ALDOLASAS RECOMBINANTES: DESARROLLO DE … · biotec’2004. oviedo 19-23 julio liasas catÁlisis de la formaciÓn de enlaces c-c aldolasas catÁlisis estereoespecÍfica de la adiciÓn

Biotec’2004. Oviedo 19-23 Julio

ALDOLASAS RECOMBINANTES:ALDOLASAS RECOMBINANTES:DESARROLLO DE BIOCATALIZADORESDESARROLLO DE BIOCATALIZADORES

ESTEREOESPECÍFICOSESTEREOESPECÍFICOS

Josep López SantínDepartament d’Enginyeria Química


LIASASCATÁLISIS DE LA FORMACIÓN DE ENLACES C-C

ALDOLASASCATÁLISIS ESTEREOESPECÍFICA DE LA ADICIÓN

DE FRAGMENTOS DE 1,2 o 3 CARBONOSA UN ALDEHIDO VIA ADICIÓN ALDÓLICA


REACCIONES CATALIZADAS POR ALDOLASAS

OHR5 C* C

OR4

R3

H

R1 CO

R2

+ R2 C* C

OR4

R3

R1

C*

R5

OH

* Ataque del C en α desprotonado de un aldehido o cetona alC carbonílico de otro aldehido o cetona

Especificidad por el substrato. Estereoquímica definida.*

* Degradación o transformación de azúcares, amino ácidos ycompuestos aromáticos

* Producción de azúcares no usuales para la industria farmacéuticao alimentaria y ciertos amino ácidos


ALDOLASAS DEPENDIENTES DE DHAP

HO OPO32 -

O

HR

O

- R

O

OPO32 -

OH

OH

+Aldolasa


ALDOLASAS DEPENDIENTES DE DHAP

PO OH

O

PO

O

R1

OH

H R1

O

OH

PO

O

R1

OH

OH

PO

O

R1

OH

OH

PO

O

R1

OH

OH

+

FruA

L-treo

D-eritroD-treo

L-eritro

RhuA

FucA3

4

3

3

34

4

4

TagA


2-Desoxirribosa-5-fosfato aldolasa (DERA).

Cataliza la condensación aldólica reversible entre el acetaldehído y el D-gliceraldehído 3-fosfato para dar la 2-desoxirribosa-5-fosfato (Figura 2). Es la única aldolasa conocida que condensa dos aldehídos para dar β-hidroxialdehídos de configuración eritro.

H R1

O

H

O

H R1

OR2

OH

R2

+DERA

2 3


ALDOLASAS DEPENDIENTES DE GLICINA.

Son aldolasas dependientes de piridoxal-5-fosfato y catalizan la condensación aldólica de la glicina con diferentes aldehídos aceptores para generar los correspondientes β-hidroxi-α-aminoácidos con dos nuevos centros estereogénicos (carbonos α y β).

-O2C H

H2N H

H CH3

O

+-O2C

CH3

NH2

OH

TA

-O2C H

H2N H

H H

O

+-O2C

OH

NH2

SHMT

αβ

αβ


ALDOLASAS DEPENDIENTES DE PIRUVATO O FOSFOENOL PIRUVATO.

Catalizan la condensación aldólica entre el piruvato o fosfoenolpiruvato y diferentes aldehídos para dar lugar a los correspondientes productos con un nuevo centro estereogénico.

-O2C CH3 +

O

H R1

O-O2C R1

O OH


Proyecto PPQ2002-04625

Dep. Ingeniería Química

Obtención y utilización de un conjunto de biocatalizadores para la síntesis asimétrica de intermedios quirales de

cara a la preparación de productos de alto valor añadido

Institut d’Investigacions Químiquesi Ambientals de Barcelona

Dep. Química y Bioquímicade péptidos y proteínas



Desarrollo de procesos

Aldolasas recombinantes no comerciales

- Aldolasas dependientes de DHAP- DERA - Treonina aldolasas

Expresiónen E.coli

Operaciónbioreactor

Purificación

Inmovilización

Síntesisselectivas



Desarrollo de procesos

Intermedios quirales tipo polioles y aminopolioles

Medios dereacción

- Síntesis específicas catalizadaspor aldolasas recombinantes

Síntesis de iminoazúcaresa partir de aminoaldehidos

Obtención productosalto valor añadido


ASPECTOS GENERALES EN LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN E. coli

g biomasa/LMáxima concentración UA/LMáxima productividad UA/L h UA / g biomasa

* SISTEMA DE EXPRESIÓNEfecto sobre el crecimientoExpresión solubleEstabilidad plasmídica

* PROCESOMedio de cultivo Bioreactor / Modo de operaciónEstrategia de inducción


PRODUCCIÓN DE FucA

Fuculosa-1-fosfato aldolasa (FucA)Especificidad: dioles 3R,4R. Tipo II (Zn2+)

CLONAJE Y SOBREEXPRESIÓN

Microorganismo: E. Coli XL1 Blue

Vector de expresión: pTrcHis

Expresión: proteína de fusión con una cola de hexahistidina en el extremo N-terminal.

Inducción: IPTG

Dr. Eduardo García-Junceda. Instituto de Química Orgánica CSIC


Time (h)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

OD

600

nm

0,1

1

10

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

Spec

ific

activ

ity A

U/g

DC

W induction

µmax= 0.55 h-1

MSC

Time (h)

0 5 10 15 20 25 30 350

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

OD

600

nm

0,1

1

10

induction

MD

µmax= 0.36 h-1

Spec

ific

activ

ity A

U/g

DC

W

Spec

ific

activ

ity A

U/g

DC

W

Time (h)

0 5 10 15 20 25 30 35

OD

600

nm

0,1

1

10

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

induction

MD+EDTA

µmax= 0.37 h-1

Time (h)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

OD

600

nm

0,1

1

10

Spec

ific

activ

ity A

U/g

DC

W

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

induction

µmax= 0.6 h-1

LB

Efecto del medio de cultivo

PRODUCCIÓN DE FucA


PRODUCCIÓN DE FucA

IPTG concentration (µΜ)

0 100 200 300 400 500

Spe

cific

act

ivity

(AU

/g D

CW

)

050

100150200250300350400450500550600650700750800

MD medium + EDTA

MD mediumLB medium

MSC medium

Medio definidoInductor: 40 µ mol IPTG / g DCWActividad FucA: 700 UA/ g DCW

Efecto de la concentración de inductor


CRECIMIENTO DISCONTINUO ALIMENTADO (FED BATCH)

SIN CONTROL POR RETROALIMENTACIÓN:Adición constanteAdición creciente (gradual, por escalones o lineal)Adición exponencial ( µ constante)

CON CONTROL POR RETROALIMENTACIÓN:METODOS INDIRECTOS:

DO-statpH- statVelocidad de producción de dióxido de carbono (CER)Concentración biomasa

METODOS DIRECTOS:Concentración de substrato


PRODUCCIÓN DE FucACRECIMIENTOS EN FED BATCH

FERMENTADOR : Braun Biostat B 1.5 L de volumen O2 disuelto 50% conc. saturación

MEDIO DE CULTIVO : Medio definido MD

OPERACIÓN : Fed-batch a µ constante = 0.1 h-1

Limitación por la fuente de C

ALIMENTO : Fuente de C (Glucosa) + microelementos

EXPRESIÓN : Inducción química. Adición de IPTG


PERFIL EXPONENCIAL DE ADICIÓN

( )apSXf

setset

YStVX

F/

00 exp⋅

⋅⋅⋅⋅=

µµBalances de materiaSistema discontinuo alimentado

YX/Sap Rendimiento aparente biomasa substrato (g biomasa/g substrato)

( )( )1exp/

000 −⋅⋅

⋅⋅

=−=∆ tYS

VXVVV set

apSXf

µAdiciones discretas

Programa en Visual BasicControl adición alimento


Alim.

Perfil exponencialde adición



0 10 20 30

O.D

. 600

nm

0

50

100

150

200

250

Glu

cose

(g.d

m-3

)

0

5

10

15

20

25

Tota

l bio

mas

s (g

DC

W)

0,1

1

10

100

Batch Fed-batch

(a)

phosphateaddition

(b)

Time (h)

0 10 20 30

Acet

ate

(g.d

m-3

)

0

2

4

6

8

10

Amm

oniu

m (g

.dm

-3)

0

1

2

3

4

5

(b)

45 g peso seco/LBiomasa total 53 g PS

µ = 0.1 h-1

Crecimiento fed batch. YX/S ap= 0.3µset =0.1 h-1


0 10 20 30 40

D.O

. 600

nm

0

50

100

150

200

250

Biom

asa

tota

l (X*

V; g

PS)

0,1

1

10

100G

luco

sa (g

/l)

0

5

10

15

20

25

30

35

Etapa Discontínua Etapa Semicontínua

Indu

cció

n

addición fosfatos

Inducción inicio


0 10 20 30 40 50 60

D.O

. 600

nm

0

50

100

150

200

250

Biom

asa

tota

l (X*

V; g

PS)

0,1

1

10

100G

luco

sa (g

/ l )

0

5

10

15

20

25

30

35

Etapa Discontínua Etapa Semicontínua

Indu

cció

n

addición fosfatos

Inducción final


20 30 40 50

Tota

l Bio

mas

s (X

*V) (

g D

CW

)

0

10

20

30

40

50

60

70

Tota

l act

ivity

(AU

)

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

Fed-

batc

h

Indu

ctio

n

(a)

Time (h)

20 30 40 50Fu

c-1-

PA S

peci

fic A

ctiv

ity (

AU

· g

DC

W-1

)0

200

400

600

800

Fuc-

1-PA

con

cent

ratio

n (A

U.d

m-3

)

0

10000

20000

30000

40000

50000

(b)

Indu

ctio

n

Fed-

batc

h

15 20 25 30 35 40

Tota

l Bio

mas

s (X

*V) (

g D

CW

)

0

10

20

30

40

Tota

l act

ivity

(AU

)

0

10000

20000

30000

40000

50000

Fed-

batc

h

Indu

ctio

n

(a)

Time (h)

15 20 25 30 35 400

200

400

600

800

1000

1200

Fuc-

1-PA

con

cent

ratio

n (A

U.d

m-3

)

0

10000

20000

30000

40000

50000

Fed-

batc

h

Indu

ctio

n

(b)

Inducción finalInducción inicio


(a)

0 10 20 30 40

Tota

l bio

mas

s (g

DC

W)

0,1

1

10

100G

luco

se (g

.dm

-3)

0

5

10

15

20

25

D.O

. 600

nm

0

50

100

150

200

250

Fed-batch

Indu

ctio

n

phosphate addition

Batch

Inducción óptima


Time (h)

10 15 20 25 30 35 40 45

Fuc-

1-PA

spe

cific

act

ivity

(AU

· g

DC

W-1

)

0

200

400

600

800

1000

1200

Fuc-

1-PA

con

cent

ratio

n (A

U.d

m-3

)

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

Fed-

batc

h

Indu

ctio

n

(b)

10 15 20 25 30 35 40 45

Tota

l Bio

mas

s (X

*V) (

g D

CW

)

0

10

20

30

40

50

60

Tota

l act

ivity

(AU

)

0

20x103

40x103

60x103

80x103

Fed-

batc

h

Indu

ctio

n(a)

Fuc-1-PA

1100 UA g-1

Discontinuo 700 UA g-1

Productividad 1200 UA L-1 h-1

47000 UA L-1


PRODUCCIÓN DE RhuA

Ramnulosa-1-fosfato aldolasa (Rham-1PA)Especificidad: dioles 3S,4R. Tipo II (Zn2+)

CLONAJE Y SOBREEXPRESIÓN

Microorganismo: E.. Coli M15

Vector de expresión: pQE-40 promotor T5

Expresión: proteína de fusión con una cola de hexahistidina en el extremo N-terminal.

Inducción: IPTG


Bam HI Hind III

Ptrc

lacIq ampr

Col E1

pTrcrham

6xHis DHFR MCS

Bam HI Hind III

PT5

ampr

Col E1

pQE-404.0 Kb

0.82 Kb rhaDDNA fragment

PT5

ampr

Col E1

pQErham

6xHis rhaD

Bam HI Hind III

Ptrc

lacIq ampr

Col E1

pTrcrham

Bam HI Hind III

Ptrc

lacIq ampr

Col E1

pTrcrham

6xHis DHFR MCS

Bam HI Hind III

PT5

ampr

Col E1

pQE-404.0 Kb

6xHis DHFR MCS6xHis DHFR MCS

Bam HI Hind III

PT5

ampr

Col E1

pQE-404.0 Kb

0.82 Kb rhaDDNA fragment

PT5

ampr

Col E1

pQErham

6xHis rhaDPT5

ampr

Col E1

pQErham

6xHis rhaD

TransformaciónE.coli M15 [pREP-4]

Gen rhaD del vector pTrcrham subclonado en el plásmido pQE-40bajo el control transcripcional del promotor T5


PRODUCCIÓN DE RhuA

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Biom

ass

(DO

600n

m l)

0

50

100

150

200

250

300

350

Amm

oniu

m, A

ceta

te (

g l-1

)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

Glu

cose

(g l-1

); Ph

osph

ate

(g l-1

)

0

5

10

15

20

25

30

35

40Batch Fed-batch

Phosphate addition

µ= 0.36 h-1

95 g PS/L

Crecimiento fed batch. YX/S ap= 0.3µset =0.3 h-1

. ( ) Biomasa (OD600nm l); ( ) Glucosa (g l-1); ( ) Amonio (g l-1); ( ) Fosfato (g l-1) ; ( ) Acetato (g l-1).


µγS

SX

SX mY

+=

/

/ 11

γx/s - Rendimiento intrínseco biomasa-substratomS - Coeficiente de mantenimiento

(Yx/s)set µset (h-1) µexp (h-1) (Yx/s)expX

(g DCW l-1) Time (h)

0.3 0.1 0.09 0.31 30.9 23.5

0.3 0.1 0.09 0.30 43.44 25.0

0.3 0.1 0.09 0.30 95.4 33.3

0.3 0.2 0.23 0.39 91.6 19.7

0.3 0.3 0.36 0.41 95.1 15.4

γx/s = 0.48 g g-1

mS = 0.10 g g-1h-1


Time (h)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Bio

mas

s (D

O60

0nm

l)

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

275

300

325

350

Amm

oniu

m, A

ceta

te (g

l-1)

0,5

1,5

2,5

3,5

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

Glu

cose

(g l-1

); Ph

osph

ate

(g l-1

)

0

5

10

15

20

25

30

35

40Batch Fed-batch(µ = 0.3 h-1)

Phosphateaddition

Zn2+addition(10 mg)

Phosphateaddition

+ IPTG

µset =0.3 h-1

. ( ) Biomasa (OD600nm l); ( ) Glucosa (g l-1); ( ) Amonio (g l-1); ( ) Fosfato (g l-1) ; ( ) Acetato (g l-1).


4 1 6 1 8

Amm

oniu

m, A

ceta

te (g

l-1)

0 ,5

1 ,5

2 ,5

3 ,5

0 ,0

1 ,0

2 ,0

3 ,0

4 ,0

Glu

cose

(g l-1

); P

hosp

hate

(g l-1

)

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

3 5

4 0

d d i t io nm g )

P h o s p h a t ea d d i t io n

+ IP T G

Time after induction (h)

-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5

Spe

cific

Act

ivity

(AU

g-1

DC

W)

0

100

200

300

400

500

600

700

( ) Biomasa (OD600nm l); ( ) Glucosa (g l-1); ( ) Amonio (g l-1); ( ) Fosfato (g l-1) ; ( ) Acetato (g l-1); ( ) RhuA actividad específica (AU g-1)


IPTG (µmol l-1)

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

Spe

cific

Rhu

A a

ctiv

ity (A

U g

-1 D

CW

)

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

C. discontinuos en Erlenmeyer ( ) y bioreactor ( )

C. discontinuos alimentados (▲)

Efecto de la concentración de IPTG

Specific activity(AU g-1 DCW)

Concentration (AU l-1)

Productivity(AU l-1h-1)Operation mode

Batch 1250 2292 255

Fed-batch 850 61436 3413


FermentadorV = 2 L

Centrifugación Biomasa

Sobrenadante

Pellets

Cromatografíade afinidad

PURIFICACIÓN DE ALDOLASAS

Disrupción celular

Centrifugación

Incubación

Zn2+

Precipitación

(NH4)2 SO4

Aldolasa


CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

Volum eluït (ml)

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

Abs

orbà

ncia

280

nm

0

1

2

3

4f 1 f 3f 2

a bc d

FucA


PURIFICACIÓN DE FucA

1 2 3 4 5

KDa

31.0

21.5

14.4

40.0

55.0

66.2

FucA

4.- Fracciones no retenidas en columna de afinidad 5.- Elución de las proteínas retenidas

1.- Marcadores 2.- Biomasa lisada3.- Sobrenadante lisado


FermentadorV = 2 L

Centrifugación Biomasa

Sobrenadante

Pellets

Cromatografíade afinidad

PURIFICACIÓN DE ALDOLASAS

Disrupción celular

Centrifugación

Incubación

Zn2+

Precipitación

(NH4)2 SO4

AldolasaRendimiento global FucA/RhuA: 65-70%Rendimiento global DERA: 80-85%


SÍNTESIS DE IMINOAZÚCARES A PARTIR DE AMINOALDEHIDOSCATALIZADAS POR ALDOLASAS

HN

H

R1n

O

Cbz

HN

n

HO OH

OHa) DHAP, Aldolase

b) H+, PaseH2, Pd/Cc)

Metodologías quimoenzimáticas a partir de α,β-aminoácidos y aminoalcoholes

Variedad de estructuras, funcionalidades y configuraciones

Poco solubles en aguaReactividad bajaMalos aceptores en agua o mezclas H2O/ DMF


EMULSIONES AGUA EN ACEITE ALTAMENTE CONCENTRADAS(EMULSIONES GEL)

Dispersiones líquido-líquido. Fracción volumétrica fase interna > 0.74

Hidrocarburo alifático6 % peso

Agua90 % peso

Surfactante4 % peso -Solubilización de compuestos

hidrofóbicos y hidrofílicos

- Gran área interfacial

- Alto contenido en agua (90-98%)Baja concentración de tensioactivo(máximo 4% en peso)


EMULSIONES AGUA EN ACEITE ALTAMENTE CONCENTRADAS(EMULSIONES GEL)

Cinética, Rendimiento

Tensión interfacial γo/wCoeficiente de reparto


2.2

2.3

2.4

2.5

2.6

2.7

2.8

2.9

3

8 10 12 14 16

Part

ition

coe

ffici

ent O

/W

Aliphatic hydroc. chain length

H

O

2.2

2.3

2.4

2.5

2.6

2.7

2.8

2.9

3

8 10 12 14 16

Part

ition

coe

ffici

ent O

/W

Aliphatic hydroc. chain length

H

O

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

Inte

rfac

ial t

ensi

on

(mN

/m)

C8 C10 C12 C14 C16

Aliphatic hydrocar. Chain length


CbzHN O

CbzHN

O

CbzHN

O

CbzHN

O

Emul / DMF 20% Emul / DMF 20% Emul / DMF 20%FruArab (RAMA) RhuA FucA

60 / 20

80 / 25

20 / 9

45 / 5

AldehydeConver%

HN

H

R1n

O

Cbz

HN

R1n

OH

Cbz

O

OH

OPO3-2DHAP

Aldolase

100-120 mM DHAP:180-216 mM aldehyde

50 / 58

87 / 80

64 / 60

69 / 61

35 / 18

60 / 15

37 / 17

55 / 17

42 / 40

58 / 58

62 / 50

45 mM DHAP:72 mM Aldehyde

S

R


ESTEREOSELECTIVIDAD

RhuA

Expected 3R,4S(S)

(R) OP

O

OH

OH

(R)(R) OP

O

OH

OH

80%60% de

80% de90%

20%

10%

NH

H

O

Cbz

Cbz

HN

H

O

33%34% de

67%

100% de100%Cbz

HN

H

O

Cbz

HN

H

O


INMOVILIZACIÓN

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

NH3

NH3+

NH2 NH2NH2

NH2+C H

O

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

NH3

NH3+

NH2 NH2NH2

NH2+NH3NH3

NH3+NH3NH3+

NH2NH2 NH2NH2NH2NH2

NH2NH2+C H

O

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

NH3

NH3+

NH2 NH2NH2

NH2+NH3NH3

NH3+NH3NH3+

NH2NH2 NH2NH2NH2NH2

NH2NH2+C H

O

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

NH3NH3

NH3+NH3NH3+

NH2NH2 NH2NH2NH2NH2

NH2NH2+NH3NH3

NH3NH3+NH3NH3+

NH2NH2 NH2NH2NH2NH2

NH2NH2+C H

O

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

NH3

NH3+

NH2 NH2NH2

NH2+C H

O

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

NH3

NH3+

NH2 NH2NH2

NH2+NH3NH3

NH3+NH3NH3+

NH2NH2 NH2NH2NH2NH2

NH2NH2+C H

O

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

NH3

NH3+

NH2 NH2NH2

NH2+NH3NH3

NH3+NH3NH3+

NH2NH2 NH2NH2NH2NH2

NH2NH2+C H

O

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

C HO

NH3NH3

NH3+NH3NH3+

NH2NH2 NH2NH2NH2NH2

NH2NH2+NH3NH3

NH3NH3+NH3NH3+

NH2NH2 NH2NH2NH2NH2

NH2NH2+

VARIABLES QUE CONTROLAN EL PROCESO DE INMOVILIZACIÓN:- ACTIVACION DEL SOPORTE: 205 µ Eq aldehidos/mL soporte- pH: 10

- TEMPERATURA: 20ºC- TIEMPO: 15 min

VARIABLES QUE CONTROLAN EL PROCESO DE INMOVILIZACIÓN:- ACTIVACION DEL SOPORTE: 205 µ Eq aldehidos/mL soporte- pH: 10


- ACTIVACION DEL SOPORTE: 205 µ Eq aldehidos/mL soporte- pH: 10


DERIVADO INMOVILIZADO DE FUCULOSA 1 FOSFATO ALDOLASA 65 Unidades de Actividad/mL agarosa

43%actividad respecto al total inmovilizado


REACCIONES DE SÍNTESIS CON FucA INMOVILIZADA

t (h)

0 5 10 15 20 25

Con

vers

ión

(%)

0

10

20

30

40

50

60

Propanal S-Alaninal R-Alaninal


Dr. Gregorio Álvaro

Dra. Dolors Benaiges Dra. Olga DuranyDra. Glòria Caminal Jaume Pinsach

Dr. Carles de Mas Trinitat Suau

Luis VidalDr. Pau Ferrer

Lorena FerrerDra. Glòria González


Dr. Jordi BujonsDr. Pere Clapés

Dra. Conxita SolansDr. Antonio Delgado

Jordi CalverasDr. Jesús Joglar

Dra. Laia Espelt

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