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ACTIVIDAD Y CARACTERIZACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS PRODUCIDOS POR UNA NUEVO MICROORGANISMO PARA EL CONTROL DE ENFERMEDADES EN PLANTAS Microorganismos capaces de utilizar los tejidos vegetales para el crecimiento en los suelos fueron aislados y sus caldos de cultivo vegetales fueron rociadas individualmente directamente sobre las hojas para poner a prueba su capacidad de controlar Plaga Phytophthora de pimiento causada por Phytophthora capsici. Cultivo líquido de Streptomyces cepa TKA-5, una especie no descrita obtenida en este estudio, muestra varias características deseables de control de enfermedades en la naturaleza, incluyendo alta potencia, larga duración y la capacidad de controlar también la mancha negra de la hoja de col causada por Alternaria brassicicolca. El extracto fue fungicida para P. capsici, pero fungistático de A. brassicicola. Se mantuvo estable a alta temperatura y pH alto. Sin embargo, después de la exposición a pH 2 durante 24 h, el extracto ya no era inhibidor de P. capsici aunque seguía siendo fuerte inhibidor de A. brassicicola. Después del tratamiento con cationes o resinas de intercambio de aniones, el extracto perdido su efecto inhibitorio frente a P. capsici, pero no A. brassicicola. Los resultados sugieren que el extracto contenía dos diferentes tipos de metabolitos inhibitorios, uno frente a P. capsici con cargas positivas y negativas en su molécula y otro contra A. brassicicola sin cargas en su molécula. Los metabolitos inhibitorios son solubles en etanol o metanol, pero no en agua, éter o cloroformo. Fueron dializables en la membrana tubular con un peso molecular límite de 10.000, 1.000 o 500, pero no al 100, indicando que los inhibidores tienen un peso molecular entre 500 y 100. Los resultados también mostraron que ambos inhibidores son no proteicos. INTRODUCCION Los fungicidas son más comúnmente utilizados para el control de enfermedades de las plantas causadas por hongos en el campo y en invernadero. Frutas y vegetales son regularmente rociados con fungicidas para satisfacer las demandas del consumidor de productos perfectos. Los fungicidas son también comúnmente aplicados a los cultivos de granos para aumentar el rendimiento mediante la reducción de las enfermedades foliares. Sin embargo, el desarrollo de métodos alternativos de control de enfermedades es necesario debido a la alta preocupación acerca de los efectos adversos de los plaguicidas en la salud humana y el medio ambiente. El control biológico de enfermedades de las plantas con microorganismos es una prometedora alternativa al control químico. Varios productos comerciales de bio-control de los microorganismos se han desarrollado para el control de enfermedades de plantas causadas por hongos. Sin embargo, el número es muy pequeño en comparación con fungicidas. Un proyecto, por lo tanto, se inicio para probar microorganismos del suelo directamente en hojas de planta de la pimiento con capacidad para

ACTIVIDAD Y CARACTERIZACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS PRODUCIDOS POR UNA NUEVO MICROORGANISMO PARA EL CONTROL DE ENFERMEDADES EN PLANTAS

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ACTIVIDAD Y CARACTERIZACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS PRODUCIDOS POR

UNA NUEVO MICROORGANISMO PARA EL CONTROL DE ENFERMEDADES EN PLANTAS

Microorganismos capaces de utilizar los tejidos vegetales para el crecimiento en los suelos fueron aislados y sus caldos de cultivo vegetales fueron rociadas individualmente directamente sobre las hojas para poner a prueba su capacidad de controlar Plaga Phytophthora de pimiento causada por Phytophthora capsici. Cultivo líquido de Streptomyces cepa TKA-5, una especie no descrita obtenida en este estudio, muestra varias características deseables de control de enfermedades en la naturaleza, incluyendo alta potencia, larga duración y la capacidad de controlar también la mancha negra de la hoja de col causada por Alternaria brassicicolca. El extracto fue fungicida para P. capsici, pero fungistático de A. brassicicola. Se mantuvo estable a alta temperatura y pH alto. Sin embargo, después de la exposición a pH 2 durante 24 h, el extracto ya no era inhibidor de P. capsici aunque seguía siendo fuerte inhibidor de A. brassicicola. Después del tratamiento con cationes o resinas de intercambio de aniones, el extracto perdido su efecto inhibitorio frente a P. capsici, pero no A. brassicicola. Los resultados sugieren que el extracto contenía dos diferentes tipos de metabolitos inhibitorios, uno frente a P. capsici con cargas positivas y negativas en su molécula y otro contra A. brassicicola sin cargas en su molécula. Los metabolitos inhibitorios son solubles en etanol o metanol, pero no en agua, éter o cloroformo. Fueron dializables en la membrana tubular con un peso molecular límite de 10.000, 1.000 o 500, pero no al 100, indicando que los inhibidores tienen un peso molecular entre 500 y 100. Los resultados también mostraron que ambos inhibidores son no proteicos.

INTRODUCCION

Los fungicidas son más comúnmente utilizados para el control de enfermedades de las plantas causadas por hongos en el campo y en invernadero. Frutas y vegetales son regularmente rociados con fungicidas para satisfacer las demandas del consumidor de productos perfectos. Los fungicidas son también comúnmente aplicados a los cultivos de granos para aumentar el rendimiento mediante la reducción de las enfermedades foliares. Sin embargo, el desarrollo de métodos alternativos de control de enfermedades es necesario debido a la alta preocupación acerca de los efectos adversos de los plaguicidas en la salud humana y el medio ambiente. El control biológico de enfermedades de las plantas con microorganismos es una prometedora alternativa al control químico. Varios productos comerciales de bio-control de los microorganismos se han desarrollado para el control de enfermedades de plantas causadas por hongos. Sin embargo, el número es muy pequeño en comparación con fungicidas. Un proyecto, por lo tanto, se inicio para probar microorganismos del suelo directamente en hojas de planta de la pimiento con capacidad para controlar el tizón Phytophthora causada por Phytophthora capsici, ya que es una enfermedad devastadora en todo el mundo.Durante las pruebas de detección, cultivo líquido de una nueva especie de Streptomyces muestra una fuerte capacidad para controlar el tizón de Phytophthora pimienta. Posteriormente, también mostró ser eficaz para el control de de la mancha negra de la hoja de col causada por Alternaria brassicicola, un patógeno importante de aceite de crucíferos y las cosechas de hortalizas. Nuestros objetivos fueron: (i) buscar microorganismos del suelo para el control del tizón Phytophthora directamente en plantas de pimiento, (ii) probar el rendimiento de control de enfermedades en las plantas huéspedes con metabolitos secundarios producidos por el organismo seleccionado, y (iii) caracterizar a los metabolitos secundarios producidos por los microorganismos seleccionados para el control de enfermedades de las plantas.

MATERIALES Y METODOS

El aislamiento de los microorganismos del sueloLas muestras de suelo fueron tomadas a una profundidad de 0-10 cm., tamizada y humedecido con un 65% capacidad de retener agua. El medio selectivo para el aislamiento de hongos consistía en 10% extracto del suelo, 0.02% de urea, un 0.1% Tergitol NP-7 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y el 1,5% de agar. Tergitol NP-7 fue para la restricción del tamaño de la colonia de hongos. Después del autoclave, el medio fue suplementado con 50 ppm de chloramphencol y 50 ppm de sulfato de estreptomicina para la inhibición de las bacterias y los actinomicetos. El extracto de suelo fue preparado con 100 g suelo tamizado, 0.2 g de CaCO3 y 1000 ml de agua destilada durante 20 minutos, filtrado el sobrenadante a través de tres capas de gasa y centrifugado el filtrado a 1500 rpm x g por 5 min. para clarificar el extracto. El medio selectivo para aislamiento de los actinomicetos consistió en 0,02% la urea y el 1.5% de agar. Después del autoclave, el medio fue ajustado a pH 10,5 con KOH 1N para suprimir las bacterias, y modificado con 50 ppm de nistatina para inhibir hongos. El medio selectivo para el aislamiento de hongos consistía en 10% extracto del suelo, 0.02% de urea y 1,5% de agar. Después del autoclave, el medio fue suplementado con 50 ppm pentacloronitrobenzeno para inhibir actinomicetos y 50 ppm de nistatina para inhibir los hongos.Suspensión de suelo se preparó mezclando 1.3 g de suelo con 100 ml agua destilada estéril en una cámara de Omni mezclador a 5000 rpm durante 30 s. Para determinar la dilución necesaria para obtener la suspensión del suelo esencialmente libre de cada grupo de microorganismos, las suspensiones se diluyeron a 10-4, 10-5 y 10-6 de hongos, 10-5, 10-6 y 10-7 de actinomicetos, y 10-6, 10-7 y 10-8 para las bacterias. Un mililitro de la suspensión de suelo diluida se mezcló con 20 ml de un medio selectivo líquido a 45 ºC en una placa de Petri. Cinco placas fueron usadas para cada tratamiento.Para mejoramiento del suelo, tomate (Lycopersicon esculentum), espinaca (Spinacia oleracea), batata (Ipomoea batatas), Ipomea (Ipomoea aquatica) y verdolaga (Portulaca oleracea) fueron comprados en el mercado local, y picado en trozos pequeños. Cerca de 500 g de suelo se mezcló con el 4% de cada verdura picada en una botella de 1000 ml, y se incubo a 24 ºC por lo menos dos semanas antes de su uso. Para aislar los microorganismos capaces de utilizar nutrientes modificados para la multiplicación, la suspensión de suelo mejorado se diluyó a la concentración pre-determinada para cada grupo de microorganismos como se describió anteriormente y se colocaron en el medio selectivo. Microorganismos con diferente morfología de las colonias se transfieren individualmente a 10% V-8 agar (10% jugo V-8, 0.02% de CaCO3 y un 2% agar) placas.

Cultivo de microorganismos aislados en caldo de vegetalesCaldo de vetales fue preparado por trituración de 4 g de cada una de las verduras picadas y 1% de la melaza en 100 ml de agua en un Ovni mezclador a 4000 rpm durante 3 min, y distribuidos 50 ml de caldo en frascos de 250 -ml. Después del autoclave, cada frasco fue inoculado con dos asas de la bacteria, o un trozo (de 4 x 5 x 3 mm) de los actinomicetos o el hongo de cultivo de agar. Matraces inoculados se incubaron en un agitador durante dos semanas. Después de la incubación, los cultivos fueron centrifugados en un mezclador Omni a 4000 rpm durante 1 minuto antes de ser utilizado para poner a prueba su capacidad para reducir la incidencia de la enfermedad.

Preparación de los inóculosLas conidias de Alternaria brassicicola (Schw.) Wiltshire (aislado Aba-31) fueron producidos por el crecimiento del hongo en 10% de agar V-8 (10% V-8 jugo, el 0.02% de CaCO3 y un 2% agar) a 24 ºC bajo la luz de 4-6 d. Una suspensión de conidias fue preparada colocando dos trozos cultivo (de 5 x 5 x 3 mm) en 5 ml de agua destilada estéril en un tubo de ensayo, y agitando el tubo de

ensayo durante 30 s con un mezclador Vortex. La concentración de conidias se ajustó a 3 conidias / µl con un Pipetman microlitro pippet (West Coast Científico, Oakland, CA).Phytophthora capsici Leonian (aislado Pc 1-1) fue cultivada en 20% de agar V-8 (20% jugo clarificado de V-8, el 0.02% de CaCO3 y un 2% de agar) en 24 ºC. El jugo de V-8 se clarifico por centrifugación a 1500 rpm x g por 5 min. Cinco trozos de cultivo (de 10 x 10 x 3 mm) obtenidos a partir de 3 días de edad, los trozos se colocaron en 7 ml solución salina (0.24% Ca(NO3)2, 0.05% KNO3, el 0.1% MgSO4 y 0.05% FeEDTA) en una placa de Petri de 6 - cm. Después de la incubación a 24 ºC bajo la luz durante 24 horas, placa fue trasladada a 4 ºC durante 20 minutos para inducir la liberación de zoosporas de esporangios. La suspensión de zoosporas fue pipeteada en un tubo de ensayo y se ajusto a 4 zoosporas / µl como se describe anteriormente.

Ensayo de cultivos líquidos para control de enfermedadesSemillas de pimiento (Capsicum annuun L. cv. California Wonder) y la col (Brassica chinensis L. cv. Ching-verde) se cultivadon en macetas de 8 cm que contiene una mezcla de turba y vermiculita (9:1, v / v). Dos hojas de una planta de 4 semanas de edad fueron rociadas una vez fugaz con el cultivo de un microorganismo de prueba todos los días durante 3 días antes de la inoculación en el día cuarto.El método de inoculación descrito por Ko et al. se utilizó en este estudio. Cada hoja de pimiento se inoculó con cinco gotas de 2 ml de suspensión de zoosporas de P. capsici a lo largo del borde de la hoja, y unos 10 ml gota de agar fundido que consiste en 1% de agar y 1% de jugo V-8 en 60 ºC fue agregado a cada gota de inóculo para fijar el inóculo en el objetivo del sitio. Hojas de col se inocularon de manera similar con conidios de A. brassicicola. Hojas de pimiento y col rociadas con un medio líquido fueron inoculadas con zoosporas de P. capsici y conidios de A. brassicicola, respectivamente, utilizando el mismo método, y utilizados como controles. Las plantas inoculadas fueron colocadas en cámaras húmedas y se mantuvo en el invernadero. El número de lesiones que se desarrollan en los sitios inoculados se registró tres días después de la inoculación. Dos hojas fueron utilizadas para cada tratamiento, y todos los experimentos se realizaron al menos dos veces.

Caracterización molecular del organismoTKA-5 cepa se cultiva en 10% de agar V-8 (10% jugo V-8, el 0.02% CaCO3 y un 2% agar) durante 6 días a 24 ºC. Las esporas y el micelio se rasparon de la superficie de la colonia con un asa de transferencia y para inocular 10 ml de 10% de caldo V-8 en un frasco de 125 ml. Después de incubación a 24 ºC por 6 d, el cultivo se centrifugó a 8000 rpm x g durante 10 minutos. El pellet se utilizo para extraer el ADN utilizando el Sistema de extracción genómica de ADN (Viogene, Taiwan). Amplificación por PCR de el 16S rDNA y la reacción de secuenciación ciclo posterior se llevó a cabo utilizando un 16S ADNr MicroSeq Gene Kit (Applied Biosystems, EE.UU.). Los productos fueron analizados con una genética PRISM 310 analizador (Applied Biosystems). Valores de similitud de homología búsquedas en la base de datos GenBank se obtuvieron utilizando la BLASTN 02/02/18.

Extracción de los metabolitos de la supresión de patógenosCultivo líquido de Streptomyces cepa TKA-5 fue liofilizado. Uno gramo de polvo seco, que se obtiene a partir de aproximadamente 50 ml del cultivo, se extrajo con 25 ml de agua, 95% de etanol, metanol, acetona, éter o cloroformo en un matraz de 250 ml por agitación en un agitador durante 24 h. La mezcla se centrifuga a 1500 rpm x g por 5 min a obtener extracto clarificado. Para el bioensayo y caracterización de los metabolitos de la supresión de patógenos, 10 ml de extracto se evaporaron a 2 ml seguido por la adición de 2 ml de agua y la evaporación de 2 ml otra vez. Para poner a prueba la capacidad de los diferentes solventes para extraer las sustancias inhibidoras, 10 veces la dilución de los extractos se uso. Extracto de etanol se utilizó para estudiar la posibilidad de supresión de la enfermedad, la estabilidad a altas temperaturas y el modo de

inhibición de las sustancias inhibitorias 2 veces la dilución de los extractos se uso, para estimar el peso molecular de los inhibidores 5 veces la dilución de los extractos se uso, y para determinar la efectos del pH, resinas de intercambio iónico y carbón activado en el actividad inhibitoria 10 la dilución de los extractos se uso.

Las pruebas de germinaciónPara probar el efecto del extracto del cultivo en la germinación de las esporas, 10 ml de suspensión de conidias (2 x 104 esporas / ml) de A. brassicicola o suspensión de zoosporas (3 x 104 esporas / ml) de P. capsici se mezcló con 10 µl de extracto en una cavidad de una cubeta de ocho cavidades estéril. Para obtener un alto porcentaje de germinación de P. capsici, 0.1% de glucosa se añadió a la suspensión de zoosporas antes de mezclarlo con el extracto. Cavidades con las esporas se mantuvieron húmedas, colocando cada una en una en varilla en L de vidrio en una placa Petri de 9 cm que contiene 10 ml agua destilada estéril. La germinación se registró después de la incubación a 24 ºC durante 5 h, y 100 esporas fueron contadas en cada una de las tres repeticiones. Todos los experimentos se realizaron en dos ocasiones.

Caracterización de los inhibidoresPara estudiar los efectos de diferentes tratamientos sobre la propiedad de inhibición del extracto de cultivo de Streptomyces cepa TKA-5, 10 g de cada uno de Diaion resinas de intercambio catiónico SK1B (equivalente a Amberlite 1R-120), Diaion SA 12A resinas de intercambio aniónico (equivalente a Amberlite 1RA-420) (Tai-Young Chemical Co., Kaohsiung, Taiwán), y carbón activado (Sigma-Aldrich) se lavaron con 100 ml de agua destilada tres veces por agitación durante un período de 6 h para eliminar posibles sustancias inhibidoras. Diez mililitros extracto fueron sacudidos con un g de resinas de intercambio catiónico, aniones intercambio iónico o carbón activado en un matraz de 125 ml en 200 golpes / min durante 24 horas y se filtra a través de un papel de filtro Whatman no. 1. Los filtrados fueron utilizados para las pruebas de germinación.Para determinar si los inhibidores eran proteínas, 10 ml de extracto se evapora hasta sequedad. Un miligramo del residuo fue procesado a través de electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE), siguiendo el protocolo de Sambrook y Russell.Para estimar el peso molecular de la sustancia inhibitoria, 5 ml del extracto fueron colocados en una membrana tubular porosa molecular con un peso molecular de corte de 100, 500, 1.000 o 10.000 (Espectro Medical Industries Inc., Los Angeles, CA), se dializan en 24 ºC contra 1000 ml de agua destilada cambiado tres veces en un período de 24 h, y se utiliza para las pruebas de germinación.Para determinar si el efecto de los inhibidores es fungistático o fungicidas, zoosporas de P. capsici o conidias de A. brassicicola en 1 ml del extracto (105 esporas / ml) en un tubo centrífugo de 1,5 ml fueron incubados a 24 ºC. Después de 4, 8 o 12 h, los inhibidores fueron retirados por centrifugación de la suspensión de esporas a 1500 rpm x g por 5 min y se reemplazó sobrenadante con la misma cantidad de agua destilada estéril. Conidias en 0.1 ml de la suspensión se extendió luego sobre una placa de agar agua al 1,5%. La germinación se registró después de incubación a 24 ºC durante 24 h. Tres repeticiones se utilizaron para cada tratamiento y todos los experimentos se realizaron dos veces.

RESULTADOS

Efecto de cultivos líquidos de los microorganismos aislados enincidencia de la enfermedadEn este estudio, 27 hongos, 11 bacterias y 8 actinomicetos que fueron capaces de utilizar los tejidos vegetales mixtos para la multiplicación en los suelos recolectados en dos lugares diferentes fueron aislados. Cuando se rocío en las hojas de pimiento, cultivos líquidos de 14 de hongos, 5 bacterias y 6 actinomicetos fueron capaces de reducir la incidencia de enfermedades de

Phytophthora plaga causada por P. capsici de 100% en el control a menos del 50%. Estos cultivos líquidos también se redujo la lesión tamaño de 30 mm de diámetro en el control a 0-6 mm. Entre estos efectivos, los cultivos de 3 hongos, 2 bacterias y 3 actinomicetos mostraron capacidad constante para reducir la incidencia de la enfermedad. Los cultivos de estos microorganismos fueron capaces de reducir la enfermedad incidencia de 100% en el control a 00-40%, y disminuir el diámetro de la lesión de 30 mm en el control a 0-12 mm (Tabla 1). Entre estos, el cultivo de la cepa de Streptomyces TKA-5 fue capaz de evitar el desarrollo de la enfermedad por completo en repetición de las pruebas. Esta cepa fue, por lo tanto, seleccionada para el estudio adicional.

Tabla1. Efecto de ocho cultivos líquidos de los microorganismos del suelo del primer aislamiento y su incidencia de la enfermedad del tizón de pimiento Phytophthora

causada por Phytophthora capsic

Dos hojas, una vez fueron rociadas con un cultivo líquido al día durante 3 días antes de la inoculación enel 4 º día. Cada hoja se inoculó con cinco gotas de 2 ml de la suspensión de zoosporas de P.

capsici lo largo del borde de la hoja y 10 ml de agar fundido se añadió a cada gotade inóculo para fijar el inóculo en el sitio de destino. La incidencia de la enfermedad y el tamaño de la lesión

se registraron después de 3 días.

La enfermedad de rendimiento de control de cultivo líquido deStreptomyces cepa TKA-5Para probar el control potencial de la enfermedad, el cultivo líquido de Streptomyces cepa TKA-5 se diluyó 2 -, 5 -, 10 -, 50 - y 100 veces antes de ser fumigado en las hojas de pimiento. Los resultados mostraron que incluso en 50 veces la dilución, el cultivo fue capaz de reducir la incidencia de la enfermedad del tizón Phytophthora del 100% en el control a 60%, y disminuir el diámetro de la lesión de 30 mm en el control a 18 mm. Para determinar el efecto de la frecuencia de spray sobre la enfermedad la efectividad del control, las hojas de pimiento fueron rociados una vez al día con cultivo líquido para tiempos de 1, 2 o 3 antes de la inoculación en el cuarto día. La incidencia de la enfermedad disminuyó con el aumento del número de spray (Tabla 2). Aun cuando la hojas de pimiento fueron rociados sólo una vez, la incidencia de la enfermedad se redujo de 100% en el control a 40% y el diámetro de la lesión se redujo de 30 mm en el control de hasta 12 mm.

Tabla 2. Efecto de la frecuencia de aspersión de cultivo líquido de Streptomyces cepa TKA-5 en la incidencia de la enfermedad del tizón Phytophthora de pimiento

causada por Phytophthora capsici

Dos hojas, una vez fueron rociados con el cultivo líquido al día durante tiempos de 1, 2 o 3 dias antes de la inoculación en el día cuarto. Cada hoja se inoculó con cinco gotas de 2 ml de zoosporas

suspensión de P. capsici en el borde de la hoja y 10 ml de agar fundido se adiciono a cada gota de inóculo para fijar el inóculo en el sitio de destino. La incidencia de la enfermedad y el tamaño de la lesión

se registraron después de 3 días.

Durabilidad de la actividad de supresión de la enfermedad de cultivo líquido de Streptomyces cepa TKA-5 se determinó mediante la inoculación de las hojas de pimiento 1, 7, 14, 21 o 28 días después de la última rociada de cultivo líquido. Los resultados mostraron que incluso después de 28 días en las hojas, las sustancias supresoras de la enfermedad en el cultivo líquido son capaces de reducir la incidencia de la enfermedad del tizón Phytophthora del 100% en el control a 10%, y la disminución de la lesión diámetro de 30 mm en el control a 3 mm (Tabla 3). Cuando rosearon las hojas de col, el cultivo líquido de Streptomyces cepa TKA-5 también fue capaz de reducir la incidencia de la enfermedad de La mancha negro causado por A. brassicicola de 100% en el control a 5% y disminuir el diámetro de la lesión de 30 mm a 12 mm.

Tabla 3. Eficacia de cultivo líquido de Streptomyces cepa TKA-5 rociado en las hojas a diferentes períodos de tiempo en la reducción de la

Incidencia de la enfermedad del tizón Phytophthora del pimiento causada por Phytophthora capsici

Dos hojas, una vez fueron rociadas con el cultivo líquido al día durante 3 días antes de la inoculación 1, 7, 14, 21 o 28 días después de la última aspersión. Cada hoja se inoculó con cinco gotas de 2 ml de

zoosporas suspensión de P. capsici en el borde de la hoja y 10 ml de líquido agar se añadieron a cada gota de inóculo para fijar el inóculo en el sitio de destino. La incidencia de la

enfermedad y el tamaño de la lesión se registraron después de 3 días.

Caracterización de bio-control de organismoEn comparación con las secuencias disponibles en GenBank, la secuencia parcial 16 S ADNr (476 nucleótidos) de la cepa de Streptomyces TKA-5 (No GenBank. EU340346) mostraron la mayor similitud (98%) de Streptomyces fragilis. El organismo también fue enviado a la identificación Servicio, DSMZ-Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH, Alemania,

para su identificación. El informe de identificación indica que el 16 S ADNr secuencia de la cepa TKA-5 mostraron la mayor similitud (98,3%) a S. fragilis. Sobre la base de su experiencia, para la asignación de un Streptomyces desconocido a una especie conocida, la similitud debe estar por encima del 99,4%. Los estudios comparativos de los patrones de Riboprint no mostraron una alta correlación entre la cepa TKA-5 y otros miembros del género Streptomyces. El informe concluyó que todos los métodos utilizados no permite identificar la cepa TKA-5 con una de las especies descritas en del género Streptomyces. Descripción TKA-5 como una nueva especie de Streptomyces se llevará a cabo en el futuro. Un cultivo de esta cepa fue depositado en la Colección Cultura y Centro de Investigación, Industria Alimentaria Instituto de Investigación y Desarrollo, Hsinchu, Taiwán, con el número de acceso del Centro Regional 16884.

Aislamiento de los metabolitos de la enfermedad de la represión secundariaPara el estudio de la naturaleza de los metabolitos supresores de la enfermedad, la sustancias inhibidoras fueron aislados por liofilización del cultivo líquido de la cepa de Streptomyces TKA-5 y extrayendo el polvo seco con etanol. El extracto fue reexaminado para asegurar que las sustancias inhibitorias estaban todavía presentes después de que el proceso de aislamiento. Los resultados mostraron que el extracto del polvo todavía era capaz de controlar enfermedades de las plantas. Rociar las hojas de pimiento y col con el extracto redujo la incidencia de las enfermedades de Phytophthora tizón y mancha foliar negro de 100% en el control al 20% y 15%, respectivamente.Prueba de germinación de las esporas se utilizó en el estudio posterior, ya que es más fácil y más rápido que la prueba de la incidencia de enfermedades. Liofilizado seco en polvo de cepa TKA-5 el cultivo se extrajo con diferentes disolventes orgánicos. Después de la evaporación de solventes, los extractos probaron su capacidad para apoyar a la germinación de esporas de P. capsici y A. brassicicola. Extracto en etanol o metanol inhibió completamente la germinación de P. capsici zoosporas y A. brassicicola conidios. Sin embargo, su germinación no fue inhibida o ligeramente inhibida por los extractos de agua, acetona, éter o cloroformo (Tabla 4).

Tabla 4. Eficacia de solventes para extraer las sustancias inhibidoras de Cultivo liofilizado de Streptomyces cepa TKA-5 para suprimir

la germinación de zoosporas de Phytophthora capsici y Conidias de Alternaria brassicicola.

Caracterización de los metabolitos secundarios supresores de la enfermedadLa exposición de zoosporas de P. capsici en el extracto de 4, 8 o 12 horas, destruyó por completo su capacidad de germinar incluso en agar agua, lo que indica la naturaleza fungicida de los metabolitos supresores de la enfermedad (Tabla 5). Sin embargo, la exposición de conidios de A. brassicicola al extracto por los mismos períodos de tiempo no afectó a su capacidad de germinar,

lo que indica la naturaleza fungistática de los metabolitos supresores de la enfermedad contra este hongo. Las esporas de ambos patógenos todavía no germinaron después de que el extracto se calentó a 100 ºC, o en autoclave durante 20 minutos (datos no mostrados).

Tabla 5. Capacidad de zoosporas de Phytophthora capsici y conidias de Alternaria brassicicola para germinar después de la exposición al extracto de cultivo

Streptomyces cepa TKA-5 durante diversos períodos de tiempo.

Cuando el pH del extracto se ajustó a partir de la original de 4 a 5 con KOH 1N, germinación de las esporas de los agentes patógenos todavía inhibió por completo o casi completo (Tabla 6). Cuando el pH del extracto se ajustó a 6, la germinación de P. capsici zoosporas y brassicicola A. aumentó al 16% y 57%, respectivamente. A pH 8.7, la germinación de esporas en el extracto se incrementó del original del 0% al 55-66% y 57-68% para P. capsici y A. brassicicola, respectivamente. Ajustar el pH de nuevo a la original de 4, con HCl 1N sólo aumento parcialmente el efecto del inhibidor.

Tabla 6. La germinación de zoosporas Phytophthora capsici y conidias de Alternaria brassicicola en el extracto de cultivo de Streptomyces cepa TKA-5

ajustados al valor de pH.

Valor entre paréntesis es la tasa de germinación en el extracto después de reajuste del valor de pH de 4.

La exposición del extracto a pH 2 durante 24 h destruyó el efecto inhibidor frente a P. capsici, pero no afectó a su efecto inhibidor contra A. brassicicola (Tabla 7). La exposición del extracto a pH 12 durante 24 horas no afectó a su efecto inhibidor frente a cualquier organismo.

Tabla 7. La germinación de zoosporas de Phytophthora capsici y conidias de Alternaria

brassicicola en el extracto de cultivo de Streptomyces cepa TKA-5 ajustando el valor de pH de 2 a 12 durante 24 horas antes de ser ajustado

al original pH de 4.

El extracto se convirtió en no-inhibidores o sólo ligeramente inhibitoria para la germinación de zoosporas de P. capsici después del tratamiento con cationes intercambio iónico, resinas de intercambio aniónico o carbón activado (Tabla 8). Sin embargo, el efecto inhibidor del extracto contra germinación de los conidios de A. brassicicola fue eliminada sólo después de tratamiento con carbón activado, pero no con intercambio de cationes Las resinas o resinas de intercambio de aniones. No se observaron bandas positivas después de SDS-PAGE del extracto de inhibidor que indica que la Los inhibidores no son proteínas.

Tabla 8. Efectos de diferentes tratamientos en el extracto de cultivo de Streptomycescepa TKA-5 en su actividad inhibidora contra la germinación de las

zoosporas de Phytophthora capsici y conidias de Alternaria brassicicola.

El pH se ajustó a 4,0 antes de las pruebas de germinación de esporas.

El extracto en la tubería de diálisis con peso molecular de 10.000, 1.000 o 500 fue o no inhibitorio o redujo su efecto inhibitorio seguido del tratamiento con diálisis (Tabla 9). Sin embargo, el extracto fue todavía fuertemente inhibitorio de germinación de las esporas de los agentes patógenos después del tratamiento en la tubería de dialisis con un peso molecular de corte de 100.

Tabla 9. La germinación de zoosporas Phytophthora capsici y conidias de Alternaria

brassicicola en el extracto de cultivo de Streptomyces cepa TKA-5 después del tratamiento de microdialisis con un peso molecular limite.

DISCUSIÓNEn este estudio, los microorganismos capaces de utilizar verduras tejidos para el desarrollo en el suelo fueron aislados y su caldo de verduras cultivos fueron rociadas individualmente directamente sobre las hojas para poner a prueba sus capacidad para controlar el tizón Phytophthora del pimiento. Resultados demostró que este enfoque es muy eficaz en la obtención de microorganismos con la capacidad para controlar la enfermedad. Entre los 46 microorganismos aislado de dos suelos, un 50% de ellos fueron capaces de para reducir la incidencia de la enfermedad del 100% en el control al menos del 50%. El método es directo y eficaz y debe ser aplicable a aislamiento de microorganismos para el control de otros enfermedades de las plantas.

Cultivo líquido de tensión TKA-5, una nueva especie de Streptomyces, obtenidos en este estudio se muestra el control de varias enfermedades deseable características de la naturaleza. La cultura seguía siendo eficaz en el control Phytophthora plaga del pimiento después de ser diluido 50 veces, y fue capaz de reducir la incidencia de la enfermedad más del 50% cuando se rocía una sola vez a las hojas. Por otra parte, después de ser aplicado, los metabolitos enfermedad supresión secundaria de la cultura se mantuvo activo en las hojas durante 28 días, el el más largo período de prueba. También fue eficaz para el control de negro mancha de la hoja de col cuchara. Estos resultados sugieren que la enfermedad suppressionmetabolites producido por Streptomyces cepa TKA-5 es adecuadas para el desarrollo en un producto comercial para el control de de enfermedades de las plantas.

Los resultados del estudio fromthis sugieren que el extracto cultivo de Streptomyces strainTKA-5 probablemente contenía dos tipos diferentes de enfermedad supresión secundaria metabolitos, uno frente a P. capsici y la otros en contra de A. brassicicola. El primero es un organismo parecido a un hongo estrechamente relacionada con las algas marrones [21], mientras que el segundo es un hongo verdadero. El extracto de la cultura se fungicida a P. capsici, pero fungistática a A. brassicicola.Afterexposure topH2 durante 24 h, el extractwasnolonger inhibitoria de P. capsici, pero se mantuvo fuerte inhibidor de A. brassicicola. Además, las pruebas de resina de intercambio iónico sugieren que en el extracto, el inhibidor de la sustancia P. capsici tiene efectos positivos y cargas negativas en itsmolecule, mientras que no se cobre presente en el molécula de la sustancia inhibitoria de A. brassicicola. Siguiente diálisis, el extracto de la corte de diálisis withmolecularweight tubería de 10.000, 1.000, o sea 500was no inhibidora o con la reducción de efecto inhibitorio. Sin embargo, el extracto fue todavía fuertemente inhibitoria de germinación de las esporas de los agentes patógenos, lo que indica que ambas Los inhibidores de peso molecular entre 500 y 100, SDS-PAGE de la sustancia inhibidora sugiere que no son proteínas.