberte2, Antonio Rezusta3, Álvaro Pascual1,4.
Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina. Universidad de Sevilla1. Unidad de Dermatología, Hospital San Jorge, Huesca2. Departamento de Microbiología, Hospital Universitario Miguel Servet. Universidad de Zaragoza. Zaragoza3. Unidad de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. Hospital Universitario Virgen Macarena. Sevilla4.
Material y métodosCepas:
S. aureus ATCC 29213 y ATCC 33591 (productora y no productora de slime)
S. epidermidis ATCC 35984 (productora de slime).Actividad de hipericina (0.04-500 uM):
Bacterias en suspensión: 5 min de preincubación y dosis de luz de 8 J/cm2 (lámpara LED 602±10 nm; intensidad 24 mW/cm2, 10 min tto).
Biocapas de 24 horas formadas sobre placas
de poliestireno:
Diferentes tiempos de preincubación
30 J/cm2 (30 min tto)
Resultados
Cinco minutos de preincubación con hipericina 1µM fueron suficientes para eliminar los estafilococos en suspensión.
Bacterias en suspensión:Preincubación: 5 minutos.Dosis de luz: 8 J/ cm2
ResultadosBiocapas estafilocócicas:Preincubación: 5 minutos.Dosis de luz: 8 J/ cm2
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
0 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 125 250
Log
cfu/
wel
l
Hypericin µM
S. aureus ATCC 33591
20 min 2 h 6h 24h
Conclusiones
Hipericina mostró un efecto bactericida dosis-dependiente frente a las biocapas de S. aureus y S. epidermidis.
La actividad de Hiperericina frente a las biocapas de S. aureus y S. epidermidis fue tiempo de preincubación y concentración dependientes
La reducción en la supervivencia bacteriana fue menor en la cepa de S. aureus productora de slime que en la no productora.
El efecto de la hipericina sobre las biocapas de S. epidermidis fue similar al observado en las biocapas de S .aureus no productor de slime.
Actividad fotodinámica de hipericina asociada a antimicrobianos frente a biocapas de Staphylococcus aureus
Cepas: S. aureus ATCC 29213 y ATCC 33591 (productora y no productora de slime)
Preincubación de las biocapas de 24 horas formadas sobre placas de poliestireno con hipericina (0.125-250 µM)
Dosis de luz: 30 J/cm2 (lámpara LED 602±10 nm; intensidad 24 mW/cm2, 30 min tto).
Incubación durante 24 h con:
10mg/L Linezolid+/- 3 mg/L Rifampicina
**
Conclusiones
La actividad fotodinámica de hipericina fue similar a la mostrada por linezolid solo o asociado a rifampicina frente a biocapas de S. aureus.
La actividad de hipericina asociada a linezolid o a linezolid más rifampicina fue mayor que la mostrada por hipericina sola.
Supervivencia SAMR SAMSbacteriana 11 cepas 11 cepas
REDUCCIÓN 0,12 µM 0,12 µM3 LOG
REDUCCIÓN 0,12 µM 0,25 µMTOTAL
Actividad fotodinámica de hipericina frente a cepas clínicas de Staphylococcus aureus
Bacterias en suspensión:
Supervivencia bacterianaHYP REDUCCION LOGµM MR MS
2 1,08 ± 0,35 1,05 ± 0,27
4 1,30 ± 0,31 1,09± 0,30
8 1,49 ± 0,42 1,26 ± 0,28
16 1,79 ± 0,47* 1,20 ± 0,30
Biocapas :