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ANALISIS DE FLUJOS METABOLICOS EN BACILLUS SUBTILIS
I. INTRODUCCION.-
Bacillus subtilis es el microorganismo Gram + mas ampliamente estudiado.
Sin embargo, por mucho tiempo se postuló que era un microorganismo
estrictamente aerobio y por tanto existen relativamente pocos estudios en
condiciones anaeróbicas e inexistentes en condiciones controladas en
fermentadores. Desde el punto de vista cinético, estequiométrico y
energético no se conoce a detalle como crece y que vías de fermentación
son activas en presencia de nitrato como aceptor de electrones, así mismo
no se sabe si esporula o sí inicia este proceso en estas condiciones, Durante
el crecimiento de B. subtilis en glucosa, sin limitación de oxígeno, se produce
ácido acético como subproducto. Esto sucede como respuesta a un exceso
en el flujo de entrada de glucosa y por tanto a un incremento en el flujo
glicolítico a ácido pirúvico, el cual la célula es incapaz de utilizar en su
totalidad para biosíntesis en el ciclo de Krebs (Phalakornkule, et al., 2000;
Blencke, et al., 2003). Este fenómeno ocurre cuando existe glucosa en el
medio en concentraciones suficientes para controlar, por medio de la
proteína CcpA (proteína de control catabólica), regiones reguladoras CRE
(elementos de respuesta catabólicos) en los promotores de algunos genes
entre los cuales están ackA y pta (acetato cinasa y fosfotransacetilasa) de la
vía de producción de ácido acético e incluyendo también algunos genes de
las rutas del catabolismo de la glucosa (Prescan-Siedel et al., 1999). En
estudios empleando modelos de flujos metabólicos desarrollados para la
cepa 168 de B. subtilis, se encontró que en cultivo continuo limitado por
glucosa, el flujo de carbono (milimoles de carbono/gCélula-h) al través de la
ruta de los ácidos tricarboxilicos (TCA) y la síntesis de las enzimas que
componen el ciclo, se incrementa conforme aumenta la velocidad de
crecimiento, siendo drásticamente reprimidas solamente a velocidades de
crecimiento muy altas como las que se observan en el crecimiento por lote
(0.6 h-1) y conforme la concentración de glucosa se incrementa (Goel et al.,
1993). La proteína CcpA también esta involucrada en la fuerte represión que
ocurre en casi todos los genes necesarios para el ciclo de Krebs (Tobisch, et
al., 1999). Por medio de la velocidad de crecimiento, de balances
estequiométricos, de consumo de glucosa y la acumulación de los
metabolitos formados en condiciones anaerobias, es posible calcular las
velocidades específicas (flujo metabólico) y el porcentaje de la fuente de
carbono que es catabolizada por la glicólisis y el ciclo de las pentosas, este
procedimiento fue inicialmente propuesto por Papoutsakis y Meyer (1985).
Haciendo uso de esta metodología, Bulthuis et al. (1991) cultivando a
Bacillus licheniformis en condiciones anaeróbicas, por lotes o en continuo,
encontraron que hasta un 52 % de la glucosa es metabolizada por la vía de
pentosas.
Figure 1: Metabolic Network of B. subtilis
II. PROCEDIMIENTOS Y RESULTADOS
1.- Se introdujeron los datos obtenidos de la ruta metabolica de bacillus subtilis en el programa excell.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
r1 r2 r3 r4 r5 r6 r7 r8 r9 r10 r111 G6P -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -12 R5P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 13 GAP 2 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 04 3PG 0 1 -1 0 0 0 0 0 0 0 05 PEP 0 0 1 -1 0 0 0 -1 0 0 06 Pyr 0 0 0 1 -1 0 0 0 0 0 07 AcCoA 0 0 0 0 1 -1 0 0 0 0 08 OAA 0 0 0 0 0 -1 1 1 0 0 09 AKG 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
10 NADH 0 1 0 0 1 0 2 0 -1 0 011 FADH 0 0 0 0 0 0 1 0 0 -1 0
12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
G6P 1 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0R5P 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0GAP 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 03PG 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0PEP -1 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0Pyr 1 0 0 0 0 0 -1 -1 0 0 0 0AcCoA
0 0 0 0 0 0 0 0 -1 -1 0 0
OAA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1AKG 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0NADH 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0FADH 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
MATRIZ ESTEQUIOMETRIA DE LAS11 REACCIONES
MATRIZ ESTEQUIOMETRIA DE LAS12 REACCIONES (12 AL 23)
2.-Siguiendo los datos extraídos del paso anterior, se dispuso a utilizar el
programa Matlab, con el cual se añadieron los siguientes:
3.- Al correr el programa, en comando se obtuvo lo siguiente:
III. CONCLUSIONES
El calculo de flujos desconocidos se da por la siguiente formula :
En matlab se aplico:
% flux calculation
qc=-inv_S_C * S_M * qm
donde S_c : MATRIZ ESTEQUIOMETRIA DE LAS11 REACCIONES
S_M : MATRIZ ESTEQUIOMETRIA DE LAS REACCIONES(12 al 23)
Q_M : QUE CONTIENE LOS FLUJOS MEDIDOS
El cálculo de flujos metabólicos es una herramienta de la ingeniería
metabólica y una determinación fundamental en estudios cuantitativos de
fisiología celular, ya que permite organizar el conocimiento metabólico de
un microorganismo en una red de reacciones bioquímicas y provee una
medida del grado de ajuste entre varias vías metabólicas (Varma y Palsson,
1994; Stephanopoulos y col., 1998; Nielsen, 2001).
El grado de ajuste entre vías metabólicas se entiende como la producción
de intermediarios en unas y el consumo de los mismos en otras, por
ejemplo, cuando las condiciones ambientales cambian los flujos
metabólicos son redistribuidos de manera que se mantenga el balance de
óxido-reducción en la célula (Varma y Palsson, 1994; Torres y Voit, 2002).
Una poderosa herramienta para la determinación de los flujos en la red de
reacciones bioquímicas es el análisis de flujos metabólicos (AFM), en el
cual los flujos intracelulares son calculados usando un modelo
estequiométrico que describe la bioquímica del microorganismo (Jørgensen
y col., 1995; Nissen y col., 1997; Stephanopoulos y col., 1998). Sin
embargo, ya que el análisis cuantitativo del metabolismo requiere datos
experimentales, es importante que la consistencia de los datos sea
confirmada, antes de utilizarlos en la determinación de flujos metabólicos
(Stephanopoulos y col., 1998).
En algunos casos, el modelo estequiométrico y los flujos extracelulares
medidos permiten calcular, además de los flujos intracelulares, flujos
extracelulares no medidos o incluso algunos que sí fueron medidos pero
fueron intencionalmente omitidos en los cálculos. En éste último caso, el
grado de concordancia entre los flujos medidos y las predicciones del
modelo, pueden servir para validarlo.
Se utilizo el comando “length” que devuelve el número de componentes de
un vector. Para usar esta función debe definir el vector antes de llamar a la
función, que define la cantidad de elementos máximos que tiene un vector.
Lista de reacciones :
Glucose + ATP = glucose-6-P + ADP
Glucose-6-P + 2NADP = ribulose-5-P + C02 + 2NADPH
Ribulose-5-P = ribose for nucleic acid
Ribulose-5-P = 3 fructose-6-P + 5 TP 2 1
Glucose-6-P = fructose-6-P
Fructose-6-P + ATP = 2 TP + ADP
TP = triglycerides
PEP = pyruvate + ATP
Pyruvate = AA (from pyruvate pool)
Pyruvate = organics (other than acetate)
Pyruvate + NAD = ACoA + C02 + NADH
ACoA = AA (from ACoA pool)
ACoA = membrane
ACoA + ADP = acetate + ATP
ACoA + OM = isocitrate
Isocitrate + NADP = a-KetoG + C02 + NADPH
a-KetoG = AA (from a-KetoG pool)
a-KetoG + FAD + GDP + 2NAD = OAA + C02 +
FADH + GTP + 2NADH
OAA = NA (from OAA pool)
OAA = AA (from OAA pool)
Pyruvate + C02 = OAA
NADH + 1.3 ADP + iy = 1.3 ATP + NAD
FADH + ;(1.3 ADP) + 502 = ;(1.3 ATP) + FAD
Las especies consideradas son las siguientes:
Glucose
Glucose 6-P
Ribulose 5-P
NA (from ribose)
Fructose 6-P
Cell wall
AA (from Glucose pool)
TP
Triglycerides
PG
AA (from PG pool)
NA (from PG pool)
PEP
AA (from PEP)
Pyruvate
AA (from pyruvate)
Organics (other than acetate)
ACoA
AA (from ACoA pool)
Membrane
Acetate
Isocitrate
a-KetoG
AA (from a-KetoG pool)
OAA
Nucleic acid (from OAA pool)
NADPH
NADH
FADH
C02
02
IV. REFERENCIAS
- Aiba, S., Matsuoka, M. 1979. Identification of metabolic model:Citrate production from glucose by Candidu lipolytica. Biotechnol.Bioeng. 21: 1373-1386.
- Bailey, JE 1991. Towards a science of metabolic engineering.Science 252: 1668- 1675