Aislamiento y Selección de Lactobacillus spbdigital.unal.edu.co/8647/1/lizethjohannamorenogalarza.2012.pdf · Resumen y Abstract IX Resumen En el presente estudio se aisló, caracterizó

Aislamiento y Selección de Lactobacillus sp con potencial probiótico a partir de

pan de abejas

Lizeth Johanna Moreno Galarza

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias

Posgrado Interfacultades de Microbiología

Bogotá, Colombia

2012

Aislamiento y Selección de Lactobacillus sp con potencial probiótico a partir de

pan de abejas

Lizeth Johanna Moreno Galarza

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ciencias-Microbiología

Directora:

M.Sc. Judith Figueroa Ramírez

Grupo en Ciencia y Tecnología Apícola AYNI

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias

Posgrado Interfacultades de Microbiología

Bogotá, Colombia

2012

Todo individuo, desde su nacimiento hasta su muerte, coexiste con más de cien billones de células

bacterianas, diez veces más que el número de células que habitan

en el cuerpo humano.

Luckey y Floch.

Agradecimientos

A Dios, mi padre celestial, mi guía espiritual, mi inspiración y mi luz, por el fortalecimiento y las bendiciones recibidas en mi vida. A mi Familia, mis Padres por ser mis grandes maestros en la carrera de mi vida, a través de sus enseñanzas, esfuerzos, apoyo, educación y valores. A mis Hermanos, por su apoyo incondicional, emocional, solidario y por las experiencias compartidas en todos los momentos de nuestras vidas. A mi Abuela, mi otra Mamá, quien aparte de formarme y exigirme como persona, me consiente cariñosamente. Y a mis fieles, tiernos y traviesos Pino y Mati. A mi Directora de tesis la Profesora Judith Figueroa Ramírez por acogerme en el Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, formando parte de su equipo de trabajo, por su apoyo, dedicación, confianza y enseñanzas brindadas durante este tiempo, mi más sincero sentimiento de agradecimiento, admiración y respeto. Al Posgrado Interfacultades de Microbiología por admitirme como estudiante y brindarme la posibilidad de continuar con mi formación profesional al nivel de Maestría. A la Profesora Martha Fontanilla, quien a través de su calidad humana y de su conocimiento, forma estudiantes de posgrado íntegros. Y a Socorro Prieto, esa amiga incondicional, lista a apoyar, colaborar, enseñar, escuchar y aconsejar, siempre dispuesta con una sonrisa y un abrazo sincero. A la Profesora Martha Quicazán, por su colaboración, amabilidad y por haber sido la primera persona que me guiara e introdujera al maravilloso mundo de las abejas. A Carlos Fuenmayor, por su incondicional colaboración. Al Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos ICTA, y a Don Álvaro, por su colaboración en los análisis químicos. Al grupo AYNI, Paola Monserrate, Ivonne Hernández, Viviana Gamboa, Carla Portillo, Andrés Sánchez, César Talero y Giovanny Vargas, por haber hecho de la parte experimental de mi tesis, una experiencia inolvidable, compartiendo desde la cabina, los almuerzos, hasta los viajes (nacionales e internacionales). A Germán Suárez por su apoyo y voz de aliento en la etapa final. A mis amigas de Maestría, Natalia Comba, Melisa Núñez y Patricia Cifuentes, por haber formado un grupo de estudio integro, dedicado y divertido, y a mis demás compañeros de Maestría, por compartir conocimientos y experiencias. Al personal humano del Laboratorio de diagnostico de Microbiología Veterinaria de la Universidad Nacional de Colombia, por su disposición y colaboración. A Víctor Tibatá por su don de gente, colaboración y asesoría en los análisis moleculares.

VIII

A la Universidad Nacional de Colombia y al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, por facilitar las instalaciones y financiar los insumos para la elaboración de este estudio, en el marco del programa “Estrategias para establecer la denominación de origen de los productos de las abejas en Colombia” y del proyecto “Cualificación de productos de las abejas: Miel, Polen y Propóleos mediante indicadores microbiológicos” (código 2007C3476 111-5832007). Y a todas y cada una de las personas que no nombre, que conocí en el transcurso del proceso y que me colaboraron en este camino brindándome siempre su apoyo y amabilidad.

Resumen y Abstract IX

Resumen

En el presente estudio se aisló, caracterizó y evaluó cepas de Lactobacillus sp con potencial

probiótico a partir de pan de abejas de Apis mellifera; las cepas fueron incorporadas como

bacterias probioticas mediante fermentación in vitro en polen apícola para así lograr un potencial

producto funcional. Se procesaron 38 muestras de pan de abejas en el medio de cultivo, Man

Rogosa Sharpe (MRS), se realizó pruebas bioquímicas para su identificación. Entre las pruebas

para evaluar la capacidad probiótica se determinó: tolerancia a pH ácido (3, 4 y 5), crecimiento en

bilis (0.3, 0.5 y 1.0%), actividad hemolítica, actividad antibacteriana frente a cepas de referencia y

sensibilidad a antibióticos; e identificación molecular. Se obtuvieron 11 aislamientos de

Lactobacillus sp con una o más características probióticas, 4 de ellas resistente a pH bajos y a

bilis, productoras de sustancias antimicrobianas, no productoras de hemolisinas y sensibles a

antibióticos comunes como amoxicilina y eritromicina; en las fermentaciones con cepas

autóctonas se obtuvo pan de abejas con comportamientos superiores para el índice de pH y

acidez e inferiores en el recuento de células viables, en comparación con los resultados obtenidos

con la cepa de referencia Lactobacillus acidophilus.

Palabras clave: Lactobacillus sp, probiótico, Apis mellifera, fermentación, pan de abejas, polen

apícola.

X

Abstract

This study isolated, characterized and evaluated strains of Lactobacillus sp with probiotic

potential from Apis mellifera´s bee bread; the strains were incorporated as probiotics bacteria

through in vitro fermentation into bee pollen in order to achieve a potential functional product.

Thirty-eight samples were processed in the culture medium Man Rogosa Sharpe (MRS); to the

strains obtained were subjected biochemical tests for it identification. To assess the probiotic

ability of the strains were determined some tests as: acid pH tolerance (3, 4 and 5), growth in bile

(0.3, 0.5 and 1.0%), hemolytic activity, antibacterial activity against reference strains and

sensitivity to antibiotics; and molecular identification. Once isolated of Lactobacillus were

obtained with one or more probiotic characteristics, four showed resistance to low pH and to

bile, with production of antimicrobial substances, not synthesizing hemolysins and sensitive to

antibiotics commons as amoxicillin and erythromycin; in the fermentations with autochthons

strains were obtained bee bread with behavior higher of pH and acidity and lower viable cell

count in comparison with the results obtained from reference strain Lactobacillus acidophilus.

Keywords: Lactobacillus sp, probiotic, Apis mellifera, fermentation, bee bread, bee pollen.

Contenido XI

Contenido

Pág.

Resumen ................................................................................................................................ IX

Lista de figuras ...................................................................................................................... XIV

Lista de tablas ........................................................................................................................ XV

Lista de abreviaturas ............................................................................................................. XVI

Introducción ............................................................................................................................ 1

1. Objetivos .......................................................................................................................... 5 1.1 Objetivo general .............................................................................................................. 5

1.2 Objetivos específicos ....................................................................................................... 5

2. Marco teórico ................................................................................................................... 7 2.1 El Polen ............................................................................................................................ 7

2.1.1 Clasificación del polen de Apis mellifera ............................................................. 7 2.1.2 Recolección y secado del polen .......................................................................... 8 2.1.3 Propiedades fisicoquímicas y microbiológicas del polen .................................... 8 2.1.4 Empleo del polen .............................................................................................. 10

2.2 Pan de abejas ................................................................................................................ 10 2.2.1 Composición nutricional del pan de abejas ...................................................... 11 2.2.2 Propiedades del pan de abejas ......................................................................... 11 2.2.3 Microorganismos en el pan de abejas .............................................................. 12

2.3 Aplicación microbiológica en alimentos ....................................................................... 12 2.3.1 Origen de los microorganismos industriales ..................................................... 12

2.4 Probióticos .................................................................................................................... 13 2.4.1 Evolución del término probiótico ...................................................................... 13 2.4.2 Bacterias acidolácticas (BAL) ............................................................................. 14 2.4.3 El género Lactobacillus ...................................................................................... 17 2.4.4 Características de los probióticos ..................................................................... 18 2.4.5 Mecanismos de acción de los probióticos ........................................................ 19 2.4.6 Aplicaciones clínicas de los probióticos ............................................................ 21 2.4.7 Requisitos de los alimentos probióticos ........................................................... 23 2.4.8 Presentación de probióticos ............................................................................. 23 2.4.9 Riesgos de los probióticos en la práctica clínica ............................................... 24

XII Contenido

2.5 Directrices para la evaluación de probióticos en los alimentos ................................... 25 2.5.1 Pruebas In vitro para la selección de microrganismos probióticos................... 26

3. Materiales y métodos ..................................................................................................... 27 3.1 Localización del estudio ................................................................................................ 27 3.2 Obtención de muestras ................................................................................................. 27 3.3 Aislamiento y selección de cepas de Lactobacillus sp .................................................. 27 3.4 Pruebas In vitro para potencial probiótico ................................................................... 28

3.4.1 Tolerancia a pH ácido ........................................................................................ 28 3.4.2 Crecimiento en bilis ........................................................................................... 28 3.4.3 Actividad hemolítica .......................................................................................... 28 3.4.4 Actividad antibacteriana ................................................................................... 29 3.4.5 Pruebas de susceptibilidad a los antibióticos ................................................... 29

3.5 Identificación bioquímica y molecular de las cepas ...................................................... 30 3.5.1 Identificación bioquímica .................................................................................. 30 3.5.2 Identificación molecular.................................................................................... 31

3.6 Fermentación de polen ................................................................................................. 32 3.6.1 Preparación de los inóculos .............................................................................. 32 3.6.2 Matriz de polen para la fermentación .............................................................. 33 3.6.3 Valoración de pH y acidez libre titulable .......................................................... 33 3.6.4 Recuento celular de las BAL .............................................................................. 33 3.6.5 Evaluación sensorial .......................................................................................... 34

3.7 Análisis Estadístico ........................................................................................................ 34

4. Resultados ..................................................................................................................... 35 4.1 Aislamiento y selección de cepas de Lactobacillus sp.................................................. 35

4.1.1 Aislamiento y selección de aislados por características microscópicas y macroscópicas ................................................................................................................... 35 4.1.2 Selección por pruebas bioquímicas (Catalasa y Oxidasa) ................................. 37

4.2 Pruebas In vitro para potencial probiótico ................................................................... 38 4.2.1 Tolerancia a pH ácido ........................................................................................ 38 4.2.2 Crecimiento en bilis ........................................................................................... 38 4.2.3 Actividad hemolítica .......................................................................................... 38 4.2.4 Actividad antibacteriana ................................................................................... 41 4.2.5 Pruebas de susceptibilidad a los antibióticos ................................................... 42

4.3 Identificación bioquímica y molecular de las cepas ...................................................... 43 4.3.1 Identificación bioquímica .................................................................................. 43 4.3.2 Identificación molecular.................................................................................... 44

4.4 Fermentación de polen ................................................................................................. 45 4.4.1 Medición de pH ................................................................................................. 45 4.4.2 Medición de la acidez libre titulable ................................................................. 46 4.4.3 Recuento celular de las BAL .............................................................................. 46 4.4.4 Evaluación sensorial .......................................................................................... 47

5. Discusión ........................................................................................................................ 49 5.1 Aislamiento y selección de cepas de Lactobacillus sp.................................................. 49 5.2 Pruebas In vitro para potencial probiótico ................................................................... 50

5.2.1 Tolerancia a pH ácido ........................................................................................ 50 5.2.2 Crecimiento en bilis ........................................................................................... 51

Contenido XIII

5.2.3 Actividad hemolítica .......................................................................................... 51 5.2.4 Actividad antibacteriana ................................................................................... 52 5.2.5 Susceptibilidad a los antibióticos ...................................................................... 53

5.3 Identificación bioquímica y molecular de las cepas ...................................................... 53 5.3.1 Identificación bioquímica .................................................................................. 53 5.3.2 Identificación molecular .................................................................................... 54

5.4 Fermentación de polen ................................................................................................. 56 5.4.1 Comportamiento del pH y la acidez ................................................................. 56 5.4.2 Recuento celular de las BAL .............................................................................. 57 5.4.3 Evaluación sensorial .......................................................................................... 57

6. Conclusiones y recomendaciones .................................................................................... 59 6.1 Conclusiones ................................................................................................................. 59 6.2 Recomendaciones ......................................................................................................... 61

A. Anexo: Procedimiento para realizar recuentos ................................................................ 63

B. Anexo: Procedimiento Actividad antibacteriana .............................................................. 65

C. Anexo: Cuantificación de microrganismos por el método de Miles y Misra ....................... 67

D. Anexo: Extracción de ADN .............................................................................................. 69

E. Anexo: Identificación molecular ...................................................................................... 71

F. Anexo: Ficha técnica del cultivo liofilizado comercial Lb acidophilus Danisco® .................. 77

G. Anexo: Estadística .......................................................................................................... 79

Bibliografía ............................................................................................................................ 83

Contenido XIV

Lista de figuras

Pág. Figura 2-1: Pan de abejas. ...................................................................................................... 10

Figura 2-2: Árbol filogenético de las BAL [55]. ....................................................................... 14

Figura 2-3: Fermentación de la glucosa en bacterias lácticas homofermentativas y

heterofermentativas [74]. .................................................................................... 16

Figura 2-4: Mecanismos de actividad probiótica [30, 37]. ..................................................... 19

Figura 2-5: Modulación de células inmunitarias en el intestino por probióticos [125]. ........ 20

Figura 2-6: Formato de los productos probióticos comercializados [31]. ............................. 24

Figura 2-7: Directrices para la evaluación de probióticos en los alimentos FAO/OMS [96]. . 25

Figura 4-1: Porcentaje % de microrganismos según el Gram en el pan de abejas. ............... 35

Figura 4-2: Características microscópicas del género Lactobacillus. ..................................... 37

Figura 4-3: Características macroscópicas del género Lactobacillus. .................................... 37

Figura 4-4: Actividad antimicrobiana sobre el S. aureus ATCC 25923. .................................. 41

Figura 4-5: Prueba de susceptibilidad a los antibióticos. ....................................................... 43

Figura 4-6: Sistema API®50 CHL. ............................................................................................ 43

Figura 4-7: Electroforesis de productos de PCR de los aislados............................................. 44

Figura 4-8: Comportamiento del pH para cada cepa en los ensayos de fermentación. ........ 45

Figura 4-9: Comportamiento de la acidez para cada cepa durante la fermentación. ........... 46

Figura 4-10: Dinámica poblacional durante la fermentación de las cepas 6, 7, 10, 11, Cp. .... 47

Figura 4-11: Pan de abejas in vitro. .......................................................................................... 48

Contenido XV

Lista de tablas

Pág. Tabla 2-1: Evaluación sensorial y físico-química de cuatro especies de polen [134]. ................ 9

Tabla 2-2: Características Físico-químicas del polen y del pan de abejas en Colombia [35]. ..... 9

Tabla 2-3: Especies de Lactobacillus aislados del Tracto Gastrointestinal usados como

Probióticos [12, 46, 132]. ......................................................................................... 17

Tabla 2-4: Efectos de los probióticos en la práctica clínica [37]. .............................................. 21

Tabla 2-5: Criterios para evaluar el riesgo de sepsis por probióticos en la práctica

Clínica [37]. ............................................................................................................... 24

Tabla 3-1: Discos comerciales empleados Oxoid®. ................................................................... 30

Tabla 4-1: Identificación microscópica por Gram de las colonias obtenidas. ........................... 36

Tabla 4-2: Resultados de Tolerancia a pH ácido. ...................................................................... 39

Tabla 4-3: Resultados de Crecimiento en bilis. ......................................................................... 40

Tabla 4-4: Crecimiento y tipo de hemólisis presentado por los once aislados ......................... 38

Tabla 4-5: Resultados de Actividad antibacteriana ................................................................... 41

Tabla 4-6: Resultados de sensibilidad a antibióticos. ............................................................... 42

Tabla 4-7: Resultados obtenidos en el programa informático de identificación apiweb™. ..... 44

Tabla 4-8: Resultados de la evaluación sensorial ...................................................................... 47

Tabla 5-1: Patrones de fermentación de carbohidratos sistema API®50 CHL .......................... 55

Contenido XVI

Lista de abreviaturas

Abreviatura Término

ADN Ácido desoxirribonucleico ARN Ácido ribonucleico ARNr Ácido ribonucleico ribosómico AOAC Association of Analytical Communities ATCC (American Tipe Culture Collection): Colección americana de Cultivos tipo ATP Adenosin Trifosfato BAL Bacterias Acidolácticas BPM Buenas Prácticas de Manufactura CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute DO Densidad Óptica EMP Embden Meyerhof Parnas ETA Enfermedad Transmitida por Alimentos FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations):

Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación GRAS (Generally recognized as safe): Generalmente reconocida como segura HDL Colesterol de alta densidad IEC Células Epiteliales Intestinales IFN Interferón Ig Immunoglobulina LDL Colesterol de baja densidad MRS Medio de cultivo Man Rogosa Sharpe NK Natural Killer OMS Organización Mundial de la Salud PCR (Polymerase Chain Reaction): Reacción en cadena polimerasa TH1 Linfocitos T 1 ayudadores TH2 Linfocitos T 2 ayudadores TNF Factor de Necrosis Tumoral TSA Agar Tripticasa de soya UFC Unidad Formadora de Colonias

Introducción

En Colombia la demanda de productos apícolas, como suplementos alimentarios, nutricionales y terapéuticos, ha permitido la generación de una cadena de comercialización que viene ganando mercados locales, regionales e internacionales, que demandan estudios de calidad y estabilidad, por parte de los consumidores. A partir del adecuado manejo que se le puede dar a las abejas, se obtiene una variedad de productos para el uso y el consumo humano y para las propias abejas como fuente nutricional, a fin de mejorar su rendimiento productivo; entre los productos destinados al consumo humano alimenticio o terapéutico, están jalea real, miel, polen, propóleos, apitoxina, cera y pan de abejas [85, 91]. La apicultura en Colombia es considerada como una actividad importante, por constituir un recurso productivo y una forma de vida que permite la conservación de la diversidad biológica, las abejas participan como actores principales en la polinización de las plantas garantizando de esta manera la presencia de futuras generaciones en la vegetación, obteniendo a través de esta alimentos y productos, conocidos por los innumerables beneficios nutricionales y medicinales en los consumidores [13, 16, 115]. Esta actividad se lleva a cabo principalmente en algunas regiones de Colombia como Magdalena, Santander, Boyacá, Cauca, Meta, Quindío, Huila, Tolima, Sucre, Antioquía, Cundinamarca, lugares en donde la producción y la comercialización de los productos apícolas está condicionada al conocimiento y a la tecnología que posea el apicultor, lo que hace deseable que se incremente la investigación en torno a este tema con el fin de aumentar el aprovechamiento de los productos de la colmena, como también dar origen al desarrollo de productos de valor agregado que cumplan con criterios de calidad. En nuestro país la actividad apícola está orientada principalmente en la producción de miel, en segundo lugar a la de polen, en menor proporción a la de jalea real, cera, propóleos, apitoxina y casi nula en pan de abejas, siendo este uno de los productos de la colmena más desaprovechados actualmente [84, 85]. El pan de abejas es un producto de la colmena, obtenido a partir de la fermentación microbiana sucedida en el polen corbicular, que posee múltiples beneficios en el consumo humano y animal, al constituirse como el alimento básico en el desarrollo de las larvas de las abejas, ostenta de innumerables cualidades nutricionales aportadas por su alto contenido de aminoácidos, vitaminas, minerales, fácilmente asimilables y digeribles [25, 45, 115].

2 Introducción

Apis mellifera, requiere de ciertos compuestos nutricionales, obtenidos del polen necesarios para su funcionamiento vital y para la fabricación y secreción de otros productos, siendo asimilados únicamente después de una serie de procesos bioquímicos sucedidos en el interior de una celda; producto de una fermentación ácido láctica desarrollada por bacterias y por levaduras [44]. En los humanos, se hace aprovechable los nutrientes por ser más fáciles de absorber, además la combinación de diversas sustancias biológicamente activas, lo hace eficaz en la prevención y en el tratamiento de distintas enfermedades [25]. Este tipo de producto contiene aproximadamente seis veces más la cantidad de ácido láctico comparado con el polen fresco, ventaja que le provee mayor preservación y conservación de los nutrientes que se encuentran disponibles [43]. Este alimento al proveer múltiples beneficios en el consumidor se constituye como un potencial alimento funcional, alimentos que de acuerdo a la necesidad actual deben hacer parte de la alimentación diaria. El consumo de alimentos funcionales se ha incrementado en los últimos años, debido al beneficio para la salud de los consumidores y en la productividad de los animales, debido a esto ha acrecentado el interés surgido en la actualidad, por la investigación orientada al avance en la producción de alimentos inocuos, con contenido nutricional, de poco aporte calórico y saludable, lo que ha generado el desarrollo de una variedad de productos, a partir de microorganismos intestinales tales como las bacterias acidolácticas y las bifidobacterias. El ser humano y los animales en vista de su necesidad de sobrevivencia deben hacer uso de requerimientos nutricionales de los alimentos, incluyendo el agua, siendo estos la fuente constructora, reguladora y energética, para el desempeño adecuado de las funciones vitales del organismo; no obstante, estos también pueden ser el origen de un sin número de afecciones por exceso o por defecto y de enfermedades, afectando directamente la salud [27]. Las Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETAs), son un problema mundial de gran magnitud, por las consecuencias políticas, económicas y sanitarias que generan [95]. La falta de implementación de programas de vigilancia y seguridad alimentaria como son las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM), favorecen la aparición y el desarrollo de enfermedades microbianas, que desencadenan desde un trastorno gastrointestinal hasta un compromiso sistémico, presentándose con mayor frecuencia en países en vía de desarrollo, lugares donde el sistema de acueducto y alcantarillado es deficiente o lo que es peor inexistente, aumentando el consumo de agua no potable y una inadecuada manipulación de alimentos [33]. La OMS asegura que el 88 % de las enfermedades diarreicas son producto de un abastecimiento de agua insalubre y de un saneamiento e higiene deficiente [57]. El polen apícola comercial en ocasiones ha mostrado no cumplir con los criterios de calidad establecidos para los alimentos, ya que presenta elevados recuentos de microorganismos indicadores, como mesófilos, coliformes, mohos y levaduras generando un producto de riesgo para el consumo humano, siendo de esta manera un problema su comercialización entre países productores y países consumidores [24]. La inconveniencia principal radica en la salud pública, ya que el polen al ser un alimento de ingesta cruda, facilita la incorporación de poblaciones

Introducción 3

microbianas que afectan el equilibrio de la flora residente benéfica, predisponiendo el organismo a patologías del tracto gastro intestinal. El Tracto gastrointestinal inferior, normalmente está poblado de comunidades bacterianas, que no generan ningún tipo de reacción adversa a su huésped, se encuentra colonizado por microorganismos, ya desde el nacimiento y durante toda la existencia del organismo anfitrión. Aunque la ingestión de agua y nutrientes supone cada día una oportunidad de colonización por nuevos microorganismos, la población microbiana permanece relativamente estable a no ser que se altere el equilibrio de la microflora como consecuencia de factores exógenos, como un tratamiento antibiótico [47, 81, 82, 92, 116, 128]. El uso de antibióticos facilita la proliferación de microorganismos resistentes a éstos fármacos, como Enterococcus, Pseudomonas y Hongos. C. difficile también prolifera con rapidez en esta situación, originando desde una diarrea hasta una colitis pseudomembranosa [92]. La exposición a otros microorganismos patógenos intestinales, como Shigella, E. coli, Salmonella sp, pueden alterar la microflora del colon, ocasionando inflamaciones e infecciones de tipo agudo, las cuales al no ser tratadas eficientemente podrían causar la muerte [29, 110, 116]. Las infecciones intestinales, han sido un punto de estudio destinado a encontrar posibles soluciones, que mitiguen total o parcialmente este tipo de afecciones, debido a esto y al no existir un adecuado sistema de vigilancia y control sanitario, ha tomado importancia el tema de Inocuidad en los Alimentos, se conoce que se puede reducir la presencia de microorganismos indeseables al aumentar los microorganismos deseables en los Alimentos Funcionales, incluyendo el uso de microrganismos probióticos, que han adquirido importancia en los últimos años debido a que se les atribuye beneficios a la salud en la prevención y el tratamiento de enfermedades [89]. Se han estudiado poblaciones bacterianas, que pueden actuar como antagonistas de microorganismos oportunistas y de patógenos, a través de diferentes funciones propias de las especies implicadas en dichas investigaciones. Las cepas microbianas utilizadas en la producción de probióticos, en su mayoría son de origen animal, aisladas del tracto Gastrointestinal [98]. El riesgo de infección por productos probióticos Lactobacilos o Bifidobacterias es similar a una infección por bacterias comensales, sin implicación para consumidores sanos, sin embargo lo podría ser para pacientes inmunocomprometidos [97]. El desarrollo de probióticos, requiere una adecuada selección de cepas, debido a que solo unas pocas especies de bacterias ácidolácticas tienen efectos positivos en la salud. Los microorganismos deben ser identificados mediante pruebas que deben ser realizadas en cepas individuales, según estudios previos de evaluación, se atribuyen efectos diferentes entre diversas especies [119]. Entre otras propiedades, las bacterias acidolácticas producen varios tipos de metabolitos, como ácidos grasos libres, peróxido de hidrógeno, bacteriocinas que impiden el crecimiento de patógenos, modifican enzimáticamente receptores de toxinas e impiden la colonización de los patógenos, por inhibición competitiva [54]. También se utilizan frente a casos de intolerancia a la lactosa, enfermedades crónicas como la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, gastroenteritis aguda, alergias y cáncer de colon [41], lo

4 Introducción

que hace de este tipo de bacterias una alternativa prometedora para la prevención de desórdenes intestinales [30]. Es precisamente debido a este tipo de microorganismos, patógenos y oportunistas, que surgió la idea de investigar a fondo como contrarrestar la acción de estos, haciendo uso de los microorganismos residentes en el tracto gastrointestinal benéficos, utilizándolos como terapia preventiva frente a infecciones que comprometen el Sistema Digestivo [54]. Investigaciones previas han revelado que, los microorganismos aislados en el pan de abejas han pertenecido a los géneros, Lactobacillus, Streptococcus, Pseudomonas, Eschericia, y Bacillus; levaduras tipo Sacharomyces dentro de las más importantes [43]. De todos estos, Lactobacillus y Streptococcus, son los encargados de la fermentación láctica [43], en donde para efectos de este estudio, el género Lactobacillus se constituyó en bacterias a caracterizar y evaluar su potencial como probióticos, mediante pruebas como tolerancia a pH ácido, crecimiento en bilis, actividad hemolítica, actividad antibacteriana, sensibilidad a antibióticos y fueron identificadas molecularmente; las mejores cepas que cumplieron los anteriores parámetros fueron probadas en procesos fermentativos en sustratos de polen apícola, con el objetivo de lograr un acercamiento a obtener un alimento funcional tipo pan de abejas industrial.

1. Objetivos

1.1 Objetivo general

Evaluar el potencial probiótico del aislamiento de Lactobacilos obtenidos a partir de Pan de abejas y valorar su posible aplicación en la fermentación in vitro de polen apícola.

1.2 Objetivos específicos

Aislar y Caracterizar Lactobacilos de Pan de abejas de Apis mellifera. Evaluar el Potencial Probiótico del aislamiento de Lactobacilos in vitro. Comparar el comportamiento de propagación y sostenibilidad de los Lactobacilos aislados, versus una cepa comercial de Lactobacillus acidophilus reconocida como probiótica, en el sustrato natural polen apícola, bajo condiciones de posible aplicación industrial.

2. Marco teórico

2.1 El polen

Se define como el elemento germinal masculino, producido en los sacos polínicos de la antera de la flor, indispensable para la fecundación y consiguiente transformación de la flor en fruto; desde el punto de vista morfológico, los granos miden aproximadamente de 20 a 40 micrones, con forma esférica u ovalada, están compuestos por una célula viviente rodeada de una membrana gruesa llamada esporodermis [113]. La esporodermis está constituida por dos cubiertas concéntricas, en la parte interna es denominada intina, su principal componente es la celulosa, quien le confiere elasticidad y en la parte externa la exina, pared gruesa conformada por la esporopolenina, quien le confiere resistencia a la desecación y por lo tanto impide la muerte de la célula [39, 113]. Su aspecto y propiedades sensoriales de color, sabor, aroma, textura y tamaño están en función de su origen botánico. En cuanto al Color, las tonalidades van desde el verde al naranja y desde el amarillo al marrón, en algunos casos se pueden observar pólenes violáceos y café oscuro; al degustarlo se presentan sabores intensamente dulzainos o ligeramente amargos con tonos astringentes; el aroma: esta proporcionado por la flor; desde el punto de vista de la producción, la mejor zona es aquella que no depende de una floración única, sino de varias ofertas de néctar y polen capaces de proporcionar recursos abundantes que superen las necesidades de la colonia [38]. El polen es fundamental en la alimentación de las larvas que van a originar las futuras obreras y en menor medida a los zánganos, una colonia no puede criar larvas si no tiene polen, es la única fuente de proteínas para la colmena, es el principal aporte de vitaminas A, B, K y E, además de fósforo, cloruros, flúor, potasio, magnesio, calcio, sodio, hierro y manganeso entre otros [25, 39, 90].

2.1.1 Clasificación del polen de Apis mellifera

Polen corbícular: Corresponde al material colectado por las abejas y transportado en sus patas a la colmena. Polen apícola: Es el polen capturado mediante trampas por los apicultores, que luego es removido, seleccionado y sometido a un proceso de secado para reducir su actividad de agua e incrementar su vida útil para su comercialización.

8 Aislamiento y Selección de Lactobacillus sp con potencial probiótico a partir de pan de abejas

Polen Alveolar: También llamado Pan de abejas, está dispuesto en las celdas de los panales para su maduración. Estos tipos de pólenes presentan diferencias fisicoquímicas y nutricionales.

2.1.2 Recolección y secado del polen

El procedimiento se efectúa por medio de trampas situadas en la piquera o en el piso de la colmena, que contienen orificios que al ser atravesados por las obreras hacen que los granos de polen corbicular rocen con los bordes de las perforaciones ocasionando su caída para la colecta, es indispensable el vaciado diario de los cajones con la cosecha, ya que al permanecer húmedo el polen fermenta rápidamente [2, 99]. Para la deshidratación del polen es necesario el uso del secador, el cual consta de una serie de bandejas, en una cámara ventilada, donde es extendido el polen y sometido a temperaturas inferiores a los 48°C por espacio de 3 ó 4 h, en el proceso de secado se reduce su contenido de humedad desde un 12 % hasta un 5.6 %. Posteriormente, al polen le es retirado las impurezas (patas, alas, antenas) utilizando ventiladores; finalmente se empaqueta el vacío o con el mínimo de aire posible, con el fin de asegurar al máximo su conservación y sus propiedades nutricionales [2, 25, 99].

2.1.3 Propiedades fisicoquímicas y microbiológicas del polen

El polen fresco es de carácter acido, posee una textura blanda que se altera en el proceso de deshidratación pasando a ser ligeramente duro. En la Tabla 2-1, se pueden observar algunas propiedades del polen, evaluadas por [134]. La fracción proteica del polen le confiere un alto valor biológico por el alto contenido de aminoácidos esenciales, sumado al contenido de minerales (zinc, hierro, cobre, sodio, potasio, calcio, magnesio y fósforo), fibra y la reducida fracción grasa con presencia de omegas, haciendo de este producto un alimento funcional. En la Tabla 2-2 se pueden observar algunas propiedades físico-químicas del polen colombiano [35]. La calidad microbiológica del polen está en función de la humedad relativa, un valor alto contribuye a su deterioro en algunos casos con la presencia de hongos toxigénicos que producen aflatoxinas, como también, es frecuente encontrar poblaciones microbianas que atentan contra la calidad higiénica de estos productos relacionándose las Enterobacterias, principalmente [9].

9

Tabla 2.1: Evaluación sensorial y físico-química de cuatro especies de polen [134].

Tabla 2.2: Características Físico-químicas del polen y del pan de abejas en Colombia [35].


2.1.4 Empleo del polen

El polen se ha utilizado por sus múltiples acciones en alimentación, cosmetología y terapéutica: Suplemento mineral, indicado a cualquier edad, en personas hipertensas gracias a la relación

Sodio/Potasio. Suplemento Proteínico. Regulación del equilibrio orgánico y estimulación del crecimiento. Regulación de las funciones intestinales y del sistema nervioso. Resistencia a infecciones. Previene la obesidad [38, 91].

2.2 Pan de abejas

La abeja Apis mellifera requiere de ciertos compuestos nutricionales, agua, carbohidratos, obtenidos a partir del néctar, proteínas, lípidos, vitaminas y minerales; obtenidos partir del polen, necesarios para su funcionamiento vital. El polen no es consumido directamente por las abejas, la producción del alimento está ligado al almacenamiento de los granos por la abeja en la celda, la obrera que regresa del campo los deposita en el alvéolo, al momento otra abeja, usualmente una de casa o una abeja joven, llega a la celda y examina su contenido, al encontrar los granos libres, empieza a trabajar en la base de la celda con un activo movimiento de la cabeza y con las mandíbulas cerradas. Cuando los granos alcanzan la base de la celda, donde hay polen guardado, estos son perforados e incorporados dentro de la masa, y el conjunto es pulido con las mandíbulas y la lengua [38]. En el interior las secreciones salivares (con alto contenido enzimático y microbiano) [56] y el néctar le son agregados, mientras las celdas son operculadas con una delgada capa de miel [43], generándose internamente un ambiente anaeróbico con una temperatura de 37 ± 1°C, lo que desarrolla en el polen una serie de reacciones bioquímicas, originados por una fermentación ácido láctica producida por bacterias y por levaduras [43, 45], dando origen al Pan de Abejas Figura 2-1. Figura 2-1: Pan de abejas.

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Chevtchik (1950) En estudios previos realizados sobre la fermentación del polen a pan de abejas, observó que el proceso se llevaba a cabo en cuatro etapas a lo largo de siete días, la primera etapa dura aproximadamente 12 horas, caracterizada por la presencia de un grupo variado de microorganismos como bacterias lácticas, aerobias y levaduras; en la segunda etapa surgen las bacterias anaerobias, que utilizan factores de crecimiento sintetizados por levaduras y bacterias, ocasionando un descenso en el pH del polen e incrementando el contenido de vitamina B; en la tercera etapa, comienzan a desaparecer los microorganismos incapaces de tolerar el pH, incrementándose las bacterias lácticas tipo Lactobacillus, favoreciendo una mayor producción de ácido láctico, la última etapa empieza el séptimo día, con un pH de alrededor de 4 – 4.2, destacándose la reducción del contenido microbiano, permaneciendo únicamente algunos microorganismos resistentes a condiciones adversas, bacterias lácticas y levaduras.

2.2.1 Composición nutricional del pan de abejas

El pan de abejas contiene proteínas de alto valor biológico, encontrándose disponibles como aminoácidos esenciales con una mayor facilidad de absorción, contiene vitaminas, como B1, B2, C, E, K, entre otras, pigmentos como carotenoides y antocianinas; enzimas como la sacarasa, amilasa y fosfatasa, más de 25 minerales entre los que se destacan, hierro, calcio, magnesio, fósforo, potasio, cobre, zinc y selenio [7, 11, 93, 100]. La cantidad de ácido láctico generado (aproximadamente seis veces mayor que en el polen), provee funciones de conservación y preservación del producto, por mucho tiempo, además conserva los nutrientes provenientes del polen, siendo más digerible y apetecido por las abejas adultas para la fabricación y secreción de otros productos [93].

2.2.2 Propiedades del pan de abejas

En las abejas la falta de proteínas por escasez de pan de abejas en los primeros 10 días de vida se puede ver reflejado en el desarrollo inadecuado de las glándulas hipo faríngeas, encargadas de la secreción de la Jalea Real, de igual manera cuando se acaban las reservas para mantener la cría, se recurre a las proteínas del intestino y del musculo, originando abejas más pequeñas con problemas intestinales, con deficiencias hormonales e inmunitarias, además afecta la recolección del polen [48]. En el ser humano, la combinación de diversas sustancias biológicamente activas, lo hace eficaz en la prevención y el tratamiento de numerosas enfermedades como, gastritis, úlceras, colitis, constipación crónica, diarreas, hepatitis, anemia, alergias, infartos, disminuye los niveles séricos de colesterol, triglicéridos, reduce la presión arterial, y desempeña un papel importante en la alimentación dietética. [7, 93]. Posee actividad antiséptica conocida frente a varias especies patógenas de los géneros Staphylococcus y Escherichia.


2.2.3 Microorganismos en el pan de abejas

Los microorganismos aislados en el pan de abejas corresponden a levaduras destacándose Sacharomyces y a especies bacterianas de los géneros, Pseudomonas, Escherichia, Bacillus, Lactobacillus y Streptococcus, estas dos últimos pertenecientes a las bacterias acidolácticas y encargadas directamente de la producción de ácido láctico [43]. La Apis mellifera ha hecho uso de los procesos de fermentación para la obtención de su alimento preservándolo por más tiempo haciéndolo biodisponible.

2.3 Aplicación microbiológica en alimentos

En la actualidad hay un considerable interés por el aumento de la cantidad y actividad de la flora del colon, con el fin de promover la salud en los humanos y en las especies animales, de esta manera se han determinado diferentes estrategias para modificar el contenido microbiano, como la inclusión en los alimentos de bacterias utilizadas como probióticos, de carbohidratos no digeribles utilizados como prebióticos y la suma de probióticos y prebióticos originando un alimento de carácter simbiótico [127, 135]. Los probióticos pueden ser considerados como “ingredientes funcionales” que son utilizados para “funcionalizar” alimentos, es decir agregar una propiedad definida que le otorga un valor agregado al producto, ya que entregan beneficios para la salud del consumidor, más allá de los beneficios nutricionales del alimento que los contiene [15]. Además que su utilización como estimuladores del crecimiento animal constituye una alternativa satisfactoria para la sustitución de antibióticos. Algunas de las cepas microbianas usadas como probióticos, son de origen gastrointestinal humano o animal [40], presentando cada una distintas propiedades, de manera que una cepa específica ejerce solo algunas de todas las características que describen a los probióticos. [35] La Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y Alimentos (FAO) y la Organización Mundial de la Salud (OMS) han declarado que hay evidencia científica para indicar el potencial de los probióticos que proporcionan beneficios en la salud y de las cepas específicas que son seguras para uso humano [96].

2.3.1 Origen de los microorganismos industriales

Han sido escogidos a partir de fuentes naturales bajo criterios establecidos como: Selección in vitro de aquellas cepas que presentan características benéficas para el huésped. Cepas sintetizadoras de enzimas de uso en alimentos. Cepas con características probióticas. Provenientes de fuentes reconocidas como colecciones de cultivo públicas y privadas [72].

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2.4 Probióticos

2.4.1 Evolución del término probiótico

El científico Elie Metchnikoff en el año 1907, evidenció beneficios en el proceso de fermentación de la leche, tras notar que los lactobacilos convertían la lactosa en ácido láctico, por ende la acidez generada creaba un ambiente hostil para las bacterias patógenas. De esta manera, defendió la importancia de la dieta en la salud, tras proveer protección frente a patógenos y así mejorar la calidad de vida [34, 79, 96]. El médico pediatra francés Henry Tissier, destaco la importancia de las bifidobacterias, al notar la baja cantidad en niños con episodios diarreicos, no así en niños sanos, en quienes encontraba una cantidad significativa, con esta investigación postulo que la administración de bifidobacterias a pacientes con diarrea podría ayudar a restaurar su flora intestinal [34, 96]. Lilly y Stilwell en 1965, introdujeron por primera vez el término “probiótico” refiriendo que son “Sustancias secretadas por un organismo y capaces de estimular el crecimiento de otro“[34]. Parker en 1974 definió a los probióticos como “organismos y sustancias que contribuyen al balance microbiano intestinal” [34]. Fuller en 1989 postulo a los probióticos como “suplementos microbianos que influyen beneficiosamente en el huésped animal mejorando su balance microbiano” [34]. Salminem en 1998 posteriormente, conceptualizo a los probióticos como “Alimentos que contienen bacterias vivas las cuales son beneficiosas para la salud” [34, 79]. Con la consecuente investigación en torno al tema y teniendo en cuenta los postulados y las definiciones anteriormente enunciadas, se ha ampliado y actualizado el concepto que se tiene de probióticos, como un producto que contiene un número suficiente de microorganismos vivos, puros o mixtos, con un efecto beneficioso sobre la salud, a través de una alteración positiva de la microbiota por colonización del intestino [69, 118, 130]. Finalmente según la FAO/OMS se define como “Organismos vivos que ingeridos en cantidad adecuada confieren un beneficio saludable en el huésped”. Los microorganismos empleados como probióticos, son hongos y/o bacterias comensales que forman parte de la flora gastrointestinal, vaginal y de la boca, se citan los siguientes géneros entre las levaduras, Saccharomyces cerevisiae y boulardii y entre las bacterias Bacillus, bacterias acidolácticas destacándose el Bifidobacterium y para efectos del presente estudio el Lactobacillus.” [79, 108].


2.4.2 Bacterias acidolácticas (BAL)

Las BAL son generalmente reconocidas como GRAS (Generally recognized as safe) con importancia en la preservación y en la fermentación de alimentos, mejorando la calidad higiénica e inhibiendo la presencia de patógenos [59, 111]. Los diversos géneros de las BAL, se han definido sobre la morfología celular, ADN y tipo de fermentación. La relación filogenética se basa en la comparación de secuencias de ARNr 16S, con un % molar guanina-citosina bajo en el ADN, mostrando a Carnobacterium, Enterococcus, Vagococcus, Aerococcus, Tetragenococcus y el recientemente descrito Lactosphaera como los géneros más cercanos, Lactococcus y Streptococcus relativamente cercanos, mientras que Lactobacillus es más diverso y los géneros no relacionados Propionibacterium y Bifidobacterium Figura 2-2 [46, 55]. Figura 2-2: Árbol filogenético de las BAL [55].

Son bacilos o cocos Gram positivos que como producto de fermentación originan ácido láctico, carecen de porfirinas y de citocromos, no obtienen energía por fosforilación oxidativa por transporte de electrones, sino por fosforilación a través del sustrato en ambientes ricos en azúcares, tienen metabolismo biosintético limitado a medios de cultivo con aminoácidos, vitaminas, purinas y pirimidinas [21, 105]. Todas crecen en condiciones anaerobias, no obstante pueden crecer en presencia o ausencia de oxígeno, por eso son consideradas como anaerobias aerotolerantes, algunas cepas pueden utilizar O₂ con la mediación de sistemas de flavoproteína oxidasa produciendo H₂O₂, eliminando este último por intermedio de peroxidasas [21, 105].

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Entre los subgrupos de las bacterias acidolácticas se generan dos tipos de fermentaciones de acuerdo a los productos obtenidos: Grupo homofermentativo: produce solamente ácido láctico. Grupo heterofermentativo: produce además de ácido láctico, etanol y CO2. En la Figura 2-3, se observan las rutas de fermentación de la glucosa por organismos homo y heterofermentativos, la diferencia está determinada por la presencia o ausencia de la enzima aldolasa, los heterofermentativos carecen de esta enzima y no pueden fragmentar la fructosa difosfato, que origina ácido láctico, en su lugar la glucosa 6 fosfato es oxidada hasta 6-fosfogluconato, que es descarboxilado hasta pentosa fosfato que escinde hasta triosa fosfato y acetil fosfato por acción de fosfocetolasa, la triosa fosfato da origen al ácido láctico y una molécula de ATP, y el acetil fosfato da origen a etanol sin moléculas de ATP y la descarboxilación del 6-fosfogluconato produce CO2 [74]. Existe poca variación de estirpe a estirpe por poseer una composición de bases de DNA muy parecida entre los miembros de los géneros, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc y Pediococcus. No presentándose la misma situación entre las especies de Lactobacillus, al poseer una composición de bases muy diversa, lo que lo hace un grupo heterogéneo [74]. Los medios de cultivo utilizados para el aislamiento de bacterias ácidolácticas, deben conservar características ácidas, con los requerimientos nutritivos mencionados anteriormente y con un ambiente preferiblemente microaerofílico; el medio de cúltivo de elección para su crecimiento es el Man Rogosa Sharpe (MRS), selectivo para bacterias acidolácticas, incluyendo, Enterococcus, Pediococcus, Bifidobacterium y Lactobacillus [22].


Figura 2-3: Fermentación de la glucosa en bacterias lácticas homofermentativas y heterofermentativas [74].

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2.4.3 El género Lactobacillus

Son microorganismos Gram positivos, de morfología bacilar, en algunas especies algo flexionados, con longitud y grosor variado, no formadores de esporas, Inmóviles, catalasa negativos, no reductores de nitratos, citocromo negativos, no licuan la gelatina, su temperatura óptima de crecimiento es de 30-40°C; está ampliamente distribuido en la naturaleza, en productos de origen vegetal y en el tracto Gastrointestinal humano y animal y presentan metabolismo homofermentativo y heterofermentativo [9, 34, 74, 104, 105]. Actualmente existen 207 especies conocidas [70] y desde el punto de vista como probióticos comerciales tienen especial interés 26 especies que se observan en la Tabla 2-3. La comparación de las secuencias de genes ADN 16S de Lactobacillus muestran que las regiones V1, V2 y V3 contienen la información específica de las especies [132]. Tabla 2-3: Especies de Lactobacillus aislados del Tracto Gastrointestinal usados como probióticos [12, 46, 132].

Especies Cepa comercialmente disponible

Lactobacillus acidophilus LA1; NCFM; LA5 Lactobacillus johnsonii La1; DDS-1; SBT-2062; NCC533 Lactobacillus paracasei F19 Lactobacillus casei CRL-431; Immunitas; Shirota Lactobacillus rhamnosus GG; LB21; 271; GR-1; VTT E-97800 Lactobacillus plantarum 299v; Lp01 Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus Lb 12 Lactobacillus delbrueckii subsp lactis L1a Lactobacillus cellobiosus Lactobacillus curvatus Lactobacillus fermentum RC-14 Lactobacillus reuteri MM2 Lactobacillus brevis Lactobacillus salivarius UCC118 Lactobacillus helveticus B02 Lactobacillus amylovorus Lactobacillus crispatus Lactobacillus gallinarum Lactobacillus gasseri LG21 Lactobacillus coryniformis Lactobacillus agilis Lactobacillus aviarius Lactobacillus murinus Lactobacillus hamsteri Lactobacillus intestinalis Lactobacillus ruminis


Lactobacillus es el género con más especies acidolácticas clasificadas de acuerdo a sus propiedades fermentativas: Grupo A: Lactobacilos homofermentativos obligados, fermentan hexosas a ácido láctico vía Embden Meyerhof Parnas (EMP), los microorganismos poseen la enzima fructosa 1,6 bifosfatoaldolasa y no la fosfocetolasa por lo que no fermentan pentosa ni gluconato. L. delbruekii y L. acidophilus [66, 136]. Grupo B: Lactobacilos homofermentativos facultativos, fermentan hexosas hasta ácido láctico vía (EMP), fermentan pentosas y gluconato vía fosfogluconato hasta ácido láctico y ácido acético. L. casei y L. plantarum [66, 136]. Grupo C: Lactobacilos heterofermentativos obligados, fermentan siempre las hexosas a ácido láctico, etanol, ácido acético y CO2 vía fosfogluconato y fermentan las pentosas a ácido láctico y a ácido acético vía fosfogluconato. Cepas de Lactobacillus próximos a Leuconostoc [66, 136].

Los Lactobacillus son generalmente más resistentes a las condiciones ácidas que otras bacterias acidolácticas, siendo capaces de crecer a pHs bajos de 4. Lo que facilita su aislamiento en medios que contengan ácidos y azúcares; esta resistencia les permite seguir creciendo, aun en pHs que hayan descendido tanto, en comparación con otras bacterias lácticas, siendo las únicas capaces definalizar las fermentaciones lácticas [74].

2.4.4 Características de los probióticos

Según la FAO/OMS es deseable que los microrganismos probióticos posean características que intervengan en el control de patógenos intestinales tales como:

Producción de sustancias antimicrobianas. Exclusión competitiva Competencia por los nutrientes Modulación del sistema inmunitario Resistencia a la acidez gástrica y biliar Capacidad de permanecer viables en el producto, desde el envasado, almacenamiento, hasta

el consumo, conservando las características descritas en las etiquetas. Ser habitante normal del intestino humano [59, 69, 130, 138]. Proporcionar seguridad a nivel clínico y alimentario (no ser patógeno ni toxigénico) [69, 106,

130, 138].

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Poder de adaptación a la microbiota intestinal sin desplazar la microbiota nativa ya existente [59, 69,130, 138].

Proporcione deseables propiedades organolépticas [42, 69, 106, 130, 138].

2.4.5 Mecanismos de acción de los probióticos

Se han descrito múltiples mecanismos, Figura 2-4, destinados a mejorar la resistencia del huésped contra organismos patógenos, a través de diferentes funciones: Figura 2-4: Mecanismos de actividad probiótica [30, 37].

Efectos bioquímicos: Son logrados a través de la producción de sustancias antimicrobianas que reducen el número de células viables patógenas, afectan el metabolismo bacteriano, la producción de toxinas [112] y contribuyen a la prevención en la descomposición de los alimentos [30, 49, 111], a través de:

Metabolitos originados como producto final en cantidades variables como el ácido láctico, ácidos grasos de cadena corta, peróxido de hidrógeno y diacetilo [30, 34, 76].

En la disminución del pH intestinal favoreciendo el crecimiento de organismos

beneficiosos.

Bacteriocinas, corresponden a proteínas o complejos de proteínas biológicamente activas de alto peso molecular, se dividen en cuatro clases, clase I: lantibióticas, termolábiles<5 kDa, clase II: pequeñas, hidrofóbicas, termoestables, 13 kDa, clase III: termolábiles, 3 kDa y las clase IV (bacteriocinas complejas): se encuentran asociadas a lípidos o carbohidratos. La mayoría de las bacteriocinas que han sido aisladas de Lactobacillus, pertenecen a la clase II[30, 34, 49, 111].


Competición por nutrientes: La capacidad para competir por nutrientes, es un factor

determinante en la composición de la microflora intestinal, las especies bacterianas residentes en la porción proximal del colon tienen un gran suministro de nutrientes proporcionado por los residuos alimenticios provenientes del intestino delgado, no así existe la misma disponibilidad de nutrientes para las bacterias que habitan en la porción distal del colon, de esta manera la presencia de microrganismos probióticos reduce aún más, el sustrato disponible en los tramos del colon para otras especies bacterianas [27, 30, 34, 112].

Actividad Inmunomoduladora: Estimula la inmunidad innata y adquirida, activando los

mecanismos celulares y humorales a través de la producción de Inmunoglobulina A (IgA), activando la actividad fagocítica mediante el aumento de macrófagos e incrementando Interferón Gamma (IFN-gamma) y Citoquinas proinflamatorias, Figura 2-5 [30, 34, 58, 62, 107].

Figura 2-5: Modulación de células inmunitarias en el intestino por probióticos [125].

Adhesión celular: Los probióticos deben tener la capacidad de adherirse a la mucosa intestinal,

para de esta forma resistir la peristalsis y evitar ser expulsados. En adición, debido a su permanencia bloquean la invasión y la adhesión de enteropatógenos. Algunas cepas han sido escogidas por su habilidad de adherencia a las células epiteliales como Lactobacillus spp [34, 42, 59, 68, 87, 101, 112, 138].

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2.4.6 Aplicaciones clínicas de los probióticos

De acuerdo a las cepas probióticas administradas, forma de adquisición, dosis y características inherentes al huésped, se observará un resultado beneficioso para la salud Tabla 2-4. Tabla 2-4: Efectos de los probióticos en la práctica clínica [37].

El uso de microrganismos probióticos se ha incrementado debido a los múltiples beneficios en salud que se han observado a través de sus aplicaciones en diferentes patologías [30, 37, 53, 88, 96]: Tracto gastrointestinal La diarrea es un efecto secundario frecuente al uso de antibióticos, ocurre generalmente en pacientes que reciben antibioterapia de amplio espectro, los probióticos son una alternativa eficaz para reducir esta alteración, microorganismos como el Saccharomyces boulardii, Lactobacillus GG, y otros como las bifidobacterias se han usado en la prevención y tratamiento de la diarrea y han demostrado la reducción de la intensidad y de la duración del cuadro clínico [79, 88]. Su uso también está indicado en casos de Colitis pseudomembranosa por C. difficile, diarreas asociadas con cepas de E.coli enteropatógenas y enterotoxigénicas, Rotavirus principalmente en niños, síndrome de colon irritable y enterocolitis necrotizante, [88]. Frente a casos de enfermedad inflamatoria intestinal, la cual es una patología asociada a la defectuosa regulación que hay entre la microflora bacteriana y la inmunidad de la mucosa intestinal sucediendo en pacientes genéticamente susceptibles; en esta enfermedad las bacterias probióticas actúan de diferentes formas, produciendo sustancias antimicrobianas, por


interacciones competitivas metabólicas e inhibiendo la adherencia de patógenos por la acción de factores de defensa inmune local [52, 79, 124]. En el problema de intolerancia a la lactosa, causada por una deficiencia congénita de la enzima β-galactosidasa o lactasa, ocasionando dificultad en la absorción y digestión de este azúcar, para este caso, la lactosa llega al intestino donde es fermentada por las bacterias residentes produciendo agua, gas metano e hidrógeno, causando flatulencia, dolor abdominal y diarrea acuosa, los probióticos actúan transformando la lactosa en ácidos orgánicos como el láctico y el acético y produciendo lactasa, que facilita la digestión de la lactosa en la parte alta del intestino delgado [27, 79, 112]. Helicobacter pylori (Efecto Gastro-protector) Estudios previos indican que los probióticos, actúan en contra de esta bacteria Gram negativa involucrada en el desarrollo de gastritis crónica, úlceras gástrica y duodenal posterior a la colonización de la mucosa del intestino, además factor de riesgo para cáncer gástrico [10, 107], inhibiendo la adherencia a los receptores glicolípidos y disminuyendo la actividad de la enzima ureasa necesaria para su supervivencia en el medio ácido del estómago [27, 49, 51]. Entre los microorganismos destacados está el Bacillus subtilis que secreta componentes antibióticos, el L. reuteri que inhibe la unión del H. pylori a los receptores glicolípidos a través de una proteína que tiene en su superficie celular, dando lugar a una competencia por el receptor que impide la colonización por dicha bacteria y el L. salivarius que produce elevadas cantidades de ácido láctico en el estómago, lo que estimula la producción de prostaglandinas endógenas quienes actúan como mecanismos de defensa con efecto protector de la mucosa gástrica [18, 53, 79]. Alergias (efecto inmunomodulador) Los alérgenos alimenticios pueden provocar una respuesta proinflamatoria en el intestino por alteración de la función de la barrera intestinal, los probióticos, actúan reduciendo la inflamación intestinal, corrigen el desbalance de los linfocitos y pueden ser efectivos en la respuesta inmune al prevenir las reacciones alérgicas, estimulando las células del Sistema Inmune en la producción de Inmunoglobulina A (IgA), citoquinas, (IL-4, IL-5, y IL-13) que a su vez promueven la secreción de inmunoglobulina E (IgE) y la eosinofilia [18, 53, 79, 80, 112]. Cáncer Se han realizado estudios en animales, indicando la reducción en el riesgo de cáncer por los lactobacilos y las bifidobacterias al modificar la microbiota intestinal, a través de la posible disminución de las enzimas fecales (glycosidasa, ß- glucoronidasa, azoreductasa y nitroreductasa) asociadas con la conversión de precarcinógenos a carcinógenos, e Inhibiendo directamente la formación de células tumorales inactivando o bloqueando el carcinógeno [107, 112]. De igual manera los lactobacilos participan en la producción de ácidos grasos de cadena corta, los cuáles acidifican el medio ambiente, un pH bajo se asocia a menor riesgo de cáncer colorrectal [18, 53, 79]

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Infección del Tracto Genito-Urinario Los Lactobacillus presentes en la microbiota vaginal, han presentado eficacia clínica en el tratamiento de infecciones vaginales, los mecanismos de acción están basados en la capacidad de adherencia y colonización al tracto urogenital, sumado al efecto microbicida debido a la producción de peróxido de hidrógeno (H2O2) y de ácido láctico alterando este microambiente por ende la impidiendo el crecimiento de patógenos [18, 53, 79, 39]. Enfermedades Cardiovasculares Los elevados niveles de colesterol en sangre, se constituyen en un factor de riesgo asociado a desencadenar patologías de tipo cardiovascular, de acuerdo a lo anterior, según estudios realizados tras el consumo de lácteos fermentados en períodos determinados, hubo correlación en la reducción de los niveles séricos de colesterol, L. reuteri es una de las bacterias que se encuentra directamente relacionada con una disminución del 20-30% del colesterol total y de 22-35% de los triglicéridos, además aumenta la razón HDL/LDL [53].

2.4.7 Requisitos de los alimentos probióticos

Durante el tránsito gastrointestinal, las bacterias probióticas, deben mantenerse viables y activas en el producto, a fin de asegurar el efecto benéfico en el consumidor, en este sentido, es importante el pH producido a partir del proceso de fermentación, el oxígeno disuelto (primordialmente para las bifidobacterias), el antagonismo entre especies, la composición química del medio de cultivo, la concentración de azúcares, las prácticas de inoculación del cultivo probiótico, la temperatura, la duración de la fermentación y las condiciones de almacenamiento del producto [10, 79].

2.4.8 Presentación de probióticos

En el comercio se encuentran disponibles los probióticos en distintos formatos [31] Figura 2-6: Alimentos fermentados como: Lácteos, vegetales, carnes y bebidas alcohólicas artesanales

fermentados. Suplementos nutricionales solos o asociados con suplementos vitamínicos, fibra. Antioxidantes. Agentes farmacológicos, empleando cepas únicas o mezclas de varias cepas, en dosis altas y

liofilizadas para dar mayor estabilidad y conservación. Asociados con alimentos prebióticos, constituyendo un producto simbiótico.


Figura 2-6: Formato de los productos probióticos comercializados [31].

Producto probiótico Producto alimentario probiótico producto probiótico no alimentario Secos Líquidos Sólidos Complemento Suplemento Terapéutico Alimenticio Fermentado No fermentado Líquido Líquido Cápsula Cápsula Polvo Polvo Crema Supositorio

2.4.9 Riesgos de los probióticos en la práctica clínica

Estudios clínicos han estipulado que el riesgo de infección por el consumo de probióticos sería similar al producido por cepas comensales, las infecciones por estos microorganismos podrían ocurrir de forma natural incluso sin estar relacionadas con la ingesta de estos, los casos reportados de enfermedades con compromiso sistémico desencadenados por probióticos, son raros, para que se presenten este tipo de patologías, los pacientes deben tener algún compromiso o supresión en el sistema inmune (Diabetes, VIH, Cáncer, valvulopatías, problemas hematológicos, desnutrición, pacientes en la unidad de cuidados intensivos, prematuros y trasplantados). Con base a lo anterior se recomienda emplear con precaución la administración de probióticos especialmente en pacientes prematuros y en determinados pacientes inmunodeprimidos, como se plantea en la Tabla 2-5, donde se establecen una serie de factores predisponentes a la sepsis por probióticos [37]. Tabla 2-5: Criterios para evaluar el riesgo de sepsis por probióticos en la práctica clínica [37].

Criterios mayores

Inmunodeficiencia severa incluyendo estados de desnutrición grave o cáncer Neonatos prematuros

Criterios menores

Catéteres venosos centrales Barrera epitelial intestinal incompetente (procesos diarreicos severos,

inflamación intestinal) Administración de probióticos por yeyusnostomía Administración concomitante de antibióticos de amplio espectro a los cuales

los probióticos son resistentes (por ejemplo muchos Lactobacillus son naturalmente resistentes a la vancomicina)

Probióticos con capacidad de alta adhesión a la mucosa intestinal o patogenicidad conocida

Enfermedad valvular (únicamente para Lactobacillus)

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2.5 Directrices para la evaluación de probióticos en los alimentos

La Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) y la Organización Mundial de la Salud (OMS), reconocieron la necesidad de establecer directrices para un criterio sistemático en la evaluación de probióticos en los alimentos, con el fin de identificar y delinear los requerimientos mínimos necesarios para la condición de probiótico, ver Figura 2-7. Figura 2-7: Directrices para la evaluación de probióticos en los alimentos. Tomado de la FAO/OMS


2.5.1 Pruebas in vitro para la selección de microorganismos probióticos

Las cepas a evaluar como probióticas deben cumplir entre otras, con las siguientes pruebas [96]: Resistencia a la acidez gástrica Antes de llegar al tracto intestinal, las bacterias probióticas deben sobrevivir en primer lugar, a la acidez gástrica, que se presenta por la secreción de jugos gástricos como mecanismo de defensa del estómago hacia la mayoría de los microorganismos ingeridos, esta prueba está dirigida a determinar el grado de tolerancia a la acidez que presentan diferentes Lactobacillus [42, 59, 86]. Crecimiento en bilis Destinada a evaluar la capacidad de los potenciales probióticos para resistir los efectos de los ácidos biliares, quienes son sintetizados por el hígado, a partir de colesterol y secretados por la vesícula biliar hacia el duodeno. En la bilis se encuentra a las sales biliares actuando como detergentes, afectando la estabilidad de la membrana, demostrada in vitro e in vivo en cepas de E. coli, y Enterococcus sp [42, 64]. Actividad hemolítica Los microorganismos que producen hemolisinas pueden utilizar la hemoglobina, la hemina y la hematina de los glóbulos rojos como fuente de hierro, propiedad indeseable en los criterios de selección para un probiótico, frente a esto se hace necesario evidenciar su presencia en medios de cultivo con sangre [4,14]. Actividad antimicrobiana Las bacterias acidolácticas producen varios metabolitos con efectos antimicrobianos, esta prueba verifica la presencia de inhibidores sintetizados por las cepas en estudio, tales como bacteriocinas u otro tipos de compuestos tóxicos [4, 14, 27, 64]. Susceptibilidad a los antibióticos Los microorganismos probióticos, pueden presentar resistencia a los antibióticos, resistencia relacionada con genes localizados en el cromosoma o en los plásmidos. Con base a lo anterior, la FAO/OMS estableció “No deberían utilizarse en alimentos bacterias que contengan genes transferibles de resistencia a medicamentos”, concluyendo que cuando se proceda a la selección de cepas probióticas, se recomienda que no posean genes transmisibles que codifiquen la resistencia a medicamentos utilizados con fines clínicos [96, 109]. En contradicción, para algunos autores, es deseable que las cepas sean resistentes a los antibióticos, debido al elevado consumo de antibióticos que afecta la microflora benéfica, lo que facilita su eliminación; de igual manera frente a casos de, terapia combinada (Probióticos y Antibióticos) y como cultivos iniciadores en productos que contienen antibióticos [60, 78]. Existen otras valoraciones como adhesión celular, actividad inmunomoduladora, capacidad antioxidante y pruebas in vivo, entre otras, que no fueron valoradas en el presente estudio.

3. Materiales y métodos

3.1 Localización del estudio

El estudio de aislamiento, identificación y evaluación de cepas probióticas de pan de abejas de Apis mellifera y su aplicación en la fermentación de polen apícola, fueron realizadas en el laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia y el Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos ICTA de la Universidad Nacional de Colombia. Este trabajo hizo parte del programa “Estrategias para establecer la denominación de origen de los productos de las abejas en Colombia” y del proyecto “Cualificación de productos de las abejas: Miel, Polen y Propóleos mediante indicadores microbiológicos” financiado por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo rural. Los apiarios utilizados están ubicados en la Facultad de Biología de la Universidad Nacional sede Bogotá (humedad relativa 77%, 2556 m.s.n.m, 21°C)

3.2 Obtención de muestras

Las muestras de pan de abejas fueron recogidas al azar en colmenas sanas de Apis mellifera, tomando un marco por colmena donde se observara mayor cantidad de polen alveolar. El muestreo se realizó por un período de cinco meses. Se recogieron un total de 38 muestras que fueron transportadas en bolsas plásticas, a temperatura ambiente hasta el laboratorio para ser procesadas bajo cabina de flujo laminar, las muestras que no fueron procesadas fueron mantenidas a 4ºC por un tiempo máximo de 7 días.

3.3 Aislamiento y selección de cepas de Lactobacillus sp

El polen alveolar fue obtenido con una cucharilla de acero inoxidable estéril y depositado en tubos estériles tapa roscas en una cantidad aproximada de 10 g. Se realizaron siembras de las muestras en agar Man Rogosa Sharpe (MRS), con diversas metodologías, a través de la siembra directa en superficie, siembra en profundidad, a través de diluciones seriadas 1:10, tomando 4 g para 36 ml en solución salina fisiológica estéril con siembra de 0.1 ml por cada dilución, pre enriquecimiento en caldo MRS por 24 h, y la adición de miel al 5% directamente a la preparación del agar MRS, con el fin de recuperar el mayor número y variedad de colonias; los medios fueron incubados a 37°C de 24-72 horas bajo condiciones de microaerofilia [50, 63, 75, 86, 121]. A partir de las colonias aisladas, se procedió a la selección de aquellas que cumplían con las propiedades que permitían considerarlas como pertenecientes al género en estudio, por medio


de la observación macroscópica de las colonias en medio MRS y MRS modificado (azul de anilina) para ayudar al reconocimiento de los microrganismos lácticos [23, 32, 60, 122]. La valoración microscópica se efectuó a través de las coloraciones de Gram y Schaeffer-fulton, observándose la morfología Gram positiva y la ausencia de esporas respectivamente [63, 64, 82, 86, 98]. Se realizaron pruebas bioquímicas como catalasa y oxidasa, las cepas identificadas como catalasa y oxidasa negativas fueron evaluadas para potencial probiótico [63, 64, 82, 86, 98]. Las cepas aisladas fueron conservadas en caldo MRS con 20% (p/v) de glicerol y mantenidas a -20°C, con reactivación semanal para la realización de las diferentes pruebas [63, 86, 120].

3.4 Pruebas in vitro para potencial probiótico

3.4.1 Tolerancia a pH ácido

Se evaluó el comportamiento frente a cuatro pH diferentes 3.0, 4.0, 5.0 y 7.0 en 3 ml de caldo MRS, ajustando los pHs con HCl 1N con el potenciómetro, los caldos estériles, fueron inoculados con un cultivo axénico y fresco de cada uno de los aislados en prueba, hasta conseguir una turbidez del 0.5 de la escala de Mc Farland (1-2 x 108 UFC/ml). Los caldos se incubaron a 37ºC, por 2h y 4h, se realizaron siembras sobre agar MRS, que fueron incubadas a 37ºC en condiciones de microaerofilia [63, 86]. A las cepas resistentes al pH 3.0 por 4h, se les realizó un recuento en superficie para cuantificar las UFC/ml (Anexo A).

3.4.2 Crecimiento en bilis

Para esta prueba el crecimiento se realizó frente a tres concentraciones de bilis de buey (deshidratada Sigma) 0.3, 0.5 y 1.0 % p/v en 3 ml caldo MRS, Se inóculo, teniendo un cultivo axénico y fresco de las colonias, hasta conseguir una turbidez del 0.5 de la escala de Mc Farland (1-2 x 108UFC/ml), con una incubación de 2 y 4h a 37°C, se realizó la siembra en agar MRS realizando su lectura 72h después. Posteriormente las cepas que sobrevivieron a la concentración de 1.0%, se les realizó recuento en superficie para cuantificar las UFC/ml (Anexo A) [63, 64, 86, 87, 133].

3.4.3 Actividad hemolítica

A partir de un cultivo axénico y fresco, se sembró una colonia en Agar Columbia con 5% de sangre de cordero, las placas fueron incubadas a 37°C en condiciones microaerofílicas de 24-72 h, posterior al tiempo de incubación se realizó la lectura de la presencia de hemolisis a las 24, 48 y 72 h, [4, 14, 77, 86, 109]. Hemólisis β: Rompimiento total de los Glóbulos rojos, observándose zonas claras alrededor de las colonias en el medio de cultivo.

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Hemólisis α: Rompimiento parcial de Glóbulos rojos, observándose zonas parcialmente claras alrededor de las colonias en el medio de cultivo. Hemólisis γ: No hay rompimiento de Glóbulos rojos, no se observan zonas claras alrededor de

las colonias.

3.4.4 Actividad antimicrobiana

Para valorar esta propiedad a los aislados se enfrentaron a cepas de referencia, Gram positivas y Gram negativas. Según la metodología descrita por Schillinger y Lücke (1989), [14, 63, 64, 98, 109, 117, 126, 137]. Staphylococcus aureus ATCC 25923 Escherichia coli ATCC 25922 Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 Bacillus subtilis ATCC 6633

Cultivos puros de las cepas de referencia, se suspendieron en solución salina con una turbidez de 0.5 de la escala de Mc Farland, que fueron sembradas masivamente en el agar Tripticasa de soya (TSA); por otro lado se elaboraron cultivos de cada uno de los aislados por crecimiento masivo en el agar MRS, de este cultivo fueron cortados cilindros de agar, que fueron superpuestos en las placas donde se tenia sembrada la suspensión de las cepas de referencia teniendo en cuenta que la superficie crecida quedara en contacto con la superficie de la cepa de referencia, posteriormente fueron incubadas a 37°C por 24-48h, con lectura de presencia/ausencia de halos de inhibición (Anexo B). La interpretación se indicó bajo el concepto de valor de inhibición absoluto y relativo, expresado mediante la siguiente fórmula:

Valor de Inhibición= (I-DC)/2 Dónde: DC: Diámetro del cilindro del cultivo (mm) I: Diámetro de Inhibición

3.4.5 Pruebas de susceptibilidad a los antibióticos

La susceptibilidad a los antibióticos se determinó en medios sólidos empleando discos comerciales de antibióticos, según el método estándar de difusión en discos Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Los resultados se interpretaron como sensibles (S) o resistentes (R).[5, 14, 19, 20, 63, 77, 78, 86, 87, 94, 126, 140]. Los inóculos bacterianos de los aislados se ajustaron a una turbidez de 0.5 de la escala de Mc Farland, esta suspensión fue colocada y esparcida sobre la superficie del agar MRS con previa adición de azul de anilina [5, 86], a continuación fueron colocados los sensidiscos con un


dispensador, las placas se incubaron a 37°C de 24-72h en condiciones de microaerofilia, posterior al tiempo de incubación la lectura fue efectuada por la medición del diámetro de la zona de inhibición y la interpretación se basó en los estándares de diámetros de inhibición para Enterococcus spp, microorganismo cercano filogenéticamente al Lactobacillus, género que no posee valores estandarizados para estudios de susceptibilidad en la técnica de difusión en disco[1, 8, 20]. Los Antibióticos empleados, concentraciones y siglas, se indican en la Tabla 3-1. Tabla 3-1: Discos comerciales empleados Oxoid®.

Antibiótico Sigla Concentración Eritromicina E 15 µg

Gentamicina CN 10 µg

Metronidazol MTZ 5 µg

Trimetoprim sulfametoxazol SXT 25 µg

Amoxicilina AML 10 µg

Tetraciclina TE 30 µg

Enrofloxacina ENR 5 µg

3.5 Identificación bioquímica y molecular de las cepas

3.5.1 Identificación bioquímica

Se efectuó para aquellas cepas que cumplieron con las condiciones de probiótico en cuanto a acidez, a crecimiento en bilis, con efecto antibacteriano, sin presencia de hemolisinas y con perfil de susceptibilidad a antibióticos adecuado. Se realizó mediante la utilización de una galería API® 50 CHL, conformado por 50 cúpulas que contienen como sustrato diferentes carbohidratos más un indicador de pH, con el fin de establecer el patrón fermentativo del género Lactobacillus creando un perfil bioquímico interpretado por el programa informático APIWEB® (BioMérieux), anexo al kit [50, 71, 109]. A partir de cada cultivo puro se prepararon suspensiones en el medio que acompaña el kit API 50 CHL Medium con una turbidez en la escala de Mc Farland de 0.2, las suspensiones se inocularon en cada cúpula de la galería, empleando una por cada aislado. La lectura se interpretó, postincubación a 37°C por 24-48h con base en la fermentación de carbohidratos produciéndose un viraje del indicador del pH.

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3.5.2 Identificación molecular

Los aislados pertenecientes al género Lactobacillus, según pruebas bioquímicas, fueron identificados molecularmente.

Extracción de ADN

En la extracción del ADN genómico, se empleo un método enzimático combinado con fenol cloroformo, partiendo de un cultivo puro mantenido en caldo MRS, posteriormente se siguieron las indicaciones del protocolo (Anexo D). Reacción en cadena polimerasa (PCR) Para la confirmación del género y la especie, se utilizó la técnica de Polymerase Chain Reaction (PCR), los iniciadores usados fueron 27 F (5’ AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3’) y 1492R (5’

GGTTACCTTGTTACGACTT 3’ [67], que amplifican un fragmento de 1470 pb, del gen que codifica para la subunidad 16s del ARNr de las bacterias [55, 63, 109]. El sitio donde se anillan los iniciadores en este gen es en sus extremos, donde su secuencia es conservada para todas las especies de bacterias, en el interior su secuencia es altamente polimórfica y específica de cada género y especie, lo cual permite diferenciarlas mediante una posterior secuenciación de cada amplificado. Se tomaron 5 µL de ADN extraído (2 ng) de cada uno de los cuatro aislados escogidos. Cada muestra de ADN se suspendió en 45 µL de la mezcla de PCR que contenía una concentración final de: 1X de solución tampón de PCR, 1.5 mM de MgCl2, 0.2 µM de cada iniciador 27F y 1492R, 0,2 mM de dNTPs, 1 unidad de Taq ADN polimerasa (TucanTaq ADN polimerasa, Corpogen Bogotá Colombia) y agua destilada ultrapura hasta completar un volumen final de 50 µL. Como control positivo se empleó ADN extraído de una cepa de referencia Lactobacillus plantarum (ATCC 8014) y como control negativo se empleó agua ultrapura. La PCR se llevó a cabo en un termociclador PxE 0.2 (Thermo Electron Corporation, USA) con las siguientes condiciones: Desnaturalización inicial a 94oC por 3 minutos, seguidos de 30 ciclos de desnaturalización a 94oC por 30 segundos, apareamiento de los iniciadores a 55oC por 30 segundos, extensión a 72oC por 2 minutos y extensión final a 72oC por 3 min. Electroforesis en gel de agarosa Alícuotas de 5 µL de los amplicones fueron mezclados con 5 µL de solución tampón de carga y sometidos a electroforesis en geles de agarosa al 1 %, teñidos con bromuro de etidio, en solución tampón TBE 1X (90 mM Tris, 90 mM Borato y 2 mM EDTA, pH 8.3). Los fragmentos fueron corridos a 70 voltios en una hora y luego visualizados en un transiluminador UV (Spectroline USA). El tamaño de los amplificados obtenidos posteriormente se comparó con un marcador molecular de 100 pb (Promega WI, USA).


Secuenciación y análisis bioinformático El volumen restante de todos los productos de PCR (45 µL) de las 4 cepas y del control positivo (L. plantarum), fueron enviados a la Corporación Corpogen en Bogotá, quienes recibieron estas muestras y luego las remitieron a MACROGEN en la República de Corea del Sur, para que allí realizaran la secuenciación, por el método capilar en ambas cadenas del amplificado (secuenciación doble), con el fin de obtener una mejor secuencia consenso. Una vez obtenidas las secuencias se procedió a realizar un ensamblaje de las dos cadenas complementarias de cada amplificado, mediante el programa Bioedit. Con el fin de obtener una identificación por género y especie de cada Lactobacilo, las secuencias consenso pertenecientes a cada aislamiento, fueron alineadas y comparadas con las secuencias reportadas en la base de datos del GeneBank del NCBI, usando la herramienta BLASTn.

3.6 Fermentación de polen

Para hacer una aproximación en la obtención de un alimento funcional tipo pan de abejas industrial, se empleo polen apícola deshidratado (comercial) como sustrato para la realización de las fermentaciones, utilizando cuatro cepas nativas previamente caracterizadas como L. kunkeei vs la cepa comercial Lactobacillus acidophilus. Para el proceso se siguió la metodología propuesta por Fuenmayor (2009), usando una matriz de polen en similares condiciones de proceso. La cepa comercial, correspondió a un cultivo liofilizado de la marca Danisco ® referenciada como probiótica, comercializada bajo el nombre de HOWARY dophilus LYO 40 DCU, liofilizada en polvo, libre de humedad y mantenida a -20°C durante su uso. Lactobacillus acidophilus (Lb. acidophilus A-1, conocido también como NCFM). Ficha técnica (Anexo F).

3.6.1 Preparación de los inóculos

El inóculo de las cepas nativas, fue preparado teniendo un cultivo axénico y fresco de las cepas mantenidas en el agar MRS en microaerofilia a 37°C de 24-48h, recogiéndose de 3 a 4 colonias en 5 ml de caldo MRS con una incubación de 8-10h hasta conseguir una turbidez correspondiente una D.O de 0.10 – 0.130 a una longitud de onda de 625 nm, equivalente a 1-2 x 108 UFC/ml, empleando un espectrofotómetro ( Genesys® 5),adicionalmente se realizo el recuento celular utilizando el agar MRS, siguiendo las indicaciones del anexo D, e incubándose a 37°C en microaerofilia de 24-72h [5, 17, 126, 129]. El inóculo de la cepa comercial se preparó minutos antes de la utilización, teniendo como referencia el recuento reportado por la casa comercial y activando el microorganismo según las instrucciones indicadas.

33

3.6.2 Matriz de polen para la fermentación

Se empleo un lote único de polen colectado en la zona de Une (Cundinamarca), para preparar una adecuada mezcla de fermentación, en un sustrato duro y compacto como el polen, se hizo necesario tratarlo térmicamente a 121 °C por 15 min, con el objeto de lograr un ablandamiento de sus capas y obtener un sustrato estéril. El polen fue homogenizado manualmente con agua estéril siguiendo una proporción 2:1, utilizando un agitador estéril de acero inoxidable, a la anterior mezcla, se le agregó un 5 % (v/v) del inóculo del cultivo, la mezcla fue servida en frascos de vidrio de 110 ml hasta las ¾ partes del frasco, posteriormente las preparaciones fueron colocadas en incubación a 35±1°C por 36h con monitoreo de pH, acidez y de viabilidad celular cada 12h partiendo del tiempo 0, cada ensayo se realizó por triplicado [35].

3.6.3 Valoración de pH y acidez libre titulable

Las muestras fueron procesadas en el Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos (ICTA) siguiendo metodologías reconocidas internacionalmente por la Association of Analytical Communities (AOAC)[6]. Las mediciones de los valores de pH y acidez en las fermentaciones, se realizaron mediante el uso de un titulador automático Mettler Toledo ®T70, la concentración del titulante fue de 0.05 M de NaOH. Las muestras a analizar se prepararon pesando 3 g para 30 ml de agua desionizada, con agitación constante de 30 min, posteriormente la suspensión fue filtrada al vacío al kitasato, el filtrado fue transferido al vaso del titulador. En el tiempo 0h la acidez en meq/kg fue tomada como 0 meq/kg y para los tiempos 12, 24 y 36h fue calculada en base a la siguiente ecuación:

Apr= At - Ᾱi

Dónde: Apr es la acidez libre producida a partir del momento de la inoculación hasta un tiempo t. At es la acidez libre de la muestra medida en un tiempo t. Ᾱi es la acidez inicial promedio para el mismo ensayo.

3.6.4 Recuento celular de las BAL

Para las diluciones de las muestras se siguieron las indicaciones del anexo A y para la siembra se siguieron las indicaciones del anexo C, con incubación a 37°C de 24-72h en condiciones microaerofílicas. Los resultados se expresaron en UFC/g.


3.6.5 Evaluación sensorial

Las muestras obtenidas por fermentación fueron probadas y valoradas por tres personas conocedoras del pan de abejas natural, se estimaron características como sabor, olor y aspecto. Las apreciaciones en escala de valor fueron: Muy agradable, Agradable, Poco agradable y Desagradable.

3.7 Análisis Estadístico

En las fermentaciones, se empleo un diseño factorial tipo AB, el primer factor correspondió a las cepas nativas con seis niveles (cepas número 6, 7, 10, 11, L. acidophilus (control positivo cp) y Blanco (control negativo cn)) y el segundo factor correspondió al tiempo de fermentación (h) con cuatro niveles (0, 12, 24, 36); donde el tiempo 0 reflejó las condiciones iniciales de fermentación. Este diseño permitió comparar los tratamientos de las cepas aisladas 6, 7, 10, 11, de la cepa comercial (L. acidophilus) y del blanco, en función del tiempo de la fermentación, combinando las dos variables. Los resultados se analizaron con el paquete estadístico R-2.15.0, realizando un Análisis de Varianza (ANOVA) con el fin de comparar los datos obtenidos y establecer las significancias y diferencias de los efectos de las variables en las respuestas, y la comparación entre promedios para encontrar las diferencias significativas entre tratamientos, llevado a cabo a través de la prueba Tukey con una probabilidad de P<0.05.

4. Resultados

4.1 Aislamiento y selección de Lactobacillus sp

4.1.1 Aislamiento y selección de aislados por características microscópicas y macroscópicas

A partir de las treinta y ocho muestras procesadas de pan de abejas de Apis mellifera, se obtuvieron, cuarenta y dos colonias en el medio MRS, a las que se les realizaron observaciones microscópicas, con tinción de Gram, conservándose únicamente las colonias Gram positivas con morfología bacilar compatibles con el género Lactobacillus, Tabla 4-1. Del total de las muestras recogidas, el 26% de las colonias obtenidas fueron compatibles con la morfología de las bacterias ácido lácticas tipo Lactobacillus, bacilos Gram positivos largos y cortos y en algunos casos curvos, el 22% correspondió a cocobacilos Gram negativos, el 21% a Levaduras y el 31% a cocos Gram positivos, Figura 4-1. Figura 4-1: Porcentaje % de microorganismos según el Gram en el pan de abejas.

26%

31%

22%

21% Bacilos largos y cortosGram positivos

Cocos Gram positivos

Cocobacilos Gramnegativos

Levaduras


Tabla 4-1: Identificación microscópica por Gram de las colonias obtenidas.

Número de aislado Coloración de Gram 1 Coco Gram positivo

2 Bacilo largo Gram positivo

3 Cocobacilo Gram negativo

4 Coco Gram positivo




8 Levadura

9 Bacilo corto Gram positivo







16 Levadura


18 Levadura

19 Levadura




23 Levadura



26 Bacilo corto Gram positivo curvo



29 Levadura



32 Levadura




36 Levadura


38 Levadura





37

Once colonias (sombreadas) de las cuarenta y dos, correspondieron a las características microscópicas deseadas Figura 4-2. Figura 4-2: Características microscópicas del género Lactobacillus, en la fotografía izquierda bacilos Gram positivos largos y en la fotografía derecha bacilos cortos Gram positivos.

La parte microscópica continúo con la tinción de Schaeffer-Fulton, a través de esta coloración se pudo confirmar que el 100% de los 11 aislados fueron bacilos no formadores de espora, correspondiendo morfológicamente al género Lactobacillus. Dentro de las características macroscópicas, se encontraron colonias de color blanco con aspecto circular, ligera elevación, convexas y no pigmentadas, algunas de consistencia mucosa y otras seca Figura 4-3. Figura 4-3: Características macroscópicas del género Lactobacillus, en la fotografía izquierda colonias en el agar MRS y en la fotografía derecha colonias en el agar MRS con adición de azul de anilina.

4.1.2 Selección por pruebas bioquímicas (Catalasa y Oxidasa)

Para todos los aislados las pruebas de catalasa y oxidasa fueron negativas. De esta manera los once aislados correspondieron con los criterios morfológicos y bioquímicos que presenta el género Lactobacillus, y entraron a la evaluación como potenciales probióticos.




En la Tabla 4-2 se observa la resistencia y el conteo de los aislados frente a los diferentes pH utilizados, se indica en sombreado los aislados que cumplieron con las condiciones deseadas de tolerancia a pH 3 por 4h. El aislado 4 no cumplió con la condición deseada al no tolerar el pH 3.0, por lo tanto no se le realizó recuento.


En la Tabla 4-3 se observa la resistencia a la acción de la bilis y el conteo de los aislados que se mantuvieron viables, se indica en sombreado los que cumplieron las condiciones deseadas de crecimiento en bilis a una concentración de 1.0% por 4h. En este ítem se evidencio que los aislados 4, 8 y 9 no tuvieron el desempeño esperado de selección al no crecer en bilis al 0.5% y al 1.0%, por lo tanto no se les realizó recuento.


Se observan los comportamientos presentados por los aislados en estudio en el medio de cultivo Agar Columbia con sangre, cuatro de los once aislados no crecieron y de los siete que crecieron, dos presentaron α-hemólisis siendo un criterio más de eliminación y cinco γ-hemólisis (sombreados). En esta fase los aislados 2 y 9 no cumplen con el criterio de selección, como se puede observar en la Tabla 4-4. Tabla 4-4: Crecimiento y tipo de hemólisis presentado por los once aislados.

Aislados

Crecimiento

Hemólisis

1 Negativo -

2 Positivo α

3 Negativo -

4 Negativo -

5 Positivo γ

6 Positivo γ

7 Positivo γ

8 Negativo -

9 Positivo α

10 Positivo γ

11 Positivo γ

39

Tabla 4-2: Resultados de Tolerancia a pH ácido.

Lectura 2h

Lectura 4h

Aislado

pH 3.0

pH 4.0

pH 5.0

pH 7.0

pH 3.0

pH 4.0

pH 5.0

pH 7.0

Recuento UFC/ml

pH 3.0 4h 1 Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo 3.3 X 10⁵

2 Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo 9.4 X 10⁵


4 Negativo Positivo Positivo Positivo Negativo Positivo Positivo Positivo -


6 Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo 3.4 X 10⁶







Tabla 4-3: Resultados de Crecimiento en bilis.

Lectura 2h

Lectura 4h

Aislado

0.3 %

0.5 %

1.0 %

Caldo MRS

0.3 %

0.5 %

1.0 %

Caldo MRS Recuento UFC/ml 1.0% 4h




4 Positivo Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo Positivo -








4.2.4 Actividad antibacteriana

En la Tabla 4-5, los resultados están expresados como positivo o negativo y soportados con el valor de inhibición absoluto y el valor de inhibición relativo entre paréntesis; se seleccionaron los aislados que ejercieron antagonismo frente a al menos tres de las cuatro cepas de referencia, teniendo en cuenta que ninguna fue efectiva para B. subtilis. Tabla 4-5: Resultados de Actividad antibacteriana.

Aislado

S. aureus

ATCC 25923

P. aeruginosa

ATCC10145

E. coli

ATCC 25922

B. subtilis ATCC 6633

1 Negativo Negativo Negativo Negativo

2 Positivo 7 (0.5) Negativo Negativo Negativo


4 Positivo 13(3.5) Positivo 14(4) Negativo Negativo

5 Positivo 15 (4.5) Positivo 14 (4) Positivo 12 (3) Negativo

6 Positivo 15 (4.5) Positivo 13 (3.5) Positivo 11 (2.5) Negativo

7 Positivo 14 (4) Positivo 11 (2.5) Positivo 11 (2.5) Negativo

8 Negativo Positivo 11 (2.5) Negativo Negativo


10 Positivo 15 (4.5) Positivo 10 (2) Positivo 11 (2.5) Negativo

11 Positivo 11 (2.5) Positivo 12 (3) Positivo 11 (2.5) Negativo

En la Figura 4-4 se observa el efecto antagónico ejercido sobre la cepa S. aureus ATCC 25923. Figura 4-4: Actividad antimicrobiana sobre el S. aureus ATCC 25923.


Evaluados en su conjunto los cuatro criterios anteriores (tolerancia a pH ácido, crecimiento en bilis, actividad hemolítica y actividad antimicrobiana) se seleccionaron las cepas 5, 6, 7, 10 y 11 para la valoración de susceptibilidad a antibióticos.

4.2.5 Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

En la Tabla 4-6, se muestran los resultados de las cepas a los antibióticos expresados como Sensible o Resistente, de acuerdo al estándar de difusión en discos por la Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI: SENSIBILIDAD (S): No hay crecimiento alrededor del disco comercial, con medición del halo de inhibición (mm). RESISTENCIA (R): Hay crecimiento alrededor del disco comercial, no hay presencia de halo de inhibición. Los datos numéricos correspondientes al halo de inhibición en mm se ubican entre paréntesis; se seleccionó el aislado 7 que presento sensibilidad frente a tres de los siete antibióticos probados y a los aislados 6, 10 y 11 que presentaron sensibilidad frente a dos antibióticos. Tabla 4-6: Resultados de sensibilidad a antibióticos. E: Eritromicina, CN: Gentamicina, TE: Tetraciclina, AML: Amoxicilina, SXT: Trimetoprim sulfa, MTZ: Metronidazol, ENR: Enrofloxacina.

Aislado E (15µg)

CN (10 µg)

TE (30 µg)

AML (10 µg)

SXT (25 µg)

MTZ (5 µg)

ENR (5 µg)

5 R R R S (22) R R R

6 S (32) R R S (30) R R R

7 S (36) R R S (40) S (16) R R

10 S (24) R R S (22) R R R

11 S (28) R R S (30) R R R

En la Figura 4-5 se observa la prueba de sensibilidad a los antibióticos ejercidos sobre los aislados, se evidenció claramente las zonas de inhibición alrededor del sensidisco comercial.

43

Figura 4-5: Prueba de sensibilidad a los antibióticos.


4.3.1 Identificación bioquímica En la Figura 4-6 se observa el montaje de las 49 pruebas de fermentación y el control (Sistema API®50 CHL) realizado para el aislado 11 con incubación de 48h, donde se evidenció la fermentación de la glucosa, fructosa y de la sacarosa únicamente, comportamiento que fue similar para los aislados 6, 7 y 10. Figura 4-6: Sistema API®50 CHL con 48h de incubación.


En la Tabla 4-7, se observan las identificaciones preliminares realizadas por el programa informático de identificación apiweb™, los resultados obtenidos arrojaron los nombres género y especie, con un porcentaje bajo de confiabilidad en la identificación. Tabla 4-7: Resultados obtenidos en el programa informático de identificación apiweb™.

Aislado Identificación % Confiabilidad

6 Lactobacillus delbrueckii ssp delbrueckii Lactobacillus fructivorans

81.4 72.3


85.2 76.1


82.9 70.8


83.7 73.2

Control positivo Lactobacillus plantarum 95.3

De esta forma se confirmó a los aislados como pertenecientes al género sin tener aún clara la identificación de la especie.

4.3.2 Identificación molecular El tamaño de los amplificados obtenidos fue de 1470 pb, los cuales fueron comparados con un marcador molecular de 100 pb (Promega WI, USA) Figura 4-7. Figura 4-7: Electroforesis de productos de PCR de los aislados.

Carril 1: Cepa 6. Carril 2: Cepa 7. Carril 3: Control negativo. Carril 4: Cepa 10. Carril 5: Cepa 11. Carril 6: Control positivo L. plantarum, Carril 7: Marcador de peso (escalera de 100 pb).

1 2 3 4 5 6 7

1470

p

45

El alineamiento de las cuatro secuencias permitió obtener identidades entre el 99 y el 100% con las secuencias de Lactobacillus kunkeei depositadas en el GenBank del NCBI, (Anexo E). Adicionalmente el alineamiento de la secuencia del control positivo, arrojó una identidad del 100% con Lactobacillus plantarum.


Las cuatro cepas seleccionadas 6, 7, 10 y 11, que se destacaron previamente por su potencial probiótico, y que fueron sometidas a fermentación mostraron los siguientes resultados:

4.4.1 Medición de pH

En la Figura 4-8, se observa el descenso del pH producido por cada una de las cepas en estudio (6, 7, 10, 11, L. acidophilus (control positivo cp) y blanco (control negativo cn), en el transcurso de las 0, 12, 24 y 36h de la fermentación de los polenes inoculados; la gráfica permite hacer la comparación entre el desempeño de cada una de las cepas vs los controles. Figura 4-8: Comportamiento del pH para cada cepa en los ensayos de fermentación.

La reducción de pH es particularmente marcada a las 12 h. El descenso máximo de pH se logro con la cepa 10 a un valor de 4.3, las cepas restantes presentaron un valor cercano al control positivo de 4.44.


4.4.2 Medición de la acidez libre titulable En la Figura 4-9, se observa el comportamiento de la acidez producida por cada una de las cepas en estudio (6, 7, 10, 11, L. acidophilus (cp) y blanco (cn), en el transcurso de las 0, 12, 24 y 36h; la gráfica permite hacer la comparación entre el desempeño de la cepa vs los controles. Figura 4-9: Comportamiento de la acidez para cada cepa durante la fermentación.

La cepa 10 registro la mayor acidez libre titulable de 141.6 meq/kg y la cepa 11 presento un comportamiento irregular con el valor más alto de 86.6 meq/kg a las 24h y el valor más bajo de 76.2 meq/kg a las 36h.


La sobrevivencia al proceso fermentativo de las cepas en estudio y del control positivo (Lactobacillus acidophilus) en UFC/g, transcurrido el tiempo de 0, 12, 24 y 36 h se encuentran graficados en la Figura 4-10.

47

En la Figura 4-10, se observa el crecimiento y viabilidad de las cepas (6, 7, 10, 11, L. acidophilus (cp), en el transcurso de las 0, 12, 24 y 36h de incubación, las cinco cepas mantuvieron la viabilidad en forma semejante durante el proceso experimental. Figura 4-10: Dinámica poblacional durante la fermentación de las cepas 6, 7, 10, 11, cp.


En la Tabla 4-8 se observan los resultados obtenidos a partir de la prueba sensorial por tres personas conocedoras del pan de abejas natural, el producto obtenido se muestra en la Figura 4-11. Tabla 4-8: Resultados de la evaluación sensorial.

Cepa Sabor Olor Aspecto

6 Agradable Agradable Agradable

7 Muy agradable Muy Agradable Agradable



Cp Muy agradable Agradable Agradable

Cn Desagradable Desagradable Desagradable

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 12 24 36

Lo

g U

FC

/ml

Tiempo (h)

Crecimiento logarítmico de las cepas

6

7

10

11

cp


Figura 4-11: Pan de abejas in vitro.

Ninguno de los productos fue catalogado como poco agradable o como desagradable, para los conocedores de las características sensoriales del pan de abejas.

5. Discusión

5.1 Aislamiento y selección de cepas de Lactobacillus sp

En la fase inicial correspondiente a la toma de muestras, se estableció que el pan de abejas es una muestra de difícil obtención, por su empaquetamiento, poca cantidad en las celdas, y bajo peso, por lo que fue necesaria la colecta de por lo menos treinta celdas para conformar una muestra. Para la recuperación de Lactobacillus, el proceso de enriquecimiento microbiano se hizo en una relación de 4g para 36 ml de caldo de cultivo (MRS), ensayos previos indicaron la obtención de colonias similares utilizando mayor cantidad de muestra en volúmenes reducidos de medio líquido, siendo la mejor proporción la recomendada por Picozzi (2010) (4:36). Las bacterias ácido lácticas del pan de abejas, fueron aisladas empleando el medio de cultivo MRS a 37°C en condiciones microaerofílicas con 48 - 72 h de incubación, tiempo establecido para el crecimiento del género Lactobacillus. La morfología hallada correspondió con la flora reportada para el pan de abejas [43], ya sea proveniente del néctar recolectado [45] y/o de origen gastrointestinal de las abejas [38, 131]. Por otro lado la presencia de otros grupos microbianos en el agar MRS, confirma la selectividad para las BAL y no la especificidad para el género Lactobacillus, debido a que en él se ha reportado la presencia de otros géneros como Leuconostoc, Pediococcus y de algunas Levaduras [23]. La suplementación con miel al 5% en al agar MRS, no le proporcionó ningún tipo de ventaja, sobre el agar MRS sin la adición de ningún suplemento, al efectuar comparaciones en la obtención de diferentes colonias en los dos agares no se obtuvo colonia alguna diferente a las obtenidas previamente, como tampoco un incremento en la población. Las características macroscópicas de las 11 colonias elegidas, como el color blanco, la carencia de pigmentos, algunas especies con superficie brillante otras con superficie mate y todas convexas, corresponden con la descripción realizada por Kandler y Weiss en 1986; las mismas colonias sembradas en agar MRS con adición de azul de anilina al 0.3%, las mostraban de color azul propiedad asociada a las bacterias acidolácticas como las únicas que asimilan el colorante. Según [61] las cepas sugestivas de Lactobacillus no deben poseer las enzimas catalasa y oxidasa, un criterio más para la exclusión probiótica, en estas pruebas bioquímicas el comportamiento de los aislados fue negativo para las dos enzimas.



Luego de obtener resultados microscópicos, macroscópicos y bioquímicos en el primer objetivo del proyecto, se dio comienzo con la evaluación probiótica de las once cepas, siguiendo los criterios establecidos por la FAO/OMS y los seguidos por [27, 46, 53, 59, 69, 78, 109, 137], este punto del estudio evaluó los once aislados en pruebas que se constituyeron como filtros de selección, con una identificación bioquímica y molecular final.


La resistencia al pH bajo, es una de las propiedades requeridas en los microorganismos probióticos, su razón se debe al tránsito de los microorganismos deseables por el tracto gastrointestinal luego de haber resistido la alta acidez encontrada en el estómago [101], en este órgano, se tiene estimado que el tiempo de duración de la digestión es de tres horas y los valores de pH oscilan entre 2.0 -3.0 en algunos casos llegando hasta 1.0 [65], de igual manera se ha reportado a la cepa L. acidophilus M92 como no sobreviviente al pH 3.0 por más de 3h [86, 137], permitiendo establecer para esta prueba a las cepas como candidatas a probióticos, que deban cumplir con un tiempo de sobrevivencia de 3h en un pH de 3.0 simulando el tiempo de residencia en el estómago. Según [114], la metodología que emplea el uso del HCl permite asemejar las condiciones in vivo en el estómago, ya que el HCl es conocido como un fuerte agente oxidante, con acción sobre importantes compuestos como los ácidos grasos, las proteínas y el ADN, inhibiendo directamente la actividad metabólica, desencadenando la reducción de la viabilidad de los probióticos. A partir de la evaluación de la resistencia al pH ácido se evidenció que el 91% de los aislados sobrevivió al pH de 5.0, 4.0 y al mínimo establecido para la prueba de 3.0 después de las 2 y 4h de incubación; en los recuentos, las cepas 1, 2, 3, 5 y 8 presentaron los valores más bajos cercanos a valores de 105 UFC/ml y las cepas 6, 7, 9, 10 y 11 obtuvieron valores más altos cercanos a 106 UFC/ml, recuentos aceptados como mínimos luego de las exposiciones a este tipo de pruebas, 4 de ellas correspondiendo con las 4 mejores cepas finales que fueron identificadas molecularmente como L. kunkeei. La cepa 4 creció en el pH 5.0 en las 2 y 4h de realizada la prueba y como pH mínimo para su desarrollo se encontró en el pH 4.0 para las 2 y 4h, no así fue su desempeño en el pH 3.0 donde no se obtuvo crecimiento en la lectura de las 2 y 4h, constituyéndose de esta manera como cepa no cumplidora de los requerimientos como probióticos. Estos resultados permitieron visualizar cepas que pueden ser capaces de oponer resistencia al encuentro de los ácidos gástricos que se encuentran en el tracto gastrointestinal.

51


Este es otro parámetro que evalúa directamente la sobrevivencia de las cepas en el ambiente hostil gastrointestinal al entrar en contacto con la bilis, referenciada con una concentración en el cuerpo humano no constante, pero aproximadamente de 0.3% (p/v), que al entrar en contacto con los microorganismos, afecta la homeostasis celular causando la disociación de la bicapa lipídica y de las proteínas integrales de la membrana celular, desintegrando y permitiendo la salida del contenido citoplasmático originando la muerte celular [114]. El sometimiento de las cepas a concentraciones de bilis bovina comercial de 0.3%, 0.5% y 1.0%, permite la selectividad de los adecuados comportamientos frente a este inhibidor, observándose que el 73% de las cepas que corresponden a la 1, 2, 3, 5, 6, 7, 10 y 11 fueron capaces de crecer en las tres concentraciones estudiadas 0.3%, 0.5% y 1.0%, en los tiempos de 2 y 4h; en los recuentos se observó que las cepas 2, 3 y 5 presentaron conteos cercanos a 105 UFC/ml, valor no convincente para esta prueba y las cepas 1, 6, 7, 10, 11 presentaron conteos cercanos a 106UFC/ml, ajustándose en un requerimiento más como potencial probiótico. La cepa 1 no tuvo buen desempeño en medio ácido por lo que no fue opcionada para continuar en el estudio. El porcentaje de crecimiento bacteriano en bilis de 73%, indica que en el pan de abejas existe un buen número de Lactobacillus resistentes, si se tiene en cuenta que algunas cepas de este género no crecen en presencia de sales conjugadas, por el contrario si haciéndolo en presencia de sales deconjugadas, probablemente por no poseer enzimas que hidrolicen sales conjugadas y aunque la bilis bovina comercial contiene los dos tipos de sales, las cepas nativas fueron capaces de crecer [78]. La cepa 4 en esta prueba fue incapaz de tolerar la bilis, sumado a que ya había demostrado su incapacidad de crecer en el pH ácido, por lo que se considera que no es una cepa probiotica, semejante a las cepas 8 y 9, que tampoco mostraron buenas características. Este resultado para algunas cepas era esperado debido a que en la fuente de origen no existe ningún compuesto similar a la bilis.


La actividad hemolítica determinó la presencia de hemolisinas, presente en microorganismos potencialmente patógenos [4, 14, 77]. Los aislados 1, 3, 4 y 8, fueron colonias de las que no se obtuvo crecimiento, evitando de esta manera que este parámetro sea tenido en cuenta en la determinación como candidatas a probióticos, los aislados 2 y 9 presentaron α-hemólisis, característica eliminatoria para la selección; y dentro del grupo microbiano del que se obtuvo crecimiento con una γ-hemólisis se ubican las cuatro cepas(6, 7, 10 y 11) que tuvieron los mejores comportamientos en las pruebas anteriores, junto con el aislado 5, esta variación en cuanto a capacidad hemolítica y de crecimiento en el agar Columbia con sangre, indica la presencia de diversas especies en el producto natural.


5.2.4 Actividad antibacteriana

El efecto antimicrobiano de las cepas ácido lácticas ha sido bien conocido, a través de la síntesis de productos inhibitorios como bacteriocinas, y de sustancias originadas como producto del metabolismo fermentativo, entre estos, ácidos orgánicos principalmente el ácido láctico. Este tipo de compuestos ejercen su acción frente a una amplia gama de microorganismos destacándose los géneros Staphylococcus, Pseudomonas, Eschericia, Salmonella, Listeria, Bacillus y Levaduras como Candida [60, 78, 109, 137, 139]; para efectos de este estudio se utilizaron cepas de referencia S. aureus. Pseudomonas, Escherichia y Bacillus vs cepas nativas, evidenciándose el poder antagónico de las cepas nativas sobre el 75% de las cepas de referencia. Acerca de la metodología empleada, se establece que la técnica de difusión en agar fue apropiada para evaluar de manera cualitativa y rápida la posible acción antimicrobiana ejercida por los aislados; como criterio de selección se estableció que como mínimo existiera efecto antibacteriano sobre tres de las cuatro cepas de referencia empleadas, comprobándose así su acción inhibitoria. Los aislados 1, 3 y 9 no presentaron ningún tipo de acción antibacterial frente a las cuatro cepas de referencia, descartándose de esta manera la continuación en las siguientes pruebas; la cepa 2 ejerció efecto sobre el S. aureus con el valor de inhibición más bajo del estudio 7 (0.5), la cepa 8 únicamente ejerció efecto sobre la P. aeruginosa y la cepa 4 presento efecto sobre el 50% de las cepas de referencia el S. aureus y la P. aeruginosa. El S. aureus y la P. aeruginosa fueron los microorganismos más vulnerables para los aislados, el 63.6% de las cepas nativas ejercieron algún tipo de efecto inhibitorio sobre estas; la E. coli fue inhibida por el 45.5% de las cepas nativas y el B. subtilis no fue inhibido por ninguna cepa nativa. Estos resultados permitieron concluir que los aislados 5, 6, 7, 10 y 11 debían continuar con el proceso, indicando que las cepas correspondientes al L. kunkeei eran cepas con un interesante efecto antibacteriano frente a cepas patógenas comúnmente asociadas a patologías severas, además pueden actuar en casos de diarreas de origen bacteriano principalmente por E. coli, teniendo en cuenta que estas cepas superaron pruebas como la tolerancia al medio ácido y el crecimiento en bilis facilitando su tránsito por el tracto gastrointestinal, garantizando su llegada y su acción en contra de gérmenes patógenos. Por otro lado, el L. kunkeei también es un posible microorganismo capaz de producir un efecto bioconservante en los alimentos, por intermedio de las sustancias antibacterianas que produce previniendo la contaminación que se puede generar; las cepas de referencia utilizadas en el presente estudio se relacionan con la calidad microbiológica de los alimentos [87, 95, 139], S. aureus actúa como indicador de contaminación higiénica de los manipuladores de alimentos, E. coli relacionada con la inadecuada manipulación y/o contaminación fecal y P. aeruginosa como bacteria aerobia psicrótrofa responsable del deterioro de los productos que se almacenan en refrigeración.

53

5.2.5 Susceptibilidad a los antibióticos

Dado que el 100% de los aislados sometidos a la prueba fueron resistentes al 57% de los antibióticos utilizados, el criterio de selectividad establecido fue escoger a cuatro cepas que fueran sensibles a la mayor cantidad de antibióticos posibles, de acuerdo a la FAO/OMS a través de su comunicado “No deberían utilizarse en alimentos bacterias que contengan genes transferibles de resistencia a medicamentos”. En contraposición algunos autores [60, 78, 109] defienden el hecho de desear la resistencia a antibióticos de las cepas probióticas con el fin de asegurar su permanencia en el intestino después de un tratamiento terapéutico. Para efectos de este estudio la posición adoptada está de acuerdo con lo establecido por la FAO/OMS, descartando al aislado 5, por ser de las cinco cepas, la más resistente a los antibióticos evaluados. De los siete antibióticos probados, Gentamicina (CN), Tetraciclina (TE), Metronidazol (MTZ) y Enrofloxacina (ENR), no inhibieron el crecimiento de ninguno de los Lactobacillus, constituyéndose como un dato interesante a la hora de su selección como bacteria probiótica. La cepa 7 fue la cepa más sensible a la mayor cantidad de antibióticos posibles, en este caso a tres (Trimetoprim sulfa (SXT), Eritromicina (E), Amoxicilina (AML). Las cepas 6, 10 y 11 fueron sensibles a dos antibióticos Eritromicina (E) y Amoxicilina (AML); la sensibilidad del 100% de las cepas frente a este último antibiótico, tiene la ventaja de que la amoxicilina es uno de los antibióticos más ampliamente utilizados con o sin prescripción médica; además que correlaciona con los datos de sensibilidad que se tienen de los Lactobacilos, ya que el género es sensible a las penicilinas y a los inhibidores de la síntesis de proteínas como la eritromicina [1, 3, 60, 87]. A partir de los resultados obtenidos en esta prueba, se sugiere que el L. kunkeei (cepas 6, 7, 10 y 11) proporciona una doble ventaja en cuanto a su permanencia y eliminación, ya que protege el equilibrio de la flora residente durante el uso de algunos antibióticos usados comúnmente, como en casos de enfermedades diarreicas, y son eliminados por otros antibióticos evitando la transmisión de posibles plásmidos de resistencia a cepas potencialmente patógenas del intestino.


5.3.1 Identificación bioquímica

Esta identificación permitió establecer la similitud en el comportamiento fermentativo del L. kunkeei con referencia al Lactobacillus delbrueckii ssp delbrueckii y con respecto al Lactobacillus fructivorans, según el sistema API®50 CHL.


Las cepas 6, 7, 10 y 11 con una confiabilidad entre el 81.4 – 85.2%, fueron identificadas como Lactobacillus delbrueckii ssp delbrueckii y con una confiablidad entre el 70.8 - 76.1% fueron identificadas como Lactobacillus fructivorans. El sistema API®50 CHL identifica solamente 27 especies de Lactobacillus de 207 existentes [70], por lo que ubico a las cepas de estudio en especies de Lactobacillus con comportamientos fermentativos similares, de esta manera se estableció que el sistema API®50 CHL identifica a las especies presentes en su base de datos y no puede utilizarse para identificar otros microorganismos ni para excluir su presencia. El Lactobacillus kunkeei es un fermentador de glucosa, fructosa y sacarosa, su similitud con el Lactobacillus delbrueckii ssp delbrueckii radica en que este último, también fermenta glucosa, fructosa y sacarosa además de fermentar galactosa y manosa; y la similitud con el Lactobacillus fructivorans, radica en que los dos fermentan glucosa y fructosa, como se observa en la Tabla 5-1, a través de los patrones de fermentación, basados en la tabla de identificación del sistema API®50 CHL.

5.3.2 Identificación molecular

De acuerdo con [55], estudios basados sobre comparativos de análisis de secuenciación de ADN ribosomal (ADNr) 16S, demostraron que algunos taxones generados sobre la base de características fenotípicas no corresponden con las relaciones filogenéticas sugeridas, así algunas especies no son fácilmente distinguibles por características fenotípicas, de esta forma las técnicas moleculares incluyendo la PCR se han vuelto indispensables para la identificación de especies de Lactobacillus o para la diferenciación de las cepas probióticas. A través de la extracción del ADN, se evidenciaron inconvenientes en el empleo del método de ebullición de colonia (colony-PCR), técnica que funciona adecuadamente en las especies bacterianas, sin embargo, en este caso fue difícil o imposible obtener amplificación con el ADN generado por esta técnica, por esta razón se optó por el método enzimático, procedimiento que permitió obtener ADN genómico de alta calidad y pureza, apto para la amplificación por PCR. La técnica empleada, en este caso la PCR fue oportuna y precisa al orientar la identificación, ya que la caracterización por pruebas bioquímicas previas, nos indicaba un nombre y una especie errónea, según [131], el L. kunkeei se encuentra filogenéticamente relacionado con especies como L. kefiri, L. vermifirme, L. pentosus, no siendo tan cercano con el L. delbrueckii ssp delbrueckii y con el L. fructivorans indicados por el sistema API®50 CHL. Acerca del Lactobacillus kunkeei, se conoce su participación como microorganismo causante del deterioro de los vinos en una investigación realizada por [28], y como parte de la flora encontrada en el Tracto Gastrointestinal de la abeja Apis dorsata [131]; características como potencial probiótico y comportamiento fermentativo, se establecieron en el presente estudio.

55

Tabla 5-1: Patrones de fermentación de carbohidratos (tomado del sistema API®50 CHL).

1. L. delbrueckii ssp delbrueckii 2. L. kunkeei 3. L. fructivorans

Carbohídratos

Cepa

Co

ntr

ol

Glic

ero

l

Erit

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l

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Se emplearon los cuatro aislados identificados molecularmente como Lactobacillus kunkeei, previamente caracterizados como potenciales probióticos, debido a que su comportamiento fue diferente en las cinco pruebas anteriormente descritas y como cepa control se utilizo el Lactobacillus acidophilus.

5.4.1 Comportamiento del pH y la acidez

Según estudios de [12, 123, 129], el comportamiento general del pH y de la acidez en estas valoraciones, fue el característico de una fermentación, notándose el descenso del pH con el consecutivo aumento de la acidez; con respecto al pH, el análisis estadístico indicó que el efecto de la adición de las cepas y el efecto del tiempo de fermentación sobre el descenso del pH fue significativo, por la interacción de las cepas y del tiempo (p<0.05), el descenso de las cuatro cepas fue similar en comparación con el obtenido por el L. acidophilus, sin embargo se destaco el comportamiento de la cepa 11, en la que su curva de descenso mostró un comportamiento casi igual al del control positivo al cabo de las 36h. Para todas las cepas se concluyó que la fase de crecimiento y desarrollo exponencial esta indicado hasta las 12h, en el transcurso de las 24 a las 36 h no se evidenció cambios significativos en el descenso del pH. Con respecto a la acidez libre, el análisis estadístico indicó que el efecto de la adición de las cepas y el efecto del tiempo de fermentación sobre la producción de acidez fue significativo (p<0.05), evidenciándose que la mayor producción de la acidez estuvo a cargo de la cepa 10, con 142 meq/kg caracterizándose su curva por una producción progresiva, como la producción obtenida por las cepas 6 y 7 incluyendo el L. acidophilus del que se obtuvo una acidez de 98 meq/kg, al cabo de las 36h de fermentación, la cepa 11 mostró un comportamiento en que la acidez se incremento hasta las 24h de fermentación y en las siguientes 12h mostro un ligero descenso. Con relación al control negativo, se observo un aumento de acidez libre de 43.88meq/kg a las 36 h y de descenso de pH de 4.92 estos hallazgos son similares a los descritos por [35, 36] en estudios fermentativos previos llevados a cabo en polen, este variación en el pH y en la acidez no son atribuibles al metabolismo bacteriano, sino a las actividades químicas propias del sustrato, posterior al proceso térmico. Aunque las cepas utilizadas de Lactobacillus kunkeei (6, 7, 10 y 11) y de Lactobacillus acidophilus A-1, generaron un incremento en la población con un máximo descenso en el pH de 4.3 logrado por la cepa 10, y de 4.4 para el L. acidophilus, no se alcanzó al valor que presenta el pan de abejas natural referenciado por [35] de 4.1; similar fue el caso de la acidez, en el producto fermentado su valor total fue de 263 meq/kg, siendo superado por el pan de abejas natural cuyo alimento registra un valor de 271 meq/kg [35].

57


Se pudo establecer el crecimiento del L. acidophilus como el más óptimo, en la matriz de fermentación de polen, presentando recuentos más altos en comparación con todas y cada una de las cepas nativas, sus recuentos estuvieron alrededor de 108UFC/g, cumpliendo con la cantidad deseada para probióticos establecida por la FAO/OMS, en el tiempo 36h su conteo descendió a 107UFC/g, concordando con la alta acidez presentada en el sustrato; en el caso de las cepas nativas los conteos fueron similares entre ellos, estuvieron alrededor de 107UFC/g. Los resultados obtenidos señalan que 12 horas, es el tiempo adecuado para que se dé una fermentación optima por parte del L. acidophilus, tiempo similar establecido en los estudios de [35, 36], suficiente para inducir una producción significativa de acidez y un descenso significativo en el pH, conservando un número deseable de células viables; para el L. kunkeei también se establece un tiempo de 12 horas, para llevar a cabo un proceso fermentativo, con una producción significativa de acidez y un descenso significativo en el pH, no aplicando así el recuento de células viables, ya que estuvo alrededor de 107 UFC/g , evidenciándose como un recuento más bajo en comparación con el L. acidophilus. Este hallazgo permite visualizar al L. kunkeei como una cepa prometedora industrialmente, ya que su desempeño no esta muy distante del presentado por el L. acidophilus, teniendo en cuenta que esta última, pertenece al grupo de las cepas reconocidas como probióticas empleadas en la industria, cepas que probablemente han sido sometidas a distintos procesos biotecnológicos con el fin de obtener mejores rendimientos.


Para el efecto del proyecto, se demostró que las cepas correspondientes al L. kunkeei fueron capaces de fermentar adecuadamente el sustrato de polen, sin evidenciar ningún tipo de alteración física que afectara el aspecto, el color, el olor y el sabor; de acuerdo al concepto emitido por las personas conocedoras del pan de abejas, el producto obtenido se tornó interesante, el concepto para los tres en cuanto al pan de abejas con la cepa 6, 10 y 11 fue de agradable para el sabor, el olor y el aspecto; el pan de abejas con la cepa 7 recibió el concepto de muy agradable para el sabor y el color, y agradable para el aspecto; y la percepción con respecto al pan de abejas inoculado con la cepa L. acidophilus fue de agradable para el sabor, el olor y el aspecto. Las características que adquiere el pan de abejas, después de la inoculación con cualquiera de las cepas del L. kunkeei, se establecen como aceptables para su aplicación industrial. Este parámetro de evaluación, para los productos fermentados, permitió obtener una ligera aproximación a la elaboración de una prueba organoléptica, no desarrollada satisfactoriamente, debido a las desventajas para su realización, como la limitación en el número de personas conocedoras del pan de abejas para constituir un panel de expertos y la inexistencia de parámetros estandarizados de evaluación sensorial en este producto.

58 Aislamiento y selección de Lactobacillus sp con potencial probiótico a partir de pan de abejas

Los productos fermentados aportan innumerables beneficios en la salud de los consumidores, con base en su adecuada manipulación, se asegura la calidad higiénica y la eliminación de microrganismos potencialmente patógenos, así como la incorporación de microrganismos favorecedores del equilibrio de la microflora intestinal; la obtención de alimentos apícolas fermentados, es una ventaja no solamente visto desde el punto de vista en salud humana y animal, sino también como avance en el desarrollo tecnológico, económico y social para los apicultores colombianos.

6. Conclusiones y recomendaciones

6.1 Conclusiones

La literatura en torno al L. kunkeei es limitada, existen pocas investigaciones acerca de él, y se asocia a vinos donde ocasionan un deterioro en el sabor; de manera que esta tesis se constituyó como un importante reporte de asociación de este microorganismo al pan de abejas, ya que no se encuentran referencias bibliográficas con respecto a este aporte. La caracterización de las cuatro cepas genera mayor conocimiento con respecto a esta especie en cuanto a su morfología, comportamiento bioquímico, fermentativo y a las propiedades como potencial probiótico. Se hace necesario destacar que todas las cepas aisladas a partir de la fuente natural como el pan de abejas, deben ser evaluadas individualmente, en este estudio se encontraron diferencias en comportamientos en cepas identificadas molecularmente con la misma denominación taxonómica. El principal microorganismo fermentador cultivable del pan de abejas perteneciente al género Lactobacillus es el L. kunkeei, además el que presento mejores comportamientos en las pruebas evaluadas, con mayor resistencia y sobrevivencia a la manipulación en el laboratorio. Las pruebas de Actividad hemolítica y Actividad antibacteriana son concluyentes en la selectividad de BAL candidatas a probióticos, mientras que pruebas como la susceptibilidad a antibióticos son clasificatorias. El L. kunkeei es un microorganismo que presento propiedades de resistencia a condiciones hostiles como el medio ácido y la presencia de sales biliares, que posee capacidad antagónica frente a cepas conocidas por su patogenicidad y que fue sensible a dos antibióticos de uso rutinario en la medicina como la eritromicina y la amoxicilina. El L. kunkeei produce fermentaciones con niveles considerables de acidez y causa un buen descenso del pH, las células viables presentaron conteos ligeramente inferiores a los resultados obtenidos con el L. acidophilus. Sin embargo, en estudios posteriores las cepas obtenidas son susceptibles al mejoramiento en cuanto a su viabilidad. Se establece que el L. acidophilus A-1, conocido también como NCFM de Danisco®, es un buen microorganismo para la elaboración de pan de abejas industrial por su rápida adaptabilidad al medio, por los conteos presentados en cada hora evaluada, siendo de la cantidad deseada de 108


UFC/g, aunque los valores de pH y acidez no fueron los mejores en comparación con las otras cepas, las cantidades producidas son significativas para lograr un buen producto. La aplicabilidad en la apicultura del L. kunkeei, no solamente se relaciona con su origen sino también, con las ventajas que aportaría a nivel productivo, es conocido que el alimento básico de las larvas de las abejas es el producto fermentado del polen, al obtener un pan de abejas in vitro con probióticos además de proveer los nutrientes necesarios, también aportaría los múltiples beneficios de estos microorganismos, como el fortalecimiento del sistema inmune, disminuyendo la posibilidad de contraer enfermedades. En la actualidad se desea, sustituir la terapia antibiótica por la terapia preventiva grupo al que pertenecen los microorganismos probióticos, debido a que el efecto de su consumo seria menos agresivo en comparación con los efectos de los antibióticos, esta ha sido una de las premisas para que la industrias farmacéutica y alimentaria deseen investigar a este tipo de bacterias, aislándolas de fuentes no comunes, producirlas a nivel escala industrial e incorporarlas en la dieta humana y animal, el L. kunkeei es un ejemplo de microorganismo atrayente para estos sectores, ya que fue aislado de una fuente no común, y es poseedor de características probióticas interesantes. El objetivo de cualquier proceso biotecnológico es utilizar toda la tecnología disponible para la producción de microorganismos o cualquier producto de interés industrial, que sea económicamente rentable y a partir del cual se pueda generar algún tipo de beneficio en la salud y en la economía. Para lograr este propósito en la apicultura, resulta necesaria la optimización del proceso para la producción de pan de abejas tipo industrial y/o del L. kunkeei, el conocimiento profundo del microorganismo y de los sustratos a utilizar como el polen, a fin de obtener un producto con los mas altos estándares de calidad con rendimientos incrementados en la salud, en la economía y en el posicionamiento en el mercado nacional e internacional.

61

6.2 Recomendaciones

Caracterizar la flora acompañante del Lactobacillus kunkeei, principalmente las bacterias correspondientes a cocos Gram positivos que podrían ser BAL y las levaduras, de esta forma establecer su importancia en el proceso fermentativo. Realizar estudios más profundos en el Lactobacillus kunkeei, microorganismo con comportamientos interesantes para este estudio y con más propiedades por descubrir e investigar, como las relacionadas con su capacidad para inhibir el crecimiento de cepas patógenas. Ampliar el perfil de evaluación del L. kunkeei como potencial probiótico, incluyendo pruebas como adhesión celular, actividad antioxidante, efecto inmunomodulador entre otras y pasar a la siguiente fase de selección a través de la experimentación in vivo. Realizar estudios para establecer el tiempo de vida útil del producto, con el fin de ajustarlo a las condiciones deseadas para su comercialización. Generar ensayos en alimentos, para la obtención de materia prima con incorporación de L. kunkeei, a fin de constituirse en la base hacia el desarrollo de productos funcionales.

A. Anexo: Procedimiento para realizar recuentos

Montar diluciones 1:10 con solución salina fisiológica estéril pH 7.0 ó agua peptonada

Homogeneizar las diluciones

1 ml 1 ml 1 ml

10¯¹ 10¯² 10¯³ 10¯⁴

0.1 ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml

Sembrar 0.1 ml por cada dilución a estudiar, por duplicado

(Por cada serie de diluciones montar una réplica)

Extender muy bien en toda la superficie del agar.

Incubar a la temperatura correspondiente.

(Lactobacillus – Anaerobiosis 37 ° /24-48-72 h)

(Levaduras –Aerobiosis 25-28 °C/72 h)

Después de la incubación, realizar los conteos

Tener en cuenta las diluciones que presentan conteos entre 10 y 300 colonias

Aplicar la fórmula para establecer el número de UFC/ml:

90ml + 10 ml

de muestra 9 ml 9 ml 9 ml


Σ colonias

( n1 X 1) + (n2 X 0.1) + (n3 X 0.01) d

Donde

n1: Número de placas de la primera dilución que presenta un conteo en el rango establecido n2: Número de placas de la segunda dilución n3: Número de placas de la tercera dilución d: Primera dilución considerada

Ejemplo para un conteo de:

10¯⁴ 10¯⁵ 10¯⁶

Incontables >300 30 <10

X X

299 58 <10

X X

Σ colonias

( n1 X 1) + (n2 X 0.1) + (n3 X 0.01) d

58+30+299 = 387 = 322.5 X 10⁴ = 3.2 X 10⁶

(1X1) + (2 X 0.1) 1.2 X 10¯⁴

Adaptado de [102, 103]

B. Anexo: Actividad antimicrobiana

1. Cultivo de L kunkeei 2. Extracción de cilindros 3. Cilindro con L. kunkeei 4. Cultivo con la cepa de referencia 5. Cultivo con los cilindros superpuestos 6. Identificación de halos de inhibición del L. kunkeei sobre la cepa de referencia

C. Anexo: Cuantificación de microorganismos por el método de Miles y Misra

1. Con un marcador dividir la parte externa inferior de las cajas en seis sectores.

2. Marque tres sectores de una caja con la dilución 105 y los otros tres con 106, tres sectores de la segunda caja con la dilución 107 y los otros tres sectores con 108.

3. Con una pipeta Pasteur, tomar una muestra de la dilución 108 , colocar la pipeta en posición vertical y a una altura aproximada de 2 cm sobre la superficie del medio de cultivo, dejar caer una gota en el centro de cada uno de los tres sectores que corresponden a una dilución.

4. Con otra pipeta inocular por triplicado la dilución 107 en los otros tres sectores, cuidando de colocar la pipeta en cada ocasión en posición vertical y a la altura indicada.

5. Inocule la segunda caja con las diluciones 106 y 105.

6. Dejas que las gotas absorban el medio, invertir las cajas e incubar a la temperatura y durante el tiempo adecuado para los microrganismos que se desea cuantificar.

7. Después de la incubación, seleccionar los sectores que presenten entre 20 y 30 colonias y proceder a la cuantificación de las mismas.

8. Calcule el número de bacterias /ml o g de la muestra con la siguiente fórmula

Número de bacterias por ml = N X f

V

En donde N = Número promedio de colonias.

f = Inverso del factor de dilución.

V = Volumen de la gota.


Tomado de [83].

D. Anexo: Extracción de ADN


E. Anexo: Identificación molecular

L1 con 27 F (50 a 330)

TTTTATGCTTGCATAAATGATTTTTGGATTCGGAGCGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGTAACCT

GCCCCGAAGCGGGGGATAACATTTGGAAACAAGTGCTAATACCGCATAATTAGTTGGAACCGCATGGTTC

CAACTTGAAAGATGGCTCTGCTATCACTTTGGGATGGACCCGCGCCGTATTAGTTAGTTGGTGAGATAAAA

GCCCACCAAGACGATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCC

Accession Description Max

score

Total

score

Query

coverage

E

value

Max

ident

AB498042.2

Lactobacillus kunkeei gene for

16S rRNA, partial sequence,

strain: F20-1

520 520 100% 2e-

144 100%

AB498039.2



strain: F7-2

520 520 100% 2e-

144 100%

AB559822.1



strain: NRIC 0778

520 520 100% 2e-

144 100%

AB559821.1



strain: NRIC 0777

520 520 100% 2e-

144 100%

AB559820.1



strain: NRIC 0776

520 520 100% 2e-

144 100%

AB498043.1



strain: F20-2

520 520 100% 2e-

144 100%

GQ451608.1

Lactobacillus kunkeei strain Taj

Arash-1 16S ribosomal RNA

gene, partial sequence

520 520 100% 2e-

144 100%

EU753691.1

Lactobacillus kunkeei 16S

ribosomal RNA gene, partial

sequence

520 520 100% 2e-

144 100%

EF187239.1 Lactobacillus kunkeei 16S

ribosomal RNA gene, partial 520 520 100%

2e-

144 100%



score

Total

score

Query

coverage

E

value

Max

ident

sequence

L1 con 1492 r (50 a 331)

GTCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGT

GGCATGCTGATCCACGATTACTAGTGATTCCAACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGA

GAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTTTCGCGACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTG

TAGCCCAGCTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTC


score

Total

score

Query

coverage

E

value

Max

ident

AB498042.2



strain: F20-1

521 521 100% 7e-

145 100%

AB498040.2



strain: F10-3

521 521 100% 7e-

145 100%

AB559822.1



strain: NRIC 0778

521 521 100% 7e-

145 100%

AB559821.1



strain: NRIC 0777

521 521 100% 7e-

145 100%

AB559820.1



strain: NRIC 0776

521 521 100% 7e-

145 100%

AB559819.1



strain: IWBT B227

521 521 100% 7e-

145 100%

AB559818.1



strain: IWBT B226

521 521 100% 7e-

145 100%

EF187239.1



sequence

521 521 100% 7e-

145 100%

73

L2 con 27f (50 a 330)

TTTATGCTTGCATAAATGATTTTTGGATTCGGAGCGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTG

CCCCGAAGCGGGGGATAACATTTGGAAACAAGTGCTAATACCGCATAATTAGNTGGAACCGCATGGTTCC

AACTTGAAAGATGGCTCTGCTATCACTTTGGGATGGACCCGCGCCGTATTAGTTAGTTGGTGAGATAAAAG

CCCACCAAGACGATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCC


score

Total

score

Query

coverage

E

value

Max

ident

AB498042.2



strain: F20-1

516 516 100% 3e-

143 99%

AB498039.2



strain: F7-2

516 516 100% 3e-

143 99%

AB559822.1



strain: NRIC 0778

516 516 100% 3e-

143 99%

AB559821.1



strain: NRIC 0777

516 516 100% 3e-

143 99%

AB559820.1



strain: NRIC 0776

516 516 100% 3e-

143 99%

AB498043.1



strain: F20-2

516 516 100% 3e-

143 99%

GQ451608.1




516 516 100% 3e-

143 99%

EU753691.1



sequence

516 516 100% 3e-

143 99%

EF187239.1



sequence

516 516 100% 3e-

143 99%

L2 con 1492r (50 a 330)

TCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTG

GCATGCTGATCCACGATTACTAGTGATTCCAACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAG

AATGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTTTCGCGACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTA

GCCCAGCTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCT



score

Total

score

Query

coverage

E

value

Max

ident

AB498042.2



strain: F20-1

521 521 100% 7e-

145 100%

AB498040.2



strain: F10-3

521 521 100% 7e-

145 100%

AB559822.1



strain: NRIC 0778

521 521 100% 7e-

145 100%

AB559821.1



strain: NRIC 0777

521 521 100% 7e-

145 100%

AB559820.1



strain: NRIC 0776

521 521 100% 7e-

145 100%

AB559819.1



strain: IWBT B227

521 521 100% 7e-

145 100%

AB559818.1



strain: IWBT B226

521 521 100% 7e-

145 100%

EF187239.1



sequence

521 521 100% 7e-

145 100%

L4 con 27 F (70 a 370)

AAATGATTTTTGGATTCGGAGCGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCCGAAGCGG

GGGATAACATTTGGAAACAAGTGCTAATACCGCATAATTAGTTGGAACCGCATGGTTCCAACTTGAAAGAT

GGCTCTGCTATCACTTTGGGATGGACCCGCGCCGTATTAGTTAGTTGGTGAGATAAAAGCCCACCAAGACG

ATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGG

AGGCAGCAGTAGGGAATCTTC


score

Total

score

Query

coverage

E

value

Max

ident

AB498042.2



strain: F20-1

558 558 100% 5e-

156 100%

AB498039.2



strain: F7-2

558 558 100% 5e-

156 100%

75


score

Total

score

Query

coverage

E

value

Max

ident

AB559822.1



strain: NRIC 0778

558 558 100% 5e-

156 100%

AB559821.1



strain: NRIC 0777

558 558 100% 5e-

156 100%

AB559820.1



strain: NRIC 0776

558 558 100% 5e-

156 100%

AB498043.1



strain: F20-2

558 558 100% 5e-

156 100%

GQ451608.1




558 558 100% 5e-

156 100%

EU753691.1



sequence

558 558 100% 5e-

156 100%

EF187239.1



sequence

558 558 100% 5e-

156 100%

F. Anexo: Ficha técnica del cultivo liofilizado comercial Lb acidophilus Danisco®


G. Anexo: Estadística

Análisis de varianza para PH

ajuste=aov(respuesta~cepa.f+tiempo.f+cepa.f*tiempo.f,data=ph)

>summary(ajuste)

Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)

cepa.f 5 0.6963 0.1393 20.630 5.57e-08 ***

tiempo.f 3 2.5216 0.8405 124.526 9.17e-15 ***

cepa.f:tiempo.f 15 0.5466 0.0364 5.399 0.000136 ***

Residuals 24 0.1620 0.0068

---

Signif.codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1

>ajuste$assign

[1] 0 1 1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Terms: cepa.f tiempo.f cepa.f:tiempo.f Residuals Sum of Squares 0.6962500 2.5216417 0.5466333 0.1620000 Deg. of Freedom 5 3 15 24 Residual standard error: 0.08215838


Análisis de varianza para Acidez >ajuste=aov(respuesta~cepa.f+tiempo.f+cepa.f*tiempo.f,data=basedatos)

>summary(ajuste)

Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)

cepa.f 5 7439 1488 4.32 0.00605 **

tiempo.f 3 60609 20203 58.67 3.39e-11 ***

cepa.f:tiempo.f 15 8059 537 1.56 0.16067

Residuals 24 8265 344

---

Signif.codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1

>ajuste$assign

[1] 0 1 1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Call: aov(formula = respuesta ~ cepa.f + tiempo.f + cepa.f * tiempo.f, data = basedatos) Terms: cepa.f tiempo.f cepa.f:tiempo.f Residuals Sum of Squares 7438.65 60609.11 8059.06 8264.73 Deg. of Freedom 5 3 15 24 Residual standard error: 18.55705

81

Gráficas de residuos para pH

4.4 4.6 4.8 5.0

-0.2

-0.1

0.0

0.1

0.2

Fitted values

Resid

uals

Residuals vs Fitted

42

41

27

-2 -1 0 1 2

-3-2

-10

12

3

Theoretical Quantiles

Sta

ndard

ized r

esid

uals

Normal Q-Q

42

41

27

4.4 4.6 4.8 5.0

0.0

0.5

1.0

1.5

Fitted values

Sta

ndard

ized r

esid

uals

Scale-Location

4241

27

-3-2

-10

12

3

Factor Level Combinations

Sta

ndard

ized r

esid

uals

10 20 11 6 7 100cepa.f :

Constant Leverage:

Residuals vs Factor Levels

42

41

27


Gráficas de residuos para Acidez

0 20 40 60 80 100 120 140

-40

-20

020

40

Fitted values

Resid

uals

Residuals vs Fitted

41

42

31

-2 -1 0 1 2

-3-2

-10

12

3

Theoretical Quantiles

Sta

ndard

ized r

esid

uals

Normal Q-Q

41

42

31

0 20 40 60 80 100 120 140

0.0

0.5

1.0

1.5

Fitted values

Sta

ndard

ized r

esid

uals

Scale-Location

4142

31

-3-2

-10

12

3

Factor Level Combinations

Sta

ndard

ized r

esid

uals

100 11 20 7 6 10cepa.f :

Constant Leverage:

Residuals vs Factor Levels

41

42

31

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Aislamiento y Selección de Lactobacillus spbdigital.unal.edu.co/8647/1/lizethjohannamorenogalarza.2012.pdf · Resumen y Abstract IX Resumen En el presente estudio se aisló, caracterizó