Anàlisi estructural de la interacció ciclina-CDK

Anàlisi estructural de la Anàlisi estructural de la interacció ciclina-CDKinteracció ciclina-CDK

A. Macià, P. Margalef, O. Morales i S. NajasA. Macià, P. Margalef, O. Morales i S. Najas

+ = CDK-ciclinaCDK-ciclina

Anàlisi estructural de la interacció ciclina-CDK

INDEX

1. Ciclines: funció i estructura

2. Cyclin-dependent kinases (CDKs): funció i estructura

3. CDK-ciclina

4. Estudi evolutiu

5. Formació del complex CDK-ciclina

6. Activació per fosforilació

7. Acció dels inhibidors

8. Conclusions


1. CICLINES: Introducció

Família de proteïnes (30 membres)

Elements estructurals comuns:

- Caixa ciclina interecció amb cdk

- Caixa de degradació només en cA i cB

Subfamílies segons la funció:

Reguladores del cicle cel·lular cA, cB, cD, cE

Reguladores de la transcripció cH, cI, cT

Reguladores de l’apoptosis cO

1fin.pdb


1. CICLINES

Ciclines reguladores del cicle cel·lular

Abundància cíclica al llarg del cicle cel·lular

Poliubiquitinació en la caixa de degradació

Sequència de destrucció

Caixa ciclina


Classe: proteïnes tot α

Plegament: Cyclin-like

Ciclina A

Ciclina H

Ciclina Viral

Activador 1 de cdk5

1. CICLINES: Classificació de SCOP

5 hèlixs, una de les quals és envoltada per les altres 4

Superfamília: Cyclin-like

Famílies: 1. Ciclina 2. Factor de transcripció IIB (TFIIB) 3. Dominis de Rb supressors de tumors

2 dominis d’aquest plegament

Familia Ciclina


1. CICLINES: Dominis estructurals

Caixes ciclina i de destrucció són 2 estructures repetitives

Eix perpendicular al pla entre hèlixs α2 i α2’ punt de rotació de 160º de les dues subunitats

3 dominis

Hèlix N-terminal

Caixa de destrucció

Regió d’ubiquitinació

Caixa ciclina

Unió a la CDK

160º

1fin.pdb



Nucli hidrofòbic situat a la hèlix 3

Hèlix 5

Hèlix 3

Hèlix 4 Hèlix 1

Hèlix 2



Nucli hidrofòbic situat a la hèlix 3

Residus hidrofòbics Núvol hidrofòbic


2. CDK: Introducció

Família multigènica de proteïnes

Proteïna quinases Fosforilen residus de Serina i Treonina

Subfamílies segons la funció:

Reguladores del cicle cel·lular Cdk1, Cdk2, Cdk4, Cdk6

Reguladores de la transcripció Cdk7, Cdk8, Cdk9

Neurogènesis Cdk5

Unió a ciclina és necessària per la seva activació

Poden unir-se a més d’un tipus de ciclina

http://desktopmates.com/galleries/images/warning-symbol.jpg


Classe: proteïnes alfa i beta (α+β)

Plegament: protein kinase-like (PK-like)

2. CDK: Classificació de SCOP

Superfamília: protein kinase-like (PK-like)

Famílies:

• Dos dominis α+β

• Domini C-terminal hèlix α

Proteïna quinases, subunitat catalítica

Fragment de l’actina quinasa, domini catalític

Quinasa MHCK/EF2

Fosfoinositidina 3-quinasa

Colin quinasa

Aminoglicosil fosfotransferasa

Quinases RIO1-like


Domini N-terminal

(petit)

Domini C-terminal

(gran)

• Dominis cdk2


• Parts principals de la cdk:

PSTAIRE

Thr 160

T-loop

Escletxa catalítica


2. CDK

Comparació de CDK2 i CDK6

Inserció 2: 82-88

Inserció 1:15-22


3. CICLINA-CDK

Caldran dos ciclines per activar-la

• CDK és dimèrica


3. CICLINA-CDK

CDK

Ciclina

INACTIU

Complex cdk-ciclina

PARCIALMENT ACTIU


3. CICLINA-CDK

PARCIALMENT ACTIU

Cyclin H

Cdk7

CAK

ACTIU

FOSFORILAT en THR160


3.CICLINA-CDK

ACTIU

FOSFORILACIÓ DE DIANA

E2F site

E2F

Rb

Gen

E2F siteE2F

Rb

P P

P PP

Gen


3.CICLINES-CDK

Regulació del complexe Ciclina-CDK

Fosforilació de la subunitat cdk

Nivells de la ciclina

Nivells dels inhibidors

CAK

Inhibidor-cdk


3. CICLINA-CDK

Tipus de complexes ciclina-cdk

G1 Preparació síntesi DNA cdk4/cicl Dcdk6/cicl D

Duplicació del centrosomacdk2/cicl E

S Fosforilacióde complexes de cdk2/cicl Apre-replicació

G2/M cdk1/cicl B

M Condensació de cromosomes cdk1/cicl BTrencament embolcall nuclearFús mitòticAliniament de cromosomes enplaca metafàsica


3.CICLINES-CDK

G1 S G2 M G1

Ciclina E-Cdk2

Ciclina A-Cdk2

CiclinaB-Cdk1

Ciclina D-Cdk4/6

Act

ivit

at q

uin

asa

Temps


4. CONSERVACIÓ I EVOLUCIÓ DE LES CDKS I LES CICLINES


4. CONSERVACIÓ DE LES CDKS HUMANES

Alta conservació del PSTAIRE


4. CONSERVACIÓ DE LES CDKS HUMANES

Bona conservació del T-loop i de la Thr160


4. CONSERVACIÓ DE LA CDK2 ENTRE ESPÈCIES

Alta conservació en general


4. COMPARACIÓ DE LA CDK2 HUMANA AMB LA PFPK5 (P. Falciparum)

Alta conservació en general

PSTAIRE

T-loop i Thr 160



Molt bona conservació

estructural



Molt bona conservació de les estructures claus:

PSTAIRE i T-loop


4. CONSERVACIÓ DE LES CICLINES HUMANES

Zones de baixa conservació


4. CONSERVACIÓ DE LES CICLINES HUMANES

Zones de bona conservació: interacció amb la cdk


4. CONSERVACIÓ DE LA CAIXA DE DESTRUCCIÓ

Bona conservació de la caixa de destrucció


4. CONSERVACIÓ DE LA CICLINA A ENTRE ESPÈCIES

Bona conservació: interacció amb la cdk


4. COMPARACIÓ DE LA CICLINA A HUMANA AMB

LA CICLINA D’HERPESVIRUS SAIMIRI

Bona conservació en general




Molt bona conservació estructural




Molt bona conservació

de la caixa ciclina


5. CANVIS ESTRUCTURALS EN CDK2 DEGUTS A LA UNIÓ AMB LA CICLINA A


PSTAIRE

T-loop

Caixa ciclina

cdk2 ciclina A

Interacció ciclina-cdk:

PSTAIRE

T-loop

Unió d’ATP

CDK2


CDK2 sola: lloc d’unió d’ATP tapat

PSTAIRE

T-loop

ATP

CDK2

Ciclina A


CDK2-ciclina A: lloc d’unió d’ATP exposat

T-loop - cdk2 sola


T-loop

cdk2-ciclina A

~ 20 Å

Canvi de lloc del T-loop

Interaccions de Van der Waals


Interaccions del T-loop

Ponts d’hidrogen


Interaccions del T-loop


PSTAIRE

cdk2-ciclina A

PSTAIRE

cdk2 sola

21 Å

Canvi d’orientació

del PSTAIRE

Glu51 - cdk2 sola

Glu51 - cdk2 ciclina A


Canvi d’orientació del PSTAIRE (Glu 51)

Glu51 - cdk2 solaGlu51 - cdk2

ciclina A


Canvi d’orientació del PSTAIRE (Glu 51)

Glu51


Glu 51 al centre catalític

Glu51


Glu 51 fora del centre catalític


Interaccions a la part N-terminal de la cdk2


Interaccions a la part C-terminal de la cdk2


Ponts d’H al loop que precedeix el PSTAIRE


6. ACTIVACIÓ DEL COMPLEX: Fosforilació

Complex CDK-ciclina 0,2 % activitat

Centre actiu de la proteïna no té la conformació correcta

Requereix fosforilació per CAK (CDK-activating kinase)

Treonina 160 (THR160) del T-loop


6. ACTIVACIÓ DEL COMPLEX: Superposició estructural (STAMP)

Observació de canvis estructurals

PDB: 1JSTPDB: 1JST

PDB: 1FINPDB: 1FIN



Observació de canvis estructurals + ATP

PDB: 1JSTPDB: 1JST

PDB: 1FINPDB: 1FIN



Observació de canvis estructurals + ATP + THR160

PDB: 1JSTPDB: 1JST

PDB: 1FINPDB: 1FIN


6. ACTIVACIÓ DEL COMPLEX: Canvis estructurals

No hi ha canvis a nivell macroscòpic en la fosforilació

No hi ha alteració en la posició de l’ATP en la butxaca catalítica de la

CDK.

Hi ha una “suposada” rotació del residu fosforilat (THR160)

Noves interaccions

Estabilització de l’estructura de la butxaca catalítica


6. ACTIVACIÓ DEL COMPLEX: Noves interaccions

Interacció dels OH del grup fosfat de la TPO amb residus d’ARG (50, 126 i 150) de la butxaca catalítica

PDB: 1B38PDB: 1B38 PDB: 1JSTPDB: 1JST

Unió per ponts d’hidrogen

Actua com a centre organitzador

Augmenta l’afinitat de la CDK per l’ATP

Redueix l’afinitat de la CDK per l’ADP

Estabilitza l’estructura de la butxaca catalítica

6. ACTIVACIÓ DEL COMPLEX: Accions del fósfor


Permet entrada del substrat augmenta mobilitat del T-loop

Reorientació de l’ATP atac nucleofílic contra el substrat

Activació de la funció fosforiladora de la CDK

IMPORTANT Fosforilació no afecta l’estructura de la ciclina


6. ACTIVACIÓ DEL COMPLEX: Reorientació de l’ATP

PDB: 1JSTPDB: 1JST

Interaccions:

• LYS33 – Pα(ATP)

• GLU81 – OH(Adenosina)

• LEU83 – OH (Adenosina)

Unió per ponts d’hidrogen


6. ACTIVACIÓ DEL COMPLEX: Reorientació de l’ATP

Interaccions:

• LYS33 – Pα(ATP)

• GLU51(PSTAIRE) - P β(ATP)

• GLU81 – OH(Adenosina)

• LEU83 – OH (Adenosina)

• ASP145 – Mn & P β(ATP)

PDB: 1JSTPDB: 1JSTUnió per ponts d’hidrogen


6. ACTIVACIÓ DEL COMPLEX: Resum de les interaccions

PDB: 1JSTPDB: 1JST

ARG50

ARG126

ARG150

TPO160

GLU51

GLU81LYS33

LEU83

ASP145

ATP

MN



PDB: 1JSTPDB: 1JST

Substrat



PDB: 1JSTPDB: 1JST

Substrat

P


7. INHIBIDORS

INK4 KIP/CIP

p15, p16, p18, p19 cdk4 cdk6Complex binariRegula la preparació de la sintesi del DNA

P21, p27, p57 cdk2Complex ternariRegula la fosforilació dels complexes de pre-replicació.

Families d’inhibidors que intervenen en la regulació del cicle cel·lular

Cdk4/6

Cy D INK

Cdk2

Cy ACip/Kip

Cdk2

Cy ACip/Kip

Cdk4/6

Cy D

INK

Complex binari:

Família INK4 Família KIP

ACTIU

INACTIU

Complex ternari:


7. INHIBIDORS


7. INHIBIDORS :

INK4 KIP/CIP




p27: 1jsu.pdb p19: 1blx.pdb


7. INHIBIDORS : Familia INK4

p19 interacció amb cdk6

p19: 1blx.pdb

p19 Cdk6:

T-loop

PLTAIRE

COMPLEX BINARI



ESTRUCTURA p19 : ankyrin

ANKYRINBETA- HAIRPIN



ESTRUCTURA p19 : ankyrin

1 2 3 4 5

1

2

3

4

5

5 motius repetits ankyrin Estructura cóncava interaccions cdk6



INTERACCIÓ p19-cdk6

Helix 1, 3, 5Full beta



INTERACCIÓ p19-cdk6 : butxaca hidrofòbica

Loop 6

Loop 7

Loop 11

PHE 86




Loop 6

Loop 7

Loop 11

PHE 86




Loop 6

Loop 7

Loop 11

PHE 86




Val 48 Met 49 Phe 51 Gly 52

P19: loop 4cdk6: loop 7 Asp 102

cdk6 Lys 29 Lys 111




P19:Gly 52

Cdk6:Asp 102

Pont d’hidrogen




P19:Gly 52

Cdk6:Lys 111

Pont d’hidrogen




P19:Met 49Phe 51

Cdk6:Asp 102

Pont d’hidrogen




P19:Val 48Met 49

Cdk6:Lys 29




Cdk6:Lys 29His 100Asp 102




P19:Val 48Met 49Phe 51Gly 52

Cdk6:Lys 29His 100Asp 102

P19: loop 4



Reorganització cdk6 degut a la interacció amb l’inhibidor p19

1blx.pdb

1hcl.pdb



Reorganització cdk6 degut a la interacció amb l’inhibidor p19

1fin.pdb

1blx.pdb


7. INHIBIDORS :

INK4 KIP/CIP




p27: 1jsu.pdb


7. INHIBIDORS : Familia CIP/KIP

p27 interacció amb cdk2-cyclina A

p27

Cdk2:

T-loop

PSTAIRE

1jsu.pdb

Cyclina A

COMPLEX TERNARI



ESTRUCTURA p27

motiu LFG rigid coil helix alfa amfipàtica beta-hairpin amfipàtic cadena beta helix 3.10



INTERACCIÓ p27 amb cyclina A motiu LFG

1

34

Leu 32Phe 33Gly 34



INTERACCIÓ p27 amb cyclina A motiu LFG



INTERACCIÓ p27 amb cyclina A helix alfa amfipàtica

5



INTERACCIÓ p27 amb cdk2 beta-hairpin

Beta-hairpin

beta sanvitx

1jsu.pdb

1jst.pdb



INTERACCIÓ p27 amb cdk2 cadena beta



INTERACCIÓ p27 amb cdk2 cadena beta

beta 1

beta 2 beta 3, 4, 5

8,5 A



INTERACCIÓ p27 amb cdk2 helix 3.10




P27:Tyr 88

Cdk2:Glu 81

Cdk2:Leu 83




P27:Phe 87

p27:Arg 90

Cdk2:Lys 33




P27:Tyr 88

Cdk2:Glu 81

Cdk2:Leu 83




P27:Phe 87

p27:Arg 90

Cdk2:Lys 33




8. CONCLUSIONS


La interacció de la CDK2 amb la ciclina A es essencial per a

l'activació d’aquesta

Moviment del T-loop que permet l’obertura de l’escletxa

catalitica i fosforilacio de la THR160

Reorientacio del PSTAIRE: introducció del GLU51 a la

butxaca catalitica

Següent pas necessari: fosforilacio del residu THR160 TPO160

Rotació cap a la triada d’arginines

Estabilització i orientació òptima de l’ATP atac nucleoficlic

contra el substrat

8. CONCLUSIONS


Conservació de seqüència i estructura de les regions importants

implicades en les interaccions CDK-ciclina

Hèlix PSTAIRE

T-loop

Caixa ciclina

THR160 + residus butxaca catalitica

9. PEM


1. Quin és l'aminoàcid de la cdk2 que es fosforila mitjançant la CAK?a) ASPb) GLYc) THRd) ALAe) Totes les anteriors

2. Quin plegament és només hèlix-alfa?a) La CDK6b) La CDK2c) Les dues anteriorsd) La ciclinae) Totes les anteriors

3. Quines són les estructures principals que participen en la interacció cdk2-ciclinaA?a) El T-loopb) El PSTAIREc) Els 2 anteriorsd) La caixa ciclina

e) Totes les anteriors

9. PEM


4. Referent als inhibidors del complex cdk-ciclina és fals:a) Existeixen 2 families d’inhibidorsb) El p19 forma un complex binari amb la cdkc) El p27 forma un complex ternari amb cdk-ciclinad) p19 i p27 comparteixen el mateix plegament de la classe

tot helix alfae) Totes les anteriors

5. Assenyala la/es correcta/es:1. La unió cdk2-ciclinaA produeix canvis conformacionals en la ciclinaA.2. La unió cdk2-ciclinaA produeix canvis conformacionals en la cdk2.3. La fosforilació de la cdk2 inactiva el complex cdk2-ciclinaA.4. La unió de cdk2 a ciclina A és necessària per l’activació de la cdk2.a) 1, 2 i 3.b) 1 i 3.c) 2 i 4.d) 4.e) 1, 2, 3 i 4.

9. PEM


6. La unió de la ciclina a la cdk comporta:a) Rotació del PSTAIRE.b) Exposició de l’escletxa catalítica.c) Moviment del T-loop.d) Exposició de la treonina 160.e) Totes les anteriors.

7. Referent als inhibidors:a) El p27 s’uneix amb la cdk2-ciclinaA. b) El p19 interacciona amb el T-loop de la cdk6.c) El p19 s’uneix a la cdk2-ciclinaA.d) El p27 no interacciona amb la butxaca catalítica.e) Totes les anteriors.

8. Interacció de l’ATP amb la cdk2.a) Es dóna amb un residu del PSTAIRE.b) L’ATP entra amb un ió de magnesi.c) Les dues anteriors.d) Es dóna amb un residu del T-loop.e) Totes les anteriors.

9. PEM


6. La unió de la ciclina a la cdk comporta:a) Rotació del PSTAIRE.b) Exposició de l’escletxa catalítica.c) Moviment del T-loop.d) Exposició de la treonina 160.e) Totes les anteriors.

7. Referent als inhibidors:a) El p27 s’uneix amb la cdk2-ciclinaA. b) El p19 interacciona amb el T-loop de la cdk6.c) El p19 s’uneix a la cdk2-ciclinaA.d) El p27 no interacciona amb la butxaca catalítica.e) Totes les anteriors.

8. Interacció de l’ATP amb la cdk2.a) Es dóna amb un residu del PSTAIRE.b) L’ATP entra amb un ió de magnesi.c) Les dues anteriors.d) Es dóna amb un residu del T-loop.e) Totes les anteriors.

9. PEM


9. Referent al plegament de les ciclines: quina és la falsa?a) Tenen un plegament cyclin-like format per 5 hèlixs alfa.b) Conté una regió beta a la part N-terminal.c) Pertanyen a la classe tot alfa.d) El plegament s’estabilitza gràcies a un core hidrofòbic al voltant de l’hèlix 3.e) Una ciclina conté dos dominis amb el mateix plegament.

10. Referent al plegament de les cdks: quina és la certa?1. El seu plegament pertany a la classe (α+β)2. La part N-terminal està formada per 5 cadenes beta antiparal·leles.3. L’escletxa catalítica es situa entre la regió N-terminal i C-terminal.4. El PSTAIRE té una estructura secundària de beta-hairpin.a) 1, 2 i 3.b) 1 i 3.c) 2 i 4.d) 4.e) 1, 2, 3 i 4.

Documents

Anàlisi estructural de la interacció ciclina-CDK